CN107383054B - 一种含二硫键长臂生物素及其制备方法 - Google Patents
一种含二硫键长臂生物素及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种含二硫键长臂生物素及其制备方法，该化合物可应用于生化检测领域，减少位阻效应的影响，提高检测的灵敏度，其结构为，以生物素为原料，经酰化乙二胺、二硫代丙酸酰化、活性酯合成制备了含二硫键生物素。
Description
技术领域
本发明涉及新型生化试剂领域，具体的说是一种含二硫键的长臂生物素的制备方法。
背景技术
生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的 卵黄（α型）和肝组织（β型）中提取，α、β两型的生物活性基本相同，现已可人工合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。分子量为244.31，分子中有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。
近几十年来，利用生物素及衍生物作为标记探针得到了迅速发展，生物素标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性，生物素标记的抗体可存放多年而不失活。能与生物素结合的二级试剂为亲和素和链霉亲和素，所需的各种标记物均可购置。此外，亲和素和链霉亲和素的结合背景水平非常低．结合紧密且快速。抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料或放射性碘的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。
利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。大多数生物素酰基化反应是利用生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯，琥珀酰亚胺基可以与抗体上的自由氨基结合，通常是赖氨酰侧链。比如有用于标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）和生物素对硝基苯酯（pBNP），其中以BNHS最常用。近年来，应用活化长臂生物素标记生物大分子，可以减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。较长的空间桥联臂可以使偶联物更容易接近生物素，其柔韧性也更好，尽管也更容易出现非特异结合。某些空间桥联臂可以劈开，这样就可在一定的控制条件下将抗体释放出来，在某些情况下，空间桥联臂起决定性作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含二硫键长臂生物素及其制备方法，该化合物可应用于生化检测领域，减少位阻效应的影响，提高检测的灵敏度。
本发明的含二硫键长臂生物素结构如下：
。
本发明的制备方法以生物素为原料，经酰化乙二胺、二硫代丙酸酰化、活性酯合成制备了含二硫键生物素，反应式如下：
实现本发明的具体技术方案是：
先将生物素与N-羟基琥珀酰亚胺反应得到活性酯，然后与乙二胺一锅法反应得到生物素酰乙二胺，其结构如下：
再将生物素酰乙二胺与单N-羟基琥珀酰亚胺二硫代二丙酸酯反应生成生物素酰乙二胺二硫代二丙酸，其结构如下：
最后将得到的上述二硫代丙酸生物素类化合物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应制备本发明的含二硫键长臂生物素。
优选的是，包括以下具体步骤：
A、制备生物素酰乙二胺
将生物素加入至有机溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和缩合剂，在适量有机碱的参与下室温反应1—5小时制备得到生物素活性酯，再加入乙二胺，室温下反应1—24小时制得生物素酰乙二胺；其中，生物素与N-琥珀酰亚胺和缩合剂的摩尔比为1︰1—1.5︰1—2，生物素与乙二胺和碱的摩尔比为1︰1—2︰1—5；缩合剂为二环己基碳二亚胺（DCC），1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），或者2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）；有机碱为三乙胺，吡啶，二甲胺基吡啶（DMAP），或者N,N-二异丙基乙胺（DIEA）；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（DMF），N,N-二甲基乙酰胺（DMAC），二甲基亚砜（DMSO），N-甲基吡咯烷酮（NMP），或者乙腈；
B、制备生物素酰乙二胺二硫代二丙酸
将单N-羟基琥珀酰亚胺二硫代二丙酸酯溶于有机溶剂中，加入步骤A生成的生物素酰乙二胺，室温下反应1—24小时，制得生物素酰乙二胺二硫代二丙酸；其中生物素酰乙二胺与单N-羟基琥珀酰亚胺二硫代二丙酸酯的摩尔比为1—2︰1—3；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（DMF），N,N-二甲基乙酰胺（DMAC），二甲基亚砜（DMSO），N-甲基吡咯烷酮（NMP），或者乙腈；
C、制备含二硫键长臂生物素衍生物
将上述生物素酰乙二胺二硫代二丙酸溶于有机溶剂中，室温下加入N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，加入有机碱反应1—24小时后，反应制得含二硫键长臂生物素；其中生物素酰乙二胺二硫代二丙酸与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和有机碱的摩尔比为1︰1—2︰1—5；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N,N-二甲基乙酰胺（DMAC），二甲基亚砜（DMSO），N-甲基吡咯烷酮（NMP），或者乙腈；有机碱为三乙胺，吡啶，二甲胺基吡啶（DMAP），或者N,N-二异丙基乙胺（DIEA）。
本发明的含二硫键长臂生物素应用于生物素-亲和素标记系统，可与包括抗原、抗体或酶的蛋白质、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记试剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。与其他长臂生物素或近似标记探针相比是在生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了乙二胺和二硫代二丙酸，形成连接臂，使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不容易受位阻效应的影响，增加的二硫键在识别某些蛋白质时更易发挥生物素的活性作用。
本发明提供了一种未被报道的合成含二硫键长臂生物素的制备方法，反应条件温和，反应温度在室温条件下且不需要苛刻反应条件就可以完全进行；合成路线简短，产品提纯容易；不需要使用金属催化剂，避免了重金属离子的引入。
附图说明
图1是具体实施例制备的含二硫键长臂生物素的核磁共振氢谱。
具体实施方式
生物素酰乙二胺的制备
将1.24克（5.04 mmol）生物素溶于30 毫升N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，可适当加热溶解，随后加入N,N-二环己基碳酰亚胺（DCC）1.04克（5.12 mmol）和0.40毫升吡啶（5.04mmol），室温搅拌15分钟后加入0.76克N-羟基琥珀酰亚胺（6.60mmol），室温继续搅拌约18小时。反应完毕后，反应混合物过滤除去不溶物。室温下，将滤液滴加到0.38毫升乙二胺（5.5mmol）的10毫升DMF溶液中，滴加完毕反应继续搅拌约20小时。反应完毕后，过滤除去不溶物，滤液真空浓缩至1/4体积，加入适量正己烷结晶析出白色固体，抽滤收集产物，少量异丙醇洗滤饼，得到淡黄色固体产物 0.92克，收率63wt%。
产物核磁共振参数为：1H NMR (DMSO-d6，400MHz)，δ：8.00 (1H, s)，7.91-7.67(2H, m)，6.40 (2H, d)，4.36-4.24 (1H, m)，4.18-4.06 (1H, m)，3.17-2.92 (5H, m)，2.82 (1H, d)，2.57 (1H, d)，2.06 (2H, t)，1.69-1.15 (6H, m) ，ESI-MS：calcd. For(C12H22N4O2S + H)+：287.4；found：287.2。
生物素酰乙二胺二硫代二丙酸的制备
氮气保护下，将0.45克（1.57 mmol）生物素酰乙二胺溶于15毫升DMF，溶液滴加至由0.48克（1.57 mmol）单N-羟基琥珀酰亚胺二硫代二丙酸酯溶于10毫升DMF形成的溶液中，随后室温反应约24小时。反应完毕后，过滤除去不溶物，滤液真空浓缩，粗产物用柱层析分离（二氯甲烷/甲醇=10/1），得到淡黄色固体0.42克，收率56wt%。
产物核磁共振参数为： 1HNMR(DMSO-d6,400MHz)，δ：7.87(1H,s)，7.82(1H,s)，6.44(2H,d)，4.24-4.19(1H,m)，4.12-4.04(1H,m)，3.15-3.39(6H,m)，3.05-3.22(2H,m)，2.63-2.97(5H,m)，2.42-2.59(2H,t)，2.13-2.18(2H,t)，1.62-1.93(5H,m)，1,34-1.55(2H,m)，ESI-MS：calcd. For (C18H30N4O5S3 + H)+：479.6；found：479.2。
含二硫键长臂生物素的制备
室温下向干燥50 mL三口烧瓶中加入0.30克（0.63 mmol）生物素酰乙二胺二硫代二丙酸、0.16克（0.63mmol）N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶于10毫升 DMF，氮气保护下缓慢滴加入（3.1mmol）0.47毫升三乙胺，滴加完毕后继续反应8小时。过滤，滤液真空减压浓缩，粗产物用制备色谱分离纯化得到淡黄色产品 120毫克，收率33wt%。
产物核磁共振参数为：1HNMR(DMSO-d6,400 MHz)，δ：7.81(1H,s)，7.72(1H,s)，6.42(1H,s)，6.36(1H,s)，4.29-4.32(1H,m)，4.11-4.14(1H,m)，3.01-3.34(6H,m)，2.97-2.99(2H,t)，2.49-2.84(9H,m)，2.33-2.37(2H,t)，2.03-2.07(2H,t)，1.49-1.52(1H,m)，1.44-1.50(3H,m)，1.29-1.32(2H,m)。
Claims (2)
1.一种长臂生物素的制备方法，其特征在于，先将生物素与N-羟基琥珀酰亚胺反应得到活性酯，然后加入乙二胺一锅法反应得到生物素酰乙二胺，再将生物素酰乙二胺与单N-羟基琥珀酰亚胺二硫代二丙酸酯反应生成生物素酰乙二胺二硫代二丙酸，最后将得到的上述生物素酰乙二胺二硫代二丙酸与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应制备得到最终的含二硫键生物素；具体反应为：
。
2.根据权利要求1所述长臂生物素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备生物素酰乙二胺
将生物素加入至有机溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和缩合剂，在适量有机碱的参与下室温反应1—5小时制备得到生物素活性酯，再加入乙二胺，室温下反应1—24小时制得生物素酰乙二胺；其中，生物素与N-羟基琥珀酰亚胺和缩合剂的摩尔比为1︰1—1.5︰1—2，生物素与乙二胺和有机碱的摩尔比为1︰1—2︰1—5；缩合剂为二环己基碳二亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，或者2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；有机碱为三乙胺，吡啶，二甲胺基吡啶，或者N,N-二异丙基乙胺；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺，二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮，或者乙腈；
B、制备生物素酰乙二胺二硫代二丙酸
将单N-羟基琥珀酰亚胺二硫代二丙酸酯溶于有机溶剂中，加入步骤A生成的生物素酰乙二胺，室温下反应1—24小时，制得生物素酰乙二胺二硫代二丙酸；其中生物素酰乙二胺与单N-羟基琥珀酰亚胺二硫代二丙酸酯的摩尔比为1—2︰1—3；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺，二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮，或者乙腈；
C、制备含二硫键长臂生物素
将上述生物素酰乙二胺二硫代二丙酸溶于有机溶剂中，室温下加入N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，加入有机碱反应1—24小时后，反应制得含二硫键长臂生物素；其中生物素酰乙二胺二硫代二丙酸与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和有机碱的摩尔比为1︰1—2︰1—5；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺，二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮，或者乙腈；有机碱为三乙胺，吡啶，二甲胺基吡啶，或者N,N-二异丙基乙胺。
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| A Mechanism-Based Affinity-Labeling Agent for Possible Use in Isolating N-Acetylglucosaminidase;Mie Ichikawa,et al.,;《Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters》;20011231;第11卷;第1769-1773页 |
| Covalent reactivity of phosphonate monophenyl esters with serine proteinases: an overlooked feature of presumed transition state analogs;Yasuhiro Nishiyama,et al.,;《Archives of Biochemistry and Biophysics》;20021231;第402卷;第281-288页 |
| Synthesis of biotinylated bis(D-glucose) derivatives for glucose transporter photoaffinity labelling;Makoto Hashimoto,et al.,;《Carbohydrate Research》;20001123;第331卷;第119-127页 |
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