CN110407749A - 一种含有二硫键的光亲和链接体及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种含有二硫键的光亲和链接体及制备方法和应用,2‑(叔丁基氧基)‑4‑戊炔酸与乙二胺在PyBoP缩合剂的作用下,得到带有氨基末端中间体;含有氨基末端的中间体与带有二硫键的羧基末端中间体在EDC·HCl的缩合下,得到带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体;将带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到目标光亲和链接体。本发明中的生物可降解光亲和链接体分子可以对生物大分子进行化学共价修饰构建探针分子,进而通过传统的光亲和标记技术对目标分子进行标记,后通过触发可释放基团释放体积较大的诱饵分子,从而达到对目标分子的准确标记示踪。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有二硫键的光亲和链接体及制备方法和应用。
背景技术
光亲和标记技术(PAL)是结合现代分子生物学、细胞生物学、药物化学、分析化学等多学科的优势,运用合成的光亲和探针分子,在特定波长光的照射下产生高活性的中间体,其可以直接与药物分子特异性结合的蛋白质进行不可逆共价交联从而实现对药物靶标蛋白分子的捕获。它是分子水平上研究配体与受体相互作用的核心工具之一,对阐明配体与受体相互作用机理以及药物新靶点的发现都有着巨大的推动作用。
近些年来这项技术主要应用于活性小分子靶标蛋白的示踪及确证,其主要基于光交联技术、生物正交技术以及相关的生物分析技术等,实现药物分子靶标的捕获及其示踪。其中光亲和探针分子的设计合成是在不影响分子活性的基础上直接进行化学修饰,在其非活性部位上引入光亲和链接体设计合成光亲合探针分子,其在特定波长光的照射下特异性不可逆的共价捕获与其相互作用的靶标蛋白。再接下来通过生物正交反应来实现所捕获的靶标蛋白的示踪及鉴定。通过对光亲和标记技术工作原理的研究发现,发现该技术也可用于研究生物大分子间的相互作用。基于此,有必要提供一种含有二硫键的光亲和链接体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有二硫键的光亲和链接体及制备方法和应用,生物可降解光亲和链接体分子用于化学修饰生物大分子,并且可以用于验证含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体所构建的探针进行生物标记示踪的可行性。
为达到上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种含有二硫键的光亲和链接体,其结构式如下:
一种含有二硫键的光亲和链接体的制备方法,包括以下步骤:
a)4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐与亚二硫基二乙酸在EDC·HCl的缩合下,得到带有二硫键的羧基末端中间体;
b)2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸与乙二胺在PyBoP缩合剂的作用下,得到带有氨基末端中间体;
c)含有氨基末端的中间体与带有二硫键的羧基末端中间体在EDC·HCl的缩合下,得到带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体;
d)将带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到目标光亲和链接体,其结构如下:
本发明进一步的改进在于,其特征在于,步骤a)的具体过程为:将亚二硫基二乙酸、EDC·HCl、NHS溶于无水二氯甲烷中,0℃下搅拌均匀后,滴加三乙胺,反应2h后,加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐进行反应,得到含有带二硫键的羧基末端中间体。
本发明进一步的改进在于,所述步骤a)的具体过程为:将亚二硫基二乙酸0.1987mmol、EDC·HCl 0.2384mmol、NHS 0.2384mmol溶于无水二氯甲烷中,0℃下搅拌均匀后,滴加三乙胺0.2384mmol,反应2h后,加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐0.1987mmol,进行反应24h,得到带有二硫键的羧基末端中间体。
本发明进一步的改进在于,其特征在于,步骤b)的具体过程为:2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸、PyBOP溶于无水二氯甲烷中,在0℃条件下滴加三乙胺,搅拌2h后,加入乙二胺,室温反应24h后,得到含有炔基的氨基末端中间体。
本发明进一步的改进在于,所述步骤b)的具体过程为:将2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸0.4690mmol、PyBOP 0.9380mmol溶于无水二氯甲烷中,在0℃条件下滴加三乙胺1.8759mmol,搅拌2h后,加入乙二胺0.9380mmol,室温反应24h后,得到含有炔基的氨基末端中间体;
步骤c)的具体过程为,将含有炔基的氨基末端中间体与带有二硫键的羧基末端中间体溶于无水二氯甲烷中,加入EDC·HCl、NHS,0℃下搅拌1h后滴加三乙胺,室温搅拌24h,得到带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体。
本发明进一步的改进在于,所述步骤c)的具体过程为,在0℃下,将含有二硫键的羧基末端中间体0.1055mmol、EDC·HCl 0.1266mmol、NHS 0.1266mmol溶于无水二氯甲烷中,0℃下搅拌1h后滴加三乙胺0.1266mmol,反应2h后,加入含有炔基的氨基末端中间体0.1055mmol,室温搅拌24h,得到带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体。
本发明进一步的改进在于,所述步骤d)的具体过程为,将带Boc保护基的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中间体0.0114mmol,溶于10mL无水二氯甲烷中,0℃下搅拌均匀后,滴加三氟乙酸2mL,在0℃下反应1h后,室温反应24h,得到含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体。
一种基于含有二硫键的光亲和链接体在光亲和标记技术方面的应用。
一种含有二硫键的光亲和链接体在细胞原位荧光瞬时示踪标记方面的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明通过将光亲和基团三氟甲基取代的双吖丙啶、炔基生物正交手柄以及生物可降解基团二硫键连接,获得生物可降解光亲和链接体分子。该链接体分子能够化学修饰生物大分子进而构建生物大分子光亲和探针,接下来探针分子中的生物正交手柄与含有荧光素的另一生物正交手柄进行点击反应以示踪及确证相互作用分子。本发明的生物可降解光亲和链接体分子制备方法简单,易于实现,并且收率较高。
本发明中的生物可降解光亲和链接体分子可以对生物大分子进行化学共价修饰构建探针分子,进而通过传统的光亲和标记技术对目标分子进行标记,后通过触发可释放基团释放体积较大的诱饵分子,从而达到对目标分子的准确标记示踪。利用该链接体所构建的探针分子可以改善传统光亲和标记技术研究生物大分子间相互作用的缺点。原有的标记技术不能有效的释放诱饵分子,存在的诱饵大分子会由于其较大的分子体积对所标记的分子造成干扰,其次,由于体积较大,其对生物体中丰度较低的大分子难以标记,即其灵敏度低。而通过可降解光亲和链接体所构建的探针分子在进行特异性共价捕获后,可以通过触发可释放基团释放体积较大的诱饵分子实现生物正交基团的转移,以改善传统光亲和标记技术应用于研究大分子相互作用的不足。本发明的生物可降解光亲和链接体能够用于构建生物大分子探针以及验证该探针进行示踪的可行性。
附图说明
图1为本发明提供的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体的合成路线图;
其中,化合物1为4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐,化合物2为亚二硫基二乙酸,化合物3为2-((2-氧代-2-((4-(3-(三氟甲基)-3H-二氮杂萘-3-基)苄基)氨基)乙基)二硫烷基)乙酸,化合物4为2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸,化合物5为乙二胺,化合物6为(3,8,13-三氧代-1-(4-(3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基)苯基)-5,6-二硫-2,9,12-三氮杂十八烷-16炔-14-基)叔丁基酰胺,化合物7为2-氨基-N-(2-(2-((2-氧代-2-((4-(3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基)苄基)氨基)乙基)二硫基)乙酰胺基)乙基)戊-4-炔酰胺。
试剂与条件:(a)EDC·HCl,NHS,TEA,DCM,0℃to rt,24h;(b)PyBoP,TEA,DCM,0℃to rt,24h;(c)EDC·HCl,NHS,TEA,DCM,0℃to rt,24h.(d)TFA,DCM,0℃to rt,24h。
图2为细胞成像结果,其中,(a)为未添加还原剂,(b)为添加还原剂释放探针及荧光素。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明通过使用4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐、2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸、亚二硫基二乙酸、乙二胺合成生物可降解光亲和链接体分子,在光亲和链接体的生物正交基团和光亲和基团之间引入生物可降解基团二硫键;该链接体可以用于化学修饰生物大分子,以构建生物大分子光亲合探针。
本发明提供的具有生物可降解二硫键的光亲和链接体,其结构如下:
本发明所述的具有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体名称如下:
2-氨基-N-(2-(2-((2-氧代-2-((4-(3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基)苄基)氨基)乙基)二硫基)乙酰胺基)乙基)戊-4-炔酰胺。
下面结合图1中所示的合成路线和具体的合成实施例来详细说明本发明提供的具有构建生物大分子光亲合探针的光亲和链接体的制备方法。
参见图1,一种含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体分子的合成路线,包括以下步骤:
a)4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐与亚二硫基二乙酸在EDC·HCl的缩合下,得到含有带二硫键的羧基末端中间体;
b)2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸与乙二胺在PyBOP缩合剂的作用下,得到含有炔基的氨基末端中间体;
c)将含有炔基的氨基末端中间体与含有二硫键的羧基末端中间体在EDC·HCl的缩合下,得到带Boc保护基的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中间体;
d)将带Boc保护基的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到目标光亲和链接体。
所述步骤a)的具体操作为:
将亚二硫基二乙酸、EDC·HCl、NHS溶于无水二氯甲烷中,0℃下搅拌一段时间待体系冷却后,缓慢滴加三乙胺,反应2h后,加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐进行反应,得到含有带二硫键的羧基末端中间体粗品,经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相,柱色谱分离即得;
所述步骤b)的具体操作为:
将2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸、PyBOP溶于无水二氯甲烷中,在0℃条件下缓慢滴加三乙胺,搅拌2h后,加入乙二胺,室温反应24h后,得到含有炔基的氨基末端中间体粗品,经水洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相,柱色谱分离即得;
所述步骤c)的具体操作为:
含有氨基末端的中间体与含有二硫键的羧基末端中间体溶于适量无水二氯甲烷中,加入EDC·HCl、NHS,0℃下搅拌1h后缓慢滴加三乙胺,室温搅拌24h,得到带Boc保护基的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中间体粗品,经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相,柱色谱分离即得;
所述步骤d)的具体操作为:
将带Boc保护基的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中间体,溶于10mL无水二氯甲烷中,0℃下搅拌待体系冷却,缓慢滴加三氟乙酸,在0℃下反应1h后,室温反应24h即得含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体粗品,经饱和碳酸氢钠调节体系pH至中性,经萃取收集有机相,分别经饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥洗涤有机相,减压旋干即得目标产物。
上述含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体在构建生物大分子光亲合探针方面的应用。
实施例1
该含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中的制备过程如图1所示,
a)4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐与亚二硫基二乙酸在EDC·HCl的缩合下,得到含有带二硫键的羧基末端中间体,具体过程如下:
将亚二硫基二乙酸(0.0362g,0.1987mmol)、EDC·HCl(0.0457g,0.2384mmol)、NHS(0.0274g,0.2384mmol)溶于3mL无水二氯甲烷中,0℃下搅拌一段时间待体系冷却后,缓慢滴加三乙胺(0.0241g,0.2384mmol),反应2h后,加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐(0.05g,0.1987mmol)进行反应,得到含有带二硫键的羧基末端中间体粗品,经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相,减压蒸去溶剂,得粗品,用层析柱分离纯化粗品,使用乙酸乙酯洗脱得到目标化合物,重0.04g,收率53.1%,得到带有二硫键的羧基末端中间体;
LC-MS(ESI,m/z):380.14[M+H]+,378.10[M-H]--
b)2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸与乙二胺在pyBoP缩合剂的作用下,得到含有炔基的氨基末端中间体,具体过程如下:
将2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸(0.1g,0.4690mmol)、PyBOP(0.4881g,0.9380mmol)溶于3mL无水二氯甲烷中,在0℃条件下缓慢滴加三乙胺(0.1898g,0.9380mmol),搅拌2h后,加入乙二胺(0.0546g,0.9380mmol),室温反应24h后,得到含有炔基的氨基末端中间体粗品,经水洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相,减压蒸去溶剂,得粗品,用层析柱分离纯化粗品,使用石油醚/乙酸乙酯(V/V=1/3)洗脱得到目标化合物,重0.03g,收率22.5%,得到带有炔基的末端氨基中间体;
LC-MS(ESI,m/z):256.10[M+H]+,255.25[M-H]-
c)含有氨基末端的中间体与含有二硫键的羧基末端中间体在EDC·HCl的缩合下,得到带Boc保护基的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中间体,具体过程如下:
在0℃下,将含有二硫键的羧基末端中间体(0.04g,0.1055mmol)、EDC·HCl(0.024g,0.1266mmol)、NHS(0.015g,0.1266mmol)溶于3mL无水二氯甲烷中,搅拌1h后,缓慢滴加三乙胺(0.0131g,0.1266mmol),反应2h后,加入含有炔基的末端氨基化合物(0.03g,0.1055mmol),室温反应24h,得到含有炔基的氨基末端中间体粗品,经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相,减压蒸去溶剂,得粗品,用层析柱分离纯化粗品,使用石油醚/乙酸乙酯(V/V=10/1)洗脱得到目标化合物,重0.03g,收率46.1%,到带有Boc保护基的光亲和链接体中间体;
LC-MS(ESI,m/z):617.10[M+H]+,615.80[M-H]--
d)将带Boc保护基的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到目标光亲和链接体,具体过程如下:
将带Boc保护基的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中间体(0.03g,0.0487mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中,0℃下搅拌待体系冷却,缓慢滴加三氟乙酸(3mL),在0℃下反应1h后,室温反应24h即得含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体粗品,经饱和碳酸氢钠调节体系pH至中性,经二氯甲烷萃取收集有机相,有机相分别经饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥洗涤有机相,减减压蒸去溶剂,得到目标化合物,重0.02g,收率79.6%。
LC-MS(ESI,m/z):517.13[M+H]+,515.30[M-H]-
含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体在光亲和标记技术方面的应用,具体如下:
利用该可释放光亲和链接体化学修饰VEGF细胞因子,构建了VEGF光亲和探针分子,并且利用所构建的VEGF光亲合探针分子对一些高表达VEGFR受体的细胞进行示踪定位成像分析。
VEGF细胞因子光亲合探针的构建:(1)配制I液:VEGF细胞因子溶于1mL三蒸水中,4℃保存2h;(2)配制II液:将光亲和链接体、EDC、NHS溶于1mL三蒸水中。4℃活化2h;将II液缓慢加入I液中,4℃反应24h后,4℃下透化24h,冷冻干燥即得VEGF光亲和探针分子。
含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体在细胞原位荧光瞬时示踪标记方面的应用,具体如下。
利用上述设计合成的VEGF光亲合探针分子对EA.hy926细胞进行成像分子。
具体细胞成像步骤:
1.细胞种板:每孔细胞密度为4.3*105细胞/ml,37℃孵育过夜
2.细胞给药:每孔探针浓度为1ug/ml,37℃孵育2h;
3.洗涤:利用PBS洗涤三次细胞,除去过量探针分子;
4.光交联及细胞固定:洗涤完成后,将细胞置于距离紫外等3cm下的冰盘中紫外照射30min,光交联完成后,在室温下,在细胞中加入1ml 3.7%多聚甲醛(925ul 4%多聚甲醛+75ul PBS),固定30分钟,用PBS洗涤两次(轻微搅拌1-2分钟),并在室温下用含有0.1%Triton X-100的PBS溶液透化10分钟。然后用PBS将细胞洗涤两次,缓慢搅拌1分钟,在室温下,用含2%BSA的PBS(含0.05%Tween-20)封闭30分钟,并用PBS(含0.05%Tween-20)洗涤两次。每次5分钟,轻轻晃动。
5.点击成像:
5.1各孔中,分别按顺序添加以下试剂:82.5ul PBS,5ul Cy3-N3(0.8mmol DMSO溶液),5.8ul TCEP(170mmol水溶液,新鲜制备)和6.7ul TBTA(15mmol),震荡混合。
5.2加入10ul CuSO4·5H2O(0.1mol水溶液)开始反应。在室温下,避光孵育60分钟。
5.3向一组中加入还原剂DTT,另一组不加还原剂,室温反应1h
5.4PBS洗涤细胞3次,每次5分钟。
6.DAPI复染
各孔中均加入10ul 1ug/ml DAPI,染色10min,PBS洗涤3次,20min/次
7.封片:在各组加入5ul抗荧光淬灭封片剂,周围加指甲油封片。
8.荧光显微镜进行检测
细胞成像结果如图2所示:探针浓度为1μg/ml,探针与Cy3的物质的量比例为1:5。
从图2可以看出,未添加还原剂时,细胞的状态比较差,加入还原剂后,释放外来引入的蛋白分子后,细胞的状态较好,说明本发明的引用可释放基团后对细胞进行成像分析时,对细胞正常生命活动影响较小。
在临床诊断方面,可以利用设计合成的可降解光亲和链接体对与疾病标记物分子相互作用的分子进行化学修饰构建探针分子,进而通过生物正交反应对疾病标记物发进行示踪后再通过触发释放外源分子,在不影响正常机体生理活动的基础上实现对疾病的诊疗。
Claims (10)
1.一种含有二硫键的光亲和链接体,其特征在于,其结构式如下:
2.一种含有二硫键的光亲和链接体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
a)4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐与亚二硫基二乙酸在EDC·HCl的缩合下,得到带有二硫键的羧基末端中间体;
b)2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸与乙二胺在PyBoP缩合剂的作用下,得到带有氨基末端中间体;
c)含有氨基末端的中间体与带有二硫键的羧基末端中间体在EDC·HCl的缩合下,得到带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体;
d)将带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到目标光亲和链接体,其结构如下:
3.根据权利要求2所述的一种含有二硫键的光亲和链接体的制备方法,其特征在于,步骤a)的具体过程为:将亚二硫基二乙酸、EDC·HCl、NHS溶于无水二氯甲烷中,0℃下搅拌均匀后,滴加三乙胺,反应2h后,加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐进行反应,得到含有带二硫键的羧基末端中间体。
4.根据权利要求3所述的一种含有二硫键的光亲和链接体的制备方法,其特征在于,所述步骤a)的具体过程为:将亚二硫基二乙酸0.1987mmol、EDC·HCl 0.2384mmol、NHS0.2384mmol溶于无水二氯甲烷中,0℃下搅拌均匀后,滴加三乙胺0.2384mmol,反应2h后,加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐0.1987mmol,进行反应24h,得到带有二硫键的羧基末端中间体。
5.根据权利要求2所述的一种含有二硫键的光亲和链接体的制备方法,其特征在于,步骤b)的具体过程为:2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸、PyBOP溶于无水二氯甲烷中,在0℃条件下滴加三乙胺,搅拌2h后,加入乙二胺,室温反应24h后,得到含有炔基的氨基末端中间体。
6.根据权利要求5所述的一种含有二硫键的光亲和链接体的制备方法,其特征在于,所述步骤b)的具体过程为:将2-(叔丁基氧基)-4-戊炔酸0.4690mmol、PyBOP 0.9380mmol溶于无水二氯甲烷中,在0℃条件下滴加三乙胺1.8759mmol,搅拌2h后,加入乙二胺0.9380mmol,室温反应24h后,得到含有炔基的氨基末端中间体;
步骤c)的具体过程为,将含有炔基的氨基末端中间体与带有二硫键的羧基末端中间体溶于无水二氯甲烷中,加入EDC·HCl、NHS,0℃下搅拌1h后滴加三乙胺,室温搅拌24h,得到带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体。
7.根据权利要求6所述的一种含有二硫键的光亲和链接体的制备方法,其特征在于,所述步骤c)的具体过程为,在0℃下,将含有二硫键的羧基末端中间体0.1055mmol、EDC·HCl0.1266mmol、NHS 0.1266mmol溶于无水二氯甲烷中,0℃下搅拌1h后滴加三乙胺0.1266mmol,反应2h后,加入含有炔基的氨基末端中间体0.1055mmol,室温搅拌24h,得到带Boc保护基的含有二硫键的光亲和链接体中间体。
8.根据权利要求6所述的一种含有二硫键的光亲和链接体的制备方法,其特征在于,所述步骤d)的具体过程为,将带Boc保护基的含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体中间体0.0114mmol,溶于10mL无水二氯甲烷中,0℃下搅拌均匀后,滴加三氟乙酸2mL,在0℃下反应1h后,室温反应24h,得到含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体。
9.一种如权利要求2-8中任意一项方法制备的基于含有二硫键的光亲和链接体在光亲和标记技术方面的应用。
10.一种如权利要求2-8中任意一项方法制备的含有二硫键的光亲和链接体在细胞原位荧光瞬时示踪标记方面的应用。
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