CN112358414B - 非天然氨基酸及其在蛋白质定点修饰和蛋白质相互作用中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及如通式(I)所表示的非天然氨基酸化合物及其制备方法、在生物大分子蛋白质定点修饰、蛋白质相互作用及生物学研究中的应用。具体地，本发明提供的非天然氨基酸作为一类结构新颖的化学探针，用于蛋白质交联、蛋白质‑蛋白质相互作用的研究、蛋白质的定点标记以及蛋白质定点修饰的应用。

Description

非天然氨基酸及其在蛋白质定点修饰和蛋白质相互作用中的 用途
技术领域
本发明涉及结构新颖非天然氨基酸，其各种形式的盐类化合物，用于蛋白质交联、蛋白质-蛋白质相互作用的研究、蛋白质的定点标记以及蛋白质定点修饰的应用。
背景技术
非天然氨基酸区别于自然界中天然存在的氨基酸，指的是在天然氨基酸进行修饰后的氨基酸，尤其以赖氨酸和酪氨酸的衍生物为主。修饰后的氨基酸具有天然氨基酸所不具备的性质，例如光谱性质、荧光性质、交联性质、光保护和脱保护性质等。这些氨基酸可以通过“遗传密码子扩充技术”定点插入到蛋白之中。
一般而言，在遗传密码指导的蛋白质合成过程中，每以氨酰tRNA各自氨酰化一个天然的氨基酸，添加到正在合成的蛋白质链上。而遗传密码扩充则是将非天然氨基酸通过特殊的密码子(例如UAG)添加到蛋白质链中的技术。遗传密码扩充技术模拟的是天然蛋白质表达过程，区别是需要在表达系统中引入与非天然氨基酸对应的氨酰tRNA以及氨酰tRNA合成酶，并使它们与特殊的密码子对相应，从而将非天然氨基酸表达到蛋白质中。需要注意的是，引入的氨酰tRNA以及氨酰tRNA合成酶在功能上与内源的必须是正交的关系。即以内的tRNA只能倍引入的氨酰tRNA合成酶氨酰化。反而言之，引入的氨酰tRNA合成酶只能催化引入的tRNA与非天然氨基酸氨酰化，这样的tRNA与合成酶称之为正交。
生命体活动的正常运行离不开蛋白质的作用，蛋白质功能的发生离不开蛋白-蛋白之间的相互作用。因此在生理条件下捕获蛋白质之间的物理或者化学相互作用显得尤为重要。对蛋白-蛋白相互作用的研究有助于帮助我们理解蛋白的行为和功能，预测未知蛋白的功能，绘制蛋白功能网络，进而理解相关信号通路的作用机制，为疾病治疗提供依据。相对于传统的研究蛋白-蛋白相互作用的方法，非天然氨基酸具有分子体积小、透膜性好、信噪比低的特点。此外非天然氨基酸的另外一个优势是能够通过基因编码的方式定点引入蛋白之中，最大程度上模拟了原生环境中蛋白-蛋白之间的相互作用。
在过去的10余年中，“基因密码扩充技术”得到了迅速的发展，具有新颖结构和功能的非天然氨基酸不断被定点引入到蛋白中，非天然氨基酸也因为其独特的性质被广泛应用于蛋白标记和蛋白-蛋白相互作用的研究中。目前已经有超过150种非天然氨基酸成功地引入细菌、真菌、以及哺乳动物细胞的蛋白质中，这些非天然氨基酸作为化学生物学工具用于蛋白质研究的多方面，例如：蛋白-蛋白相互作用界面的发现、酶活性的调控以及细胞信号转导调控等。而这些非天然氨基酸主要分为以下几类：选择性反应基团、光反应探针、荧光探针、光谱探针、酶活性开关等。选择性反应如酮催化的“click”反应在蛋白标记，底物蛋白的捕获和富集中起到重要的作用。光谱探针插入到蛋白质结构中，可以作为在氨基酸水平化学或生物学环境的报告基团，能够为蛋白质的结构、定位提供非常重要的信息。同时，光谱探针还能够动态反映蛋白的构象变化，为研究蛋白之间相互作用提供了便利。
然而，目前能够在活体细胞中，高效表达并用于蛋白质相互作用研究以及蛋白质定点标记的非天然氨基酸并不多，主要是缺乏有特殊功能的新颖结构的非天然氨基酸；存在一些非天然氨基酸在原核表达系统和真核表达系统中表达效率不高的问题；此外已有的光交联非天然氨基酸没有残基选择性，给后续的交联蛋白在质谱中的鉴定带来了非常大难度；同时已开发的一些氟代的非天然氨基酸结构种类偏少，还未开发如赖氨酸苯甲酰化修饰的氟代非天然氨基酸等等。因此，从非天然氨基酸的化学功能开发的角度、在生物学研究需求、生物大分子蛋白质的修饰和生物医药及疾病治疗的角度来看，急需要发展新结构和新功能的氨基酸，通过氨酰tRNA合成酶的设计和优化，获得高表达效率的非天然氨基酸；获得具有选择性及高交联效率的光交联非天然氨基酸，有效地在活体细胞中捕捉蛋白相互作用，为生物学研究提供高效研究技术；高效地实现对目标蛋白质如蛋白质药物、纳米抗体、抗体进行定点标记和修饰，用于疾病诊断和疾病治疗等等。因此，继续开发新颖结构的非天然氨基酸，以开发新的技术和应用具有非常重要研究价值和现实意义。
发明内容
在本发明中，基于不同化学反应基团的物理和化学性质，发展了多种新型的非天然氨基酸。这些新结构和新功能的非天然氨基酸为赖氨酸和酪氨酸的衍生物，通过后续的生物实验进行验证，并实现各种在生物学研究和生物医学中的多种用途。
第I类是邻硝基苄醇类非天然氨基酸，邻硝基苄醇基团能够在紫外光光照下形成邻硝基苯甲醛中间体，并且能够相互作用的蛋白质复合物中邻近的的氨基等发生交联，具有很高的反应活性和反应效率，可以应用于蛋白的定点标记以及化学交联。本发明中的光交联活性非天然氨基酸也是描绘生物分子相互作用的的强有力的工具，可以被应用于蛋白-蛋白相互作用，蛋白-核酸相互作用，配体相互作用，及蛋白质定点修饰的研究中。这种高效捕捉方式，能够共价捕捉蛋白之间瞬时、非共价的相互作用，这在许多其他方式的探针中是难以实现的。
该类非天然氨基酸在目标蛋白质中通过定点表达，还可以作为一种蛋白质药物如抗体、纳米抗体等一种可控的修饰技术；如在生物药大分子如蛋白质药物、抗体、纳米抗体中定点表达；并用于蛋白质定点修饰，连接药物分子如各类细胞毒素药物分子如微管蛋白抑制剂(美登霉素、MD1、MD4)、烷化剂、DNA小沟抑制剂(烯二炔类抗生素)，蛋白降解剂，同位素核素，荧光成像分子等，连接修饰后的蛋白质作为生物药和生物大分子成像分子在生物医药中的用途。
第II类是苯甲酰类非天然氨基酸，包括单纯苯甲酰修饰以及单氟代和多氟代修饰的非天然氨基酸。苯甲酸类化合物是FDA批准的食品添加剂，近期有工作表明，苯甲酸类化合物可以导致组蛋白赖氨酸的苯甲酰化，这是一种翻译后修饰，研究组蛋白的苯甲酰化对食品安全和疾病研究具有重要意义。19F核磁对周问环境改变异常敏感，这包括范德华相互作用和静电相互作用。当19F探针位于大分子上时，周围环境的变化可以转换为核磁信号的变化，通过监测核磁信号可以获得蛋白的一些动力学数据。基于此，本发明设计了一类氟代的非天然氨基酸，氟原子的优势是跟氢原子体积相似，可以最大程度模拟苯甲酰化过程，并且氟核磁信号具有灵敏度高，受干扰小的优点，被广泛应用与蛋白-蛋白相互作用的研究中之中。本发明中的氟代苯甲酰非天然氨基酸可以被定点表达到蛋白之中，并且能够通过核磁信号来检测苯甲酰化的组蛋白与相关蛋白的相互作用。
第III类非天然氨基酸是一类双功能的非天然氨基酸，该类氨基酸的特点是具有两类化学修饰基团：一类是用于交联蛋白，另一类是用于蛋白富集。例如实例III-1所示的，吖丙碇类属于蛋白交联基团，这类化学基团在光照下可以产生活性的卡宾中间体，卡宾可以迅速得插入临近的C-H或者N-H之间，共价进行交联。另外一类基团是炔基，炔基可以通过“点击化学”与叠氮基团进行反应，形成三氮唑的中间体。双功能的非天然氨基酸的优势在于既可以进行光交联，又提高了后续蛋白富集的特异性，减少了后续分子的工作量。
第IV类非天然氨基酸是具有四氮唑的非天然氨基酸。四氮唑是一类具有特殊性质化学基团，其环上相对苯环而言缺电子，容易发生亲核取代反应，四氮唑上的氯可以与氨基发生亲核取代与丹巴进行交联。四氮唑本身可以与环张力的炔进行“点击化学”反应，进行共价交联，作为一种光交联探针使用。
第V类非天然氨基酸是4位取代的7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)非天然氨基酸，这类非天然氨基酸具有特殊的性质，NBD基团在分子内或者距离近时能够与氨基发生反应，产生共价结合。7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑化合物是一类具有特殊荧光性质的基团，当4-为连接原子为氧时，可以被分子内或者距离在一定范围内的氨基所取代。被氨基取代后，化合物会产生荧光，可以被作为一种分子探针，来监测蛋白-蛋白之间相互作用。由于具有相互作用的蛋白之间的距离是十分接近的，可以通过这种距离上的优势进行光交联。
第VI类非天然氨基酸是酪氨酸的衍生物，在酪氨酸侧链有一个含有吖丙碇基团的侧链，这个侧链可以在光照条件下形成高活性的卡宾中间体，并与临近的C-H和N-H键进行共价结合。
本发明的一个目的是提供通式(I)所示的化合物、其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物。
本发明的另一个目的是提供通式(I)所示的化合物以及其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物，在目标蛋白质中定点表达，并用于蛋白质-蛋白质相互作用的研究中作为捕捉相互作用的蛋白质交联技术及其在质谱中检测交联片段并鉴定相互作用的蛋白质中的用途。
本发明的另一个目的是提供通式(I)所示的化合物以及其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物，在目标蛋白质中定点表达，并用于蛋白质相互作用中作为化学探针，进行氟信号的检测研究蛋白质相互作用的用途。
本发明的另一个目的是提供通式(I)所示的化合物以及其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物，在生物药大分子如蛋白质药物、抗体、纳米抗体中定点表达；并用于蛋白质定点修饰，连接药物分子如各类细胞毒素药物分子如微管蛋白抑制剂(MMAE、MMAF、MD1、MD4)、烷化剂、DNA小沟抑制剂(烯二炔类抗生素)，蛋白降解剂，同位素核素，荧光成像分子等，修饰后的蛋白质作为生物药在疾病治疗和成像分子在生物医药中的用途。
本发明的另一个目的是提供该类化合物的重要中间体及制备方法。
本发明提供如下通式(I)所示的化合物以及其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物：
Figure BDA0002143594070000031
Figure BDA0002143594070000041
其中，当X为–A–(CH2)2–NH–，Y为–C(O)–时,
A选自CH2、O、S或Se；
Z为
Figure BDA0002143594070000042
其中R1、R2、R3、R4、R5各自独立地任选自氢、氘、或卤素，且Z不为
Figure BDA0002143594070000043
Figure BDA0002143594070000044
当X为–A–(CH2)2–NH–，Y选自–C(O)–O–或–C(O)–NH–时，
或者X为–CH2–A–(CH2)2–，Y为–C(O)–NH–时，
A选自CH2、O、S、Se；
Z为
Figure BDA0002143594070000045
Figure BDA0002143594070000046
其中R6，R7各自独立地任选自氢、氘、卤素、氰基、甲酰基、C1-C3烷基羰基，C1-C3烷氧基羰基、C1-C3烷基磺酰基、C1-C3烷基胺基羰基或氨基羰基；
R8为氢、氘或卤素；
n1为0、1、2或3；
n2为1、2、3、4、5或6；
当X为–(Ph)–，Y为–O–时，
Z为
Figure BDA0002143594070000047
n3为1、2或3；
n4为1、2、3、4或5；
R9选自氢、氘、卤素；
R10选自CH3或CF3
当X–Y–Z为
Figure BDA0002143594070000048
时，R11为氢、氘或卤素。
优选地，通式(I)所示的化合物以及其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物，其中，
当X为–A–(CH2)2–NH–，Y为–C(O)–时,
A选自CH2、O、S或Se；
Z为
Figure BDA0002143594070000051
其中R1、R2、R3、R4、R5各自独立地任选自氢、氘或卤素，且Z不为
Figure BDA0002143594070000052
Figure BDA0002143594070000053
当X为–A–(CH2)2–NH–，Y选自–C(O)–O–或–C(O)–NH–时,
或者X为–CH2–A–(CH2)2–，Y为–C(O)–NH–时；
A选自CH2、O、S或Se；
Z为
Figure BDA0002143594070000054
Figure BDA0002143594070000055
R6，R7为氢、氘、卤素、氰基、甲酰基、C1-C2烷基羰基，C1-C2烷氧基羰基或氨基羰基；
R8为卤素；
n1为0、1、2或3；
n2为1、2、3、4、5或6；
当X为–(Ph)–，Y为–O–时，
Z为
Figure BDA0002143594070000056
n3为1、2或3；
n4为1、2、3、4或5；
R9为卤素；
R10为CH3或CF3。
当X–Y–Z为
Figure BDA0002143594070000057
时，R11为氢、氘或卤素。
进一步优选地，通式(I)所示的化合物以及其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物，其中通式(I)的化合物选自如下通式：
Figure BDA0002143594070000061
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、n1、n2、n3、n4、A和Z的定义与上述定义中相同，且
Figure BDA0002143594070000062
不为
Figure BDA0002143594070000063
在一优选实施方式中，通式(I)所示的化合物以及其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物，其中通式(I)的化合物选自如下通式：
Figure BDA0002143594070000064
Z为
Figure BDA0002143594070000065
Figure BDA0002143594070000071
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、n2、n3、n4和A的定义与上述定义中相同，且
Figure BDA0002143594070000072
不为
Figure BDA0002143594070000073
更优选地，通式(I)的化合物以及其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物，其中通式(Ⅰ)的化合物可选自下列化合物之一：
Figure BDA0002143594070000074
Figure BDA0002143594070000081
其对映体、消旋体、同位素化合物、前体化合物及各种形式的盐或其水合物。
通式(I)所示的化合物可以含有一个或多个不对称或手性中心，因此可以以不同立体异构体形式存在。本发明化合物包括所有立体异构体形式，包括但不限于对映异构体和它们的混合物(如外消旋体)，均包括在本发明的范围内。
术语“取代”指特定的基团上的一个或多个氢原子被特定的取代基所取代。除非特别说明，某个任意取代的基团可以在该基团的任何可取代的位点上具有一个选自特定组的取代基，所述的取代基在各个位置上可以是相同或不同的。
本领域技术人员应理解，本发明所预期的取代基的组合是那些稳定的或化学上可实现的组合。本发明中相关结构上的取代，包括取代和未取代，如“可选地”被某种取代基取代，是指包括被某种取代基取代或者未取代的含义。
本发明中提到的当取代基数>1时，R取代基可以为相同或不同的取代基，指当某一种结构中取代基数为多个时，R的取代基组合可以为选自多种不同类型的取代基。
术语“取代”只适用于能够被取代基所取代的位点，不包括在现有的化学知识上不能实现的取代。
术语“对映体”是指互为镜像而不可重叠的立体异构体。
“消旋体”是指两个互为镜像的立体异构体，旋光性相反，互相抵消了旋光性。
“各种形式的盐”是非天然氨基酸分子与对应的有机酸、无机酸或者有机碱、无机碱形成相应的盐的，例如盐酸、甲酸、三氟乙酸、琥珀酸、甲磺酸盐等。
“水合物”是指含有水的化合物。
术语“卤素”包括氟、氯、溴或碘。
术语“C1-C3烷基羰基”非限制性地包括甲酰基、甲基羰基、乙基羰基。
术语“C1-C3烷氧基羰基”非限制性地包括甲氧基羰基、乙氧基羰基。
术语“C1-C3烷基磺酰基”非限制性地包括甲基磺酰基、乙氧磺酰基，丙基磺酰基，异丙基磺酰基。
术语“C1-C3烷基氨基羰基”非限制性地包括甲胺基羰基、乙胺基羰基、丙胺基羰基、异丙胺基羰基。
术语“同位素化合物”非限制性地包括氢原子被氘带，包括本技术领域可实现被氘带的位置；卤素原子被其同位素原子替换。
术语“前体化合物”非限制性地指本发明中的化合物的氨基被Boc、Cbz、Fmoc、苄基保护，或者本发明中的化合物的羧基形成甲酯、乙酯、叔丁酯等。
术语“细胞毒素”非限制性地指，对特定的细胞造成毒性作用的能力或趋势，可对细胞造成损伤或死亡；如MD1、MD4指美登毒素类化合物，MMAE指Monomethyl auristatin E，MMAF指Monomethylauristatin F
在本发明中，除非特别指出，所用术语具有本领域技术人员公知的一般含义。
本发明也包含这里公布的任何一种新的中间体。
本发明有一个方面提供了通式(I)所示的化合物的制备方法，所述方法选自如下方法之一：
一种通式(I)化合物的合成方法参照化合物16的合成方法：
Figure BDA0002143594070000101
步骤I-1：化合物I-A在碳酸氢钠、水和丙酮条件下回流水解得到化合物I-B。
步骤I-2：化合物I-B溶于DMF，在咪唑存在条件下与叔丁基二甲基氯硅烷反应得到化合物I-C。
步骤I-3：化合物I-C溶于干燥的四氢呋喃，加入硼烷还原得到化合物I-D。
步骤I-4：化合物I-D溶于干燥的四氢呋喃中，加入对硝基苯基氯甲酸酯，加入N,N-二异丙基乙胺，室温反应过夜得到化合物I-E。将反应体系旋走溶剂，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤I-5：将BOC-L-赖氨酸溶于2N氢氧化钠水溶液中，将I-4所得的反应体系重新溶于四氢呋喃，逐滴加入到BOC-L-赖氨酸的溶液中，反应得到化合物I-E。
步骤I-6：将I-E溶于四氢呋喃中，加入1N的四丁基氟化铵溶液，室温反应过夜，得到化合物I-F。
步骤I-7：将化合物I-F溶于少量二氯甲烷，加入盐酸二氧六环溶液，室温反应过夜。反应完成后，旋走溶剂得到化合物I-G，即化合物I-1的盐酸盐形式。
一种通式(I)化合物的合成方法参照化合物3的合成方法：
所述化合物3的合成方法：
路线1：
Figure BDA0002143594070000102
步骤II-1：将化合物II-A溶于叔丁醇，加入二碳酸二叔丁酯、4-二甲氨基吡啶，室温反应过夜得到化合物II-B。
步骤II-2：将化合物II-B溶于甲醇，加入甲酸铵和钯碳，回流反应得到化合物II-C。
步骤II-3：将化合物II-D溶于DMF，加入2,5-二氟苯甲酸、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N-二异丙基乙胺，反应得到化合物II-D。
步骤II-4：将化合物I1-D溶于少量二氯甲烷，加入盐酸二氧六环溶液，反应完成后，旋走溶剂得到化合物II-E。
路线2:
Figure BDA0002143594070000111
步骤II-5：将BOC-L-赖氨酸溶于氢氧化钠溶液(1N)中，加入等体积四氢呋喃，之后加入2,5-二氟苯甲酰氯，反应完成得到化合物II-G。
步骤II-6：将II-F溶于少量二氯甲烷，加入盐酸二氧六环溶液。反应完成后，旋走溶剂得到化合物II-G。
附图说明
图1：非天然氨基酸16在GST 97位的定点表达，其蛋白胶SDS图(图1A)及经质谱确认分子量(图1B)。
图2：非天然氨基酸1和3在Ub 5位的定点表达，其蛋白胶SDS图及经质谱确认分子量，其中，图2A：化合物1在目标蛋白质分子Ub中的表达及分子量确认；图2B：化合物3在目标蛋白质分子Ub中的表达及分子量确认。
图3：非天然氨基酸16在目标蛋白质纳米抗体中的定点表达，并通过非天然氨基酸16发生光激活反应被荧光素分子修饰，蛋白胶SDS图及荧光成像图，其中，图3A：化合物16，图3B：纳米抗体未标记，图3C：纳米抗体被荧光素标记。
图4：非天然氨基酸16在目标蛋白质蛋中定点表达，并作为新的蛋白质交联技术捕捉其相互作用蛋白(MBP-Z)。图4A，非天然氨基酸16在Afb(Afb-33U)中的定点表达，在光激活条件下能够捕捉其相互作用蛋白质(MBP-Z)的蛋白胶SDS图；图4B，非天然氨基酸16在Afb(Afb-33U)中的定点表达并通过质谱确认分子量；图4C，Afb-33U捕捉其相互作用蛋白(MBP-Z)，其交联肽段经质谱分析获得确认。
具体实施方式
所有实施例中，1H NMR由Bruker Avance III-300或Avance III-400型核磁共振仪记录，化学位移以δ(ppm)表示；质谱由MS质谱UPLC-MS(ESI)测定；其中UPLC型号是WatersHPLC H-CLASS，MS(ESI)的型号是Waters SQ Detector 2；无水四氢呋喃由二苯甲酮/金属钠回流干燥除氧制得，无水甲苯和无水二氯甲烷由氯化钙回流干燥制得；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等用于柱层析流动相的溶剂均购置于国药集团化学试剂有限公司；反应检测中使用的薄层层析硅胶板(HSGF254)来自国药集团化学试剂有限公司；化合物分离选用国药集团化学试剂有限公司的200-300目硅胶。本发明中原料可以从商业途径获得，如主要试剂购买于国药集团化学试剂有限公司，或者通过本领域抑制的方法制备，或者根据本发明中所述方法制备。
实施例1：
Figure BDA0002143594070000121
步骤I-1：将4-溴甲基-3-硝基苯甲酸(5.0g，19.31mmol，1.0eq)溶于60mL丙酮中，加入60mL水，搅拌均匀。之后加入无水碳酸钠(7.16g，67.58mmol，3.5eq)。所得混合物在70℃反应2小时。用LC-MS监测反应。反应完成后，用2N的盐酸调节pH到3～4，乙酸乙酯萃取，干燥，旋走溶剂得到4.02g黄色固体，无需进一步纯化，直接投下一步。ESI-MS[M-H]-m/z＝196.09.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.79(d,J＝1.6Hz,1H),8.36(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),7.96(d,J＝8.2Hz,1H),5.11(s,2H).
步骤I-2：将上步得到的化合物溶于50mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入叔丁基二甲基氯硅烷(5.82g，38.62mmol，2.0eq)和咪唑(2.63g，38.62mmol，2.0eq)。所得混合物在室温条件下搅拌反应过夜。反应完成后，用乙酸乙酯稀释，1N的盐酸溶液洗涤，干燥，柱层析纯化得到4.69g黄色固体，两步收率为78％。ESI-MS[M-H]-m/z＝310.21.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.82(d,J＝1.6Hz,1H),8.39(dd,J＝8.2,1.6Hz,1H),8.09(d,J＝8.2Hz,1H),5.17(s,2H),0.98(s,9H),0.16(s,6H).
步骤I-3：将化合物I-C(4.69g，15.06mmol，1.0eq)溶于50mL无水四氢呋喃中，冰浴，加入硼烷(1M，2.0eq，30.12mmol，30.12mL)，之后在50℃反应2小时。反应完成后，冰浴条件下用甲醇淬灭反应，旋走溶剂，柱层析得到4.03g黄色油状物，收率为90％。ESI-MS[M-H]-m/z＝296.35.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(s,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,1H),7.66(d,J＝8.9Hz,1H),5.08(s,2H),4.79(s,2H),0.96(s,9H),0.14(s,6H).
步骤I-4：化合物I-D(4.03g，13.55mmol，1.0eq)溶于50mL干燥的四氢呋喃中，加入对硝基苯基氯甲酸酯(4.37g，21.68mmol，1.6eq)，加入N,N-二异丙基乙胺(7.21mL，40.65mmol，3.0eq)，室温反应过夜得到化合物I-E。将反应体系旋走溶剂，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤I-5：将BOC-L-赖氨酸(5.0g，20.33mmol，1.5eq)溶于2N氢氧化钠水溶液中，将I-4所得的反应体系重新溶于四氢呋喃，逐滴加入到BOC-L-赖氨酸的溶液中，反应30分钟。反应完成后，用2N盐酸调节pH到3～4，乙酸乙酯萃取、干燥、过柱得到2.98g黄色油状物，两步反应收率为39％。ESI-MS[M-H]-m/z＝568.49.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.39(s,1H),8.03(d,J＝1.3Hz,1H),7.83-7.71(m,2H),7.35(t,J＝5.6Hz,1H),7.01(d,J＝8.0Hz,1H),5.10(s,2H),5.02(s,2H),3.86-3.69(m,1H),2.97(dd,J＝12.4,6.3Hz,2H),1.68-1.46(m,2H),1.43–1.27(m,13H),0.90(s,9H),0.13–0.06(m,6H).
步骤I-6：将I-E(2.98g，5.23mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃中，加入1N的四丁基氟化铵溶液，室温反应过夜，旋走溶剂，乙酸乙酯稀释，1N盐酸洗涤，干燥，柱层析纯化得到1.95g黄色油状物，收率为82％。ESI-MS[M-H]-m/z＝454.42.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.48(s,1H),8.10(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.87(d,J＝8.1Hz,1H),6.63(s,1H),5.12(d,J＝7.5Hz,1H),5.05(d,J＝5.8Hz,2H),4.14(dd,J＝16.6,9.4Hz,1H),3.56-3.41(m,2H),2.65(s,1H),1.35-1.63(m,4H),1.48-1.36(d,J＝7.4Hz,11H).
步骤I-7：将化合物I-F(1.95g，4.28mmol)溶于少量二氯甲烷，加入盐酸二氧六环溶液，室温反应过夜。反应完成后，旋走溶剂得到化合物I-G，即化合物I-1的盐酸盐形式。[M-H]-m/z＝354.35.ESI-MS[M+H]+m/z＝356.48.1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.81(s,1H),8.24(s,3H),8.01(s,1H),7.83(d,J＝7.9Hz,1H),7.72(d,J＝7.7Hz,1H),7.38(s,1H),5.58(s,1H),5.10(s,2H),4.81(s,2H),3.87(s,1H),2.99(dd,J＝12.0,5.7Hz,2H),1.81-1.71(m,2H),1.47-1.35(m,4H).
实施例2：
Figure BDA0002143594070000131
步骤II-1：在室温条件下，向100mL叔丁醇溶液的500mL圆底烧瓶中加入N-Boc-L-赖氨酸(10.0g，40.60mmol，1.0eq)，加入二碳酸二叔丁酯(6.08g，27.86mmol，1.06eq)，再加入4-二甲氨基吡啶((1.61g，13.14mmol，0.5eq)，将得到的混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后，在真空下除去叔丁醇，将残余固体重新溶解在300mL的乙酸乙酯中，然后依次用饱和氯化铵和饱和氯化钠水溶液洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到10.26g无色油状粗产物。该油状物未经纯化直接用于下一步反应。
步骤II-2：在室温条件下，将上一步的粗产物溶解在200mL甲醇溶液中，加入甲酸铵(7.58g，120.25mmol，5.0eq)，再加入Pd-C(10％，1.00g)。将所得混合物在80℃下回流2小时。反应完成后，将混合物过滤后真空浓缩。将残余固体用300mL乙酸乙酯稀释后，用饱和碳酸氢钠洗涤2次。有机相用无水硫酸钠干燥并真空浓缩。柱色谱法纯化粗产物后，得到5.89g无色油状物(两步收率为74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.08(d,J＝8.2Hz,1H),4.20–4.09(m,1H),2.76(m,2.80-2.70,2H),1.82-1.50(m,4H),1.51-1.43(m,20H).
步骤II-3：在室温条件下，将(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯(1.0g，3.31mmol，1.0eq)溶解在20mL DMF溶液中，加入2-氟苯甲酸(576mg，3.64mmol，1.1eq)，然后加入N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(1.83g，4.95mmol，1.5eq)溶解，再逐滴加入DIPEA(1.64mL，9.93mmol，3.0eq)。将得到的混合物在室温下搅拌10分钟。反应完成后，将混合物用乙酸乙酯稀释，用饱和氯化钠水溶液洗涤5次。有机相用无水硫酸钠干燥并真空浓缩。柱色谱法纯化粗产物后，得到黄色油状物1.27g(91％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10-8.00(m,1H),7.43(td,J＝7.3,1.5Hz,1H),7.22(t,J＝7.5Hz,1H),7.08(dd,J＝12.0,8.4Hz,1H),6.83–6.68(m,1H),5.09(d,J＝7.8Hz,1H),4.14(d,J＝5.2Hz,1H),3.52–3.39(m,2H),1.86–1.54(m,4H),1.43(t,J＝12.9Hz,20H).ESI-MS[M+H]+m/z＝425.55,ESI-MS[M-H]-m/z＝423.35.
步骤II-4：在室温下，将N6-(2-氟苯甲酰基)-N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯(1.27g，2.99mmol，1.0eq)溶于5mL二氯甲醇中，加入HCl的1,4-二氧六环溶液20mL。将反应体系在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系真空浓缩，得到1.28g白色固体(>99％)。1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.49(s,1H),8.31(t,J＝4.8Hz,1H),8.32–7.86(m,2H),7.58(td,J＝7.5,1.8Hz,1H),7.51(tdd,J＝8.3,5.3,1.8Hz,1H),7.31–7.24(m,2H),3.75(dd,J＝12.5,6.4Hz,1H),3.23(dd,J＝13.0,6.7Hz,2H),1.84–1.69(m,1H),1.55–1.33(m,4H).ESI-MS[M+H]+m/z＝269.26,ESI-MS[M-H]-m/z＝267.21.
实施例3：
Figure BDA0002143594070000141
步骤III-1：将化合物III-A(5.0g，23.04mmol，1.0eq)溶于干燥的四氢呋喃中，冰浴条件下加入硼烷(69.12mL，3.0eq)，加热至50℃反应2小时，反应完成，加入甲醇淬灭反应，旋走溶剂，柱层析纯化得到4.42g棕色产物，收率为95％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.85(s,1H),7.22(d,J＝8.1Hz,1H),6.96(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),6.92(d,J＝1.9Hz,1H),5.03(s,1H),4.41(s,2H).
步骤III-2：将化合物III-B(4.08g，20.09mmol，1.0eq)溶于丙酮中，加入无水硫酸钠(14.27g，100.45mmol，5.0eq)、对甲苯磺酸(380mg，2.0mmol，0.1eq)、和2,2-二甲氧基丙烷(21.0g，200.9mmol，10.0eq)，40℃反应。反映完成后，乙酸乙酯稀释，依次用饱和碳酸氢钠洗涤，饱和氯化钠洗涤，干燥，过柱得到380mg淡黄色油状物，收率为85％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.07–7.00(m,2H),6.85(d,J＝8.0Hz,1H),4.81(s,2H),1.55(s,6H).
步骤III-3：无水无氧操作，将化合物III-C(4.14g，17.03mmol，1.0eq)溶于干燥四氢呋喃中，-78℃搅拌15分钟，逐滴加入正丁基锂(7.5mL，18.73mmol，1.1eq)，滴加完成后继续反应30分钟，后加入三氟乙酸乙脂(4.84g，34.06mmol，2.0eq)，继续反应1小时。反应完成后，用甲醇淬灭反应，旋走溶剂，柱层析纯化最终得到4.20g黄色油状物，收率为95％。
步骤III-4：将化合物III-D(4.06g，15.59mmol，1.0eq)溶于20mL无水乙醇，依次加入20mL吡啶、盐酸羟胺(3.25g，46.76mmol，3.0eq)，加热至80℃反应。反应完成后乙醚稀释，酸水洗涤，干燥，柱层析纯化得到3.56g黄色油状物(含有杂质)。
步骤III-5：将上步所得化合物III-E(3.56g)溶于20mL二氯甲烷中，依次加入三乙胺(2.70g，19.40mmol，1.5eq)、对甲苯磺酰氯(2.71g，14.22mmol，1.1eq)、4-二甲氨基吡啶(790mg，6.47mmol，0.5eq)，反应完成得到5.54g黄色油状物，收率为83％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(dd,J＝8.3,3.5Hz,2H),7.41–7.35(m,2H),7.18–6.75(m,5H),4.86(d,J＝3.9Hz,2H),2.47(d,J＝6.5Hz,3H),1.57–1.49(m,8H).
步骤III-6：将化合物III-F(1.0g，2.33mmol)溶于甲醇中，通入液氨反应得到化合物III-G，反应完成后，旋走溶剂，柱层析纯化得到355mg油状物，产率为50％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.14(d,J＝7.9Hz,1H),7.09(s,1H),7.02(d,J＝7.9Hz,1H),4.85(s,2H),2.76(d,J＝8.8Hz,1H),2.20(d,J＝8.5Hz,1H),1.54(s,6H).
步骤III-7：将化合物III-G(335mg，1.22mmol，1.0eq)溶于甲醇中，加入三乙胺(395μL，3.05mmol，2.5eq)，碘粒氧化直至碘粒不褪色。之后用乙酸乙酯稀释，饱和硫代硫酸钠洗涤，干燥，过柱得到102mg黄色油状物，收率为30％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.99(d,J＝8.6Hz,1H),6.68(d,J＝6.7Hz,2H),4.84(s,2H),1.53(s,6H).
步骤III-8：将化合物III-H(102mg，0.37mmol)溶于2mL乙醇中，加入盐酸(1N)1mL加热反应。反应完成后一算你之稀释，饱和碳酸氢钠洗涤，干燥，过柱得到75mg淡黄色附体，收率为86％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.93(s,1H),7.41(d,J＝7.9Hz,1H),6.69(s,1H),6.59(d,J＝7.9Hz,1H),4.47(s,2H),3.34(s,1H).
步骤III-9：将化合物III-I(75mg，0.32mmol，1.0eq)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入碳酸钾(88mg，0.64mmol，2.0eq)和溴丙炔(92mg，0.48mmol，1.5eq)，反映过夜。反应完成后，乙酸乙酯稀释，饱和氯化钠洗涤，干燥，过柱得到69mg黄色油状物，收率为80％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.38(d,J＝7.8Hz,1H),6.83(d,J＝10.7Hz,2H),4.76(d,J＝2.4Hz,2H),4.70(d,J＝6.3Hz,2H),2.57(t,J＝2.4Hz,1H),2.09(t,J＝6.4Hz,1H).
步骤III-10：将化合物III-J(1.15g，4.26mmol，1.0eq)溶于无水四氢呋喃中，加入对硝基苯基氯甲酸酯(1.29g，6.38mmol，1.5eq)，加入N-甲基吗啡啉(689mg，6.82mmol，1.6eq)室温反应过夜得到化合物III-K。所得化合物旋走溶剂，不需要进一步纯化，直接投下一步。
步骤III-11：将BOC-L-赖氨酸(1.15g，4.65mmol，1.5eq)溶于2N氢氧化钠水溶液中，将III-10所得的反应体系重新溶于四氢呋喃，逐滴加入到BOC-L-赖氨酸的溶液中，反应30分钟，处理得到1.13g淡黄色油状物，收率为49％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(d,J＝7.5Hz,1H),6.81(d,J＝8.3Hz,2H),5.14(t,J＝14.2Hz,3H),4.89(s,1H),4.73(d,J＝2.3Hz,2H),4.28(s,1H),3.20(d,J＝6.4Hz,2H),2.55(t,J＝2.3Hz,1H),1.44(s,9H).ESI-MS[M+H]+m/z＝543.49,ESI-MS[M-H]-m/z＝541.44.
步骤III-12：将III-L溶于少量二氯甲烷中，加入盐酸二氧六环反应过夜得到化合物III-M。其中III-M为III-1的盐酸盐。1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.77(s,1H),8.23(s,3H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.34(t,J＝5.4Hz,1H),6.99(d,J＝7.9Hz,1H),6.90(s,1H),5.00(s,2H),4.93(s,2H),3.87(s,1H),3.66(s,1H),2.98(d,J＝6.0Hz,2H),1.77(t,J＝12.4Hz,2H),1.41(s,4H).ESI-MS[M+H]+m/z＝443.35,ESI-MS[M-H]-m/z＝441.30.
实施例4：
Figure BDA0002143594070000161
步骤IV-1：将化合物IV-A(2.0g，10.24mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃中，加入对硝基苯基氯甲酸酯(2.48g，12.29mmol，1.2eq)，N,N-二异丙基乙胺(2.65g，20.48mmol，2.0eq)。室温反应过夜得到化合物IV-B。反应体系旋走溶剂，无需进一步纯化，直接用于下一步反应。
步骤IV-2：将IV-1中所得混合重新溶于四氢呋喃中，加入N,N-二异丙基乙胺(1.99g，15.36mmol，1.5eq)、(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯(3.41g，11.26mmol，1.1eq)，反应得到化合物IV-C，柱层析纯化直接投下一步。
步骤IV-3：将化合物IV-C溶于甲醇、加入甲酸铵、钯碳，加热回流脱去苄氧碳基保护基得到化合物IV-D，最终得到1.13g黄色油状物，三步收率为28％。
步骤IV-4：将化合物IV-D(1.13g，2.9mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃中，加入二氯均四嗪(0.48g，3.19mmol，1.1eq)和N,N二异丙基乙胺(562mg，4.35mmol，1.5eq)。反应完成得到1.18mg红色油状物，收率为81％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.49(s,1H),5.11(d,J＝7.9Hz,1H),4.89(s,1H),4.36(s,2H),3.82(d,J＝5.0Hz,2H),3.26–3.08(m,2H),1.58–1.39(m,24H).ESI-MS[M+H]+m/z＝504.52,ESI-MS[M-H]-m/z＝502.47.
步骤IV-5：将化合物溶于少量二氯甲烷，加入盐酸二氧六环。反应完成得到化合物IV-F。ESI-MS[M+H]+m/z＝384.24,ESI-MS[M-H]-m/z＝346.23.
实施例5：
Figure BDA0002143594070000171
步骤V-1：将化合物V-A(3.0g，15.03mmol，1.0eq)溶于乙二醇中，加入氢氧化钠(1.2g，30.67mmol，2.0eq)，反应得到3.05g棕色固体，收率为90％。1H NMR(400MHz,CD3OD))8.64(1H,d,J＝8Hz),6.97(1H,d,J＝8Hz),4.50(2H,t,J＝4Hz),4.04(2H,t,J＝4Hz).
步骤V-2：将化合物V-B(3.05g，13.55mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃中，加入对硝基苯基氯甲酸酯(4.37g，21.67mmol，1.6eq)，加入N,N-二异丙基乙胺(5.25g，40.65mmol，3.0eq)反应过夜，所得混合物无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤V-3：将上步所得混合物加入BOC-L-赖氨酸(5.0g，20.33mmol，1.5eq)溶于2N氢氧化钠水溶液中，反应得到3.51g黄色固体，收率为52％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.55(d,J＝8.3Hz,1H),6.82–6.72(m,1H),5.20(d,J＝7.5Hz,1H),4.68–4.50(m,4H),4.27(s,1H),3.20(dd,J＝12.9,6.5Hz,2H),1.92–1.67(m,2H),1.55(d,J＝5.0Hz,2H),1.43(s,11H).ESI-MS[M-H]-m/z＝496.36.
步骤V-4：将V-D溶于少量二氯甲烷，加入盐酸二氧六环，反应得到化合物V-E。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ13.75(s,1H),8.74(dd,J＝8.4,5.6Hz,1H),8.32(s,3H),7.36(t,J＝5.6Hz,1H),7.11(dd,J＝14.8,8.5Hz,1H),4.70–4.60(m,2H),4.43(dd,J＝13.4,9.3Hz,2H),3.85(s,1H),3.42(dt,J＝24.3,7.4Hz,1H),2.97(dd,J＝12.3,6.2Hz,2H),1.77(t,J＝14.9Hz,2H),1.43–1.21(m,4H).ESI-MS[M+H]+m/z＝398.35,ESI-MS[M-H]-m/z＝396.38.
实施例6：
Figure BDA0002143594070000172
步骤VI-1：在0℃条件下，将4-羟基-2-丁酮(10g，113.5mmol，1.0eq)溶于氨的甲醇溶液中，反应3小时后，滴加羟胺磺酸(14.12g，124.85mmol,1.1eq)的甲醇溶液。将所得溶液升至室温下过夜。反应完成后将反应体系真空浓缩，然后将剩余的残余固体重新悬浮在甲醇溶液中后过滤，滤液于0℃条件下加入三乙胺，然后缓慢加入碘单质(14.4g，56.75mmol，0.5eq)直至溶液维持深棕色不褪色。将该溶液用乙酸乙酯稀释后，依次用1mol/L的盐酸和硫代硫酸钠的水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到淡黄色油状物2.1g(19％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.52(t,J＝6.3Hz,2H),1.62(q,J＝6.0Hz,2H),1.06(s,3H).
步骤VI-2：在室温条件下，将上一步产物(2.1g，20.97mmol，1eq)溶于20mL吡啶溶液中，于0℃条件下加入4-甲基苯磺酰氯(p-TsCl)(5.6g，29.36mmol，1.4eq)，然后升至室温下反应1h。反应完成后，加入乙酸乙酯稀释后，依次用1mol/L的盐酸溶液和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩后柱层析，得到淡黄色油状物2.1g(40％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.80(t,J＝7.5Hz,2H),7.36(d,J＝8.1Hz,2H),3.94(t,J＝6.4Hz,2H),2.45(s,3H),1.70–1.63(m,2H),0.99(s,3H).
步骤VI-3：在室温条件下，将上一步的产物(2.1g，8.26mmol，1.0eq)溶于40mL的DMF中，加入碳酸铯(Cs2CO3)(8.07g，24.78mmol，3eq)和N-[叔丁氧羰基]-L-酪氨酸叔丁酯(4.18g，12.39mmol，1.5eq)，在80℃条件下反应1小时。反应完成后，加入乙酸乙酯稀释后，依次用水和饱和碳酸钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩后柱层析，得到淡黄色油状物3.1g(89％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.07(d,J＝8.6Hz,2H),6.81(d,J＝8.6Hz,2H),4.96(d,J＝8.0Hz,1H),4.40(dd,J＝13.8,6.1Hz,1H),3.84(t,J＝6.3Hz,2H),2.98(dd,J＝11.1,8.2Hz,2H),1.79(t,J＝6.3Hz,2H),1.41(d,J＝3.3Hz,18H),1.11(s,3H).ESI-MS[M+H]+m/z＝420.41.
步骤VI-4：在室温条件下，将上一步产物(3.1g，7.39mmol,1.0eq)溶于10mL二氯甲醇中，加入HCl的1,4-二氧六环溶液30mL。将反应体系在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系真空浓缩，将得到的固体用二氯甲烷洗涤后干燥，得到1.423g白色固体(64％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.78(s,1H),8.45(d,J＝37.4Hz,3H),7.23–7.14(m,2H),6.89(dd,J＝8.6,3.6Hz,2H),4.14–4.03(m,1H),3.84(dd,J＝10.9,5.9Hz,2H),3.18–3.03(m,2H),1.78(dd,J＝10.7,5.9Hz,2H),1.06(d,J＝2.7Hz,3H).ESI-MS[M+H]+m/z＝264.57.
实施例7：
非天然氨基酸16在GST蛋白质中97位的定点表达，蛋白胶SDS图及经质谱确认分子量
目标蛋白质GST的序列为：
MTSSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGUVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKHHHHHHHH。
U表述非天然氨基酸16被定点引入的位置。
图1表明非天然氨基酸16通过改造后的氨酰tRNA以及氨酰tRNA合成酶突变体，可以顺利地被定点引入到目标蛋白质GST 97U的定点表达；在大肠杆菌表达体系中，培养基中没有非天然氨基酸16加入时没有发现全长的GST蛋白，而在添加1mM的非天然氨基酸16时，可以获得全长的GST蛋白(>4mg/L的表达量)。表达获得的蛋白质通过质谱确认，结合该蛋白质序列，非天然氨基酸16在全长的GST蛋白质97位(U位置)的理论分子量为27051.26Da，质谱中检测获得的分子量为27050.67Da。因此从这部分数据可以证明非天然氨基酸16可以很好地在目标蛋白质中顺利地实现被定点引入，并获得较好的表达效率；同时获得的蛋白质通过质谱得到确认。
实施例8：
非天然氨基酸1、3在目标蛋白质中5位的定点表达，蛋白胶SDS图及经质谱确认分子量
图2表明非天然氨基酸1和非天然氨基酸3，通过改造后的氨酰tRNA以及氨酰tRNA合成酶突变体，可以顺利地被定点引入到目标蛋白质泛素蛋白(Ub)的定点表达；在大肠杆菌表达体系中，培养基中没有非天然氨基酸1或3加入时没有发现全长的Ub蛋白，而在添加1mM的非天然氨基酸1或3时，可以获得全长的Ub蛋白(>5mg/L的表达量)。表达获得的蛋白质通过质谱确认，结合该蛋白质序列，非天然氨基酸1或3在全长的Ub蛋白质5位(U位置)的理论分子量为分别为10288.56Da和10306.55，质谱中检测获得的分子量为10288.00Da和10306.00Da。因此从这部分数据可以证明非天然氨基酸1和3可以很好地在目标蛋白质中顺利地实现被定点引入，并获得较好的表达效率；同时获得的蛋白质通过质谱得到确认。
实施例9：
非天然氨基酸16在目标蛋白质纳米抗体中的定点表达，并通过非天然氨基酸16发生光激活反应被标记荧光素分子，蛋白胶SDS图及荧光成像
图3表明非天然氨基酸16通过改造后的氨酰tRNA以及氨酰tRNA合成酶突变体，可以顺利地被定点引入到目标蛋白质纳米抗体中的定点表达；在大肠杆菌表达体系中，培养基中没有非天然氨基酸16加入时没有发现全长的纳米抗体，而在添加1mM的非天然氨基酸16时，可以获得全长的纳米抗体蛋白(>6mg/L的表达量)；表达获得的蛋白质通过质谱确认。因此从这部分数据可以证明非天然氨基酸16可以很好地在目标蛋白质纳米抗体中顺利地实现被定点引入，并获得较好的表达效率；同时获得的蛋白质通过质谱得到确认；并通过非天然氨基酸16在光激活反应条件下，纳米抗体被荧光素分子修饰。通过蛋白胶SDS图及荧光成像图，可以证明纳米抗体高效地被荧光素分子标记。从该实施例结果可以表明，本发明的非天然氨基酸可以被定点引入到在生物药大分子如蛋白质药物、抗体、纳米抗体中定点表达；并用于蛋白质定点修饰，连接药物分子如各类细胞毒素药物分子如微管蛋白抑制剂(MMAE、MMAF、MD1、MD4)、烷化剂、DNA小沟抑制剂(烯二炔类抗生素)，蛋白降解剂，同位素核素，荧光成像分子等，连接修饰后的蛋白质作为生物药和生物大分子成像分子在生物医药中的用途。
实施例10：
非天然氨基酸16在目标蛋白质Afb中的定点表达，并通过非天然氨基酸16在发生光激活条件下捕捉其相互作用蛋白质，蛋白胶SDS图及交联质谱图
蛋白质Afb(Afb-33U)的序列如下所示：
MTSVDNKFNKELSVAGREIVTLPNLNDPQKKAUIFSLWDDPSQSANLLAYAKKLNDAQAPKGSHHHHHH。U表示非天然氨基酸16在该位置被定点引入。
MBP-Z的序列如下所示：
HHHHHHHHGGPCMKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGSSGLVPRGSHGTSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKLE。
将目标蛋白质Afb(Afb-33U)和MBP-Z蛋白在PBS缓冲溶液中0℃孵育后，在紫外365nM的光照条件下(1-10分钟)，经SDS变性蛋白胶分离并用库马斯兰染色。将SDS胶中交联的蛋白(如图4A中Crosslink的蛋白)切割下来，将胶块切成小粒转入干净eppendorf管中，脱色去除上清。加入20mM DTT(50mM NH4HCO3)56℃反应30min。加入乙腈脱水后，加入IAA使终浓度为100mM(50mM NH4HCO3)，室温避光反应20min。加入Trypsin酶解37℃反应12小时。第二天，样品加入100ul 60％ACN/0.1％TFA，超声15分钟，吸出溶液，反复抽提3次，合并抽提液，冻干冷冻干燥后，加入0.1％甲酸水涡旋振荡使之充分溶解，样品12000rpm离心15min，取1/2上清加入上样瓶中质谱(orbitrap fusion)检测，pLink 2.1搜库检索交联肽段。
图4表明非天然氨基酸16在目标蛋白质蛋中定点表达，并作为新的蛋白质交联技术捕捉其相互作用蛋白(MBP-Z)。A，非天然氨基酸16在Afb(Afb-33U)中的定点表达，在光激活条件下能够捕捉其相互作用蛋白质(MBP-Z)的蛋白胶SDS图；B，非天然氨基酸16在Afb(Afb-33U)中的定点表达并通过质谱确认分子量；C，Afb-33U捕捉其相互作用蛋白(MBP-Z)，其交联肽段经质谱分析获得确认。
基于实施例10的实验结果，本发明的具有光交联活性的非天然氨基酸(如非天然氨基酸16)，可以在目标蛋白质中定点表达，并作为一种新的光交联技术捕捉相互作用的蛋白质。因此，本发明中的具有光交联活性的非天然氨基酸以及其对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物，在蛋白质中定点表达，并用于蛋白质-蛋白质相互作用的研究中作为捕捉蛋白质相互作用的交联技术及其在质谱中检测交联片段并鉴定相互作用的蛋白质中的用途。
综上，本发明提供了6类结构新颖的非天然氨基酸，这六类氨基酸能够通过“遗传密码扩充技术”定点引入到蛋白之中，在目标蛋白质中或者生物药大分子(如蛋白质药物、抗体、纳米抗体中)中被定点引入。引入非天然氨基酸之后的蛋白具有天然蛋白质所不具有的性质，例如：光交联活性、氟代核磁检测、蛋白富集功能、基于距离的交联活性，蛋白质定点被修饰及标记等。这些独特的性质赋予引入本发明的氨基酸后的蛋白质展现出新的功能，可以作为化学探针原位捕捉蛋白-蛋白之间的相互作用；同时还可以通过“点击化学”进行体外富集；通过非天然氨基酸进行对蛋白质的定点修饰和标记如连接药物分子(各类细胞毒素药物分子，微管蛋白抑制剂MMAE、MMAF、MD1、MD4、烷化剂、DNA小沟抑制剂烯二炔类抗生素)，同位素核素，荧光成像分子等，连接修饰后的蛋白质作为生物药在疾病治疗和生物大分子成像分子在生物医药中的用途。本发明中涉及氟代非天然氨基酸，可以作为核磁检测的信号来研究蛋白之间的相互作用。综上所述，本发明的涉及的非天然氨基酸具有非常强的应用前景，可以被应用到诸多领域，例如医疗检测、医疗诊断、生物大分子治疗药物、生物学机制研究、化学生物学研究、环境检测等，具有非常好的实用价值和实际意义。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
<120> 非天然氨基酸及其在蛋白质定点修饰和蛋白质相互作用中的用途
<130> DI19-1452-XC03
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GST
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Xaa=非天然氨基酸16
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(100)
<223> Xaa=非天然氨基酸16
<400> 1
Met Thr Ser Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val
1 5 10 15
Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu
20 25 30
His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe
35 40 45
Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp
50 55 60
Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys
65 70 75 80
His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met
85 90 95
Leu Glu Gly Xaa Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala
100 105 110
Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu
115 120 125
Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr
130 135 140
Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala
145 150 155 160
Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro
165 170 175
Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp
180 185 190
Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp
195 200 205
Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys His His His His
210 215 220
His His His His
225
<210> 2
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Afb
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Xaa=非天然氨基酸16
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Xaa=非天然氨基酸16
<400> 2
Met Thr Ser Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Ser Val Ala Gly
1 5 10 15
Arg Glu Ile Val Thr Leu Pro Asn Leu Asn Asp Pro Gln Lys Lys Ala
20 25 30
Xaa Ile Phe Ser Leu Trp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu
35 40 45
Ala Tyr Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Gly Ser His
50 55 60
His His His His His
65
<210> 3
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MBP-Z
<400> 3
His His His His His His His His Gly Gly Pro Cys Met Lys Ile Glu
1 5 10 15
Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly
20 25 30
Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val
35 40 45
Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala
50 55 60
Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe
65 70 75 80
Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys
85 90 95
Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr
100 105 110
Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu
130 135 140
Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu
145 150 155 160
Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala
165 170 175
Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys
180 185 190
Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu
195 200 205
Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser
210 215 220
Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn
225 230 235 240
Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly
245 250 255
Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu
275 280 285
Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu
290 295 300
Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr
305 310 315 320
Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn
325 330 335
Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe
340 345 350
Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln
355 360 365
Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn
370 375 380
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ser Ser Gly Leu Val
385 390 395 400
Pro Arg Gly Ser His Gly Thr Ser Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
405 410 415
Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu
420 425 430
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln
435 440 445
Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
450 455 460
Pro Lys Leu Glu
465
<210> 4
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ub
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Xaa=化合物 1 或 化合物 3
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=化合物 1 或 化合物 3
<400> 4
Met Thr Ser Met Xaa Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile
1 5 10 15
Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys
20 25 30
Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe
35 40 45
Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile
50 55 60
Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Leu Glu
65 70 75 80
His His His His His His His His
85

Claims (15)

1.一类如通式(Ⅰ)所示的化合物或其各种形式的盐：
Figure FDA0003435254040000011
当X为–A–(CH2)2–NH–，Y选自–C(O)–O–或–C(O)–NH–时，
或者X为–CH2–A–(CH2)2–，Y为–C(O)–NH–时，
A选自CH2、O、S、Se；
Z为
Figure FDA0003435254040000012
其中R6选自氢、氘、卤素、氰基、甲酰基、C1-C3烷基羰基，C1-C3烷氧基羰基、C1-C3烷基磺酰基、C1-C3烷基胺基羰基或氨基羰基；
n1为0、1、2或3；
当X–Y–Z为
Figure FDA0003435254040000013
时，R11为氢、氘或卤素。
2.如权利要求1所述的化合物或其各种形式的盐，其中，
当X为–A–(CH2)2–NH–，Y选自–C(O)–O–或–C(O)–NH–时,
或者X为–CH2–A–(CH2)2–，Y为–C(O)–NH–时；
A选自CH2、O、S或Se；
Z为
Figure FDA0003435254040000014
R6为氢、氘、卤素、氰基、甲酰基、C1-C2烷基羰基，C1-C2烷氧基羰基或氨基羰基；
n1为0、1、2或3。
3.如权利要求1所述的化合物或其各种形式的盐，其中通式(I)的化合物选自如下通式：
Figure FDA0003435254040000015
其中R11的定义与权利要求1中相同。
4.如权利要求1所述的化合物或其各种形式的盐，其中通式(I)的化合物选自如下通式：
Figure FDA0003435254040000021
Z为
Figure FDA0003435254040000022
其中R6和A的定义分别与权利要求1中相同。
5.如权利要求1所述的化合物或其各种形式的盐，其中通式(Ⅰ)的化合物可选自下列化合物之一：
Figure FDA0003435254040000023
6.权利要求1-5中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其各种形式的盐，在蛋白质中定点表达，并用于蛋白质-蛋白质相互作用的研究中作为捕捉相互作用的蛋白质交联技术及其在质谱中检测交联片段并鉴定相互作用的蛋白质中的用途。
7.权利要求1-5中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其各种形式的盐在制备疾病治疗试剂和成像分子中的用途，其中，所述通式(I)所示的化合物或其各种形式的盐通过在生物药大分子中定点表达；并用于蛋白质定点修饰，连接药物分子而被制备成所述疾病治疗试剂和成像分子。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述生物药大分子为蛋白质药物。
9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述生物药大分子为抗体。
10.根据权利要求7所述的用途，其中，所述生物药大分子为纳米抗体。
11.根据权利要求7所述的用途，其中，所述连接的药物分子为细胞毒素药物分子、烷化剂、DNA小沟抑制剂，蛋白降解剂，同位素核素或荧光成像分子。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述细胞毒素药物分子为微管蛋白抑制剂。
13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述微管蛋白抑制剂为MMAE、MMAF、MD1或MD4。
14.根据权利要求11所述的用途，其中，所述DNA小沟抑制剂为烯二炔类抗生素。
15.一种制备非天然氨基酸化合物16的方法，所述方法包括：
Figure FDA0003435254040000031
如以上反应式所示，
步骤I-1：化合物I-A在碳酸氢钠、水和丙酮条件下回流水解得到化合物I-B；
步骤I-2：化合物I-B溶于DMF，在咪唑存在条件下与叔丁基二甲基氯硅烷反应得到化合物I-C；
步骤I-3：化合物I-C溶于干燥的四氢呋喃，加入硼烷还原得到化合物I-D；
步骤I-4：化合物I-D溶于干燥的四氢呋喃中，加入对硝基苯基氯甲酸酯，加入N,N-二异丙基乙胺，室温反应过夜得到化合物I-E，将反应体系旋去溶剂，无需进一步纯化，直接投下一步；
步骤I-5：将BOC-L-赖氨酸溶于2N氢氧化钠水溶液中，将I-4所得的反应体系重新溶于四氢呋喃，逐滴加入到BOC-L-赖氨酸的溶液中，反应得到化合物I-F；
步骤I-6：将I-F溶于四氢呋喃中，加入1N的四丁基氟化铵溶液，室温反应过夜，得到化合物I-G；
步骤I-7：将化合物I-G溶于少量二氯甲烷，加入盐酸二氧六环溶液，室温反应过夜，反应完成后，旋去溶剂得到化合物16的盐酸盐形式。
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