CN115677776B - 膦硼非天然氨基酸、多肽和蛋白质的制备方法及直接金属配位转化 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了膦硼非天然氨基酸及其衍生物的制备方法。进而，利用膦硼非天然氨基酸及其衍生物进行膦硼非天然氨基酸的直接金属配位转化以及合成膦硼非天然蛋白质、膦金属人工金属蛋白质(酶)。所述人工膦‑金属蛋白(酶)可用于人工金属酶类型的构筑及生物酶催化等。此外，人工膦‑金属蛋白还具有一定的潜在癌细胞抑制作用及抗肿瘤转移活性。
Description
技术领域
本发明属于非天然氨基酸和人工蛋白质合成领域，具体的，本发明涉及一种膦硼非天然氨基酸、多肽和蛋白质及直接金属配位转化的制备方法。
背景技术
膦配体是N、O、S元素之外的一种重要的催化剂配体，其与金属络合所形成的过渡金属催化剂具有特殊的催化活性，催化了众多自然界不存在的反应类型，然而目前还未实现将非天然膦配体用于多肽、蛋白质的生物合成。并且也未发现能够作为人工金属酶的构筑和催化反应研究工具的含膦配体金属蛋白。
同时，如何克服非天然膦配体较强的氧敏感性、自然条件下不稳定状态也是目前尚待解决的重要问题。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种膦硼非天然氨基酸、多肽和蛋白质及直接金属配位转化的制备方法。
本发明提供了膦硼类非天然氨基酸化合物，所述化合物、药物组合物可以用于治疗或预防金属蛋白酶催化相关疾病。
具体地说：在本发明的第一方面，本发明涉及一种化合物，其为式(A)所示化合物或式(A)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐，
其中，X为氨基酸、H、或空；环A为4～8杂环基。
根据本发明的实施例，上述膦硼类化合物可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，X为
根据本发明的实施例，其中，Rx为H或保护基团，所述保护基团为Boc；
根据本发明的实施例，R为任选取代的-NH-、-O-、-COO-、C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基、C1-6卤代亚烷基、C1-6亚烷氧基、C1-6卤代亚烷氧基、C1-6亚烷氨基、C1-6羟基取代的亚烷基、(C1-6亚烷基)-C(＝O)-、(C1-6亚烷氧基)-C(＝O)-、(C1-6亚烷氨基)-C(＝O)-、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。
发明人在实验过程中发现R为可以具体为
发明人在实验过程中发现环A可以具体为
根据本发明的实施例，所述的膦硼类化合物，其为式(VIII)所示的化合物或式(VIII)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐，
根据本发明实施例的式(VIII)所示的化合物为一种非天然氨基酸，可用于非天然蛋白质的合成。
在本发明的第二方面，本发明涉及一种化合物，其为式(IX)或式(IX)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐，
根据本发明的实施例，所述式(IX)所示化合物与为一种非天然氨基酸金属化合物，其中：X为氨基酸；
根据本发明的实施例，所述环A为4～8元杂环基；
根据本发明的实施例，所述Y为含有金属的基团；
根据本发明的实施例，所述Y通过金属原子与P相连。
根据本发明的实施例，上述化合物可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，本发明所述的化合物，其为式(Ⅹ)所示的化合物或式(Ⅹ)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐，
在本发明的第三方面，本发明涉及一种分离的多肽。根据本发明的实施例，所述多肽包括第一或第二方面所述的化合物，所述化合物通过酰胺键与所述多肽的其他氨基酸相连。
根据本发明的实施例，所述膦硼类非天然氨基酸化合物通过氨基酸脱水缩合形成酰胺键方式与所述多肽的其他氨基酸相连，形成所述多肽。
在本发明的第四方面，本发明涉及一种金属蛋白。根据本发明的实施例，所述金属蛋白包括前面所述的分离的多肽。所述金属蛋白是多肽通过肽链之间的盘旋折叠形成获得。这样得到的人工金属蛋白还具有一定的药物活性，可用于抑制癌细胞增殖及抗肿瘤转移活性，具有良好的药物应用前景。其中，在合成生物大分子药物方面应用价值更高。
在本发明的第五方面，本发明涉及一种制备膦硼类非天然氨基酸化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
首先，通过式(Ⅲ)所示化合物与Boc保护的式(Ⅳ)所示化合物通过钯催化的磷-芳基化反应偶联，得到式(Ⅴ)所示化合物。然后，式(Ⅴ)所示化合物经关环烯烃复分解反应(RCM)生成式(Ⅵ)所示化合物，式(Ⅵ)所示化合物经苯基硅烷试剂还原及硼烷四氢呋喃溶液原位配位得到式(Ⅶ)所示化合物。通过该方法获得的膦硼类非天然氨基酸化合物克服了非天然膦配体较强的氧敏感性、自然条件下不稳定状态等弊端。
根据本发明的实施例，上述制备膦硼类非天然氨基酸化合物的方法可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，使式(Ⅶ)所示化合物进行脱N-Boc反应，以便获得式(Ⅷ)所示化合物，
根据本发明的实施例，所述脱N-Boc反应需要在三甲基碘硅烷存在的条件下进行。发明人在实验过程中发现，由于P-B键的强酸、强碱敏感性，为了能够在温和条件下、高效率、高选择性地脱除N-Boc基团，最终筛选得到三甲基碘硅烷(TMSI)试剂与式(Ⅶ)所示化合物反应高效脱除N-Boc基团，以便获得式(Ⅷ)所示化合物。
根据本发明的实施例，所述式(Ⅲ)所示化合物是通过使化合物(Ⅰ)与化合物(Ⅱ)进行格氏反应，以便获得所述式(Ⅲ)所示化合物。
根据本发明的实施例，磷-芳基化反应需要在二烯丙基膦氧化物与Boc-4-碘-L-苯丙氨酸存在条件下进行。
根据本发明的实施例，所述关环烯烃复分解反应需要在四氢呋喃(THF)存在条件下进行。
根据本发明的实施例，所述还原反应需要苯基硅烷试剂的参与。
根据本发明的实施例，所述配位反应需要在硼烷四氢呋喃络合物存在条件下进行。
在本发明的第六方面，本发明涉及一种制备非天然蛋白质的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：以前面所述的化合物为底物，如以式(Ⅷ)所示化合物作为底物，进行所述非天然蛋白质的表达。发明人首次将非天然膦配体用于多肽、蛋白质的生物合成，对于该领域是一个突破性的发现。
根据本发明的实施例，上述制备非天然蛋白质的方法可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述式(Ⅷ)所示化合物的制备：首先，通过化合物(Ⅰ)与化合物(Ⅱ)进行格氏反应，以便获得所述式(Ⅲ)所示化合物；其次，式(Ⅲ)所示化合物与Boc保护的式(Ⅳ)所示化合物通过钯催化的磷-芳基化反应偶联，获得式(Ⅴ)所示化合物；然后，式(Ⅴ)所示化合物经关环烯烃复分解反应(RCM)生成式(Ⅵ)所示化合物；更进一步，式(Ⅵ)所示化合物经苯基硅烷试剂还原及硼烷四氢呋喃溶液原位配位得到式(Ⅶ)所示化合物；式(Ⅶ)所示化合物与三甲基碘硅烷(TMSI)试剂反应高效脱除N-Boc基团，以便获得式(Ⅷ)所示化合物。
根据本发明的实施例，所述非天然蛋白质的表达：将携带有编码氨酰-tRNA合成酶的质粒导入受体细胞，所述氨酰-tRNA合成酶识别所制备的上述化合物；使所述受体细胞在适于蛋白表达的条件下以及所制备化合物存在的条件下进行培养，以便获得所述非天然蛋白质。基于上述方法获得的非天然蛋白质为人工金属酶的构筑和催化反应提供研究工具。
在本发明的第七方面，本发明涉及一种制备非天然氨基酸金属化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：以式(Ⅸ)所示化合物或式(Ⅸ)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐作为底物与含有金属的化合物进行反应。
根据本发明的实施例，上述制备非天然氨基酸金属化合物可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述含有金属的化合物为环钯二聚体。
根据本发明的实施例，将式(Ⅸ)所示化合物或式(Ⅸ)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐与环钯二聚体进行第一混合处理，以便得到所述非天然氨基酸金属化合物，即膦金属化合物。
根据本发明的实施例，所述第一混合处理是在有氧条件和水溶剂中进行的。
根据本发明的实施例，所述水溶剂包含水和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
根据本发明的实施例，所述第一混合处理的时间为1～5小时。
根据本发明的实施例，所述环钯二聚体与前面所述的化合物的当量比为(1～1.2)：1。
在本发明的第八方面，本发明涉及一种制备含膦-金属蛋白复合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将非天然蛋白质与含有金属的化合物进行接触，以便获得所述含膦-金属蛋白复合物。这种人工合成含膦-金属蛋白复合物的方法为人工金属酶类型的构筑及生物酶催化等功能应用打下了重要基础，比如膦-环钯金属酶，将广泛用于均相的金属催化反应，包括Suzuki、Heck、Stille、Sonogashira、Negishi、Buchwald-Hartwig偶联反应，不对称氢化反应，不对称氢甲酰化反应，Baylis-Hillman反应，碳氢(C-H)活化反应等。
根据本发明的实施例，上述制备含膦-金属蛋白复合物的方法可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述制备底物方法如下：通过化合物(Ⅰ)与化合物(Ⅱ)进行格氏反应，以便获得所述式(Ⅲ)所示化合物；其次，式(Ⅲ)所示化合物与Boc保护的式(Ⅳ)所示化合物通过钯催化的磷-芳基化反应偶联，获得式(Ⅴ)所示化合物；然后，式(Ⅴ)所示化合物经关环烯烃复分解反应(RCM)生成式(Ⅵ)所示化合物；更进一步，式(Ⅵ)所示化合物经苯基硅烷试剂还原及硼烷四氢呋喃溶液原位配位得到式(Ⅶ)所示化合物；式(Ⅶ)所示化合物与三甲基碘硅烷(TMSI)试剂反应高效脱除N-Boc基团，以便获得式(Ⅷ)所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨酰-tRNA合成酶可以识别所制备的式(Ⅷ)所示化合物或式(Ⅷ)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐。
根据本发明的实施例，首先，制备式(Ⅷ)所示化合物或式(Ⅷ)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐作为底物；其次，将携带有编码氨酰-tRNA合成酶以及编码sfGFP的核酸序列的双转质粒导入受体细胞；最后，使所述受体细胞在适于蛋白表达的条件下以及所制备化合物存在的条件下进行培养，以便获得所述非天然蛋白质。
根据本发明的实施例，所述含有金属的化合物为环钯二聚体。
根据本发明的实施例，所述接触是在DMF存在的条件下进行的。
根据本发明的实施例，所述DMF在接触体系中的体积分数为5％。
根据本发明的实施例，所述环钯二聚体在接触体系中的浓度为400μM。
根据本发明的实施例，所述接触是温度为37℃条件下进行。
在本发明的第九方面，本发明涉及一种催化反应。
根据本发明的实施例，所述方法包括将待反应化合物在前面所述的化合物、前面所述的多肽或前面所述的蛋白存在的条件下进行催化反应。根据本发明实施例所获得的含膦-金属蛋白复合物可广泛用于均相的金属催化反应，如Suzuki、Heck、Stille、Sonogashira、Negishi、Buchwald-Hartwig偶联反应，不对称氢化反应，不对称氢甲酰化反应，Baylis-Hillman反应，碳氢(C-H)活化反应等。
在本发明的第十方面，本发明涉及一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物是由式(Ⅸ)所示化合物或式(Ⅸ)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐，或式(Ⅸ)所示化合物或式(Ⅸ)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐进行脱水缩合形成的多肽，或式(Ⅸ)所示化合物或式(Ⅸ)所示化合物的立体异构体、互变异构体或其盐形成的蛋白质组成的。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或它们的任意组合；
在本发明的第十一方面，本发明涉及一种本发明第一方面所述的化合物、本发明第三方面所述的分离的多肽、本发明第四方面所述的金属蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防金属蛋白酶催化相关疾病。
根据本发明的实施例，上述药物用途可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述金属蛋白催化相关疾病中的相关疾病包括癌症。
根据本发明的实施例，上述金属蛋白催化作用在癌症中可用于抑制癌细胞增殖或转移。
在本发明的第十二方面，本发明涉及一种所述的化合物、多肽、蛋白质在制备药物中的用途，所述药物用于抑制癌细胞增殖或转移。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明实施例2水相中P3BF至膦-环钯复合物直接转化前后磷谱比对结果。
图2显示了根据本发明实施例4LmrR-15P3BF蛋白原料转化为LmrR-15P3F-CPd产物的验证结果。
具体实施方式
现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本发明所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本发明所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本发明所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本发明所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一实施方案”指一个或多个实施方案。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情形可以但不一定出现，并且该描述包括其中所述事件或情形出现的情况以及其中它不出现的情况。
术语“任选地被……所取代”，可以与术语“未取代或被……所取代”交换使用，即所述结构或基团是未被取代的或者被一个或多个本发明所述的取代基取代，其中所述取代发生在所给结构或基团上任何化合价允许的合理的位置。
一般而言，术语“取代的”表示所给结构或基团中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个取代基可以在基团各个可取代的合理的位置进行取代。当所给出的结构式中不只一个位置能被选自的一个或多个具体取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在结构式中各个合理的位置进行取代。本发明所述的取代基包括，但不限于-NH-、-O-、-COO-、C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基、C1-6卤代亚烷基、C1-6亚烷氧基、C1-6卤代亚烷氧基、C1-6亚烷氨基、C1-6羟基取代的亚烷基、(C1-6亚烷基)-C(＝O)-、(C1-6亚烷氧基)-C(＝O)-、(C1-6亚烷氨基)-C(＝O)-、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基等等。
术语“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体(旋转异构体)、几何异构体(顺/反)异构体、阻转异构体，等等。
本发明所使用的立体化学定义和规则一般遵循S.P.Parker，Ed.,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；andEliel,E.and Wilen,S,“Stereochemistry of Organic Compounds”,John Wiley&Sons,Inc,New York,1994。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面发生旋转的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子关于其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)是用于指定化合物所致平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。一种具体的立体异构体是对映异构体，这种异构体的混合物称作对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当在化学反应或过程中没有立体选择性或立体特异性时，可出现这种情况。
所得的任何立体异构体的混合物可以依据组分物理化学性质上的差异被分离成纯的或基本纯的几何异构体，对映异构体，非对映异构体，例如，通过色谱法和/或分步结晶法。
可以用已知的方法将任何所得终产物或中间体的外消旋体通过本领域技术人员熟悉的方法拆分成光学对映体，如，通过对获得的其非对映异构的盐进行分离。外消旋的产物也可以通过手性色谱来分离，如，使用手性吸附剂的高效液相色谱(HPLC)。特别地，对映异构体可以通过不对称合成制备，例如，可参考Jacques,et al.,Enantiomers,Racematesand Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Principles of AsymmetricSynthesis(2nd Ed.Robert E.Gawley,Jeffrey Aube,Elsevier,Oxford,UK,2012)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；Wilen,S.H.Tablesof Resolving Agents and Optical Resolutions p.268(E.L.Eliel,Ed.,Univ.of NotreDame Press,Notre Dame,IN 1972)；Chiral Separation Techniques:A PracticalApproach(Subramanian,G.Ed.,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA,Weinheim,Germany,2007)。
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒(lowenergy barrier)互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。
本发明所使用的“盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,describe pharmaceuticallyacceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1-19.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，和有机酸盐如乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，丙二酸盐，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，重硫酸盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊基丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2-羟基-乙磺酸盐，乳糖醛酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月桂基硫酸盐，苹果酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐，等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N+(C1-4烷基)4的盐。本发明也拟构思了任何所包含N的基团的化合物所形成的季铵盐。水溶性或油溶性或分散产物可以通过季铵化作用得到。碱金属或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁，等等。药学上可接受的盐进一步包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，C1-8磺酸化物和芳香磺酸化物。
下面详细描述本发明的实施例，这些实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，除非明确指出，在下面实施例中未详细描述的材料和方法均为本领域中常规使用的。
一般方法：
除非明确说明，在下列实施例中采用下述仪器与试剂：
试剂：分析级的石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)、丙酮、甲醇、甲苯、乙醇、乙醚等主要购自北京市通广精细化工公司；蒸馏水购于屈臣氏；色谱级乙腈购于北京捷特澳科贸有限公司；超干(无水)溶剂，用于反应的溶剂如DMF、DCM、二氧六环、THF等主要由上海泰坦科技股份有限公司提供。除特殊说明外，以上溶剂及下表1所示实验试剂，购得后均无需处理直接使用。
用于小分子合成反应后处理、分离及纯化的无水硫酸镁、硅藻土、硅胶、制备级TLC板等耗材购自北京均利博生物科技有限公司。
表1仪器使用列表
实验中所有玻璃器皿在使用前均用超纯水及丙酮清洗，并用吹风机吹干或在电鼓风干燥箱中干燥。所有需要无水无氧条件的反应均在氩气氛围下进行，用双层气球充氩气保护，橡胶塞密封。所有反应中用到的各种型号的注射器都是一次性的。通过TLC(薄层色谱法)或ESI-LRMS对反应进行程度进行监测。所有溶剂的蒸发均使用带有水浴锅的旋转蒸发仪进行，配备有乙醇循环冷凝泵，对于低沸点溶剂，如乙酸乙酯、石油醚、DCM、THF、甲醇等，采用循环水式真空泵负压进行旋蒸；对高沸点溶剂，如甲苯、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、水、TFA等，采用真空油泵负压进行旋蒸。除特殊说明外，所有粗品的分离和纯化都采用硅胶柱层析方法。
实施例1膦硼非天然氨基酸P3BF的合成
含膦配体非天然氨基酸P3BF合成过程
化合物1的合成：500mL三口瓶抽换氩气三次，在冰浴条件下用注射器注入购得的烯丙基溴化镁溶液(100mmol in 100mL Et2O,1M,3.2eq.)，将4mL亚磷酸二乙酯的乙醚溶液(31mmol溶于31mL无水Et2O,1M,1eq.)通过注射器或恒压滴液漏斗缓慢逐滴(约1滴/5秒)滴加至三口瓶中，滴加完毕后即可撤去冰浴，并在室温搅拌反应过夜。ESI-MS监测反应，直至无原料峰出现即结束反应，在冰浴下，加入18g冰的碳酸钾水溶液(130mmol溶于50mL水,4.2eq.)以淬灭反应，持续搅拌至生成均匀悬浊液，过滤，乙酸乙酯洗涤滤饼，无水硫酸镁干燥，将有机相小心地减压浓缩，得到4.5mL浅黄色油性液体。所得二烯丙基膦氧化物1粗品无需纯化，可以直接用于下一步与Boc-4-碘-L-苯丙氨酸的偶连反应。
化合物2的合成：采用钯介导的膦-芳基化反应，即二烯丙基膦氧化物与Boc-4-碘-L-苯丙氨酸偶连而成。向干燥的250mL三口瓶中加入上步的4.5mL二烯丙基膦氧化物1粗品，11.73g Boc-4-碘-L-苯丙氨酸(30mmol,1eq.)，抽换氩气3次，加入50mL二氧六环充分溶解，室温搅拌10分钟。另一个氩气保护的三口瓶中加入了347mg Xantphos(0.6mmol,0.02eq.)，550mg Pd2(dba)3(0.6mmol,0.02eq.)及20mL二氧六环，将所得完全溶解并配位的催化剂溶液用注射器转入第一个三口瓶中，最后加入4.32mL三乙胺(31mmol,1eq.)，室温搅拌反应过夜。ESI-MS监测反应，反应结束后用旋蒸除去溶剂，所得残余物采用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/1，加1％v/v乙酸)，得到7.53g化合物2(19.16mmol)，分离收率为63.9％，浅棕色固体，Rf值为0.13(展开剂：乙酸乙酯)。
化合物3的合成：在250mL三口瓶中加入4.78g化合物2(12.16mmol)，并溶解在120mL无水THF中(0.1M)，抽换氩气3次，将518mg 2代格拉布催化剂(0.61mmol,5mol％)溶解在20mL无水THF中，并两分批加入反应体系(间隔3小时，每批10mL)，继续搅拌反应过夜。TLC或ESI-MS监测反应，反应结束后用旋蒸除去溶剂，残余物用DCM(50mL)和水(50mL)稀释，用NaOH调节pH至8-9，使目标产物进入水相，转至分液漏斗分液，保留水相并用DCM洗涤3次(3x50 mL)，随后用HCl调节水相pH至3-4，乙酸乙酯萃取水相3次(3×50mL)，合并有机相，减压浓缩得到3.484g浅棕色固体化合物3(9.5mmol)，收率78.5％，Rf值为0.17(展开剂：乙酸乙酯，含1％v/v乙酸)。
化合物4的合成：在100mL三口瓶中加入3.0g化合物3(8.22mmol)，加30mL无水DMF溶解，抽换氩气3次进行惰性气体保护，随后用注射器注入3.6mL苯硅烷(29.2mmol,3.6eq.)，90℃下加热反应3小时，ESI-MS监测，完全转化为三价态膦后停止反应，冰浴冷却，注射器缓慢加入41mL硼烷四氢呋喃络合物(1M,5eq.)，配位反应1小时，脱除溶剂，所得残余物直接采用硅胶柱层析纯化，配制的洗脱剂比例为：乙酸乙酯/石油醚＝1/1-2/1并加1％v/v乙酸，最终得到2.24g白色固体化合物4(6.17mmol)，产率为75.1％，Rf值为0.34(展开剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/1，含1％v/v乙酸)。
P3BF的合成：向500mL圆底烧瓶中加入0.73g(2mmol)化合物4的无水DCM溶液(200mL)，冰浴冷却，随后缓慢逐滴加入三甲基碘硅烷(0.711mL,5mmol,2.5eq.)的无水DCM溶液(10mL)，0℃下搅拌反应10分钟，TLC和ESI(-)-MS监测反应，直至m/z＝362的质谱峰消失且m/z＝250的质谱峰出现，用NaOH的水溶液(320mg NAOH固体溶于40mL水中)终止反应，并中和反应体系至弱碱性(pH在8左右)，搅拌反应1小时，转移至分液漏斗，分出水相并用DCM，乙酸乙酯，乙醚洗涤3次(3x 50mL)，剩余水相用冻干机冻干，得到含有NaI盐的粗品P3BF，获得最终产品，1.3g白色固体粉末。
实施例2膦硼非天然氨基酸P3BF水相中直接金属配位转化
膦硼非天然氨基酸P3BF水相中直接金属配位转化的金属前体
为了在水相和富氧的空气条件下，制备膦硼化合物转化为膦-金属复合物，采用如上所示的金属前体进行反应。膦硼非天然氨基酸P3BF可以在水相、空气的条件下直接用于膦金属复合物的制备，如下所示，以环钯二聚体(CPd dimer)为例，该转化方法为：在2mL EP管中加入10mg膦硼非天然氨基酸P3BF(纯度:40％,1eq.)，用400μL DMF和水的混合溶剂(DMF：H2O＝1:1)溶解，随后加入10mg环钯二聚体(CPd dimer)(1-1.2eq.)的DMF溶液(200μL)，置于恒温金属浴上室温震荡反应3小时，直接对反应液进行磷谱、硼谱监测及高分辨质谱表征(如图1所示)，检测合格的结果即膦-环钯复合物转化成功，所得样品进行下一步实验。
水相中P3BF至膦-环钯复合物直接转化
实施例3膦硼非天然蛋白质的制备
膦硼非天然氨基酸P3BF通过遗传密码子扩展技术插入到sfGFP蛋白，方法如下：
将200μL含有特异性识别P3BF的氨酰-tRNA合成酶质粒及sfGFP目的基因的双转质粒的菌液接种到20mL新鲜LB液体培养基中进行小摇扩增，接种比例为1:100(v/v)，卡那霉素和氯霉素母液(分别为100mg/mL和34mg/mL)的加入比例均为1:1000(v/v)，37℃下过夜摇菌，而后将该20mL菌液接种到1升LB液体培养基中，接种比例为1:50(v/v)，同样加入1:1000体积比的卡那霉素和氯霉素双抗母液(即1mL)，在37℃下培养4-5小时(或OD600值达到0.6-0.8)，并依次加入UAA(终浓度约为0.5-1mM)，IPTG(终浓度为1mM)及L-阿拉伯糖(终质量浓度为0.04-0.06％)，在16℃或25℃下诱导表达24小时，同时，不加入P3BF的负对照组也在同样条件下进行蛋白表达。可通过在紫外灯下(365nm)观察离心沉淀的菌体是否有荧光的方法监测荧光蛋白的表达过程。
采用离心机离心收集菌体(5000rpm,20min,4℃,Beckman,Avanti JXN26)，重悬到100mL 50mM的PBS缓冲液中，调节pH至7.4，并加入蛋白酶抑制剂PMSF(终浓度为1mM)以及1‰v/v的表面活性剂Triton X-100，冰浴下超声破碎15分钟(300W,开3秒,关6秒)，将裂解液离心(14000rpm,Heraeus Multifuge X1R,1.5h,4℃,Thermo Scientific)，所得上清负载于5mL镍柱柱料上(Ni-NTA柱,GE Healthcare,USA)，3-5倍柱体积(CV，column volume)的PBS缓冲液洗涤，并使用2-4x 0.5CV包含梯度浓度咪唑(20-500mM)的PBS缓冲液洗脱蛋白，即洗脱2-4次，每次洗脱采用PBS缓冲液的体积为0.5倍柱体积各洗脱组分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(15％，SDS-PAGE)及考马斯亮蓝染色(InstantBlueTM，Expedeon)分析。合并含有较纯目标条带的洗脱组分，使用10K超滤管(EMD Millipore)浓缩，ESI-HRMS分析确认分子量及纯度。结果表明，含有膦硼非天然氨基酸P3BF的非天然蛋白质sfGFP成功表达。
实施例4膦金属人工金属蛋白(酶)的制备
膦-金属蛋白复合物的构建是以含有膦硼非天然氨基酸P3BF残基的LmrR-15P3BF蛋白作为骨架蛋白，其中，含有膦硼非天然氨基酸P3BF残基的LmrR-15P3BF蛋白的合成方案参考实施例3，所不同的是，采用特异性识别P3BF的氨酰-tRNA合成酶质粒及LmrR(lactococcal multidrug-resistance regulator)目的基因的双转质粒的菌液接种到20mL新鲜LB液体培养基中进行小摇扩增，获得LmrR-15P3BF蛋白溶液。
以环钯化合物为例，含膦-金属复合物的人工金属蛋白(酶)的构建方法如下：
在2mL的EP管中，向200μL的LmrR-15P3BF(单体浓度,20μM,1eq.,PBS缓冲液，pH为7.4)蛋白溶液中缓慢加入10μL溶于DMF中的环钯二聚体母液，环钯二聚体母液浓度为400μM，DMF在整个体系中终浓度为5％v/v，然后将该混合溶液的EP管置于恒温金属浴上37℃下震荡反应，并使用ESI-HRMS监测反应，约160小时后，LmrR-15P3BF蛋白原料分子量15142Da逐渐转化为LmrR-15P3F-CPd产物，分子量为15368Da，说明制备完成(如图2所示)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种制备式 (X)所述的化合物的方法，其特征在于，包括：
使式 (Ⅲ) 所示化合物与式 (Ⅳ) 所示化合物进行磷-芳基化反应，以便获得式 (Ⅴ)所示化合物；
使式 (Ⅴ) 所示化合物进行关环烯烃复分解反应，以便获得式 (Ⅵ) 所示化合物；
使式 (Ⅵ) 所示化合物进行还原以及配位反应，以便获得式 (Ⅶ) 所示化合物；
使式 (Ⅶ) 所示化合物进行脱N-Boc反应，以便获得式 (Ⅷ) 所示化合物；
将式(VIII)所示化合物与环钯二聚体进行第一混合处理，以便得到式(X)所示化合物；所述环钯二聚体具有式(XI)所示结构；
所述第一混合处理是在有氧条件，水和DMF溶剂中进行的；
所述第一混合处理的时间为1~5小时；
所述环钯二聚体与所述式(VIII)所示化合物的当量比为（1~1.2）：1；
(III)/>(Ⅳ)
(Ⅴ)/> (Ⅵ)
(Ⅶ)； />(VIII)；
式(Ⅹ)；/>式（XI）。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式 (Ⅲ) 所示化合物是通过如下方式获得的：
使化合物 (Ⅰ) 与化合物 (Ⅱ) 进行格氏反应，以便获得所述式 (Ⅲ) 所示化合物，
(Ⅰ)/> (Ⅱ)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱N-Boc反应是在三甲基碘硅烷存在的条件下进行的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷-芳基化反应是在二烯丙基膦氧化物与Boc-4-碘-L-苯丙氨酸存在的条件下进行的；
所述关环烯烃复分解反应是在THF存在的条件下进行的；
所述还原反应是在苯基硅烷试剂存在的条件下进行的；
所述配位反应是在硼烷四氢呋喃络合物存在的条件下进行的。
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| Phospholyl(borane) Amino Acids and Peptides: Stereoselective Synthesis and Fluorescent Properties with Large Stokes Shift;Mathieu Arribat et al.,;J. Am. Chem. Soc.;第140卷;第1028-1034页 * |
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