CN114560819B - 取代三嗪化合物、其制备方法及在氨基酸、肽、蛋白、细胞标记中的应用 - Google Patents

取代三嗪化合物、其制备方法及在氨基酸、肽、蛋白、细胞标记中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种取代三嗪化合物及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明提供的取代三嗪衍生物，具有如式(I)所示结构式：本发明提供的取代三嗪衍生物可有效应用于肽、蛋白和细胞的标记作用方面，质谱和HPLC检测结果表明，部分取代三嗪化合物可以很好的与氨基酸、肽、蛋白和细胞结合，具有很好地生物开发前景，可用于对肽、蛋白和细胞的标记试剂。

Description

取代三嗪化合物、其制备方法及在氨基酸、肽、蛋白、细胞标记 中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种取代三嗪化合物、其制备方法及在氨基酸、肽、蛋白、细胞标记中的应用。
背景技术
针对含有特定的氨基酸的肽或蛋白质进行选择性的标记，这引起了研究者对蛋白质与生物结合和共价药物开发的广泛关注。在天然多肽与蛋白质中，酪氨酸占20种氨基酸的3.3％。酪氨酸在生理条件下的pKa为10，其修饰通常不改变蛋白质的离子状态和稳定性，这与赖氨酸和半胱氨酸修饰不同。因此，对含有酪氨酸的多肽或蛋白进行标记、修饰，对药物的研究与开发具有重要的价值与意义。
三嗪衍生物的母体结构是带有3个活泼氯原子和2个活泼氯原子的稳定的六元环，氯原子能够被-OH、-NH2、-SH、-NHR等官能团取代，从而生成不同的衍生物，广泛应用于各个领域。三嗪环衍生物(如DMTMM)是一种高效的缩合试剂，能够与羧基形成活性酯，从而实现酰胺键的缩合。
我们发现三嗪衍生物能够与肽和蛋白上的羧基和酪氨酸的酚羟基发生反应，从而实现对肽和蛋白的标记。由于细胞膜上含有多种蛋白，三嗪衍生物也能对细胞膜进行标记，实现对细胞的定位及功能检测等作用。三嗪衍生物的检测主要是针对酪氨酸酚羟基发生亲电加成反应，从而实现对肽、蛋白和细胞的标记及检测作用，具有检测速度快、时间短、灵敏度高、样品用量少、检测方便等特点。
发明内容
本发明提供了一种取代三嗪化合物、其制备方法及在氨基酸、肽、蛋白、细胞标记中的应用，所得取代三嗪化合物可以很好的与酪氨酸、含有酪氨酸的肽、含有酪氨酸的蛋白以及细胞结合，具有很好地生物开发前景，可用于对肽、蛋白和细胞的标记试剂。
为了达到上述目的，本发明提供了一种取代三嗪衍生物，具有如式(I) 所示结构式：
其中，R1选自Cl、Br、I、吗啉、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、 N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、1-氮杂二环[2.2.2]辛烷、N-甲基吡咯烷、三甲胺、N,N-二甲基乙胺、N,N-二乙基甲胺、三乙胺、N,N-二甲基苯胺、1-甲基咪唑或吡啶及其取代衍生物中的任意一种及其盐；
X2和X3选自O、S或NH，X2和X3相同或不同；
R2、R3选自碳原子数为1-10的烷基炔、苯基、卤素取代苯基、甲基取代苯基、碳原子数为1-5的烷基、异丙基、硝基取代的苯基、硝基取代的吡啶基、吡咯取代基和原子数为1-10的烷基叠氮中的任意一种，R2和R3相同或不同。
作为优选，选自下述编号的化合物，具体为：
本发明还提供了一种根据上述任一技术方案所述的取代三嗪衍生物的制备方法，包括以下步骤：
以2,4,6-三卤素-1,3,5-三嗪化合物为起始原料，与含不同氨基、羟基或巯基取代基的化合物在有机碱和有机溶剂的作用下经取代反应得中间体1，然后进一步与含不同氨基、羟基或巯基取代基的化合物在无机碱和有机溶剂的作用下通过取代反应得到中间体2，然后再通过与相应的含氮叔胺化合物在四氢呋喃中反应得到取代三嗪衍生物及其盐。
上述制备方法中，中间体2可以选自以下化合物：
还可以理解的是，在最后得到取代三嗪衍生物的步骤中，反应时间可以为25-40min，本领域技术人员可根据实际反应情况进行选择，例如30、35min 等。
作为优选，所述含不同氨基、羟基或巯基取代基的化合物中的化合物选自碳原子数为1-5的烷基、苯基、萘基、卤素取代苯基、苯乙烯基、甲基取代苯基、碳原子数为1-10的烷基炔和碳原子数为1-10的烷基叠氮中的任意一种。可以理解的是，碳原子数为1-5的烷基中碳原子数可以为1、2、3、4、5；碳原子数为1-10的烷基炔中碳原子数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；碳原子数为1-10的烷基叠氮中碳原子数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
作为优选，在中间体1的反应步骤中，所加入的含不同氨基、羟基或巯基取代基的化合物与有机碱的摩尔比为1：(1-2)。可以理解的是，该摩尔比可以为1:1、1:1.5、1:2或上述范围内的任意比值；作为优选，在中间体2 的反应步骤中，所加入的含不同氨基、羟基或巯基取代基的化合物与无机碱的摩尔比为1：(3-4)。可以理解的是，该摩尔比可以为1:3、1:3.5、1:4或上述范围内的任意比值。可以理解的是，所述有机碱选自N,N-二异丙基乙基胺、三乙胺、4-二甲基吡啶和吡啶中的至少一种，所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、乙醇钠中的至少一种，所述有机溶剂选自四氢呋喃、二氧六环和乙醇中的至少一种。
本发明还提供了一种根据上述任一技术方案所述的取代三嗪化合物在氨基酸、肽、蛋白、细胞标记中的应用。
作为优选，所述肽为包含所述酪氨酸的肽，所述蛋白为含有酪氨酸的蛋白，所述活细胞为活HeLa细胞。
作为优选，所述蛋白为KRas蛋白，所述活细胞为活A549细胞。
本发明还提供了一种酪氨酸特异性标记剂，以权利要求1-5任一项所述的取代三嗪化合物中的至少一种化合物为主要活性成分，尤其是以化合物4 4- (4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐为主要活性成分。
本发明还提供了一种多肽MP_Y特异性标记剂，所述多肽MP_Y为 (NH2-NSTKNLTFAMRSSGDYGEV-CONH2)，以化合物4 4-(4,6-双(3- 炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐、化合物16 1-(4,6- 双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐、化合物48 4-(4- 甲氧基-6-(对硝基苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐、化合物58 4-(4-甲氧基-6-((3-硝基吡啶-2-基)氨基)-1,3,5- 三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐、化合物59 1-(4-甲氧基-6-((2- 硝基吡啶-3-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐、化合物 62 1-(4-甲氧基-6-(对甲苯基硫基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐、化合物63 4-(4-(苄基硫基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 甲基吗啉-4-胺盐酸盐和化合物64 1-(4-(苄基硫基)-6-甲氧基-1,3,5- 三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐为主要活性成分。
本发明还提供了一种KRas蛋白标记剂，以化合物16 1-(4,6-双(3-炔基 -1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐为主要活性成分。
本发明还提供了一种活细胞标记剂，以化合物4 4-(4,6-双(3-炔基-1- 氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐或16 1-(4,6-双(3-炔基-1- 氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐中的至少一种为主要活性成分。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明提供了一种新的取代三嗪化合物，该化合物由2,4,6-三卤素 -1,3,5-三嗪化合物与含羟基、氨基、巯基的取代化合物反应，改变三嗪环的电子效应和紫外及荧光吸收，同时与N-甲基吗啉反应成盐，增加其水溶性，实现对含有羧基、酚羟基的氨基酸的选择性标记；
2、本发明提供了一种取代三嗪化合物在肽、蛋白和细胞的标记作用方面的应用，质谱和HPLC检测结果表明，部分取代三嗪化合物可以很好的与氨基酸、肽、蛋白和细胞结合，具有很好地生物开发前景，可用于对肽、蛋白和细胞的标记试剂。
附图说明
图1为本发明实施例11提供的化合物4与三肽MP_SYS于水中反应后所得产物的1H-NMR检测对照图，其中，上为反应产物MP_SYS_1的1H-NMR,下为MP_SYS的1H-NMR；
图2为本发明实施例12提供的化合物4与MP_Y反应产物MP_Y_1 的UPLC检测图谱，其中，a)为化合物4和MP_Y_1的LC-MS检测图谱，反应时间为1h；b)为化合物MP_Y_1的MS数据；
图3为本发明实施例13提供的化合物16与GST-KRas蛋白反应，其中a)为KRas蛋白序列；b)为反应液LC-MS分析数据；c)为化合物16标记的氨基酸残基比例；
图4为本发明实施例14提供的蛋白组学分析探究化合物16对酪氨酸的化学选择性；
图5为本发明实施例15提供的化合物4对活细胞的生物兼容性，其中，a)为HeLa细胞在不同浓度的化合物4标记过程中的流式分析数据；b)为化合物4对HeLa细胞的活细胞成像研究；
图6为本发明实施例16提供的化合物16对于A549肿瘤细胞具有良好的生物兼容性，显示了其在肿瘤细胞酪氨酸标记中的应用潜力。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1结构式(I)中X2和X3为O，R2＝R3为烷基炔取代的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备：
化合物1：2,4-双(3-炔基-1-氧基)-6-氯-1,3,5-三嗪的制备
于50mL圆底烧瓶中加入2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪化合物(500mg, 2.7mmol)、3-丁炔-1-醇(0.37g,2.7mmol)和2mL四氢呋喃，搅拌状态下加入N,N-二异丙基乙胺(419mg,3.24mmol)，室温搅拌反应1h，再加入3-丁炔-1-醇(0.37g,2.7mmol)和碳酸钾(1.3g,9.5mmol)，于50℃水浴中搅拌反应3h。经TLC检测，反应完全。用乙酸乙酯和水萃取两遍，有机相用饱和食盐水洗涤一遍，用无水硫酸钠干燥。经硅胶柱层析分离得到产物2,4-双(3-炔基-1-氧基)-6- 氯-1,3,5-三嗪320mg，收率为47.1％。MS(ESI):m/z,252.0[M+H]+.1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.54(dt,J＝13.9,7.0Hz,4H),2.72(ddt,J＝9.6,7.1,3.7Hz,4H),2.04(dt,J＝5.1,2.6Hz,2H).
将化合物1的合成步骤中的2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪化合物用 2,4,6-三溴-1,3,5-三嗪或2,4,6-三碘-1,3,5-三嗪替换，N,N-二异丙基乙胺用吡啶替换，碳酸钾用碳酸氢钠替换，其它方法相同，可得化合物2 (2,4-双(3-炔基-1-氧基)-6-溴-1,3,5-三嗪)和化合物3(2,4-双(3- 炔基-1-氧基)-6-碘-1,3,5-三嗪)。
化合物4：4-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 甲基吗啉-4-胺盐酸盐的制备
于50mL的反应瓶中加入2,4-双(3-炔基-1-氧基)-6-氯-1,3,5- 三嗪(100mg,0.4mmol)和2mL四氢呋喃搅拌溶解，在搅拌状态下缓慢滴加入N-甲基吗啉(74mg,0.8mmol)，于室温搅拌反应30 min，有白色固体析出。过滤，固体用THF冲洗两遍，干燥，得到 4-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐110mg，收率为87.3％。MS(ESI):m/z,318.2[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ4.67(t,J＝6.5Hz,4H),4.59–4.54(m,2H), 4.10(d,J＝11.0Hz,2H),3.90(h,J＝10.4Hz,4H),3.56(s,3H),2.78 (td,J＝6.5,2.6Hz,4H),2.43(t,J＝2.6Hz,2H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ79.09,70.29,67.89,61.81,60.04,18.07。
将化合物4合成步骤中的N-甲基吗啉用吗啉、N-甲基哌啶、 N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、1-氮杂二环[2.2.2]辛烷、N-甲基吡咯烷、三甲胺、N,N-二甲基乙胺、N,N-二乙基甲胺、三乙胺、N,N-二甲基苯胺、1-甲基咪唑、4-二甲氨基吡啶或吡啶及其取代衍生物替代，实验操作相同，可得到上述取代三嗪化合物的季铵盐盐酸盐5-9， 11-23和三嗪化合物的季铵盐三氟甲磺酸盐10。
化合物5：4-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 吗啉-4-胺盐酸盐：收率85％。MS(ESI):m/z,303.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ4.11(t,J＝7.5Hz,2H),3.85–3.76(m,4H), 2.45(td,J＝7.5,3.1Hz,2H),2.10(t,J＝3.0Hz,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ172.04,80.88,70.65,66.20,64.18,45.86,19.63。
化合物6：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1- 甲基哌啶-1-胺盐酸盐：收率57％。MS(ESI):m/z,316.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.46(dt,J＝12.5,3.2Hz,1H),4.11 (dd,J＝11.8,3.2Hz,1H),4.11(s,1H),3.95–3.85(m,1H),3.30(s,2H),2.45(h,J＝3.1Hz,2H),2.09(t,J＝3.0Hz,1H),1.72(ddt,J＝ 9.1,5.8,3.3Hz,2H),1.53(q,J＝6.1Hz,1H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ172.83,80.88,70.65,64.18,50.96,40.55,23.95,23.52, 19.63。
化合物7：4-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 乙基吗啉-4-胺盐酸盐：收率47.2％。MS(ESI):m/z,332.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.57–4.47(m,1H),4.33(tdt,J＝ 11.9,4.2,1.8Hz,2H),4.29–4.20(m,1H),4.11(t,J＝4.4Hz,2H),3.28(q,J＝8.0Hz,1H),2.45(td,J＝4.4,2.9Hz,2H),2.32(t,J＝2.9Hz,1H),1.28(t,J＝8.0Hz,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ 172.91,80.88,70.65,66.36,64.18,52.34,47.21,19.63,8.53。
化合物8：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1- 乙基哌啶-1-胺盐酸盐：收率48.1％。MS(ESI):m/z,330.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.52(td,J＝12.4,3.0Hz,1H),4.11 (dd,J＝12.0,3.0Hz,1H),4.11(s,1H),4.00–3.93(m,1H),3.28(q,J＝8.0Hz,1H),2.49–2.41(m,2H),2.09(t,J＝2.9Hz,1H),1.89– 1.70(m,2H),1.53(qd,J＝5.7,2.6Hz,1H),1.23(t,J＝8.0Hz,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ172.91,80.88,70.65,64.18,52.34, 49.03,23.95,23.44,19.63,8.53。
化合物9：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1-1- 氮杂二环[2.2.2]辛烷-1-胺盐酸盐：收率34.6％。MS(ESI):m/z,328.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.11(dd,J＝11.8,3.2Hz, 1H),4.11(s,1H),3.79(dt,J＝12.5,7.1Hz,2H),3.53(dt,J＝12.4,7.0 Hz,2H),2.49–2.41(m,2H),2.12(t,J＝2.9Hz,1H),1.75(dq,J＝13.9,7.1Hz,2H),1.60–1.44(m,1H),1.47–1.38(m,1H).13C NMR (101MHz,Methanol-d4)δ170.81,165.20,80.88,70.65,64.18,38.98, 28.07,24.06,19.63。
化合物10：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1- 甲基吡咯烷-1-胺三氟甲磺酸盐的制备：
于50mL的反应瓶中加入2,4-双(3-炔基-1-氧基)-6-氯-1,3,5- 三嗪(100mg,0.4mmol)，加入2mL四氢呋喃搅拌溶解，在搅拌状态下加入三氟甲磺酸钠(69mg,0.4mmol)缓慢滴加入N-甲基吡咯烷(68mg,0.8mmol)，于室温搅拌反应30min，有白色固体析出。反应完全，过滤，固体用THF冲洗两遍，干燥，得到1-(4,6- 双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1-甲基吡咯烷-1-胺三氟甲磺酸盐100mg，收率45.2％。MS(ESI):m/z,301.2[M+H]+；1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ4.31(dddd,J＝12.2,9.7,4.0,2.3Hz,1H),4.28– 4.18(m,1H),4.11(dd,J＝12.0,3.1Hz,1H),4.11(s,1H),3.25(s,2H), 2.49–2.41(m,2H),2.07(t,J＝2.9Hz,1H),1.91(dddd,J＝15.2,9.9,5.1,3.5Hz,1H),1.85–1.71(m,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4) δ173.63,80.88,70.65,64.18,58.90,46.35,21.84,19.63。
化合物11：4,6-双(3-炔基-1-氧基)-N,N,N-三甲基-1,3,5-三嗪-2-胺盐酸盐：收率32.1％。MS(ESI):m/z,276.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)1H NMRδ4.11(t,J＝7.5Hz,2H),3.38(s, 5H),2.45(td,J＝7.5,3.1Hz,2H),2.10(t,J＝3.0Hz,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ172.11,169.61,80.88,70.65,64.18,49.54, 19.63。
化合物12：4,6-双(3-炔基-1-氧基)-N-乙基-N,N-二甲基-1,3,5- 三嗪-2-胺盐酸盐：收率43.2％。MS(ESI):m/z,290.2[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ4.11(t,J＝4.4Hz,2H),3.36(s,3H),3.28 (q,J＝8.0Hz,1H),2.45(td,J＝4.3,2.9Hz,2H),2.08(t,J＝3.0Hz,1H),1.29(t,J＝8.0Hz,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ 173.02,165.84,80.88,70.65,64.18,55.66,43.63,19.63,10.49。
化合物13：4,6-双(3-炔基-1-氧基)-N,N-二乙基-N-甲基-1,3,5- 三嗪-2-胺盐酸盐：收率25.3％。MS(ESI):m/z,304.2[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ4.39(td, J＝7.0,5.2Hz,2H),3.40(s,2H),3.28(q,J＝8.0Hz,2H),2.47(tdd,J ＝6.9,5.8,2.9Hz,2H),2.11(t,J＝2.9Hz,1H),1.27(t,J＝8.0Hz, 3H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ174.47,80.88,70.65,64.18, 54.08,41.46,19.63,10.57。
化合物14：4,6-双(3-炔基-1-氧基)-N,N,N-三乙基-1,3,5-三嗪-2-胺盐酸盐：收率32.4％。MS(ESI):m/z,318.2[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ4.11(t,J＝4.3Hz,2H),3.28(q,J＝8.0Hz, 3H),2.45(td,J＝4.2,2.9Hz,2H),2.08(t,J＝2.9Hz,1H),1.37(t,J＝ 8.0Hz,5H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ174.31,167.11, 80.88,70.65,64.18,51.01,19.63,8.53。
化合物15：4,6-双(3-炔基-1-氧基)-N,N-二甲基-N-苯基-1,3,5- 三嗪-2-胺盐酸盐：收率36.2％。MS(ESI):m/z,338.2[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ7.62–7.56(m,1H),7.52–7.39(m,2H), 4.11(dd,J＝12.0,3.0Hz,1H),4.11(s,1H),3.38(s,3H),2.49–2.41(m,2H),2.09(t,J＝3.0Hz,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ 173.75,164.30,142.01,130.05,124.24,119.42,80.88,70.65,64.18, 52.55,19.63。
化合物16：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐：收率为70％。MS(ESI):m/z,296.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ10.19–10.08(m,2H),9.09–8.98(m,1H), 8.44–8.36(m,2H),4.76(t,J＝6.5Hz,4H),2.83(td,J＝6.5,2.6Hz,4H),2.43(t,J＝2.6Hz,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ 172.49,158.24,146.41,143.37,129.77,80.88,70.65,64.18,19.63。
化合物17：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 甲基吡啶-1-胺盐酸盐：收率为56％。MS(ESI):m/z,310.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ9.02–8.96(m,1H),7.98–7.92(m, 1H),4.11(dd,J＝11.8,3.2Hz,1H),4.11(s,1H),2.53(s,2H),2.49–2.41(m,2H),2.11(t,J＝2.9Hz,1H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ172.49,161.15,158.24,141.53,130.25,80.88,70.65, 64.18,22.00,19.63。
化合物18：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-3- 甲基吡啶-1-胺盐酸盐：收率为45.6％。MS(ESI):m/z,310.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.99(dd,J＝7.6,1.5Hz,1H),8.87 (d,J＝1.5Hz,1H),8.32(t,J＝7.5Hz,1H),7.27(dt,J＝7.5,1.5Hz, 1H),4.11(dd,J＝11.8,3.2Hz,2H),4.11(s,2H),2.56(s,3H),2.49–2.41(m,4H),2.11(t,J＝3.0Hz,2H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ172.16,158.11,147.23,143.12,142.40,140.16,129.67, 80.88,70.65,64.18,19.63,18.08。
化合物19：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-3， 5-二甲基吡啶-1-胺盐酸盐：收率为60％。MS(ESI):m/z,324.1 [M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.87(d,J＝1.5Hz,1H), 4.11(t,J＝4.3Hz,2H),2.57(s,3H),2.45(td,J＝4.2,2.9Hz,2H),2.09(t,J＝3.0Hz,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ172.15, 142.37,142.25,136.50,80.88,70.65,64.18,19.63,18.52。
化合物20：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 甲氧基吡啶-1-胺盐酸盐：收率为54.3％。MS(ESI):m/z,326.1 [M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ9.08–9.02(m,1H),7.72 –7.67(m,1H),4.11(dd,J＝11.8,3.2Hz,1H),4.11(s,1H),3.81(s,2H),2.49–2.41(m,2H),2.05(t,J＝2.9Hz,1H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ172.49,162.28,158.24,141.47,114.12,80.88,70.65, 64.18,56.06,19.63。
化合物21：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 氯吡啶-1-胺盐酸盐：收率为46％。MS(ESI):m/z,330.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ9.30(d,J＝1.5Hz,1H),9.08(dd,J＝ 7.5,1.5Hz,1H),8.60(t,J＝7.5Hz,1H),7.46(dt,J＝7.5,1.5Hz,1H), 4.11(t,J＝4.3Hz,4H),2.45(td,J＝4.2,2.9Hz,4H),2.10(t,J＝3.0 Hz,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ172.16,158.11,146.71, 141.98,137.69,133.49,127.25,80.88,70.65,64.18,19.63。
化合物22：4,6-双(3-炔基-1-氧基)-N,N-二甲基-N-(吡啶-4- 基)-1,3,5-三嗪-2-胺盐酸盐：收率为56.1％。MS(ESI):m/z,339.2 [M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.56(d,J＝5.0Hz,1H), 7.64(d,J＝5.0Hz,1H),4.11(t,J＝4.4Hz,2H),3.39(s,3H),2.45(td, J＝4.3,3.0Hz,2H),2.00(t,J＝3.0Hz,1H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ173.75,164.30,152.25,145.05,110.46,80.88,70.65, 64.18,52.55,19.63。
化合物23：1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1- 甲基-1H-咪唑-1-胺盐酸盐：收率为50％。MS(ESI):m/z,299.1 [M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.19(s,1H),7.43(s,2H), 4.77(dt,J＝12.4,2.4Hz,2H),4.67(ddd,J＝12.3,10.1,2.1Hz,2H),3.83(s,3H),2.54–2.44(m,3H),2.48–2.41(m,1H),2.09(t,J＝3.0 Hz,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ173.40,157.61,140.10, 131.79,126.94,80.88,70.65,64.18,39.45,19.63。
上述取代三嗪化合物(4-23)的季铵盐盐酸盐当与三氟甲磺酸、硫酸、高氯酸或对甲基苯磺酸反应，得到对应上述取代三嗪化合物的季铵盐的三氟甲磺酸、硫酸、高氯酸或对甲基苯磺酸的盐。
实施例2结构式(I)中X2和X3为O，R2＝R3为间甲苯基取代的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备：
化合物24：2-氯-4,6-双(间甲苯氧基)-1,3,5-三嗪的制备
于反应瓶中加入2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪化合物(100mg,0.54mmol) 和4mL四氢呋喃完全溶解，0℃冰浴中搅拌。将间甲苯酚(59mg,0.54mmol)和三乙胺(81mg,0.81mmol)溶于4mL二氧六环中，缓慢滴加到上述反应液中(约30min滴加完成)，0℃搅拌反应1h。再补加间甲苯酚(59mg,0.54mmol)和乙醇钠(128.52mg，1.89 mmol)，室温搅拌反应2h。TLC检测反应完全，用乙酸乙酯和水萃取两遍，有机相用饱和食盐水洗涤一遍，用无水硫酸钠干燥。经柱层析分离得2-氯-4,6-双(间甲苯氧基)-1,3,5-三嗪141mg，收率为80％。MS(ESI):m/z,328.1[M+H]+；1H NMR(400MHz, Chloroform-d)δ7.22(t,J＝7.4Hz,1H),7.05(dt,J＝7.5,2.0Hz,1H), 6.93(dq,J＝6.9,1.5Hz,1H),6.88(q,J＝1.9Hz,1H),2.35(d,J＝1.3 Hz,3H)。
按照化合物4的合成步骤将2,4-双(3-炔基-1-氧基)-6-氯-1,3,5- 三嗪用2-氯-4,6-双(间甲苯氧基)-1,3,5-三嗪替代，实验步骤相同，合成了N-甲基吗啉、吡啶和4-N,N-二甲基吡啶的季铵盐盐酸盐，可得化合物25-27。
化合物25：4-(4,6-双(对甲苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率39％。MS(ESI):m/z,394.2[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ7.33(t,J＝7.9Hz,2H),7.15(d,J＝7.6Hz, 2H),7.10–7.02(m,4H),4.38(d,J＝10.1Hz,2H),4.05(dd,J＝9.6,2.9Hz,2H),3.89(d,J＝9.9Hz,4H),3.55(s,3H),2.37(s,6H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ170.61,152.77,139.18,129.48, 125.54,121.77,118.28,66.27,49.68,40.55,21.50。
化合物26：1-(4,6-双(对甲苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1- 胺盐酸盐：收率60％。MS(ESI):m/z,372.1[M+H]+；1H NMR(400MHz, Methanol-d4)δ9.96–9.92(m,2H),9.02(tt,J＝7.7,1.4Hz,1H),8.41 –8.36(m,2H),7.35(t,J＝7.8Hz,2H),7.18(d,J＝7.6Hz,2H),7.11–7.05(m,4H),2.38(s,6H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ 168.27,156.65,152.77,146.41,143.37,139.18,129.77,129.48,125.54,121.77,118.28,21.50。
化合物27：4,6-双(对甲苯氧基)-N,N-二甲基-N-(吡啶-4-基) -1,3,5-三嗪-2-胺盐酸盐：收率50％。MS(ESI):m/z,415,2[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.63(d,J＝5.1Hz,1H),7.57(d,J ＝5.1Hz,1H),7.19(t,J＝7.4Hz,1H),6.98–6.90(m,3H),3.25(s,3H),2.35(d,J＝1.9Hz,1H),2.35(s,2H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ169.90,152.77,152.25,139.18,129.48,125.54,121.77, 118.28,110.46,52.55,21.50。
实施例3结构式(I)中X2和X3为NH，R2＝R3为烷基炔取代的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备：将化合物1中3-丁炔-1-醇用 3-丁炔-1-胺替代，N,N-二异丙基乙胺用4-二甲氨基吡啶(DMAP)替换，碳酸钾用碳酸钠替换，按照化合物4的合成步骤，合成N-甲基吗啉和吡啶的季铵盐盐酸盐，可得化合物28-30。
化合物28：2,4-双(3-炔基-1-氨基)-6-溴-1,3,5-三嗪：收率44.2％。 MS(ESI):m/z,250.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ 4.96(s,1H),3.49(dd,J＝12.6,2.5Hz,1H),3.49(s,1H),2.30–2.22(m,2H),1.98(t,J＝2.9Hz,1H)。
化合物29：4-(4,6-双(3-炔基-1-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为87.3％。MS(ESI):m/z,316.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.96(s,1H),4.48–4.39(m,1H), 4.40–4.31(m,2H),4.24–4.14(m,1H),3.49(t,J＝7.6Hz,2H),3.23(s,2H),2.26(td,J＝7.5,3.0Hz,2H),2.02(t,J＝2.9Hz,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ164.22,82.48,82.20,66.27,49.68, 40.55,38.07,18.91。
化合物30：1-(4,6-双(3-炔基-1-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐：收率为56％。MS(ESI):m/z,294.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ9.02(dt,J＝6.9,1.5Hz,1H),8.45–8.37 (m,1H),4.96(s,1H),3.49(s,1H),3.49(dd,J＝12.5,2.7Hz,1H),2.30–2.22(m,2H),1.93(t,J＝3.0Hz,1H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ165.77,156.63,146.41,143.37,129.77,82.48,82.20, 38.07,18.91。
实施例4结构式(I)中X2和X3为NH，R2＝R3为取代苯基的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备：将化合物24中的合成步骤中的间甲苯酚用苯胺或间溴苯胺替代，按照化合物4的合成步骤，合成 N-甲基吗啉和吡啶的季铵盐盐酸盐，可得化合物31-34。
化合物31：4-(4,6-双(苯基氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为67％。MS(ESI):m/z,364.2[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ7.77–7.71(m,2H),7.30(t,J＝7.4Hz,2H), 7.03(tt,J＝7.5,2.0Hz,1H),5.29(s,1H),4.70–4.55(m,2H),4.32 (dddd,J＝11.5,6.9,5.1,1.7Hz,1H),4.07–3.98(m,1H),3.39(s,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ165.11,138.26,128.62,123.53, 122.13,66.27,49.68,40.55。
化合物32：1-(4,6-双(苯基氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1- 胺盐酸盐：收率为67％。MS(ESI):m/z,342.1[M+H]+；1H NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ9.14–9.09(m,1H),8.45–8.37(m,1H),7.77– 7.71(m,2H),7.30(t,J＝7.4Hz,2H),7.03(tt,J＝7.5,2.0Hz,1H),5.24(s,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ162.58,156.15, 146.41,143.37,138.26,129.77,128.62,123.53,122.13。
化合物33：4-(4,6-双((3-溴苯基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基) -4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为52.4％。MS(ESI):m/z,522.0 [M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.53(dt,J＝7.5,2.0Hz, 1H),7.28(dt,J＝7.5,2.0Hz,1H),7.12(t,J＝7.4Hz,1H),6.85(t,J＝2.0Hz,1H),5.32(s,1H),4.70–4.62(m,2H),4.45(td,J＝11.4,2.0Hz,1H),3.84(ddd,J＝12.4,11.3,2.5Hz,1H),3.38(s,2H).13C NMR (101MHz,Methanol-d4)δ165.11,160.82,142.00,130.44,126.67, 123.13,122.31,120.38,66.27,49.68,40.55。
化合物34：1-(4,6-双((3-溴苯基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基) 吡啶-1-胺盐酸盐：收率为45％。MS(ESI):m/z,499.9[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ9.12(dt,J＝6.9,1.5Hz,2H),8.45–8.37 (m,2H),8.08(tt,J＝7.5,1.7Hz,1H),7.53(dt,J＝7.5,2.0Hz,2H),7.32(dt,J＝7.5,2.0Hz,2H),7.17(t,J＝7.4Hz,2H),6.85(t,J＝2.1 Hz,2H),5.32(s,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ162.58, 156.15,146.41,143.37,142.00,130.44,129.77,126.67,123.13, 122.31,120.38。
实施例5结构式(I)中X2和X3为S，R2＝R3为取代苯基的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备：将化合物1中3-丁炔-1-醇用对甲基苯巯酚替代，N,N-二异丙基乙胺用4-二甲氨基吡啶(DMAP)替换，碳酸钾用乙醇钠替换，四氢呋喃用乙醇替换，按照化合物4的合成步骤，合成N-甲基吗啉和吡啶的季铵盐盐酸盐，可得化合物35-37。
化合物35：2-氯-4,6-双(对甲苯硫基)-1,3,5-三嗪：收率65.6％。 MS(ESI):m/z,360.0[M+H]+；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ 7.47–7.41(m,1H),7.26(dd,J＝7.5,1.3Hz,1H),2.34(d,J＝1.3Hz, 1H)。
化合物36：4-(4,6-双(对甲苯基硫基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为56％。MS(ESI):m/z,426.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.53–7.46(m,2H),7.26(dd,J＝ 7.4,1.4Hz,2H),4.08(ddd,J＝11.5,3.2,1.1Hz,1H),3.96(td,J＝11.5,3.0Hz,1H),3.83(dddd,J＝11.6,6.9,5.3,3.2Hz,1H),3.70 (dddd,J＝12.3,7.0,5.5,3.3Hz,1H),3.17(s,2H),2.34(d,J＝1.4Hz, 3H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ175.98,139.00,132.61, 132.34,129.89,66.27,49.68,40.55,21.19。
化合物37：1-(4,6-双(对甲苯基硫)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1- 胺盐酸盐：收率为47％。MS(ESI):m/z,404.1[M+H]+；1H NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.66–8.60(m,1H),8.45–8.37(m,1H),7.61– 7.55(m,2H),7.29–7.23(m,2H),2.34(d,J＝1.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ173.61,153.02,146.41,143.37,139.00, 132.61,132.34,129.89,129.77,21.19。
实施例6结构式(I)中X2和X3为O，R2为甲基，R3为烷基炔或异丙基取代的的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备。
化合物38：4-(4-(3-炔基-1-氧基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基) -4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐的制备
于50mL的反应瓶中加入2-(3-炔基-1-氧基)-4-氯-6-甲氧基 -1,3,5-三嗪(100mg,0.56mmol)，加入2mL二氧六环搅拌溶解，缓慢滴加入N-甲基吗啉(113mg,1.12mmol)，于室温搅拌反应30 min，有白色固体析出。反应完全，过滤，固体用乙醇冲洗两遍，干燥，得到白色固体94mg，收率为60％。MS(ESI):m/z,279.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.67(t,J＝6.5Hz,2H),4.60– 4.53(m,2H),4.20(s,3H),4.12–4.05(m,2H),3.91(q,J＝10.7Hz,4H),3.55(s,3H),2.78(td,J＝6.5,2.7Hz,2H),2.42(t,J＝2.7Hz,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ174.07,173.36,79.11,70.24, 69.90,67.79,65.96,63.79,61.80,60.01,56.22,54.59,53.29,42.60, 18.20。
按照化合物4的合成步骤，合成N-甲基吗啉和吡啶的季铵盐盐酸盐，可得化合物39-41。
化合物39：1-(4-(3-炔基-1-氧基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基) 吡啶-1-胺盐酸盐：收率为78％。MS(ESI):m/z,258.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ9.01(dt,J＝6.7,1.5Hz,2H),8.45–8.37 (m,2H),8.05(tt,J＝7.5,1.5Hz,1H),4.11(t,J＝4.5Hz,2H),3.93(s,3H),2.45(td,J＝4.4,2.9Hz,2H),2.09(t,J＝2.9Hz,1H).13C NMR (101MHz,Methanol-d4)δ172.74,170.51,157.78,146.41,143.37, 129.77,80.88,70.65,64.18,54.78,19.63。
化合物40：4-(4,6-二异丙氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉 -4-胺盐酸盐：收率为56％。MS(ESI):m/z,298.2[M+H]+；1H NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ4.91(p,J＝6.8Hz,1H),4.49–4.40(m,1H), 4.38–4.31(m,1H),4.33–4.24(m,1H),4.23–4.14(m,1H),3.26(s,2H),1.35(d,J＝6.8Hz,6H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ 170.91,164.03,71.49,66.27,49.68,40.55,21.60。
化合物41：1-(4,6-二异丙氧基-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐：收率为76％。MS(ESI):m/z,276.1[M+H]+；1H NMR(400MHz, Methanol-d4)δ9.01(dt,J＝6.7,1.5Hz,1H),8.45–8.37(m,1H),4.97 (p,J＝6.8Hz,1H),1.35(d,J＝6.8Hz,6H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ170.47,158.45,146.41,143.37,129.77,71.49,21.60。
实施例7结构式(I)中X2和X3为O，R2为甲基，R3为取代苯基的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备。实验操作按照实施例6 的操作方法，其中3-丁炔-1-醇用苯酚、间甲基苯酚、对甲基苯酚、对硝基苯酚替代，按照化合物4的合成步骤，合成N-甲基吗啉和吡啶的季铵盐盐酸盐，可得化合物42-48。
化合物42：4-(4-甲氧基-6-苯氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为87％。MS(ESI):m/z,304.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ7.21(t,J＝7.5Hz,1H),7.02–6.92(m,2H), 4.38–4.27(m,2H),3.93(s,2H),3.74(td,J＝11.7,2.5Hz,1H),3.29 –3.19(m,1H),3.24(s,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ171.66,171.06,163.14,152.29,129.39,124.49,121.64,66.27,53.50, 49.68,40.55。
化合物43：1-(4-甲氧基-6-苯氧基-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1- 胺盐酸盐：收率为76％。MS(ESI):m/z,282.1[M+H]+；1H NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.88(dt,J＝6.8,1.4Hz,2H),8.45–8.37(m, 2H),8.02(tt,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.25–7.17(m,2H),7.10–7.03(m,2H),6.96(tt,J＝7.4,2.0Hz,1H),3.98(s,3H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ169.45,169.22,157.12,152.29,146.41,143.37,129.77, 129.39,124.49,121.64,54.78。
化合物44：4-(4-甲氧基-6-(间甲苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基) -4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率46％。MS(ESI):m/z,318.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.23(t,J＝7.5Hz,1H),7.05(dt,J ＝7.5,2.1Hz,1H),6.94(dtd,J＝7.5,2.0,0.9Hz,1H),6.86(td,J＝2.0,1.0Hz,1H),4.26(s,1H),4.33–4.20(m,3H),4.17–4.04(m,4H), 3.93(s,3H),3.21(s,3H),2.35(d,J＝2.1Hz,1H),2.35(s,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ171.66,171.06,163.14,152.77, 139.18,129.48,125.54,121.77,118.28,66.27,53.50,49.68,40.55,21.50。
化合物45：1-(4-甲氧基-6-(间甲苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基) 吡啶-1-胺盐酸盐：收率48％。MS(ESI):m/z,296.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ8.87(dt,J＝6.9,1.4Hz,2H),8.45–8.37 (m,2H),8.02(tt,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.28(t,J＝7.5Hz,1H),7.11(dt, J＝7.5,2.0Hz,1H),7.01(dtd,J＝7.3,2.1,1.0Hz,1H),6.96(td,J＝2.0,1.0Hz,1H),3.98(s,3H),2.35(d,J＝2.1Hz,1H),2.35(s, 2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ169.45,169.22,157.12, 152.77,146.41,143.37,139.18,129.77,129.48,125.54,121.77,118.28,54.78,21.50。
化合物46：4-(4-甲氧基-6-(对甲苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基) -4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率39％。MS(ESI):m/z,318.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.18–7.12(m,1H),6.93–6.87(m, 1H),4.44(ddd,J＝12.4,6.5,1.2Hz,1H),4.39–4.30(m,1H),4.16–4.06(m,1H),3.95(ddd,J＝12.3,10.3,7.2Hz,1H),3.90(s,2H),3.28(s,2H),2.31(s,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ171.66, 171.06,163.14,148.33,133.73,130.09,120.43,66.27,53.50,49.68, 40.55,20.61。
化合物47：1-(4-甲氧基-6-(对甲苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基) 吡啶-1-胺盐酸盐：收率45％。MS(ESI):m/z,296.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ8.87(dt,J＝6.7,1.5Hz,2H),8.45–8.37 (m,2H),8.02(tt,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.21(dq,J＝7.5,1.2Hz,2H),7.00–6.94(m,2H),3.98(s,3H),2.31(d,J＝2.1Hz,1H),2.31(s,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ169.45,169.22,157.12,148.33, 146.41,143.37,133.73,130.09,129.77,120.43,54.78,20.61。
化合物48：4-(4-甲氧基-6-(对硝基苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基) -4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率47％。MS(ESI):m/z,349.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.23–8.18(m,1H),7.15–7.10(m, 1H),4.84(dddd,J＝12.4,8.5,5.7,2.5Hz,1H),4.50–4.41(m,1H),4.24(dddd,J＝11.2,8.8,4.1,2.4Hz,1H),3.75(s,2H),3.69–3.59(m, 1H),3.29(s,2H).13CNMR(101MHz,Methanol-d4)δ171.66,171.06, 163.14,150.75,146.20,125.84,120.57,66.27,53.50,49.68,40.55。
实施例8结构式(I)中X2为O，X3为NH，R2为甲基，R3为烷基炔、取代苯基及含氮杂环的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备。实验操作按照实施例6的操作方法，其中间甲苯酚用3-丁炔-1-胺、吡咯、2-氨基-3-硝基吡啶、3-氨基-2-硝基吡啶替代，用二氧六环作溶剂，实验操作相同，按照化合物4的合成步骤，合成N-甲基吗啉和吡啶的季铵盐盐酸盐，可得化合物49-60。
化合物49：2-氯-4-甲氧基-6-(1H-吡咯-1-基)-1,3,5-三嗪：收率85％。MS(ESI):m/z,211.0[M+H]+；1H NMR(400MHz, Chloroform-d)δ7.26(dd,J＝5.6,3.5Hz,1H),6.35(dd,J＝5.6,3.4Hz,1H),3.92(s,2H)。
化合物50：4-氯-6-甲氧基-N-(3-硝基吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2- 胺：收率76％。MS(ESI):m/z,283.0[M+H]+；1H NMR(400MHz, Chloroform-d)δ8.78(dd,J＝5.0,1.2Hz,1H),8.13(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.00(dd,J＝8.0,5.0Hz,1H),4.26(s,1H),3.90(s,3H)。
化合物51：4-氯-6-甲氧基-N-(3-硝基吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2- 胺：收率74％。MS(ESI):m/z,283.0[M+H]+；1H NMR(400MHz, Chloroform-d)δ8.90(s,1H),8.42(dd,J＝4.9,1.3Hz,1H),7.93(dd, J＝8.1,1.3Hz,1H),7.75(dd,J＝8.1,4.9Hz,1H),3.93(s,3H)。
化合物52：1-(4-(3-炔基-1-氨基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基) 吡啶-1-胺盐酸盐：收率为56％。MS(ESI):m/z,279.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ4.96(s,1H),4.45(ddt,J＝11.9,5.1,3.6Hz, 2H),4.40–4.23(m,4H),4.23–4.17(m,2H),3.89(s,3H),3.49(t,J＝4.8Hz,2H),3.26(s,3H),2.26(td,J＝4.9,3.0Hz,2H),2.00(t,J＝2.9 Hz,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ171.86,165.46,165.07, 82.48,82.20,66.27,53.67,49.68,40.55,38.07,18.91。
化合物53：1-(4-(3-炔基-1-氨基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基) 吡啶-1-胺盐酸盐：收率为75％。MS(ESI):m/z,257.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ9.03(dt,J＝6.7,1.5Hz,2H),8.45–8.37 (m,2H),8.05(tt,J＝7.4,1.5Hz,1H),4.96(s,1H),3.96(s,3H),3.49 (t,J＝4.8Hz,2H),2.26(td,J＝4.8,3.0Hz,2H),1.82(t,J＝3.0Hz, 1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ170.52,165.85,157.09, 146.41,143.37,129.77,82.48,82.20,54.78,38.07,18.91。
化合物54：4-(4-甲氧基-6-苯氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为83％。MS(ESI):m/z,273.2[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ9.40(s,1H),7.77–7.71(m,2H),7.34– 7.26(m,2H),7.03(tt,J＝7.5,2.0Hz,1H),5.20(s,1H),4.54–4.45(m,2H),4.41–4.32(m,4H),4.23(td,J＝11.7,2.9Hz,2H),3.29(s,3H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ165.23,165.02,159.24,139.61, 128.62,123.53,121.10,66.27,49.68,40.55。
化合物55：1-(4-甲氧基-6-苯氨基-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1- 胺盐酸盐：收率为74％。MS(ESI):m/z,251.1[M+H]+；1H NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ9.33(s,1H),9.06(dt,J＝6.8,1.4Hz,2H),8.45– 8.37(m,2H),8.08(tt,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.77–7.71(m,2H),7.34– 7.26(m,2H),7.03(tt,J＝7.5,2.0Hz,1H),5.14(s,1H).13C NMR(101 MHz,Methanol-d4)δ163.63,160.34,159.24,146.30,143.25,139.61, 129.65,128.62,123.53,121.10。
化合物56：4-(4-((3-溴苯基)氨基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪 -2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为58％。MS(ESI):m/z,351.1 [M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.53(dt,J＝7.5,2.0Hz, 1H),7.28(dt,J＝7.5,2.0Hz,1H),7.13(t,J＝7.5Hz,1H),6.85(t,J＝2.0Hz,1H),5.23(s,1H),4.49(dddd,J＝11.2,7.9,6.6,2.7Hz,2H), 4.42–4.27(m,4H),4.27–4.20(m,2H),3.91(s,3H),3.31(s,3H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ170.07,164.31,163.71,142.00, 130.44,126.67,123.13,122.31,120.38,66.27,53.67,49.68,40.55。
化合物57：1-(4-((3-溴苯基)氨基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪 -2-基)吡啶-1-胺盐酸盐：收率为58％。MS(ESI):m/z,359.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ9.06(dt,J＝6.7,1.5Hz,2H),8.45 –8.37(m,2H),8.07(tt,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.53(dt,J＝7.5,2.0Hz,1H),7.31(dt,J＝7.5,2.0Hz,1H),7.13(t,J＝7.5Hz,1H),6.85(t,J＝ 2.1Hz,1H),5.28(s,1H),4.02(s,3H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ168.99,162.66,155.97,146.41,143.37,142.00,130.44, 129.77,126.67,123.13,120.38,54.78。
化合物58：4-(4-甲氧基-6-((3-硝基吡啶-2-基)氨基)-1,3,5- 三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为64％。MS(ESI):m/z, 349.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.92(dd,J＝5.0, 1.3Hz,1H),8.30(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.70(s,1H),7.03(dd,J＝8.0,5.0Hz,1H),4.75–4.66(m,2H),4.44(ddd,J＝11.6,3.1,1.3Hz, 2H),3.92(s,3H),3.92(td,J＝11.6,2.5Hz,2H),3.44–3.34(m,2H), 3.30(s,3H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ170.35,161.14, 161.11,154.03,145.86,135.99,130.34,116.88,66.27,53.67,49.68,40.55。
化合物59：1-(4-甲氧基-6-((2-硝基吡啶-3-基)氨基)-1,3,5- 三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐：收率为58％。MS(ESI):m/z,327.1 [M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.98(dt,J＝6.9,1.4Hz, 2H),8.53(dd,J＝5.0,1.3Hz,1H),8.45–8.37(m,2H),8.09(tt,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.93(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.79(dd,J＝8.1,4.9 Hz,1H),4.99(s,1H),3.97(s,3H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4) δ168.96,162.41,155.97,147.55,146.41,143.37,141.42,131.56,130.30,129.77,127.99,54.78。
化合物60：4-(4-甲氧基-6-(1H-吡咯-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基) -4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为49％。MS(ESI):m/z,277.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.23(dd,J＝5.5,3.4Hz,1H),6.36 (dd,J＝5.5,3.4Hz,1H),4.85–4.75(m,1H),4.34(td,J＝11.6,2.9Hz,1H),4.20(ddd,J＝11.4,3.4,1.0Hz,1H),4.01(dddd,J＝12.1,7.0, 5.6,3.4Hz,1H),3.94(s,2H),3.36(s,2H).13C NMR(101MHz, Methanol-d4)δ171.86,169.19,158.26,122.68,113.73,66.27,53.67, 49.68,40.55。
实施例9结构式(I)中X2为O，X3为S，R2为甲基，R3为对甲基苯基和苄基的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备。实验操作按照实施例6的操作方法，其中间甲苯酚用对甲基巯醇或苄巯醇替代，碳酸钾用乙醇钠替换，四氢呋喃用乙醇替换，按照化合物4的合成步骤，合成N-甲基吗啉和吡啶的季铵盐盐酸盐，可得化合物61-64。
化合物61：4-(4-甲氧基-6-(对甲苯基硫基)-1,3,5-三嗪-2-基) -4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为54％。MS(ESI):m/z,334.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.54–7.47(m,1H),7.29–7.23(m, 1H),4.34(ddt,J＝10.9,6.2,4.7Hz,1H),4.29–4.19(m,1H),4.09–3.93(m,2H),3.92(s,2H),3.27(s,2H),2.34(s,1H).13C NMR(101 MHz,Methanol-d4)δ176.95,169.48,164.13,139.00,132.61,132.34, 129.89,66.27,54.78,49.68,40.55,21.19。
化合物62：1-(4-甲氧基-6-(对甲苯基硫基)-1,3,5-三嗪-2-基) 吡啶-1-胺盐酸盐：收率为38％。MS(ESI):m/z,312.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ8.79(dt,J＝6.8,1.4Hz,2H),8.45–8.37 (m,2H),8.02(tt,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.61–7.55(m,2H),7.29–7.23(m,2H),4.00(s,3H),2.34(d,J＝2.1Hz,1H),2.34(s,2H).13C NMR (101MHz,Methanol-d4)δ173.70,168.92,157.28,146.41,143.37, 139.00,132.61,132.34,129.89,129.77,54.78,21.19。
化合物63：4-(4-(苄基硫基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4- 甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为58％。MS(ESI):m/z,334.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.45–7.38(m,1H),7.32–7.24(m, 1H),4.42–4.32(m,1H),4.35(s,1H),4.16–4.01(m,3H),3.90(s,2H),3.28(s,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ174.90,170.27, 167.37,138.75,128.46,128.03,127.71,66.27,54.78,49.68,40.55, 35.52。
化合物64：1-(4-(苄基硫基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐：收率为64％。MS(ESI):m/z,312.1[M+H]+；1H NMR (400MHz,Methanol-d4)δ8.86(dt,J＝6.9,1.4Hz,2H),8.45–8.37 (m,2H),8.04(tt,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.45–7.38(m,2H),7.32–7.24(m,2H),7.20(ddt,J＝7.3,6.1,2.0Hz,1H),4.35(s,1H),3.97(s,3H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ172.50,169.70,158.44,146.41, 143.37,138.75,129.77,128.46,128.03,127.71,54.78,35.52。
实施例10结构式(I)中X2为O，X3为NH，R2为甲基，R3为3- 叠氮丙烷基的三嗪化合物及其它们季铵盐的制备。
于50mL反应瓶中加入溴丙胺盐酸盐(1.0g,4.6mmol)和10mL 水，搅拌状态下用塑料勺缓慢加入叠氮化钠(449mg,6.9mmol), 于100℃油浴中回流反应16h。冷却，减压浓缩，得白色固体3-叠氮-1-丙胺盐酸盐600mg，收率为94％。
于反应瓶中加入2,4-氯-6-甲氧基-1,3,5-三嗪(500mg,2.8mmol) 和4mL四氢呋喃完全溶解，搅拌状态下加入3-叠氮-1-丙胺盐酸盐 (381mg，2.8mmol)，室温搅拌反应4h。TLC检测反应完全后，用乙酸乙酯和水萃取两遍，有机相用饱和食盐水洗涤一遍，用无水硫酸钠干燥。经柱层析分离得N-(3-叠氮丙基)-4-氯-6-甲氧基-1,3,5- 三嗪-2-胺350mg，收率为51.5％。MS(ESI):m/z,244.06[M+H]+；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ3.90(s,3H),3.81(s,1H),3.65(t,J＝5.1Hz,2H),2.21(tt,J＝7.7,5.1Hz,2H),1.30(t,J＝7.7Hz,2H)。
按照化合物4的合成步骤将2,4-双(3-炔基-1-氧基)-6-氯-1,3,5- 三嗪用N-(3-叠氮丙基)-4-氯-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-胺替代，实验步骤相同，合成了N-甲基吗啉和吡啶的季铵盐盐酸盐，可得化合物 65和66。
化合物65：4-(4-((3-叠氮丙基)氨基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪 -2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐：收率为76％。MS(ESI):m/z,310.2 [M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.61–4.51(m,1H),4.50– 4.40(m,1H),4.23(dddd,J＝20.8,11.7,6.4,1.5Hz,2H),3.89(d,J＝7.5Hz,2H),3.65(t,J＝7.6Hz,1H),3.31(s,2H),2.21(tt,J＝7.7,5.2 Hz,1H),1.30(t,J＝5.2Hz,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ 171.86,165.46,165.07,66.27,53.67,49.68,49.11,40.55,39.00,27.94。
化合物66：1-(4-((3-叠氮丙基)氨基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪 -2-基)吡啶-1-胺盐酸盐：收率为79％。MS(ESI):m/z,288.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.99(dt,J＝6.9,1.4Hz,2H),8.45– 8.37(m,2H),8.05(tt,J＝7.6,1.6Hz,1H),3.95(s,3H),3.91(s,1H), 3.65(t,J＝7.6Hz,2H),2.21(p,J＝7.7Hz,2H),1.30(t,J＝7.7Hz,2H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ170.52,165.85,157.09,146.41, 143.37,129.77,54.78,49.11,39.00,27.94。
实施例11化合物4与三肽MP_SYS在水中的反应
于反应瓶中加入MP_SYS(1eq)，加入1mL水溶液，搅拌5min。加入化合物4(1eq)，室温搅拌反应1h，进行1H-NMR检测对照。如图1所示，其可有效地与模型短肽(MP_SYS)上酪氨酸上的酚羟基反应，而与其他氨基酸不反应，因此，化合物4可作为酪氨酸特异性标记剂具有潜在的应用价值。
用同样的方法，化合物5-66都可以选择性的与MP_SYS短肽中的酪氨酸上的酚羟基反应，可以特异性的标记短肽上的酪氨酸。
实施例12MP_Y(NH2-NSTKNLTFAMRSSGDYGEV-CONH2) 多肽与化合物的反应条件筛选
多肽MP_Y(NH2-NSTKNLTFAMRSSGDYGEV-CONH2,0.5μmol, 1.0eq.)和上述取代三嗪类化合物(1.3-3equiv.)用缓冲液溶解后混匀，并使MP_Y的最终浓度为0.5mM，反应液在25-30℃条件下搅拌反应，在0h、1h、2.5h、3.5h和4h时分别对反应液进行RP-UPLC 检测，通过比较MP_Y的转化来计算多肽的转化率，如表1所示。
表1多肽MP_Y与化合物在不同条件下反应时的转化率
注：a:反应浓度为0.5mM,b:通过LCMS计算反应收率,c:通过偶联反应产生的副反应。
如表1UPLC-MS分析数据可见，三嗪类化合物对模型肽(MP_Y： NH2-NSTKNLTFAMRSSGDYGEV-CONH2)上的酪氨酸进行了标记，不同的取代三嗪化合物具有不同的标记收率。除了标记酪氨酸片段外，还检测了肽中羧酸与胺之间的分子内酰胺化的副产物。结果表明，所测试的化合物以过量多肽中的酪氨酸2-3倍当量用量下，室温和缓冲溶液中可以标记多肽，副反应微量或者无副反应。
由此可推测，当蛋白中含有酪氨酸片段时，上述合成的取代三嗪化合物也可以与蛋白上的酪氨酸片段反应，从而标记蛋白。
实施例13化合物16与蛋白GST-KRas反应
将50μL溶解于HEPES pH 6.8缓冲溶液的GST-KRas蛋白和化合物16(1equiv.,8μM)在30℃孵育30分钟，然后对反应液进行 LC-MS分析。
其中，KRas是一种属于Ras蛋白家族的癌蛋白，具有控制细胞增殖、凋亡和分化的功能。利用该蛋白与不同浓度下的化合物16孵育，同时对KRas上的标记片段进行了分析。如图3所示，LC-MS/MS 结果表明，化合物16可以标记KRas蛋白上的多个残基(如H94,H95,Y96,R97)。
实施例14蛋白组学分析探究化合物16对酪氨酸的化学选择性
HeLa细胞裂解液(2mg/mL,pretreated with 20mM IAA)与化合物16(最终浓度为100μM)在30℃孵育2h，将反应液与Biotin-DADPS-Azide进行Click反应，反应时间为2h，然后加入4 倍体积ice-cold乙腈于-20℃放置过夜，固体经离心后ice-cold甲醇洗涤两次，干燥后溶于含有4％SDS，20mM EDTA和10％甘油的PBS 溶液，溶液经10倍体积的PBS溶液稀释，然后加入High-capacity streptavidin agarose beads(ThermoFisher Scientific)室温搅拌2h以结合Biotin。
将beads置于10mM NH4HCO3中，在55℃放置10分钟，随后将beads在20mMDTT中于55℃孵育40分钟，然后在50mM碘乙酰胺溶液中避光孵育40分钟，随后经2μg胰蛋白酶在37℃消化16h， beads水洗两次，10％甲酸水解两次，收集解离液进行MS分析。
如图4所示，化合物16标记了蛋白微环境中的组氨酸、酪氨酸和精氨酸。根据非共价自动对接分析，氨基酸Y96与化合物16的距离为～，推测蛋白质微环境有助于重组蛋白上残基的反应性。此外，TPC(三嗪-吡啶化学)显示了其在酪氨酸引导配体结合位点探索中的应用潜力。
实施例15化合物4对活细胞的荧光标记和生物兼容性研究
HeLa细胞使用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养，经胰酶消化后稀释至96-孔板中(0.5M cells/well)，PBS洗一次后离心(400×g,3min)，分别加入含有不同浓度化合物4的PBS溶液和42的PBS溶液，反应一定时间后加入100μL含有培养基的PBS 溶液终止反应，细胞经离心，PBS(1％FBS)洗涤两次，然后用100 μM含有biotin-azide,BTTAA-CuSO4预混液([BTTAA]:[CuSO4]＝300μM:50μM),2.5mM sodium ascorbate的溶液重悬后在冰上反应5分钟，细胞离心后用PBS(1％FBS)洗涤两次，然后加入Alexa Fluor 488-streptavidin(1μg/mL)后在冰上孵育30分钟，PBS(1％ FBS)洗涤两次，经200μL含有2μg/mL 7-AAD缓冲液重悬后进行流式分析。共聚焦成像在贴壁Hela细胞上进行，细胞上反应和标记的条件同上。
如图5所示，化合物4和42对活细胞具有较好的生物相容性，不会影响细胞的活性。由于化合物4含有炔基，可以与含有叠氮的 biotin-azide反应,从而加入荧光试剂后显色；化合物42没有炔基，只停留在标记细胞一步，不会继续与含有叠氮的biotin-azide反应，就不会产生荧光。。通过细胞活力实验，化合物4在1mM的高浓度下，在30℃下标记反应10分钟，对活细胞没有损害。共聚焦成像表明，化合物4能在短时间内高效穿透和标记活HeLa细胞，产生可被检测的荧光信号。所有这些结果表明，化合物4对于活细胞具有良好的生物相容性，显示了其在活细胞酪氨酸标记中的应用潜力。
实施例16化合物16对活肿瘤细胞A549的荧光标记和生物兼容性研究
A549细胞使用含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养，经胰酶消化后稀释至96-孔板中(0.5M cells/well)，PBS洗一次后离心(400×g,3min)，分别加入含有不同浓度化合物16的PBS 溶液和42的PBS溶液，30℃反应10分钟后加入100μL含有培养基的PBS溶液终止反应，细胞经离心，PBS(1％FBS)洗涤两次，然后用100μM含有biotin-azide，BTTAA-CuSO4预混液 ([BTTAA]:[CuSO4]＝300μM:50μM),2.5mM sodium ascorbate的溶液重悬后在冰上反应5分钟，细胞离心后用PBS(1％FBS)洗涤两次，然后加入Alexa Fluor 488-streptavidin(1μg/mL)后在冰上孵育30分钟，PBS(1％FBS)洗涤两次，经200μL含有2μg/mL 7-AAD缓冲液重悬后进行流式分析。共聚焦成像在贴壁A459细胞上进行，细胞上反应和标记的条件同上。
如图6所示，化合物16和42对肿瘤细胞具有较好的生物兼容性，不会影响细胞的活性。由于化合物16含有炔基，可以与含有叠氮的 biotin-azide反应,从而加入荧光试剂后显色；化合物42没有炔基，只停留在标记细胞一步，不会继续与含有叠氮的biotin-azide反应，就不会产生荧光。通过细胞活力实验，化合物16在1mM的高浓度下，在30℃下标记反应10分钟，对活细胞没有损害。共聚焦成像表明，化合物16能在短时间内高效标记活A549细胞，产生可被检测的荧光信号。所有这些结果表明，化合物16对于A549肿瘤细胞具有良好的生物兼容性，显示了其在肿瘤细胞酪氨酸标记中的应用潜力。

Claims (7)

1.取代三嗪衍生物在制备氨基酸、肽、蛋白、细胞标记中的应用，其特征在于，所述取代三嗪衍生物具有如式(I)所示结构式：
其中，R1选自N-甲基吗啉-1-基、N-甲基哌啶-1-基、N-乙基吗啉-1-基、N-乙基哌啶-1-基、1-氮杂二环[2.2.2]辛烷-1-基、N-甲基吡咯烷-1-基、三甲胺基、N,N-二甲基乙胺基、N,N-二乙基甲胺基、三乙胺基、N,N-二甲基苯胺基、1-甲基咪唑-1-基或吡啶-1-基中的任意一种及其盐；
X2和X3选自O、S或NH，X2和X3相同或不同；
R2、R3选自碳原子数为1-10的炔基、苯基、卤素取代苯基、甲基取代苯基、碳原子数为1-5的直链烷基、异丙基、硝基取代的苯基、硝基取代的吡啶基、吡咯取代基和碳原子数为1-10的叠氮烷基中的任意一种，R2和R3相同或不同；
所述氨基酸为酪氨酸，所述肽为含有酪氨酸的肽，所述蛋白为含有酪氨酸的蛋白。
2.取代三嗪衍生物在制备氨基酸、肽、蛋白、细胞标记中的应用，其特征在于，所述取代三嗪衍生物选自下述编号的化合物：
所述氨基酸为酪氨酸，所述肽为含有酪氨酸的肽，所述蛋白为含有酪氨酸的蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述蛋白为KRas蛋白，所述细胞为活HeLa细胞或活A549细胞。
4.酪氨酸特异性标记剂，其特征在于，以权利要求1或2所述的应用中的至少一种化合物为主要活性成分。
5.多肽MP_Y特异性标记剂，其特征在于，以化合物4-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐、化合物1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐、化合物4-(4-甲氧基-6-(对硝基苯氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐、化合物4-(4-甲氧基-6-((3-硝基吡啶-2-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐、化合物1-(4-甲氧基-6-((2-硝基吡啶-3-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐、化合物1-(4-甲氧基-6-(对甲苯基硫基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐、化合物4-(4-(苄基硫基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐和化合物1-(4-(苄基硫基)-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐中的至少一种为主要活性成分。
6.KRas蛋白标记剂，其特征在于，以化合物1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐为主要活性成分。
7.活细胞标记剂，其特征在于，以化合物4-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-胺盐酸盐或1-(4,6-双(3-炔基-1-氧基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡啶-1-胺盐酸盐中的至少一种为主要活性成分。
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