CN111560245B - 一种多活性位点荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了如结构式I所示的多活性位点荧光探针。所述的探针对于Cys的荧光信号强度是Hcy荧光信号强度的80倍，是GSH的30倍，是SO2的260倍，可以高选择性地检测Cys，同时区分Hcy、GSH和SO2的干扰，其中对Hcy、GSH和SO2的检测限分别为0.21μM、0.35μM、0.15μM，而对Cys的检测限低至13nM；探针的细胞毒性弱，通过细胞成像试验，可以明显地观察到探针对于Cys、Hcy、GSH和SO2的荧光响应变化，可用于体内外生物硫醇和SO2的检测。
Figure DDA0002476682820000011

Description

一种多活性位点荧光探针及其合成方法与应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种多活性位点荧光探针及其合成方法，以及该探针在细胞内同时区分检测半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)和二氧化硫(SO2)的应用。
背景技术
小分子硫醇在许多生理过程中有非常重要的作用，与许多疾病密切相关。其中，Cys、Hcy和GSH是生物体内最常见的生物硫醇。Cys、Hcy和GSH具有相似的结构特征和反应活性，但是它们却拥有完全不同的生理作用，同时许多疾病与其浓度变化有着密切关系。另一方面，人体长期接触亚硫酸盐，可能会导致心血管相关疾病，如缺血性心脏病、心肌缺血、自发性高血压和缺氧性肺动脉高压。在细胞质基质和线粒体中，含硫氨基酸的分解过程中将会产生SO2。与一氧化氮(NO)和硫化氢(H2S)一样，SO2作为公认的气体信号传递器，可能在调节平滑肌张力和低血压中发挥重要作用，科研工作者已经进行了大量研究来监测SO2及其衍生物的浓度。因此，开发高选择性的Cys探针，并区分Hcy/GSH的影响，同时实现对Cys和SO2的检测，用于实时检测细胞中的Cys的代谢机制具有重要意义。
近年来，多活性位点荧光探针因其高选择性、高灵敏度等优势而备受关注。但是由于Cys、Hcy和GSH之间结构和性质的相似性，想要实现同时有效区分其中两者具有非常大的难度，而同时区分三者的难度更大。目前，已有多荧光通道探针用于同时区分检测Cys、Hcy和GSH(如中国专利申请CN108484622A、CN108752331A等)，但是鲜有报道能够排除SO2干扰的探针。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种同时检测Cys、Hcy、GSH和SO2的多活性位点荧光探针，能对Cys、Hcy、GSH和SO2产生不同的紫外吸收响应信号和荧光发射信号，实现细胞内生物硫醇的检测。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
如结构式I所示的多活性位点荧光探针：
Figure BDA0002476682800000021
如结构式I所示的多活性位点荧光探针的化学名称：(E)-3-(2-(2-(4-氯-7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-苯并[g]吲哚-1-鎓-1-基)丙烷-1-磺酸盐。
本发明所述的多活性位点荧光探针的分子探针的合成方法，包括：将7-(N,N-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛和1,1,2-三甲基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[E]吲哚内盐加入适量无水乙醇中，滴加催化量乙酸，氮气保护，回流搅拌反应；反应液冷却至室温，减压浓缩，经柱层析法纯化，得(E)-3-(2-(2-(4-氯-7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-苯并[g]吲哚-1-鎓-1-基)丙烷-1-磺酸盐。
所述的7-(N,N-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛和1,1,2-三甲基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[E]吲哚内盐的摩尔比为1:1.0～1.2。
所述的7-(N,N-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛和无水乙醇的质量体积比为5mg:1～5mL。
所述的柱层析法的填料为硅胶，洗脱液为二氯甲烷:甲醇＝50:1(v:v)。
如图1所示，本发明所述的多活性位点荧光探针具有三个潜在的反应位点：苯并吲哚环上的N变为氮正离子，可以增强C5位的正电性；苯并吲哚环上的二甲基基团C原子，在反应时，进一步减少S原子上孤电子对氨基/HSO3 -排斥干扰；引入的苯并吲哚，增大共轭基团，可增强红移，使其荧光更接近近红外；引入磺酸基丙基用以增强分子水溶性。探针可以同时对Cys、Hcy、GSH和SO2产生荧光响应信号。
本发明所述的多活性位点荧光探针在同时区分检测Cys、Hcy、GSH和SO2的应用。所述的多活性位点荧光探针能够同时识别检测Cys、Hcy、GSH和SO2，通过细胞成像试验可以明显地观察到探针对Cys、Hcy、GSH和SO2的荧光响应变化。
本发明所述的多活性位点荧光探针同时区分检测Cys、Hcy、GSH和SO2的方法，包括：在室温下，将探针溶解于PBS缓冲液(含15％v/v乙腈，pH＝7.4，10mM或50mM)中进行分析检测。
在探针选择性试验中，对常见氨基酸(Tyr，Pro，Leu，Ser，Arg，Glu，Ala，Asp，Lys，Thr，Phe，Asn，Gln，Gly，Ile，Met，Trp，Val，His)以及常见无机离子(AcONa，NaF，NaCl，NaBr，NaI，NaHCO3，Na2SO4，Na2S，S8)的检测可知，只有Cys可以引起强荧光，说明探针对Cys具有高选择性，对Cys荧光信号强度是Hcy的80倍，是GSH的30倍，是SO2的260倍，因此可以高选择性地检测Cys，区分Hcy、GSH、SO2的干扰。在650nm处，只有GSH可以使探针的荧光进一步增强。Hcy和SO2均可以引起荧光淬灭，但SO2可以在10分钟内达到反应平衡，与Hcy有着明显区分。因此，本发明公开的多活性位点探针能够实现对Cys、Hcy、GSH和SO2的区分检测。
附图说明
图1探针的作用机制。
图2为本发明多活性位点荧光探针的核磁共振氢谱图。
图3为本发明多活性位点荧光探针的核磁共振碳谱图。
图4为本发明多活性位点荧光探针的高分辨质谱图。
图5为本发明多活性位点荧光探针探针的紫外吸收谱图；其中，CBI表示探针I。
图6为本发明多活性位点荧光探针与Cys作用的荧光谱图分析。
图7为本发明多活性位点荧光探针与Hcy作用的荧光谱图分析。
图8为本发明多活性位点荧光探针与SO2作用的荧光谱图分析。
图9为本发明多活性位点荧光探针与GSH作用的荧光谱图分析。
图10为本发明多活性位点荧光探针与Cys选择性试验结果；其中，1-28(试验浓度均为500μM)依次为:Tyr,Pro,Leu,Ser,Arg,Glu,Ala,Asp,Lys,Thr,Phe,Asn,Gln,Gly,Ile,Met,Trp,Val,His,AcONa,NaF,NaCl,NaBr,NaI,NaHCO3,Na2SO4,Na2S,S8；29-32(试验浓度均为100μM)依次为:SO2,Cys,Hcy,GSH；下同。
图11为本发明多活性位点荧光探针与Hcy选择性试验结果。
图12为本发明多活性位点荧光探针与SO2选择性试验结果。
图13为本发明多活性位点荧光探针与GSH选择性试验结果。
图14为本发明多活性位点荧光探针对A549细胞的毒性试验(MTT法)结果。
图15为本发明多活性位点荧光探针在人肺癌细胞A549上的共聚焦成像图；其中，系列1为红色通道荧光图像，系列2为绿色通道荧光图像，系列3为细胞亮场图像，1-3合并为系列4。
具体实施方式
实施例1
Figure BDA0002476682800000041
(E)-3-(2-(2-(4-氯-7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-苯并[g]吲哚-1-鎓-1-基)丙烷-1-磺酸盐
将7-(N,N-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛(50.0mg，179μmol)和1,1,2-三甲基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[E]吲哚内盐(65.0mg，197μmol)溶于10mL无水乙醇中，滴加2滴乙酸，氮气保护，回流搅拌反应；反应结束后，反应液冷却至室温，减压浓缩，经硅胶柱层析纯化(v:v,二氯甲烷：甲醇＝50:1)，得71.0mg(产率67％)蓝紫色固体粉末，经鉴定为(E)-3-(2-(2-(4-氯-7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-苯并[g]吲哚-1-鎓-1-基)丙烷-1-磺酸盐。
Mp 176-179℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.58–8.34(m,2H),8.34–8.08(m,4H),7.95–7.55(m,3H),7.01(d,J＝9.9Hz,1H),6.77(s,1H),4.72(t,J＝7.3Hz,2H),3.53(q,J＝6.8Hz,4H),2.64(t,J＝7.3Hz,2H),2.25(m,2H),2.01(s,6H),1.18(t,J＝6.8Hz,6H).13CNMR(75MHz,DMSO-d6)δ182.37,158.36,156.02,154.64,153.53,144.24,139.41,138.45,133.55,131.65,130.57,129.67,128.87,127.25,123.53,113.78,112.46,110.34,108.45,96.90,51.26,49.07,46.83,45.43,26.79,23.90,13.00.HRMS(ESI):calcd forC32H33ClN2O5S,[M+H]+m/z 593.1877,found 593.1872.
实施例2
多活性位点荧光探针在体外环境中区分检测Cys、Hcy、GSH和SO2的应用
探针(1mM)溶于磷酸盐缓冲液(PBS，50mM，pH 7.4，含有15％v/v乙腈)制备储备溶液。在去离子水中制备其他各种分析物的溶液。SO2的产生试剂为NaHSO3。除了特殊说明外，紫外荧光试验检测条件为：采用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.4，含有15％乙腈)稀释储备溶液，加入相应的检测底物，探针的试验浓度为10μM，在室温下孵育2h，Cys检测以365nm波长作为激发光，狭缝为3nm/3nm；Hcy检测以530nm波长作为激发光，狭缝为5nm/5nm；SO2检测以600nm为激发光，狭缝为5nm/5nm；GSH检测以650nm波长为激发光，狭缝为4nm/4nm。
图5为探针(10μM)分别与Cys、Hcy、GSH以及SO2(100μM)反应后的UV-Vis吸收光谱。本发明多活性位点荧光探针区分检测生物硫醇的具体特征如下：该探针最大吸收峰位于600nm处左右，与Cys作用后，600nm处吸收峰减弱，在360nm处产生新的吸收峰；与Hcy反应后，吸收峰蓝移至500nm处，吸收强度增强，峰形更尖锐；与GSH作用后，吸收峰增强，并且红移；加入SO2后，吸收峰则发生明显减弱。上述结果表明探针与Cys、Hcy、GSH和SO2均可发生相互作用。
图6(a)为探针(10μM)与不同浓度的Cys(0-100μM)反应后的荧光光谱；图6(b)为探针(10μM)加入不同浓度的Cys(0-100μM)后，442nm处的荧光强度变化趋势；图6(c)为探针(10μM)加入不同浓度的Cys(0-60μM)后，442nm处的荧光强度的线性关系；图6(d)为探针(10μM)与Cys(100μM)在PBS(含15％乙腈,pH 7.4,10mM)溶液中相作用，其荧光强度随时间变化的荧光光谱；图6(e)为探针(10μM)与Cys(100μM)在PBS(含15％乙腈,pH 7.4,10mM)溶液中相作用，其442nm处的荧光强度具有随时间变化的趋势。
图7(a)为探针(10μM)与不同浓度的Hcy(0-100μM)在PBS(含15％乙腈,pH 7.4,10mM)溶液中相作用的荧光光谱变化；图7(b)为探针(10μM)与不同浓度的Hcy(0-100μM)相作用，在668nm处荧光强度变化趋势；图7(c)为探针(10μM)与不同浓度的Hcy(0-30μM)相作用，在668nm处的荧光强度与Hcy浓度的线性关系；图7(d)为探针(10μM)与Hcy(100μM)相作用，在荧光强度随时间变化的荧光光谱；图7(e)为探针(10μM)与Hcy(100μM)相作用，在668nm处的荧光强度随时间变化的趋势。
图8(a)为探针(10μM)与不同浓度的SO2(0-100μM)相作用的荧光光谱变化；图8(b)为探针(10μM)与不同浓度的SO2(0-100μM)相作用，其668nm处荧光强度变化趋势；图8(c)为探针(10μM)与不同浓度的SO2(0-30μM)相作用，668nm处的荧光强度与SO2浓度的线性关系；图8(d)为探针(10μM)与SO2(100μM)相作用，其荧光强度随时间变化的荧光光谱；图8(e)为探针(10μM)与SO2(100μM)相作用，其668nm处的荧光强度随时间变化的趋势。
图9(a)为探针(10μM)与不同浓度的GSH(0-100μM)相作用的荧光光谱变化；图9(b)为探针(10μM)与不同浓度的GSH(0-100μM)相作用，其683nm处荧光强度变化趋势；图9(c)为探针(10μM)与不同浓度的GSH(0-10μM)相作用，683nm处的荧光强度与GSH浓度的线性关系；图9(d)为探针(10μM)与GSH(100μM)相作用，其荧光强度随时间变化的荧光光谱；图9(e)为探针(10μM)与GSH(100μM)相作用，其683nm处的荧光强度随时间变化的趋势。
由结果可知，该探针实现了用不同激发波长和荧光发射信号区分检测Cys、Hcy、GSH和SO2，检测限分别为13nM、0.21μM、0.15μM及0.35μM。
多活性位点荧光探针分别与Cys、Hcy、GSH和SO2的选择性试验
探针(1mM)溶于磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.4，含有15％乙腈)制备储备溶液。在去离子水中制备其他各种分析物的溶液。SO2的产生试剂为NaHSO3。采用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.4，含有15％乙腈)稀释储备溶液，加入相应的检测底物，1-28(依次为：Tyr,Pro,Leu,Ser,Arg,Glu,Ala,Asp,Lys,Thr,Phe,Asn,Gln,Gly,Ile,Met,Trp,Val,His,AcONa,NaF,NaCl,NaBr,NaI,NaHCO3,Na2SO4,Na2S,S8)的试验浓度均为500μM，29-32(依次为：SO2,Cys,Hcy,GSH)的试验浓度均为100μM，探针的试验浓度为10μM，在室温下孵育2h，Cys检测以365nm波长作为激发光，狭缝为3nm/3nm；Hcy检测以530nm波长作为激发光，狭缝为5nm/5nm；SO2检测以600nm为激发光，狭缝为5nm/5nm；GSH检测以650nm波长为激发光，狭缝为4nm/4nm。
图10显示了探针(10μM)与不同分析物在442nm处的荧光强度(λex＝365nm)；图11显示了探针(10μM)与不同分析物在668nm处的荧光强度(λex＝530nm)；图12显示了探针(10μM)与不同分析物在668nm处的荧光强度(λex＝600nm)；图13显示了探针(10μM)与不同分析物在683nm处的荧光强度(λex＝650nm)
通过对常见氨基酸(Tyr，Pro，Leu，Ser，Arg，Glu，Ala，Asp，Lys，Thr，Phe，Asn，Gln，Gly，Ile，Met，Trp，Val，His)以及常见无机离子(AcONa，NaF，NaCl，NaBr，NaI，NaHCO3，Na2SO4，Na2S，S8)的检测可知，只有Cys可以引起强荧光，说明探针对Cys具有高选择性，对Cys荧光信号强度是Hcy的80倍，是GSH的30倍，是SO2的260倍，因此可以高选择性地检测Cys，区分Hcy、GSH、SO2的干扰。在650nm处，只有GSH可以使探针的荧光进一步增强。
实施例3
多活性位点荧光分子探针细胞毒性试验与荧光成像试验
不同生物硫醇在细胞内有不同水平(Cys为30-200μM，Hcy为5-12μM，GSH为1-10mM)。根据相关报道，发明人选用人肺癌细胞A549进行细胞水平的生物硫醇成像试验。
首先进行探针对A549的MTT细胞毒性试验。人肺癌细胞(A549)在含有10％(v/v)FBS、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中于37℃、潮湿气氛下生长。用不同浓度的探针(20μM,40μM,60μM,80μM和100μM)培养A549细胞，细胞活力结果显示该探针对活细胞的细胞毒性可忽略不计(图14)。
测定探针对生物硫醇的细胞内成像能力的实验方法如下：A-E系列首先加入1mMN-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)作用30min，清除人肺癌细胞A549细胞内的硫醇；再分别加入100μMCys、GSH、NaHSO3和Hcy孵育30min；加入由磷酸盐缓冲液(PBS，10mM，pH 7.4，含有15％乙腈)配制的探针溶液使探针的终浓度为10μM，在37℃下，A、B、E系列均孵育2h，C系列孵育30min，D系列孵育10min。在成像前用PBS洗涤三次，并用多聚甲醛固定。用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，LSM700，Zeiss，Germany)观察荧光图像，如图15，细胞用NEM处理后再加入100μMCys时，细胞红色通道荧光完全消失，绿色通道可观察到强烈荧光；用NEM处理后再加入GSH，细胞红色通道荧光强度更强，绿色通道无荧光；如果NEM处理后，分别加入Hcy、SO2，Hcy和SO2均可以引起荧光淬灭，SO2与探针孵育10min即可使得探针荧光淬灭，而Hcy孵育到2h，探针荧光强度才最终减弱。
测定探针对细胞内源性的生物硫醇的成像实验方法如下(图15F)：人肺癌细胞(A549)在含有10％(v/v)FBS、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中于37℃、潮湿气氛下生长，向人肺癌细胞A549中直接加入由磷酸盐缓冲液(PBS，10mM，pH 7.4，含有15％乙腈)配制的探针溶液使探针的终浓度为10μM，在37℃下孵育2h后，发现红色通道与绿色通道同时产生荧光信号，但是与加入GSH后的细胞图像相比，红色通道荧光较弱。由于细胞生理环境下只有微量的Hcy和SO2，大部分为Cys与GSH，探针可部分与Cys反应产生绿色信号，部分与GSH反应，增强红色信号，说明实验结果与预期相符合。
上述结果表明，探针的细胞毒性弱，在生理环境下，本发明多活性位点探针在细胞内可成功地对Cys、Hcy、GSH和SO2产生荧光信号响应，对于生物硫醇的检测具有重要意义。

Claims (5)

1.如结构式I所示的多活性位点荧光探针：
Figure FDA0002914711180000011
2.权利要求1所述的多活性位点荧光探针的合成方法，其特征在于包括：
将7-(N,N-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛和1,1,2-三甲基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[E]吲哚内盐加入无水乙醇中，滴加催化量乙酸，氮气保护，回流搅拌反应；反应液冷却至室温，减压浓缩，经柱层析法纯化，得到结构式I所示的探针。
3.如权利要求2所述的多活性位点荧光探针的合成方法，其特征在于所述的7-(N,N-二乙基氨基)-4-氯香豆素-3-甲醛和1,1,2-三甲基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[E]吲哚内盐的摩尔比为1:1.0～1.2。
4.如权利要求2所述的多活性位点荧光探针的合成方法，其特征在于柱层析法的填料为硅胶，洗脱液为二氯甲烷:甲醇＝50:1v:v。
5.权利要求1所述的多活性位点荧光探针在制备同时区分检测Cys、Hcy、GSH和SO2试剂的应用。
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