CN109400609B - 用于标记SNAP-tag的蛋白标签荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明一种具有特异快速标记能力的SNAP‐tag蛋白标签荧光探针，该荧光探针以4‐氨基‐1,8‐萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，该荧光探针结构如式(1)所示，本探针基于环境敏感型荧光团萘酰亚胺衍生得到，能够特异性与SNAP‐tag蛋白反应，并且反应后荧光强度增加12倍。在荧光增强型SNAP‐tag荧光探针中，其反应速率达到了14436±1189M‐1s‐1，与商品化的需要细胞洗脱步骤的荧光底物速度相当，是目前报道的荧光增强型SNAP‐tag荧光探针中标记速度最快的。该探针能够在活细胞内短时间对融合有SNAP‐tag标签的目标蛋白进行特异性标记，实现免洗荧光成像。该探针能够在蛋白标记、蛋白识别、蛋白与小分子/大分子的相互作用，以及细胞荧光成像等领域得到广泛应用。

Description

用于标记SNAP-tag的蛋白标签荧光探针
技术领域
本发明属荧光成像技术领域，特别涉及一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针。
背景技术
荧光成像技术已经逐渐成为在细胞层次到个体水平研究蛋白质功能的强有力工具。由于具有尺寸小、荧光发射光谱宽泛、可选择荧光颜色多样等优点，在蛋白标记领域有机小分子荧光染料逐渐成为荧光蛋白的替代者。但是有机小分子染料是外源物种，存在的问题是不能够像荧光蛋白一样由细胞源生，所以无法控制在细胞中的数量以及细胞中的位置。为了解决这个问题，化学家发展了多种生物正交的方法将小分子染料共价连接到目标蛋白上，从而可以进一步跟踪研究目标蛋白的位置和功能。其中，目前应用最广泛的是蛋白标签技术，该技术通过遗传编码的方法首先将标签蛋白融合到目标蛋白上，然后这种蛋白标签与荧光底物发生专一的酶促共价连接反应，从而实现将小分子荧光染料连接到目标蛋白的目的。利用蛋白标签技术实现活细胞蛋白成像时，荧光底物需要满足多种性能要求，至少包括荧光底物具有良好的细胞透膜性、与蛋白标签意外的生物大分子无结合，与蛋白标签反应快、蛋白标记前后荧光有明显变化以提高信噪比等。其中，自由的荧光染料无荧光或很弱，与蛋白标签标记后荧光显著增强，这样的荧光信号能够有效避开背景荧光以及没有反应的荧光底物的干扰，这个性能对于活细胞成像时至关重要，可以省掉多次洗细胞这样的有损细胞的操作。
目前获得广泛应用的蛋白标签是SNAP-tag与Halo-tag。其中SNAP-tag是对由207个氨基酸组成的DNA修复蛋白酶(O6-鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，hAGT)进行突变改造而获得的，其标记原理是作为反应位点的半胱氨酸能够与O6修饰的苯甲基鸟嘌呤进行亲核反应脱去鸟嘌呤，使得半胱氨酸与苄基形成稳定的硫醚键，而荧光底物连接在苄基对位，从而实现以共价键形式与荧光底物高特异性的连接。通过有机合成可以将多种多样的有机小分子荧光探针引入苄基，从而获得多种SNAP-tag的荧光探针。
由于SNAP-tag的广泛应用，相应的荧光探针已有报道，并且部分荧光探针已经商品化。商品化SNAP-tag荧光底物主要是通过较长的链将荧光团(如罗丹明、菁染料等)连接在苯甲基鸟嘌呤上，标记反应速度快，缺点是与SNAP-tag标记前后荧光没有显著变化，细胞成像时必须洗脱出去没有反应或者定位不准确的荧光底物。目前已经报道了几种荧光探针能够在与SNAP-tag连接后引起荧光的显著增强变化，可以用于免洗细胞成像，但是这些探针的缺点是反应速度慢，与商品化的比较速度慢1-2个数量级。因此，开发反应速度快，并且与SNAP-tag标记前后有明显荧光变化的荧光底物显得迫切和需要。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的提供一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针及其制备方法和应用。
一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针，以4-氨基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，该荧光探针具有如下结构：
Figure GDA0002955931340000021
该探针能够特异性与SNAP-tag蛋白反应，并且反应后荧光强度增加12倍，应用于活细胞中蛋白免洗荧光成像；该SNAP-tag蛋白标签荧光探针反应速率达到了14436±1189M-1s-1，与商品化的需要细胞洗脱步骤的荧光底物速度相当，是目前报道的荧光增强型SNAP-tag荧光探针中标记速度最快的。
一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针的合成路线，如图1所示，具体合成步骤如下：
(1)中间体4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，向其中滴加叠氮化钠的水溶液，在90-110℃下搅拌6-10h。反应结束后，将反应液倒入冰水中，将沉淀抽滤后得到深黄色固体。将黄色固体溶于乙腈中，并加入九水硫化钠，在60-80℃持续反应12-18h。反应产物4-氨基基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺经硅胶柱分离纯化获得；4-溴-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺：N,N-二甲基甲酰胺：叠氮化钠：九水硫化钠的质量比为1-3:50-150:1:5-8；
(2)探针BGAN-Amino的合成：
将4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺(AN-Amino)、2-氨基-6-(N-甲基-环戊胺基)嘌呤氯盐1和叔丁醇钾溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应6-12h，4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺：2-氨基-6-(N-甲基-环戊胺基)嘌呤氯盐1：叔丁醇钾：N,N-二甲基甲酰胺的质量比为1:2-3:2-4:100-200，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱分离纯化得到目标物。
一种SNAP-tag蛋白标签荧光探针在SNAP蛋白标记及生物荧光成像中的应用。
本发明具有以下特征：
本发明探针拥有合成原料低价、方法简单易操作、易纯化等优点。该探针能够特异性与SNAP-tag蛋白反应，并且反应后荧光强度增加12倍，应用于活细胞中蛋白免洗荧光成像。该探针标记SNAP-tag的反应速率达到了14436±1189M-1s-1，与商品化的需要细胞洗脱步骤的荧光底物速度相当，是目前报道的荧光增强型SNAP-tag荧光探针中标记速度最快的。
本发明提供一类SNAP-tag蛋白标签荧光探针的合成方法，该方法具有操作方便、原料廉价、提纯简单等优点。
附图说明
图1该荧光探针合成路线图。
图2是中间体AN-Amino核磁谱图氢谱
图3是中间体AN-Amino核磁谱图碳谱。
图4是荧光探针BGAN-Amino核磁谱图氢谱。
图5是荧光探针BGAN-Amino核磁谱图碳谱
图6是中间体AN-Amino与探针BGAN-Amino在不同溶剂中的荧光、荧光归一化及紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度、归一化荧光强度及紫外吸收强度，荧光探针的浓度为10μM。
图7是探针BGAN-Amino在与SNAP-tag反应前后荧光强度变化图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为5μM，SNAP-tag浓度为5μM，测试环境为pH＝7.4PBS缓冲液。
图8是探针BGAN-Amino与SNAP-tag反应的动力学曲线图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为5μM，SNAP-tag浓度为5μM，测试环境为pH＝7.4PBS缓冲液。
图9是探针BGAN-Amino对线粒体和细胞核内蛋白转染SNAP-tag后的活细胞荧光共聚焦成像。
图10是探针BGAN-Amino与商品化染料BG-TMR混合液在转染细胞中随时间变化(0，5，10，15，20分钟)的荧光共聚焦成像。BGAN-Amino与BG-TMR终浓度均为1μM。
具体实施方式
实施例1
一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针的合成方法。
(1)中间体4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺(200mg，0.50mmol)置于100mL单口瓶中，加入10mL N,N-二甲基甲酰胺。将叠氮化钠(100mg，1.50mmol)溶于1mL水中加入混合液，将反应液加热至90℃。6h后，停止加热，将反应液倒入冰水中沉降并抽滤得深黄色固体。将所得固体溶于50mL乙腈中，并加入九水硫化钠(720mg,3.00mmol)。将反应液加热至60℃，12h。硅胶柱分离(200-300目)，以二氯甲烷和甲醇(200:1-100:1)为展开剂分离得黄色固体45mg，产率27％。
Figure GDA0002955931340000051
中间体AN-Amino核磁谱图氢谱如图2所示，中间体AN-Amino核磁谱图碳谱如图3所示。数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.62(d,J＝8.3Hz,1H),8.43(d,J＝7.2Hz,1H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(t,J＝7.8Hz,1H),7.49(s,2H),7.28(d,J＝7.9Hz,2H),7.23(d,J＝7.9Hz,2H),6.85(d,J＝8.4Hz,1H),5.19(s,2H),5.13(t,J＝5.6Hz,1H),4.43(d,J＝5.5Hz,2H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ164.27,163.35,153.38,141.63,136.83,134.64,131.69,130.24,129.96,127.81,126.90,124.48,122.11,119.84,108.72,107.78,63.14,42.71.
(2)探针BGAN-Amino的合成：
将AN-Amino(30mg，0.09mmol)，1(81mg,0.27mmol)and t-BuOK(70mg,0.54mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺中。氮气下室温反应6h。减压除去溶剂，硅胶柱分离(200-300目)，以二氯甲烷和甲醇(15:1)为展开剂分离得黄色固体26mg，产率62％。
Figure GDA0002955931340000061
探针BGAN-Amino核磁谱图氢谱如图4所示，探针BGAN-Amino核磁谱图碳谱如图5所示。具体数据如下：
1HNMR(400MHz,DMSO)δ12.41(s,1H),8.64(d,J＝8.3Hz,1H),8.45(d,J＝6.8Hz,1H),8.22(d,J＝8.4Hz,1H),7.79(s,1H),7.70–7.61(m,1H),7.51(s,2H),7.43(d,J＝8.1Hz,2H),7.34(d,J＝8.1Hz,2H),6.86(d,J＝8.4Hz,1H),6.27(s,2H),5.43(s,2H),5.23(s,2H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ164.32,163.37,160.08,153.44,134.72,131.79,131.77,130.34,130.30,130.12,130.03,129.18,128.99,128.01,124.53,122.12,119.87,108.74,107.76,66.95,42.74.
实施例2
一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针的合成方法。
(1)中间体4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺(500mg，1.25mmol)置于100mL单口瓶中，加入50mL N,N-二甲基甲酰胺。将叠氮化钠(500mg，7.50mmol)溶于2mL水中加入混合液，将反应液加热至100℃。8h后，停止加热，将反应液倒入冰水中沉降并抽滤得深黄色固体。将所得固体溶于80mL乙腈中，并加入九水硫化钠(2500mg,10.4mmol)。将反应液加热至70℃，15h。硅胶柱分离(200-300目)，以二氯甲烷和甲醇(200:1-100:1)为展开剂分离得黄色固体200mg，产率48％。中间体AN-Amino核磁谱图氢谱如图2所示，中间体AN-Amino核磁谱图碳谱如图3所示。
(2)探针BGAN-Amino的合成：
将AN-Amino(60mg，0.18mmol)，1(180mg,0.61mmol)and t-BuOK(180mg,1.39mmol)溶于12mL N,N-二甲基甲酰胺中。氮气下室温反应10h。减压除去溶剂，硅胶柱分离(200-300目)，以二氯甲烷和甲醇(15:1)为展开剂分离得黄色固体45mg，产率54％。探针BGAN-Amino核磁谱图氢谱如图4，探针BGAN-Amino核磁谱图碳谱如图5所示。
实施例3
一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针的合成方法。
(1)中间体4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺(1000mg，2.50mmol)置于100mL单口瓶中，加入75mL N,N-二甲基甲酰胺。将叠氮化钠(500mg，7.50mmol)溶于2mL水中加入混合液，将反应液加热至110℃。10h后，停止加热，将反应液倒入冰水中沉降并抽滤得深黄色固体。将所得固体溶于80mL乙腈中，并加入九水硫化钠(3600mg,15.00mmol)。将反应液加热至80℃，18h。硅胶柱分离(200-300目)，以二氯甲烷和甲醇(200:1-100:1)为展开剂分离得黄色固体300mg，产率36％。中间体AN-Amino核磁谱图氢谱如图2所示，中间体AN-Amino核磁谱图碳谱如图3所示。
(2)探针BGAN-Amino的合成：
将AN-Amino(120mg，0.36mmol)，1(320mg,1.08mmol)and t-BuOK(280mg,2.16mmol)溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中。氮气下室温反应18h。减压除去溶剂，硅胶柱分离(200-300目)，以二氯甲烷和甲醇(15:1)为展开剂分离得黄色固体80mg，产率48％。探针BGAN-Amino核磁谱图氢谱如图4，探针BGAN-Amino核磁谱图碳谱如图5所示。
将该探针溶于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化。
实施例4
中间体AN-Amino及探针BGAN-Amino在丙酮、乙腈、氯仿、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙醇、水、甲醇、四氢呋喃、甲苯中的荧光和吸收性质。
图6中测试终浓度为10μM，中间体AN-Amino及探针BGAN-Amino在丙酮、乙腈、氯仿、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙醇、水、甲醇、四氢呋喃、甲苯荧光性质。中间体AN-Amino及探针BGAN-Amino在不同溶剂的吸收波长在407-439nm，荧光发射波长在501-549nm。随着溶剂极性的增加二者的吸收波长及发射波长逐渐增加。
实施例5
5μM探针BGAN-Amino与5μM SNAP-tag反应前后荧光强度变化。
图7中荧光探针浓度为5μM，探针BGAN-Amino在与SNAP-tag反应之后由于嘌呤基团淬灭效应的消失与疏水环境的作用，荧光强度增强12倍，荧光发射波长由545nm蓝移至530nm。激发波长为440nm。
实施例6
5μM探针BGAN-Amino与5μM SNAP-tag反应动力学。
图8中荧光探针浓度为5μM，探针BGAN-Amino在加入5μM SNAP-tag后检测530nm处荧光强度随时间变化曲线，激发波长为440nm。530nm处的荧光强度在加入SNAP-tag之后荧光迅速增强并在1分钟内达到荧光强度最大，t1/2＝11s，反应常数为14436±1189M-1S-1。
实施例7
探针BGAN-Amino在线粒体和细胞核内蛋白转染SNAP-tag后的活细胞荧光共聚焦成像。
图9中通过pSNAPf-Cox8A and pSNAPf-H2B诱导HEK 293T细胞表达融合有SNAP-tag的Cox8A与H2B。(a)(d)为2μM探针BGAN-Amino通道染色效果图(采集500-550nm)；(b)(e)为商业化染料Mitotracker Red(采集580-654nm)与Hochest 33342(采集417-477nm)染色效果图。探针能够分别对表达融合有SNAP-tag的Cox8A与H2B进行特异性标记，从而达到对线粒体和细胞核免洗成像，与商业染料能够有很好的共定位效果。
实施例8
1μM探针BGAN-Amino与1μM BG-TMR混合液在转染细胞中随时间变化(0，5，10，15，20分钟)的荧光共聚焦成像。
图10中通过pSNAPf-H2B诱导HEK 293T细胞表达融合有SNAP-tag的H2B。(a)排为BGAN-Amino通道随时间变化染色效果图(采集500-550nm)；(b)排为BG-TMR通道随时间变化染色效果图(采集580-654nm)。BGAN-Amino在5分钟内即可对细胞内融合有SNAP-tag的蛋白H2B进行特异性标记且达到免洗效果，而BG-TMR在20分钟内虽然能进行标记但是荧光背景较强，不能达到免洗效果。

Claims (3)

1.一种用于标记SNAP-tag的蛋白标签荧光探针，其特征在于：该荧光探针以4-氨基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，该荧光探针具有如下结构：
Figure FDA0002955931330000011
2.一种如权利要求1所述的用于标记SNAP-tag的蛋白标签荧光探针的合成方法，其特征在于包含步骤如下：
(1)中间体4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，向其中滴加叠氮化钠的水溶液，在90-110℃下搅拌6-10h；反应结束后，将反应液倒入冰水中，将沉淀抽滤后得到深黄色固体；将所得固体溶于乙腈中，并加入九水硫化钠，在60-80℃持续反应12-18h；反应产物4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺经硅胶柱分离纯化获得；4-溴-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺：N,N-二甲基甲酰胺：叠氮化钠：九水硫化钠的质量比为1-3:50-150:1:5-8；
(2)探针的合成：
将4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺，2-氨基-6-(N-甲基-环戊胺基)嘌呤氯盐和叔丁醇钾溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温下反应6-12h，4-氨基-N-(4-羟甲基苄基)1,8-萘酰亚胺：2-氨基-6-(N-甲基-环戊胺基)嘌呤氯盐：叔丁醇钾：N,N-二甲基甲酰胺的质量比为1:2-3:2-4:100-200，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱分离纯化得到目标物。
3.一种如权利要求1所述的用于标记SNAP-tag的蛋白标签荧光探针在SNAP蛋白标记及生物荧光成像中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112939936B (zh) * 2019-12-10 2022-11-15 中国科学院大连化学物理研究所 羰基氮杂环丁烷取代的萘酰亚胺类荧光染料及其合成方法和应用
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CN112939934B (zh) * 2019-12-10 2022-11-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种高稳定性、高亮度的Halo-tag探针及其合成方法与应用
CN114252417A (zh) * 2020-09-23 2022-03-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种实时动态观察ace2和新型冠状病毒rbd相互作用的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104804725A (zh) * 2014-01-28 2015-07-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种检测溶酶体中h2s的荧光探针、其合成方法及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104804725A (zh) * 2014-01-28 2015-07-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种检测溶酶体中h2s的荧光探针、其合成方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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A new strategy to construct a FRET platform for ratiometric sensing of hydrogen sulfide;Longwei He 等;《Chemical Communications》;20141202;第51卷(第8期);Supporting Information第S4页 *
A wash-free SNAP-tag fluorogenic probe based on the additive effects of quencher release and environmental sensitivity;Shuang Leng等;《Chemical Communications》;20170523;第53卷(第48期);第6449页右栏最后1段、Fig.1、Table 1，第6450页右栏第2段，第6451页左栏最后1段 *
Shuang Leng等.A wash-free SNAP-tag fluorogenic probe based on the additive effects of quencher release and environmental sensitivity.《Chemical Communications》.2017,第53卷(第48期),第6448-6451页. *
SNAP-tag fluorogenic probes for wash free protein labeling;Shuang Leng 等;《Chinese Chemical Letters》;20170329;第28卷(第10期);全文 *

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