CN105593268B - 化合物、其制造方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与以往完全不同的新的肽合成方法，并且提供能够进行新的人工功能蛋白质的合成/创制、新的功能肽的合成/创制的新化合物、其制造方法。一种下述式(I)所表示的化合物或其盐。

Description

化合物、其制造方法及其用途
【技术领域】
本发明涉及新化合物、其制造方法及其用途。更具体地说，本发明提供在高分子载体上负载有次磺酰基吡啶结构的化合物、该化合物的制造方法以及使用了该化合物的新的肽合成方法等。
【背景技术】
以往，在蛋白质、肽或核酸等生物体分子的分析和检测等中，使用与该生物体分子结合的标记物质来制成标记体的技术在生物学、分子生物学等领域中得到大量应用。作为分子标记的具体例，有生物素标记。在各种检测系统或生理活性物质的提纯中，为了提高其灵敏度，开发出了利用亲和素与生物素的强力亲和性的系统。而且，生物素标记物质在该系统中是必须的(非专利文献1)。
含有生物素标记的标记分子的导入通常使用对生理活性物质中的数种官能团具有反应性的标记试剂来进行。作为该官能团的示例，可以举出氨基、羟基、咪唑基、以及硫醇基等。或者，还有能够选择性地标记任意一个官能团的试剂。例如可以举出选择性地标记SH基的试剂。关于选择性地标记SH基，在肽或蛋白质的情况下，是指选择性地标记半胱氨酸残基。已知半胱氨酸所具有的SH基或由半胱氨酸形成的二硫化物对于蛋白质的立体结构、蛋白质的酶活性具有很大影响，对其位置进行鉴定在分析蛋白质的结构或活性时是很重要的。实际上，已知有使用与SH基结合的荧光物质对蛋白质中的SH基进行标记来鉴定其在蛋白质中的所在的方法。
另外，不限于对半胱氨酸或其衍生物的应用，作为对SH基进行标记的示例，还已知有对周期蛋白依赖性激酶(以下称为CDK)的活性进行测定的方法(专利文献1)。在该测定方法中，首先使用CDK和腺苷5’-O-(3-硫代三磷酸酯)，在CDK的底物中导入SH基。接着，利用与SH基选择性地结合的标记物质对导入至底物中的SH基进行标记。然后，测定被标记的底物，由此完成CDK的活性测定。
这些用于选择性地标记SH基的试剂需要具有如下所述的性质。第一，仅对SH 基进行标记，而不会对其它官能团带来影响。第二，能够仅分离、提纯标记的分子，从标记到提纯可通过简便的操作来进行。若不仅在SH基上进行标记、而且还作用于其它官能团或结构，则会损害作为本来目的的活性测定或部位鉴定的准确性。最近也报告了多例以针对SH基的选择性标记为特征的试剂(专利文献2和3)。
但是，在利用这些试剂进行的标记操作中，多使用过量的标记试剂，在大多数情况下会残留未反应的试剂或试剂的分解物。因此，通常在标记反应后需要进行除去过量的标记试剂和副产物的操作。
在标记对象为蛋白质、抗体这样的高分子的情况下，为了除去过量投入的标记试剂，可以使用利用分子量差的凝胶过滤、利用膜滤器的(离心)超滤。但是，在标记低分子化合物的情况下，这些方法无法应用，为了除去具有相似分子量的试剂残渣，需要利用更为复杂的层析法等进行提纯。
因此，在需要对低分子有机化合物进行标记的筛选中，期望更为简便的标记方法。
如此，在用于选择性标记SH基的现有试剂中，存在各种问题。
鉴于该现有技术的问题，本发明人将现有的分子标记的方法与固相化学的方法组合使用，将与游离SH基选择性地形成非对称二硫键的2-二硫基吡啶骨架负载至固相载体上，创制出了能够有效地导入标记物质的化合物(专利文献4、非专利文献2)。并且发现，通过将该化合物作为用于利用标记物质对具有SH基的化合物进行标记的 SH选择性标记试剂来使用，能够建立即使对低分子化合物也可进行标记而无需经过复杂提纯手段的方法。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：日本特开2002-335997号公报
专利文献2：日本特开2004-530885号公报
专利文献3：日本特开2010-51289号公报
专利文献4：日本特开2012-117981号公报
【非专利文献】
非专利文献1：“化学大辞典1”共立(昭和42年9月10日)
非专利文献2：Development of a solid-supported biotinylation reagentfor efficient biotin labeling of SH groups on small molecules K.Fukumoto,A.Kajiyama,Y.Hayashi,et al,Tetrahedron Lett.,53,(5),535-538(2012).
【发明内容】
【发明所要解决的课题】
本发明的目的在于提供与以往完全不同的、具有无需进行提纯这样的特点的新的肽合成方法，并且提供能够进行新的人工功能蛋白质的合成/创制、新的功能肽的合成/创制的新化合物、以及不拘于肽的有机化合物、其制造方法。
【用于解决课题的手段】
专利文献4中公开的化合物作为SH选择性标记试剂是有用的，但并未将其本身作为新肽的合成方法使用。
本发明人进一步进行了研究，着眼于具有S-S键形成能力的3-硝基-2-氯次磺酰基吡啶，创制出了在树脂上负载有氯次磺酰基吡啶结构的化合物，结果令人吃惊地发现，通过使用该化合物，能够在不经过提纯过程的情况下利用非常简单的方法将不同的肽片段依次多个连接，从而达成了本发明。
即，本发明提供下述方案：
[1]一种下述式(I)所表示的化合物或其盐。
【化1】
(式中，
W与其它环原子一起形成选自吡啶、吡嗪、咪唑、噁唑、噻唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、菲咯啉、蝶啶或吖辛因的含氮杂环；
X表示选自氟、氯、溴或碘的卤原子；
Y表示在上述含氮杂环上存在的氢原子或吸电子性取代基；
R表示高分子载体；
L0、L1可以各自独立地存在，在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；
Aa、Ab可以各自独立地存在，在存在的情况下分别表示连接L0-L1、L1-R的官能团；
n表示0～10的整数)
[2]如[1]所述的化合物或其盐，其中，Aa、Ab在存在的情况下各自独立地选自由烯烃、炔、羰基、酯、醚、氧化烯烃、酰胺、脲、肼、三唑、砜、亚砜、磺酸酯、磺酰胺、亚磺酸酯、亚磺酰胺、哌啶以及二氧六环组成的组；
[3]如[1]所述的化合物或其盐，其中，上述化合物由下述式(II)所表示，上述含氮杂环为吡啶环，L1不存在，Aa为酰胺基，Ab不存在，n为1。
【化2】
(式中，X、Y、R、L0如式(I)中所定义)
[4]如[1]所述的化合物或其盐，其中，上述化合物由下述式(II-a)所表示，上述含氮杂环为吡啶环，Aa为酰胺基，Ab为酰胺基，n为1～5。
【化3】
(式中，X、Y、R、L0、L1如式(I)中所定义)
[5]如[1]～[4]中任一项所述的化合物或其盐，其中，上述吸电子性取代基为硝基、三氟甲基或卤素。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的化合物或其盐，其中，L0和L1在存在的情况下各自独立地选自由直链或支链的C1～C20亚烷基、C2～C20亚烯基、C2～C20亚炔基、具有3～20个碳原子的环亚烷基、具有3～20个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、酮、聚乙二醇链和下述式(a)所表示的基团组成的组，这些亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基具有或不具有取代基。
【化4】
(式中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基)
[7]如[1]～[6]中任一项所述的化合物或其盐，其中，R为固相合成法中使用的高分子载体。
[8]如[7]所述的化合物或其盐，其中，R选自由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚醚、聚氯乙烯、葡聚糖、丙烯酰胺、聚乙二醇、它们的共聚物和交联物、磁珠、以及这些物质的组合组成的组。
[9]一种SH基选择性反应性固相负载型试剂，其含有[1]～[8]中任一项所述的化合物或其盐。
[10]一种制造下述式(IV)所表示的化合物的方法，使下述式(I)所表示的化合物与式(III)所表示的化合物反应来制造式(IV)所表示的化合物。
【化5】
(式中，W与其它环原子一起形成选自吡啶、吡嗪、咪唑、噁唑、噻唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、菲咯啉、蝶啶或吖辛因的含氮杂环；
X表示选自氟、氯、溴或碘的卤原子；
Y表示氢原子或吸电子性取代基；
R表示高分子载体；
L0、L1在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；
Aa、Ab在存在的情况下分别表示连接L0-L1、L1-R的官能团；
n表示0～10的整数)
【化6】
(式中，
Q1表示有机化合物；
L2在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；
A1在存在的情况下表示具有S-PG的官能团；
PG表示SH基的保护基团或氢原子)
【化7】
(式中，W、Y、R、L0、L1、Aa、Ab、n如式(I)中所定义，Q1、L2、A1如式(III) 中所定义)
[11]如[10]所述的方法，其中，L2选自由直链或支链的C1～C10亚烷基、C2～C10亚烯基、C2～C10亚炔基、具有3～10个碳原子的环亚烷基、具有3～10个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、酮、聚乙二醇链、聚酰胺和下述式(a)所表示的基团组成的组，这些亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基具有或不具有取代基。
【化8】
(式中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基)
[12]如[10]或[11]所述的方法，其中，Q1选自由下述物质组成的组：选自氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸碱基、核苷酸或核苷的生物体来源有机化合物、高分子化合物、低分子化合物、荧光标记物质、酶标记物质、生物素、螯合剂以及它们的包含同位素的衍生物。
[13]如[10]～[12]中任一项所述的方法，其中，上述SH基的保护基团选自叔丁基、三苯甲基、二苯甲基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、三甲基苄基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、三甲氧基苄基、硝基苄基、乙酰胺甲基、9-芴基甲基、羰基苄氧基、二苯基苄基、乙基氨基甲酰基、吡啶甲基、磺酰基或其盐。
[14]一种制造下述式(VI)所表示的化合物的方法，使式(IV)所表示的化合物与式(V)所表示的化合物反应来制造式(VI)所表示的化合物。
【化9】
(式中，
W与其它环原子一起形成选自吡啶、吡嗪、咪唑、噁唑、噻唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、菲咯啉、蝶啶或吖辛因的含氮杂环；
Y表示氢原子或吸电子性取代基；
R表示高分子载体；
L0、L1、L2在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；
Aa、Ab在存在的情况下分别表示连接L0-L1、L1-R的官能团；
A1在存在的情况下表示具有S-PG的官能团；
Q1表示有机化合物；
n表示0～10的整数)
【化10】
(式中，
Q2表示有机化合物；
L3在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；A2在存在的情况下表示具有S-PG的官能团；PG表示SH基的保护基团或氢原子)
【化11】
(式中，Q1、Q2、L2、L3、A1、A2如上述所定义)
[15]如[14]所述的方法，其中，上述吸电子性取代基为硝基、三氟甲基或卤素。
[16]如[14]或[15]所述的方法，其中，L2、L3各自独立地选自由直链或支链的C1～C10亚烷基、C2～C10亚烯基、C2～C10亚炔基、具有3～10个碳原子的环亚烷基、具有3～10个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、酮、聚乙二醇链、聚酰胺和下述式(a)所表示的基团组成的组，这些亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基具有或不具有取代基。
【化12】
(式中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基)
[17]如[14]～[16]中任一项所述的方法，其中，Q1、Q2各自独立地选自由下述物质组成的组：选自氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸碱基、核苷酸或核苷的生物体来源有机化合物、高分子化合物、低分子化合物、荧光标记物质、酶标记物质、螯合剂、生物素以及包含稳定同位素的它们的衍生物。
[18]一种制造式(II)所表示的化合物的方法，其包括下述工序(a)～工序(f)：
(a)使式(1)所表示的化合物与亚硫酰氯、草酰氯、二氯烷基乙内酰脲、三氯氧磷或五氯化磷反应来制备式(2)所表示的化合物的工序；
【化13】
(Y表示氢原子或吸电子性取代基，L0在存在的情况下表示化学上稳定的连接基团)
【化14】
(b)使式(2)所表示的化合物与R’OH(R’表示C1～C10烷基)反应来制备式(3)所表示的化合物的工序；
【化15】
(c)在碱性条件下使式(3)所表示的化合物与伯烷基硫醇～叔烷基硫醇反应来制备式(4)所表示的化合物的工序；
【化16】
(R”表示成为离去基团的伯碳原子～叔碳原子)
(d)在碱性条件下将式(4)所表示的化合物水解来制备式(5)所表示的化合物的工序；
【化17】
(e)在碱存在下使式(5)所表示的化合物与NH2-R(R表示高分子载体)反应来制备式(6)所表示的化合物的工序；以及
【化18】
(f)使式(6)所表示的化合物与硫酰氯、氯气、三氯氧磷、五氯化磷、溴、氟烷基吡啶、氟化奎宁环或碘反应来制备式(II)所表示的化合物的工序；
【化19】
(X表示选自氟、氯、溴或碘的卤原子，Y表示氢原子或吸电子性取代基，R表示高分子载体，L0在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团)。
[19]一种制造式(II-a’)所表示的化合物的方法，其包括下述工序(g)～工序(m)：
(g)在脱水缩合剂存在下使式(7)所表示的化合物与NH2-R(R表示高分子载体)反应来制备式(8)所表示的化合物的工序；
【化20】
(A表示氨基的具有氨基甲酸酯结构的保护基团，L1表示具有化学上稳定的结构的连接基团)
【化21】
(h)使式(8)所表示的化合物与哌啶、二乙胺、二烷基胺、三氟乙酸、盐酸或氯化氢反应，或者通过式(8)所表示的化合物的催化氢还原来制备式(9)所表示的化合物的工序；
【化22】
(i)在脱水缩合剂的存在下使式(9)的化合物与式(7)的化合物反应来制备式(10)所表示的化合物的工序；
【化23】
(j)通过对式(10)所表示的化合物反复交替进行n-2次工序(h)和(i)的操作来制备式 (11)所表示的化合物的工序；
【化24】
(k)使式(11)所表示的化合物与哌啶、二乙胺、二烷基胺、三氟乙酸、盐酸或氯化氢反应，或者通过式(11)所表示的化合物的催化氢还原来制备式(12)所表示的化合物的工序；
【化25】
(l)在脱水缩合剂存在下使式(12)所表示的化合物与式(5)所表示的化合物反应来制备式(13)所表示的化合物的工序；
【化26】
(Y表示氢原子或吸电子性取代基，L0在存在的情况下表示化学上稳定的连接基团，R”表示成为离去基团的伯碳原子～叔碳原子)
【化27】
(m)使式(13)所表示的化合物与硫酰氯或氯气反应来制备式(II-a’)所表示的化合物的工序；
【化28】
(式中，X表示选自氟、氯、溴或碘的卤原子，Y表示氢原子或吸电子性取代基， R表示高分子载体，L0若存在则表示化学上稳定的连接基团，L1表示具有化学上稳定的结构的连接基团，n表示1～10的整数)。
【发明的效果】
将本发明的化合物用于肽合成时，能够利用简单的方法将不同的肽片段依次多个连接。本发明的化合物中，由于在树脂上固定有次磺酰基吡啶结构的官能团，因而在与其他肽进行二硫化物偶联的各步骤中，即使不特别进行提纯，仅通过过滤也能够从滤液中得到高纯度的缩合肽。另外，由于在树脂上形成的活性二硫化物的反应性非常高、且为选择性的，因而无需利用保护基团对肽链的侧链官能团进行保护，在理论上能够将无保护的肽片段进行相当次数的连接，能够得到所谓的电车肽(電車ペプチド)。
另外，本发明的化合物能够提供与现有的生理活性肽合成不同的新的合成方法。即，在现有的肽合成中，将肽键全部连接后，最后形成S-S键；而使用本发明的化合物时，能够提供首先将肽片段利用S-S键进行连接即进行二硫化物连接、之后利用分子内反应形成特定的肽键这样的新的肽合成方法。
如此，本发明的化合物能够提供可称为全新化合物的“电车肽”或“天然肽”的新的合成方法。此外，还能够通过将蛋白质的二级结构结构域作为小的片段肽利用S-S键进行连接来进行蛋白质即ds-蛋白质(二硫化物蛋白质)的合成、最终进行巨大的“人工酶”的合成。
因此，本发明能够提供一种在医药和化学产业中可创制出新分子的有效技术。
【附图说明】
图1是使用了本发明化合物的电车肽的合成路线。
图2是实施例6中的肽H-Asn-Cys(tBu)-Pro-Leu-Gly-NH2的90％甲酸水溶液的反相HPLC谱图。13.36分钟的峰对应于肽。
图3是实施例6中的在化合物Z1的合成中从反应开始起经过2小时后的反应溶液的反相HPLC谱图。由此确认到13.36分钟的峰消失。
图4是实施例6中的肽Fmoc-Cys-Tyr-Ile-Gln-OH的50％N,N-二甲基甲酰胺水溶液的反相HPLC谱图。17.86分钟的峰对应于肽Fmoc-Cys-Tyr-Ile-Gln-OH。
图5是实施例6中的在化合物Z2的合成中从反应开始起经过30分钟后的反应溶液的反相HPLC谱图。由此确认到17.86分钟的对应于肽Fmoc-Cys-Tyr-Ile-Gln-OH 的峰消失、在11.86分钟重新生成了峰。
图6是实施例6中的在化合物Z3的合成中进行过夜反应后的反应溶液的反相 HPLC谱图。确认了未观察到对应于化合物Z2的11.86分钟的峰、在15.99分钟重新生成了峰。
图7是实施例6中的在催产素(化合物Z)的合成中进行过夜反应后的反应溶液的反相HPLC谱图。确认了未观察到对应于化合物Z3的15.99分钟的峰、在12.40分钟重新生成了峰。需要说明的是，在8.82分钟、16.78分钟检测到的峰对应于来自试剂分解物的副产物。
图8是在实施例7中的电车肽化合物V1的合成中反应30分钟后的反相HPLC谱图。17.04分钟的峰对应于化合物V1。在2～3分钟观察到的峰对应于抗坏血酸钠。
【具体实施方式】
本发明的一个方式为下述式(I)所表示的化合物或其盐。
【化29】
式(I)中，W与其它环原子一起形成选自吡啶、吡嗪、咪唑、噁唑、噻唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、菲咯啉、蝶啶、吖辛因的含氮杂环，优选为吡啶。
式(I)中，X表示选自氟、氯、溴或碘的卤原子，优选为氯或溴。
式(I)中，Y表示氢原子或吸电子性取代基。作为吸电子性取代基，优选为硝基、三氟甲基或卤素(例如氯)，更优选为硝基。
式(I)中，L0表示与含氮杂环W进行化学键合且具有稳定结构的连接基团。作为 L0所表示的连接基团选自由直链或支链的C1～C10亚烷基、C2～C10亚烯基、C2～ C10亚炔基、具有3～10个碳原子的环亚烷基、具有3～10个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、酮、聚乙二醇链和下述式(a)所表示的基团组成的组。
【化30】
(式中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基。此处，作为取代基可以选择任意的取代基，例如可以举出烷基、可以具有取代基(例如烷基、烷氧基、卤素等)的芳基、烷氧基等)
作为L0，优选C2～C6的亚烷基、分子量100～1000的聚乙二醇链、或者L0本身不存在。在L0不存在时，成为含氮杂环W直接与Aa键合的结构。
上述的亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基可以具有取代基，作为取代基可以选择任意的取代基。
式(I)中，L1表示具有化学上稳定的结构的连接基团。作为L1所表示的连接基团选自由直链或支链的C1～C10亚烷基、C2～C10亚烯基、C2～C10亚炔基、具有3～ 10个碳原子的环亚烷基、具有3～10个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、酮、聚乙二醇链和下述式(a)所表示的基团组成的组。
【化31】
(式中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基。此处，作为取代基可以选择任意的取代基，例如可以举出烷基、可以具有取代基(例如烷基、烷氧基等)的芳基、烷氧基等)
作为L1，优选为C1～C6的亚烷基、分子量100～1000的聚乙二醇链、式(a)所表示的基团。
上述的亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基可以具有取代基。作为取代基，可以举出取代或无取代的烷基、取代或无取代的芳基、卤素、腈；羧酸、磺酸、亚磺酸和它们的盐。此处，作为烷基、芳基可以具有的取代基，可以举出：烷基、芳基；羧酸、磺酸、亚磺酸和它们的盐；氨基、羟基、胍基、烷氧基、单环式杂芳基、氨基甲酰基、硫醇基、硫醚基、亚砜、砜等。
式(I)中，Aa在存在的情况下表示连接“L0-L1”的官能团。此处，在连接基团L0不存在的情况下，Aa表示与含氮杂环W进行化学键合的官能团。作为Aa所表示的官能团选自由烯烃、炔、羰基、酯、醚、氧化烯烃、酰胺、脲、肼、三唑、砜、亚砜、磺酸酯、磺酰胺、亚磺酸酯、亚磺酰胺、哌啶以及二氧六环组成的组。作为L0，优选为羰基、酯、酰胺、醚、氧化烯烃。
式(I)中，Ab在存在的情况下表示连接“L1-R”的官能团。此处，在连接基团L1不存在的情况下，Ab表示与R进行化学键合的官能团。作为Ab所表示的官能团选自由烯烃、炔、羰基、酯、醚、氧化烯烃、酰胺、脲、肼、三唑、砜、亚砜、磺酸酯、磺酰胺、亚磺酸酯、亚磺酰胺、哌啶以及二氧六环组成的组。作为Ab，优选为羰基、酯、酰胺、醚、氧化烯烃。
式(I)中，n表示0～10的整数，优选为0～5的整数。
式(I)中，R表示高分子载体，代表性地为固相合成法中使用的高分子载体，作为这样的高分子载体，选自由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚醚、聚氯乙烯、葡聚糖、丙烯酰胺、聚乙二醇、它们的共聚物和交联物、磁珠、以及这些物质的组合组成的组，更优选为聚苯乙烯、聚乙二醇以及聚乙二醇的交联物。这些高分子载体可以藉由Ab的取代基和甲基等烷基等进行键合。
树脂的形状更优选为球状。优选的树脂的平均粒径为100目～400目。
本发明化合物的一个实施方式为式(I)中的含氮杂环W为吡啶环的、下述式(I-a)所表示的化合物。
【化32】
式(I-a)中，X、Y、R、L0、L1、Aa、Ab、n如式(I)中所定义。
本发明化合物的一个实施方式为式(I)中的含氮杂环W为吡啶环、L1不存在、Aa为酰胺、Ab不存在、n为1的、下述式(II)所表示的化合物。
【化33】
式(II)中，X、Y、R、L0如式(I)中所定义。
另外，本发明化合物的另一个实施方式为含氮杂环W为吡啶环、Aa为酰胺、Ab为酰胺、n为1～5的、下述式(II-a)所表示的化合物。
【化34】
(式中，X、Y、R、L0、L1、n如式(I)中所定义)
作为本发明的式(I)、(II)和式(II-a)的化合物，具体可以举出下述化合物，但并不限定于这些。
【化35】
化合物A
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标)树脂)
【化36】
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标)树脂) 【化37】
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标)树脂) 【化38】
树脂：聚苯乙烯树脂
【化39】
树脂：聚苯乙烯树脂
【化40】
树脂：聚苯乙烯树脂
【化41】
树脂：聚乙烯树脂
【化42】
树脂：聚苯乙烯树脂
【化43】
树脂：聚苯乙烯树脂
【化44】
树脂：聚苯乙烯树脂
【化45】
树脂：聚苯乙烯树脂
【化46】
树脂：聚苯乙烯树脂
【化47】
树脂：聚乙二醇-聚苯乙烯复合树脂
【化48】
树脂：聚苯乙烯树脂
本发明化合物的合成方法
接着示出本发明化合物的合成方法，首先，以下示出式(I)中的含氮杂环W为吡啶环、L1不存在、Aa为酰胺、Ab不存在、n为1的式(II)所表示的化合物的合成方法。
化合物(II)的合成路线
【化49】
工序(a)
将式(1)的化合物溶解在DMF等溶剂中，一边将溶液在惰性气体气流下在冰浴等中冷却一边添加亚硫酰氯(SOCl2)，之后加热至80℃左右，反应15～20小时。通过浓缩蒸馏除去溶剂和亚硫酰氯，加入己烷等溶剂，反复进行3～5次左右的共沸，在减压下干燥，由此得到化合物(2)。需要说明的是，在例如Y为3-硝基的情况下，式(1) 的化合物可以通过使2-羟基-5-烷基羧基-吡啶与发烟硝酸反应来得到。
工序(b)
使式(2)的化合物与R’OH(R’表示C1～C6烷基、例如甲基)反应，在减压下干燥，由此能够合成式(3)的化合物。
工序(c)
在甲醇等溶剂中溶解式(3)的化合物和C4～C25左右的伯烷基硫醇～叔烷基硫醇，加入三乙胺等碱，在50℃～70℃左右在回流下反应数小时。将反应液自然冷却至室温后，在减压下蒸馏除去溶剂，向所得到的残渣中加入蒸馏水，利用乙酸乙酯进行萃取，利用无水硫酸钠等进行干燥，之后将所得到的固体重结晶，由此能够合成式 (4)的化合物。式(4)中，R”是成为离去基团的伯碳原子～叔碳原子，例如表示苄基、甲氧基苄基、二甲氨基苄基、三苯甲基、氯代三苯甲基、甲基三苯甲基、甲氧基三苯甲基、叔丁基。
工序(d)
将式(4)的化合物溶解在甲醇等溶剂中，将溶液冷却，接着加入氢氧化锂一水合物和纯水，在室温下反应20小时左右。然后，在减压下蒸馏除去溶剂后，向水溶液中添加10％左右的柠檬酸水溶液直至pH达到2～3，利用乙酸乙酯对所得到的水溶液进行萃取后，在减压下蒸馏除去溶剂，进行真空干燥，由此能够合成式(5)的化合物。
工序(e)
向容器中依次添加式(5)的化合物、大致等摩尔的(O-(7-氮杂苯并三唑-1- 基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)(HATU)、DMF等溶剂、二异丙基乙胺，进行 1～2分钟的振荡搅拌。接着，将上述溶液一次性添加至装有H2N-R(R为固相合成法中使用的高分子载体)的另一容器中，利用磁力搅拌器、基于搅拌叶片的搅拌或振荡搅拌固相合成机(例如，国产化学株式会社制造的振荡搅拌固相合成机KMS-3)进行振荡搅拌。在1～2小时后停止搅拌，滤去溶剂，依次利用DMF进行10次左右、利用甲醇进行5次左右、利用乙醚进行3次左右的清洗后，取1mg左右的所得到的树脂，对其进行茚三酮检测(Kaiser test)(利用苯酚-乙醇溶液、氰化钾水溶液-吡啶溶液、茚三酮-乙醇溶液的混合液进行的游离氨基显色反应试验)，确认为阴性。将所得到的树脂在减压下干燥，由此能够合成式(6)的化合物。
工序(f)
在式(6)的化合物中加入1,2-二氯乙烷等溶剂，温和地搅拌数分钟，使固相载体溶胀。除去溶剂后进行冷却，加入吡啶、硫酰氯和1,2-二氯乙烷的混合液，在冰冷却下温和地搅拌1～2小时左右。搅拌后取少量溶液，利用1H-NMR确认了来自R”的烷基产物的生成后，除去溶液，加入脱水二氯甲烷进行数次清洗，由此能够合成式(II) 的化合物。需要说明的是，也可以使用氯气、三氯氧磷、五氯化磷、溴、氟烷基吡啶、氟化奎宁环或碘来代替硫酰氯。
式(II-a)的化合物的合成方法
式(I)中的含氮杂环W为吡啶环、L1存在、Aa为酰胺、Ab为酰胺、n为1～5的式(II-a)所表示的化合物可以通过以下的合成路线来制造。需要说明的是，为了便于合成路线的记载，在下述路线中将式(II-a)的化合物以(II-a’)式来表示，但两式均表示相同的化合物。
【化50】
工序(g)
向容器中依次添加式(7)的化合物、大致等摩尔的HATU等脱水缩合剂、DMF等溶剂、二异丙基乙胺，进行1～2分钟的振荡搅拌。式(7)中，A表示氨基的具有氨基甲酸酯结构的保护基团，具体地说，表示作为氨基的保护基团的9-芴基甲氧基羰基、叔丁氧基羰基或苄氧基羰基等。接着，将上述溶液一次性添加至装有H2N-R(R为固相合成法中使用的高分子载体)的另一容器中，利用振荡搅拌固相合成机(例如，国产化学株式会社制造的振荡搅拌固相合成机KMS-3)进行振荡搅拌。在1～2小时后停止搅拌，滤去溶剂，依次利用DMF进行10次左右、利用甲醇进行5次左右、利用乙醚进行3次左右的清洗后，取1mg左右的所得到的树脂，对其进行茚三酮检测(利用苯酚-乙醇溶液、氰化钾水溶液-吡啶溶液、茚三酮-乙醇溶液的混合液进行的氨基显色反应试验)，确认为阴性。将所得到的树脂在减压下干燥，由此能够合成式(8)的化合物。
工序(h)
在装有式(8)的化合物的容器中加入20％哌啶DMF溶液，进行振荡搅拌。在20 分钟左右后停止搅拌，滤去溶剂，利用二甲基甲酰胺清洗10次左右，由此得到式(9) 的化合物，将其直接用于接下来的反应。需要说明的是，也可以使用二乙胺、二烷基胺、三氟乙酸、盐酸或氯化氢来代替哌啶。
工序(i)
在加入有式(9)的化合物的容器中依次添加式(7)的化合物、DMF、脱水缩合剂(例如二异丙基碳化二亚胺、1-[双(二甲氨基)亚甲基]1-H-苯并三唑鎓-3-氧化物六氟磷酸盐(简称：HBTU)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]1H-1,2,3-三唑并(4,5-b)吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(简称：HATU)、三(吡咯烷基)溴化鏻六氟磷酸盐(简称：PyBrop)、羟基苯并三唑水合物)，进行振荡搅拌。在1～2小时后停止搅拌，滤去溶剂，利用二甲基甲酰胺进行10次左右的清洗，由此能够得到式(10)的化合物。该化合物直接用于接下来的反应。另取1mg左右的所得化合物，对其进行茚三酮检测(利用苯酚-乙醇溶液、氰化钾水溶液-吡啶溶液、茚三酮-乙醇溶液的混合液进行的氨基显色反应试验)，确认为阴性。
工序(j)
对式(10)的化合物反复交替进行n-2次的上述工序(h)和工序(i)的操作，由此得到式(11)的化合物。所得到的式(11)的化合物直接用于接下来的反应。需要说明的是，在得到式(II-a)中的n为1的化合物的情况下，不需要该工序，将式(10)的化合物供于工序(k)。
工序(k)
在装有式(11)的化合物的容器中加入20％哌啶DMF溶液，进行振荡搅拌。在20 分钟左右后停止搅拌，滤去溶剂，利用二甲基甲酰胺进行10次左右的清洗，由此得到式(12)的化合物，将其直接用于接下来的反应。需要说明的是，也可以根据A的种类适当地使用二乙胺、二烷基胺、三氟乙酸、盐酸或氯化氢来代替哌啶。
工序(l)
在容器中依次添加式(5)的化合物、大致等摩尔的HATU、DMF、大致等摩尔的二异丙基乙胺，进行1分钟左右的振荡搅拌。将该溶液一次性添加到装有式(12)的化合物的容器中，进行振荡搅拌。在1～2小时后停止搅拌，滤去溶剂，依次利用二甲基甲酰胺进行10次左右、利用甲醇进行5次左右、利用乙醚进行3次左右的清洗后，在减压下干燥，由此能够合成式(13)的化合物。另取1mg左右的所得化合物，对其进行茚三酮检测，确认为阴性。
工序(m)
在式(13)的化合物中加入1,2-二氯乙烷等溶剂，温和地搅拌数分钟，使固相载体溶胀。除去溶剂后进行冷却，加入吡啶、硫酰氯和1,2-二氯乙烷的混合液，在冰冷却下温和地搅拌1～2小时左右。搅拌后取少量溶液，利用1H-NMR确认了来自R”的烷基产物的生成后，除去溶液，加入脱水二氯甲烷进行数次清洗，由此能够合成式(II-a’) 的化合物。
本发明的SH基选择性反应性固相负载型试剂
本发明的化合物能够固定在固相合成法中使用的高分子载体上，因而可以作为与具有SH基的化合物选择性地发生反应的固相负载型试剂来使用。即，本发明的一个方式为含有式(I)、(II)或(II-a)的化合物的SH基选择性反应性固相负载型试剂。此处， SH基选择性反应性是指与具有SH基的化合物的SH基选择性地发生反应而结合。
本发明的另一个方式为使式(I)、(II)或(II-a)的化合物与具有SH基的有机化合物或SH基被保护基团所保护的有机化合物发生反应来导入S-S键的方法。即，本发明的一个实施方式为使式(I)所表示的化合物与式(III)所表示的化合物反应来制造式(IV) 所表示的化合物的方法(下文中也称为“本发明的制造方法1”)。
【化51】
式(III)和(IV)中，Q1表示有机化合物。作为Q1，选自由下述物质组成的组：选自氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸碱基、核苷酸或核苷的生物体来源有机化合物、高分子化合物、低分子化合物、荧光标记物质、酶标记物质、生物素、螯合剂以及它们的包含同位素的衍生物。
作为氨基酸，可以使用必需氨基酸、β-丙氨酸等β-氨基酸、γ-氨基丁酸等γ氨基酸、包括氘代氨基酸在内的经稳定同位素修饰的氨基酸等。在A1存在的情况下的A1、在L1存在的情况下的L1、以及S-PG可以键合在氨基酸的主链或侧链中的任一者上。
作为肽，可以举出各种寡肽，例如寡聚精氨酸、聚赖氨酸、精氨酰-甘氨酰-天冬酰胺之类的细胞粘附因子肽、赖氨酰-亮氨酰-丙氨酰-赖氨酸之类的细胞死亡诱导肽等。
作为蛋白质，例如可以举出层粘连蛋白、CFP、GFP、YFP、别藻蓝蛋白、藻红蛋白等。
作为抗体，例如可以举出单克隆抗体等。
作为核酸碱基、核苷酸或核苷，例如可以举出腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、AMP、ADP、ATP、GTP、UTP、CTP、包含脱氧核苷酸dATP的衍生物等。
作为高分子化合物，例如可以举出合成橡胶、合成树脂、合成纤维、天然橡胶、淀粉、糖链、油脂等。
作为低分子化合物，例如可以举出唾液酸、胆固醇、维生素、生物碱、类固醇、环糊精、冠醚、EDTA等以及它们的放射性同位素和稳定同位素等。
作为荧光标记物质，可以举出荧光素、香豆素、伊红、菲咯啉、芘、若丹明、吲哚菁、喹喔啉或它们的衍生物等，例如可以举出由异硫氰酸荧光素衍生的物质。
作为酶标记物质，可以举出β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、过氧化酶等。
另外，作为Q1，可以为选自由下述物质组成的组中的两种以上的有机化合物结合而成的物质：选自氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸碱基、核苷酸或核苷的生物体来源有机化合物、高分子化合物、低分子化合物、荧光标记物质、酶标记物质、生物素、螯合剂以及它们的包含同位素的衍生物。在两种以上的有机化合物结合的情况下，可以藉由连接基团(直链或支链的C1～C10亚烷基、C2～C10亚烯基、C2～C10亚炔基、具有3～10个碳原子的环亚烷基、具有3～10个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、羧酸、磺酸、磺酰胺、酮、聚乙二醇链、聚酰胺等)进行结合。
式(III)和(IV)中，L2在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团。作为L2所表示的连接基团选自由直链或支链的C1～C10亚烷基、C2～C10亚烯基、C2～ C10亚炔基、具有3～10个碳原子的环亚烷基、具有3～10个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、羧酸、磺酸、磺酰胺、酮、聚乙二醇链、聚酰胺和下述式(a)所表示的基团组成的组，这些亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基可以具有取代基，作为取代基可以选择任意的取代基。作为L2，优选为C2～C6亚烷基、分子量100-1000的聚乙二醇、聚酰胺。
【化52】
(式中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基。此处，作为取代基可以选择任意的取代基，例如可以举出烷基、可以具有取代基(例如烷基、烷氧基等)的芳基、烷氧基等)
式(III)和(IV)中，A1在存在的情况下表示具有S-PG的官能团。A1也可以不存在，这种情况下，S-PG与连接基团直接键合，或者可以与Q1的有机化合物直接键合。
作为键合了S-PG的A1、即A1-S-PG，例如可以举出：半胱氨酸、SH基被保护基团所保护的半胱氨酸、半胱氨酰胺、SH基被保护基团所保护的半胱氨酰胺、半胱胺、SH基被保护基团所保护的半胱胺、乙酰基半胱氨酸、SH基被保护基团所保护的乙酰基半胱氨酸、氨基烷基硫醇、SH基被保护基团所保护的氨基烷基硫醇、巯基乙醇、SH基被保护基团所保护的巯基乙醇。
式(III)中，PG表示SH基的保护基团或氢原子。作为SH基的保护基团，选自叔丁基、三苯甲基、二苯甲基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、三甲基苄基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、三甲氧基苄基、硝基苄基、乙酰胺甲基、9-芴基甲基、羰基苄氧基、二苯基苄基、乙基氨基甲酰基、吡啶甲基、磺酰基或其盐。
本发明的一个方面为使式(II)所表示的化合物与式(III)所表示的化合物反应来制造式(IVa)所表示的化合物的方法(下文中也称为“本发明的制造方法1a”)。
【化53】
L0、R如式(II)中所定义，Q1、L2、A1如式(III)中所定义。
本发明的另一个方面为使式(II-a)所表示的化合物与式(III)所表示的化合物反应来制造式(IVb)所表示的化合物的方法(下文中也称为“本发明的制造方法1b”)。
【化54】
L0、L0、R、n如式(II-a)中所定义，Q1、L2、A1如式(III)中所定义。
本发明的制造方法1、1a或1b可以通过以下步骤来进行。
取式(I)、(II)或(II-a)的化合物至容器中，加入相对于固相载体上的官能团取代率为1.2当量～50当量的式(III)化合物的溶液，更优选为20当量～50当量。2～8小时后，通过过滤除去溶液，利用所使用的溶剂清洗10次，进一步利用甲醇清洗5次、利用乙醚清洗5次，进行减压干燥，由此能够得到式(IV)、(IVa)或(IVb)的化合物。需要说明的是，所使用的溶剂只要为可充分溶解式(III)的化合物的溶剂即可，可以适当地选择有机溶剂或水溶液。例如为二氯甲烷、二氯乙烷、二甲基甲酰胺、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、己烷、乙醚、四氢呋喃、三氟乙酸、三氟乙醇、蒸馏水、缓冲液、乙酸、盐酸、甲酸，优选为二氯甲烷、蒸馏水、甲酸、乙酸、三氟乙酸。
以下示出可以使用本发明的制造方法1、1a或1b来制造的化合物的非限定性示例。
【化55】
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标)树脂)
【化56】
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标)树脂)
【化57】
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标))
【化58】
化合物R
树脂：聚乙二醇、聚苯乙烯复合树脂
【化59】
树脂：聚苯乙烯复合树脂
本发明的另一个方式为使式(IV)的化合物与其他的具有SH基的有机化合物或 SH基被保护基团所保护的有机化合物反应来制造具有S-S键的化合物的方法。即，本发明的一个实施方式为使式(IV)所表示的化合物与式(V)所表示的化合物反应来制造式(VI)所表示的化合物的方法(下文中也称为“本发明的制造方法2”)。
【化60】
式(V)和(VI)中，Q2与Q1同样地表示有机化合物，作为Q2，选自由下述物质组成的组：选自氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸碱基、核苷酸或核苷的生物体来源有机化合物、高分子化合物、低分子化合物、荧光标记物质、酶标记物质、生物素、螯合剂以及它们的包含同位素的衍生物。可以在Q2中使用的有机化合物与在Q1中例示的有机化合物相同。
另外，作为Q2，可以为选自由下述物质组成的组中的两种以上的有机化合物结合而成的物质：选自氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸碱基、核苷酸或核苷的生物体来源有机化合物、高分子化合物、低分子化合物、荧光标记物质、酶标记物质、生物素、螯合剂以及它们的包含同位素的衍生物；在两种以上的有机化合物结合的情况下，可以藉由Q1中例示的连接基团进行结合。
式(V)和(VI)中，L3在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团。作为L3所表示的连接基团选自由直链或支链的C1～C10亚烷基、C2～C10亚烯基、C2～ C10亚炔基、具有3～10个碳原子的环亚烷基、具有3～10个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、酮、聚乙二醇链、聚酰胺和下述式(a)所表示的基团组成的组，这些亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基可以具有取代基，作为取代基可以选择任意的取代基。作为L3，优选为C2～C6的亚烷基、分子量100-1000的聚乙二醇、聚酰胺。
【化61】
(式中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基。此处，作为取代基可以选择任意的取代基，例如可以举出烷基、可以具有取代基(例如烷基、烷氧基等)的芳基、烷氧基等)
式(V)和(VI)中，A2在存在的情况下表示具有S-PG的官能团。A2也可以不存在，这种情况下，S-PG与连接基团直接键合，或者可以与Q2的有机化合物直接键合。
作为键合了S-PG的A2、即A2-S-PG，例如可以举出：半胱氨酸、SH基被保护基团所保护的半胱氨酸、半胱氨酰胺、SH基被保护基团所保护的半胱氨酰胺、半胱胺、SH基被保护基团所保护的半胱胺、乙酰基半胱氨酸、SH基被保护基团所保护的乙酰基半胱氨酸、氨基烷基硫醇、SH基被保护基团所保护的氨基烷基硫醇、巯基乙醇、SH基被保护基团所保护的巯基乙醇。优选A2不存在、SH基的保护基团PG为氢原子或甲氧基三苯甲基，即具有L3与PG直接键合的Q2-L3-S-PG的结构。另外更优选PG为氢原子而具有Q2-L3-S-H的结构。
式(V)中，PG表示SH基的保护基团或氢原子。作为SH基的保护基团，选自叔丁基、三苯甲基、二苯甲基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、三甲基苄基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、三甲氧基苄基、硝基苄基、乙酰胺甲基、9-芴基甲基、羰基苄氧基、二苯基苄基、乙基氨基甲酰基、吡啶甲基、磺酰基或其盐。
本发明的一个方面为使式(IVa)所表示的化合物与式(V)所表示的化合物反应来制造式(VI)所表示的化合物的方法(下文中也称为“本发明的制造方法2a”)。
本发明的另一个方面为使式(IVb)所表示的化合物与式(V)所表示的化合物反应来制造式(VI)所表示的化合物的方法(下文中也称为“本发明的制造方法2b”)。
本发明的制造方法2、2a或2b可以通过以下步骤来进行。
(1)将式(V)的化合物溶解在溶剂中。根据优选的方式，将式(V)的化合物溶解在水、或者含有1％以上的水的有机溶剂中。另外，此时的pH优选为中性附近，优选pH为 6.5～8.5。另外，可以使用缓冲液来代替水，也可以任意组合使用水、缓冲液和有机溶剂。另一方面，在组合使用有机溶剂的情况下，优选与水混合的有机溶剂，可以举出乙腈、二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基亚砜、乙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环等。
(2)将上述(1)中制备的式(V)的化合物的溶液与式(IV)、(IVa)或(IVb)的化合物混合。此时，可以向装有溶液的容器中添加式(IV)或(IVa)的化合物，也可以向装有式(IV)、(IVa)或(IVb)的化合物的容器中添加溶液。需要说明的是，容器的形态、材质没有限定，优选为带过滤器的管等带有过滤用过滤器的能够进行搅拌的容器。混合时可以将容器静置，但优选通过振荡或利用固相合成用振荡机、磁力搅拌器、旋涡混合器、 Three-One Motor等的搅拌来进行。
(3)通过由上述(2)的混合而产生的反应，通常可以以5分钟～2小时进行反应。该反应中所使用的式(IV)、(IVa)或(IVb)的化合物的添加量根据式(V)化合物的量进行增减即可。例如，相对于式(V)化合物1当量，式(IV)、(IVa)或(IVb)的化合物的量优选过量使用，更优选使用1.2当量至10当量。关于反应的完结，可以利用通常的分析方法来判断溶液中的式(V)的化合物的消耗。例如，作为可以应用的分析方法，可以适当地举出HPLC、NMR、TLC、IR、MS光谱、滴定等，可以适当地利用适于式(V) 和(IV)的检测的方法。
(4)反应后，通过过滤将式(VI)的化合物、未反应的式(I)、(II)或(IIa)的化合物以及式(I)、(II)或(IIa)随着反应的进行变化而成的化合物分开，在滤液中以溶液的形式得到式(VI)的化合物。过滤中所使用的器具、过滤方法没有限制。作为器具，可以举出利用滤纸、玻璃纤维、过滤助剂、滤布的过滤或膜过滤器、玻璃过滤器等。作为过滤方法，也可以举出自然过滤、抽滤、离心分离、倾析等，可以根据各自的用途、反应规模适当地选择。
以下示出可以使用本发明的制造方法2、2a或2b来制造的化合物的非限定性示例。
【化62】
【化63】
化合物T和U分别为使化合物O和Q与甲巯丙脯酸反应、通过非对称二硫化物合成而得到的化合物。
本发明的又一个实施方式为使式(I)所表示的化合物与式(III)所表示的化合物反应来制造式(IV)所表示的化合物、并使式(IV)所表示的化合物与式(V)所表示的化合物反应来制造式(VI)所表示的化合物的方法。
另外，本发明的另一个方面为使式(II)所表示的化合物与式(III)所表示的化合物反应来制造式(IVa)所表示的化合物、并使式(IVa)所表示的化合物与式(V)所表示的化合物反应来制造式(VI)所表示的化合物的方法。
另外，本发明的另一个方面为使式(IIa)所表示的化合物与式(III)所表示的化合物反应来制造式(IVb)所表示的化合物、并使式(IVb)所表示的化合物与式(V)所表示的化合物反应来制造式(VI)所表示的化合物的方法。
本发明的又一个方式为使式(IV)的化合物与具有2个SH基且一个SH基被保护基团所保护的有机化合物反应来制造具有S-S键的化合物的方法。即，本发明的一个实施方式为使式(IV)所表示的化合物与式(Va)所表示的化合物反应来制造式(VIa)所表示的化合物的方法(下文中也称为“本发明的制造方法3”)。
【化64】
(L3’和A2’分别与对于L3和A2的定义相同)
以下示出可以使用本发明的制造方法3来制造的化合物的非限定性示例。
【化65】
化合物V
化合物V为使化合物P与H-Cys-Ser-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys(tBu)-NH2反应而得到的化合物。
进一步，可以使式(VIa)的化合物与式(I)的化合物反应，并使所得到的化合物与式(Va)或式(V)所表示的化合物反应。通过反复进行该反应，能够得到Q的片段连接而成的如下所示的化合物。
【化66】
(L(n+1)与对于L2的定义相同，A(n-1)、An与对于A1的定义相同，Qn与对于Q1的定义相同)
如此，通过使用式(I)的化合物，例如在Q为肽的情况下，能够制造几个肽片段连接而成的化合物(电车肽)。合成电车肽的路线示于图1。如图1所示，通过使用式 (I)的化合物，即使不对肽末端进行保护，也能够将肽片段连接。
另外，现有的肽合成中，在将肽键全部连接后，最后形成S-S键；而本发明能够提供首先将肽片段利用S-S键进行连接、之后利用分子内反应形成特定的肽键这样的新的肽合成方法。
【实施例】
下面通过实施例说明本发明，但本发明的范围并不限于这些实施例。
[实施例1]
作为本发明化合物的一例，以下示出化合物A的合成。
化合物A(6-氯次磺酰基-5-硝基烟酸甲酰胺树脂)的合成
通过如下的路线合成化合物A。
[化67]
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标)树脂)
(1)化合物2的合成
在500ml的茄形瓶中装入化合物1(25g、0.180mol)，加入发烟硝酸(1.52)(125ml)。一边进行搅拌一边使用油浴缓慢地进行加热，在50℃的温度条件下进行5小时搅拌。停止加热，自然冷却至室温后，在减压下将反应溶液浓缩。将所得到的残渣在冰浴中冷却，以甲醇作为溶剂进行重结晶，将通过过滤得到的固体在减压下干燥，由此得到化合物2(9.77g、0.053mmol)。
1H NMR(300MHz,CD3OD)8.44(d,J＝2.6Hz,1H),8.85(d,J＝2.6Hz,1H)； HRMS(ES+)：m/z 185.0194(M+H)+(C6H5N2O5计算值：185.0198).
(2)化合物3的合成
在氩气气流下向500ml的茄形瓶中加入化合物2(20.0g)、N,N-二甲基甲酰胺(8.44ml、0.109mmol)，一边在冰浴中冷却一边加入亚硫酰氯(158.3ml、2.18mmol)。加入全部亚硫酰氯后，恢复至室温。接着使用油浴缓慢地进行加热，在80℃的温度条件下进行16小时搅拌。停止加热，自然冷却至室温后，将反应溶液在减压下浓缩。向所得到的残渣中加入二氯甲烷(50ml)，再次进行浓缩，对残留的亚硫酰氯进行共沸。浓缩后，将所得到的残渣在冰浴中冷却，加入甲醇(50mL)后进行浓缩，在减压下干燥，由此得到化合物3(18.2g、0.084mmol)。
1H NMR(300MHz,CD3OD)4.00(s,3H),8.52(d,J＝2.1Hz,1H),9.14(d,J＝2.1 Hz,1H)；HRMS(ES+)：m/z 217.0006(M+H)+(C7H6N2O4Cl计算值：217.0016).
(3)化合物4的合成
在100ml的茄形瓶中装入甲醇(15ml)，一边进行搅拌一边加入化合物3(2.54g、11.7mmol)和苄硫醇(2.18g、17.6mmol)，使其溶解。在确认到原料完全溶解后，加入三乙胺(2.46ml)。使用油浴将外温设定为60℃，在回流下搅拌5小时。将反应液自然冷却至室温后，在减压下蒸馏除去溶剂，向所得到的残渣中加入蒸馏水，利用乙酸乙酯进行萃取。将有机相分别利用蒸馏水、饱和食盐水进行清洗，利用无水硫酸钠进行干燥。滤去无水硫酸钠后，在减压下蒸馏除去溶剂，将所得到的固体由己烷和乙酸乙酯中进行重结晶，得到化合物4(3.27g、10.7mmol)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)4.00(s,3H),4.52(s,2H),7.18-7.36(m,3H),7.38-7.48(m,2H),9.02(d,J＝1.9Hz,1H),9.25(d,J＝1.8Hz,1H)；HRMS(ES+)：m/z 305.0592 (M+H)+(C14H13N2O4S计算值：305.0596).
(4)化合物5的合成
在500ml的茄形瓶中装入化合物4(3.27g、10.7mmol)，加入甲醇(210ml)并使用冰浴进行冷却。接着加入氢氧化锂一水合物(902mg、21.5mmol)和纯水(180ml)，在冰浴下搅拌10分钟后，升温至室温，搅拌15小时。进一步加入将氢氧化锂一水合物(225mg、 5.4mmol)溶解在纯水(5ml)中而得到的溶液，搅拌4.5小时。确认溶液变得澄清，在减压下蒸馏除去甲醇。向余下的水溶液中添加10％柠檬酸水溶液至pH为3。使用乙酸乙酯对所得到的水溶液进行萃取，将有机相依次用水、饱和食盐水清洗后，使用无水硫酸钠进行干燥。滤去无水硫酸钠，接着在减压下蒸馏除去溶剂、在真空下进行干燥，由此得到化合物5(3.1g、10.7mmol)。
1H NMR(300MHz,CD3OD)4.52(s,2H),7.18-7.36(m,3H),7.38-7.48(m,2H), 8.94(d,J＝2.0Hz,1H),9.22(d,J＝2.0Hz,1H)；HRMS(ES+)：m/z 291.0442(M+H)+ (C13H11N2O4S计算值：291.0440).
(5)化合物6的合成
在15ml的聚丙烯制管中依次添加化合物5(508.1mg、1.75mmol)、(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)(528.2mg、1.72mmol)、DMF(16ml)、二异丙基乙胺(251.0μl)，进行1分钟振荡搅拌。在另外准备的60ml聚丙烯制带过滤芯的管中取500mg的氨基甲基-ChemMatrix树脂(式中的H2N-树脂、官能团取代率 0.70mmol/g)，向其中一次性添加上述15ml管内的溶液，安装到振荡搅拌固相合成机 KMS-3(国产化学株式会社制造)中，进行振荡搅拌。1.5小时后停止搅拌，滤去溶剂，依次利用5ml的二甲基甲酰胺清洗10次、利用甲醇清洗5次、利用乙醚清洗3次后，取1mg所得到的树脂，对其进行茚三酮检测(利用苯酚-乙醇溶液、氰化钾水溶液-吡啶溶液、茚三酮-乙醇溶液的混合液进行的游离氨基显色反应试验)，确认为阴性。将所得到的化合物在减压下干燥，由此得到化合物6(560mg)。
(6)化合物A的合成
取搅拌子和树脂化合物(30.7mg)至10ml的玻璃试管中，加入1,2-二氯乙烷(2.0ml)，温和地进行搅拌，使树脂溶胀。搅拌5分钟后，利用巴斯德吸管除去溶剂。接着使用冰浴将试管冷却，加入另外在30ml的三角烧瓶中制备的吡啶(7.3μl)、硫酰氯(10μl)、1,2-二氯乙烷(1.99ml)的混合液，在冰冷却下温和地搅拌。搅拌1.5小时后，使用巴斯德吸管除去溶液，加入脱水二氯甲烷(2ml)对树脂化合物进行清洗。利用巴斯德吸管除去清洗液后，再次加入二氯甲烷，进行5次同样的清洗，由此得到化合物 A。
[实施例2]
作为本发明的化合物的一例，以下示出化合物B的合成。
化合物B(5-((6-(甲基氨基树脂)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代己基)羰基)-3-硝基吡啶 -2-次磺酰氯)的合成
通过如下的路线合成化合物B。
[化68]
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标)树脂)
(1)化合物8的合成
在15ml的聚丙烯制管中依次添加9-芴基甲氧基羰基氨基己酸(化合物7、632.4mg、1.79mmol)、(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)(540.6mg、1.76mmol)、DMF(16ml)、二异丙基乙胺(257.0μl、1.79mmol)，进行1分钟振荡搅拌。在另外准备的60ml聚丙烯制带过滤芯的管中取511.7mg的氨基甲基-ChemMatrix树脂(式中的H2N-树脂、官能团取代率0.70mmol/g)，向其中一次性添加上述15ml管内的溶液，安装到振荡搅拌固相合成机KMS-3(国产化学株式会社制造)中，进行振荡搅拌。1.5小时后停止搅拌，滤去溶剂，利用5ml的二甲基甲酰胺清洗10次，由此得到树脂化合物8，将其直接用于接下来的反应。另取1mg所得到的树脂，对其进行茚三酮检测(利用苯酚-乙醇溶液、氰化钾水溶液-吡啶溶液、茚三酮-乙醇溶液的混合液进行的游离氨基显色反应试验)，确认为阴性。
(2)化合物9的合成
在装有化合物8的60ml聚丙烯制带过滤芯的管中加入20％哌啶DMF溶液16ml，进行振荡搅拌。20分钟后停止搅拌，滤去溶剂，利用5ml的二甲基甲酰胺清洗10次，由此得到树脂化合物9，将其直接用于接下来的反应。
(3)化合物10的合成
在装有化合物9的60ml聚丙烯制带过滤芯的管中依次添加9-芴基甲氧基羰基氨基己酸(化合物7、632.4mg、1.79mmol)、DMF(16ml)、二异丙基碳化二亚胺(201.0mg、1.79mmol)、羟基苯并三唑水合物(274.2mg、1.79mmol)，进行振荡搅拌。1.5小时后停止搅拌，滤去溶剂，利用5ml的二甲基甲酰胺清洗10次，由此得到化合物10，将其直接用于接下来的反应。另取1mg所得到的树脂，对其进行茚三酮检测(利用苯酚- 乙醇溶液、氰化钾水溶液-吡啶溶液、茚三酮-乙醇溶液的混合液进行的游离氨基显色反应试验)，确认为阴性。
(4)化合物11的合成
在装有化合物10的60ml聚丙烯制带过滤芯的管中加入20％哌啶DMF溶液16ml，进行振荡搅拌。20分钟后停止搅拌，滤去溶剂，利用5ml的二甲基甲酰胺清洗10次，由此得到化合物11，将其直接用于接下来的反应。
(5)化合物12的合成
在15ml的聚丙烯制管中依次添加化合物5(519.9mg、1.79mmol)、(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)(540.6mg、1.76mmol)、DMF(16ml)、二异丙基乙胺(257.0μl、1.79mmol)，进行1分钟振荡搅拌。将该溶液一次性添加到装有化合物11的60ml聚丙烯制带过滤芯的管中，进行振荡搅拌。1.5小时后停止搅拌，滤去溶剂，依次利用5ml的二甲基甲酰胺清洗10次、利用甲醇清洗5次、利用乙醚清洗3次后，将所得到的树脂在减压下干燥，由此得到化合物12(623.4mg)。另取1mg 所得到的树脂，对其进行茚三酮检测，确认为阴性。
(6)化合物B的合成
取搅拌子和化合物12(17.6mg)至10ml的玻璃试管中，加入1,2-二氯乙烷(2.0ml)，温和地搅拌，使树脂溶胀。搅拌5分钟后，利用巴斯德吸管除去溶剂。接着使用冰浴将试管冷却，加入另外在30ml的三角烧瓶中制备的吡啶(3.7μl)、硫酰氯(5μl)、1,2- 二氯乙烷(995μl)的混合液，在冰冷却下温和地搅拌。搅拌1.5小时后，使用巴斯德吸管除去溶液，加入脱水二氯甲烷(2ml)对树脂化合物进行清洗。利用巴斯德吸管除去清洗液后，再次加入二氯甲烷，进行5次同样的清洗，由此得到化合物B。
[实施例3]
通过以下的合成路线进行使用化合物A对具有SH基的化合物甲巯丙脯酸(化合物13)的八精氨酸衍生物修饰。
[化69]
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标)树脂)
在装有化合物A和搅拌子的10ml玻璃试管中，在利用冰浴冷却的条件下加入 90％甲酸水溶液(2ml)，温和地搅拌，由此进行溶剂的置换。利用巴斯德吸管除去清洗液后，再次加入90％甲酸水溶液，反复进行5次同样的清洗。在另外准备的30ml三角烧瓶中将由10个残基构成的含有八精氨酸的肽Ac-Arg8-Acp-Cys(tBu)-NH2·TFA盐 (143.37mg)溶解在90％甲酸(1ml)中，在冰冷却下将所得到的水溶液加入到装有上述化合物A的10ml玻璃试管中。在冰冷却下温和地搅拌2小时后，使用巴斯德吸管抽吸溶液，并进行冷冻干燥处理，由此回收未反应的含八精氨酸的肽。在残留的树脂中加入超纯水(2ml)对树脂化合物进行清洗，利用巴斯德吸管除去清洗液后，再次加入超纯水，反复进行5次同样的清洗，由此得到进行了固相负载的含有八精氨酸的肽化合物O。撤去冰浴，在所得到的化合物O中于室温下加入甲巯丙脯酸(化合物13、0.99mg) 的水溶液(500μl)，温和地进行搅拌。自反应开始起30分钟后，过滤出固相载体，利用反相HPLC对以滤液形式得到的溶液进行分析时，确认到来自于作为原料的甲巯丙脯酸的峰基本消失，以95％的HPLC纯度转化为经八精氨酸修饰的甲巯丙脯酸(化合物T)。进一步利用TOF-MS对所得到的溶液进行分析，确认得到了所期待的化合物T。
(HRMS(ES+)C68H133N36O14S2计算值[M+3H]3+580.6748.实测值m/z 580.6728.)。
[实施例4]
通过以下的合成路线进行使用化合物A的二硫化物肽的新合成。
[化70]
树脂：聚乙二醇的交联物(MethylChemMatrix(注册商标)树脂)
在装有化合物A(0.023mmol)和搅拌子的10ml玻璃试管中，在利用冰浴冷却的条件下加入90％乙酸水溶液(1.5ml)，温和地搅拌，由此进行溶剂的置换。利用巴斯德吸管除去清洗液后，再次加入90％乙酸水溶液，反复进行5次同样的清洗。在另外准备的30ml三角烧瓶中将由6个残基构成的肽Ac-Ser-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys(tBu)-NH2· TFA盐(6.18mg)溶解在90％乙酸(0.75ml)中，将所得到的水溶液3等分，在冰冷却下每隔1小时共计3次添加到装有上述化合物A的10ml玻璃试管中。在冰冷却下温和地搅拌1小时后，使用巴斯德吸管抽吸除去溶液。在残留的树脂中加入超纯水(2ml) 对树脂化合物进行清洗，利用巴斯德吸管除去清洗液后，再次加入超纯水，反复进行 10次同样的清洗，由此得到进行了固相负载的乙酰基六肽化合物W。撤去冰浴，在所得到的化合物W中于室温下加入由7个残基构成的肽Ac-Cys-Ser-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys(tBu)-NH2(化合物13，1.53mg)的水溶液(0.25ml)，温和地进行搅拌。自反应开始起30分钟后，过滤出固相载体，利用反相HPLC对以滤液形式得到的溶液进行分析时，确认到来自于作为原料的乙酰基七肽的峰基本消失，以71％的HPLC纯度转化为由13个残基构成的肽(化合物V)。进一步利用TOF-MS 对所得到的溶液进行分析，确认得到了所期待的化合物V。
(HRMS(ES+)C65H100N21O21S3计算值[M+2H]2+803.8322.实测值m/z 803.8383.)。
[实施例5]
通过以下的合成路线进行使用化合物A对具有SH基的化合物甲巯丙脯酸(化合物13)的乙酰基半胱氨酸修饰。
[化71]
树脂：聚乙二醇的交联物(ChemMatrix(注册商标)树脂)
在装有化合物A(0.018mmol)和搅拌子的10ml玻璃试管中，在利用冰浴冷却的条件下加入90％甲酸水溶液(1.5ml)，温和地搅拌，由此进行溶剂的置换。利用巴斯德吸管除去清洗液后，再次加入90％甲酸水溶液，反复进行5次同样的清洗。在另外准备的2ml聚丙烯管中将N-乙酰基半胱氨酸(15.0mg)溶解在90％甲酸(1ml)中，在冰冷却下加入到装有上述化合物A的10ml玻璃试管中。在冰冷却下温和地搅拌2小时后，使用巴斯德吸管抽吸除去溶液。在残留的树脂中加入超纯水(2ml)对树脂化合物进行清洗，利用巴斯德吸管除去清洗液后，再次加入超纯水，反复进行10次同样的清洗，由此得到进行了固相负载的N-乙酰基半胱氨酸肽化合物X。撤去冰浴，在室温下加入甲巯丙脯酸(化合物13、1.00mg)的水溶液(900μl)，温和地进行搅拌。自反应开始起 48小时后，过滤出固相载体，利用反相HPLC对以滤液得到的溶液进行分析时，确认到来自于作为原料的甲巯丙脯酸的峰基本消失，以92％的HPLC纯度转化为乙酰基半胱氨酸-甲巯丙脯酸二硫化物(化合物Y)。进一步利用TOF-MS对所得到的溶液进行分析，确认得到了所期待的化合物Y。
(HRMS(ES+)C14H22N2O6S2Na计算值[M+Na]+401.0817.实测值m/z 401.0801.)。
[实施例6]
作为本发明化合物的一例，通过以下的合成路线进行利用了基于化合物A的二硫化物连接的、作为生理活性肽的催产素(化合物Z)的合成。
[化72]
树脂：聚乙二醇的交联物(ChemMatrix(注册商标)树脂)
首先，如下所述进行化合物Z1的合成。在装有化合物A(0.012mmol)的3ml聚丙烯制带过滤器的柱中，在利用冰浴冷却的条件下加入90％甲酸水溶液(0.5ml)，温和地搅拌，由此进行溶剂的置换。通过过滤除去清洗液后，再次加入冰冷的90％甲酸水溶液(0.5ml)，反复进行5次同样的清洗。接着，在利用冰浴冷却的条件下加入肽 H-Asn-Cys(tBu)-Pro-Leu-Gly-NH2(1.54mg、0.0023mmol)的90％甲酸水溶液(0.248ml)，在冰冷却下温和地搅拌2小时后，通过反相HPLC(梯度：milliQ(0.1％TFA)/CH3CN＝ 95:5至45:55，25分钟以上；流速：0.9mL/分钟；UV：230nm；柱：SunfireTM C18 5 μm，4.6×150mmn柱)确认到与H-Asn-Cys(tBu)-Pro-Leu-Gly-NH2对应的峰消失。
反应中使用的肽H-Asn-Cys(tBu)-Pro-Leu-Gly-NH2的90％甲酸水溶液的反相HPLC谱图示于图2，另外，从反应开始起经过2小时后的反应溶液的反相HPLC谱图示于图3。
通过过滤除去反应溶液，加入冰冷却的超纯水(0.5ml)，温和地搅拌，由此进行树脂的清洗。通过过滤除去清洗液后，再次加入冰冷却的超纯水(0.5ml)，反复进行5次同样的清洗，由此得到化合物Z1。接着直接使用所得到的化合物Z1，如下所述进行化合物Z2的合成。从反应体系中撤去冰浴，在室温下加入肽 Fmoc-Cys-Tyr-Ile-Gln-OH(1.43mg，0.0019mmol)的50％N,N-二甲基甲酰胺水溶液 (415μl)，温和地进行搅拌。自反应开始起30分钟后，根据反相HPLC(梯度：milliQ(0.1 ％TFA)/CH3CN＝80:20至30:70，25分钟以上；流速：0.9mL/分钟；UV：230nm；柱：SunfireTM C18 5μm，4.6×150mmn柱)，与Fmoc-Cys-Tyr-Ile-Gln-OH对应的峰消失，以97％的纯度观察到新的峰。
反应中使用的肽Fmoc-Cys-Tyr-Ile-Gln-OH的50％N,N-二甲基甲酰胺水溶液的反相HPLC谱图示于图4，另外，从反应开始起经过30分钟后的反应溶液的反相HPLC 谱图示于图5。
过滤出固相载体，通过TOF-MS对所得到的溶液进行分析，由此确认得到了所期待的二硫化肽化合物Z2(HRMS(ES+)C58H79N12O15S2计算值[M+H]+1247.5229.实测值m/z1247.5229.)。
接着使用所得到的化合物Z2，进行化合物Z3的合成。在冰冷却搅拌下向化合物 Z2(1.50mg，1.12μmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(1.12ml)中加入HATU(0.514mg， 1.67μmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.474μL，2.79μmol)，在室温下搅拌过夜。搅拌过夜后，将反应溶液的一部分利用反相HPLC(梯度：milliQ(0.1％TFA)/CH3CN＝80:20至 30:70，25分钟以上；流速：0.9mL/分钟；UV：230nm；柱：SunfireTM C18 5μm， 4.6×150mmn柱)进行分析，由此，与Z2对应的峰消失，观察到的新峰。过夜反应后的反应溶液的反相HPLC谱图示于图6。利用TOF-MS对作为主峰的在15.99分钟检测到的级分进行分析，由此确认得到了所期待的化合物Z3(HRMS(ES+)C58H77N12O14S2计算值[M+H]+1229.5124.实测值m/z 1229.5181.)。
接着使用所得到的化合物Z3，进行作为生理活性肽的催产素(化合物Z)的合成。取化合物Z3(1.52mg，1.24μmol)至玻璃容器中，在室温下加入20％哌啶/DMF溶液 (0.4ml)，在室温搅拌过夜。搅拌过夜后，将反应溶液的一部分利用反相HPLC(梯度： milliQ(0.1％TFA)/CH3CN＝95:5至45:55，25分钟以上；流速：0.9mL/分钟；UV： 230nm；柱：SunfireTM C185μm，4.6×150mmn柱)进行分析，由此，与Z3对应的峰消失，观察到新的峰。过夜反应后的反应溶液的反相HPLC谱图示于图7。利用 TOF-MS对在12.40分钟检测到的级分进行分析，由此确认得到了所期待的催产素(化合物Z)(HRMS(ES+)C43H67N12O12S2计算值[M+H]+1007.4443.实测值m/z 1007.4418.)。
[实施例7]
作为本发明化合物的一例，通过以下路线进行使用基于化合物A的二硫化物连接的电车肽(化合物V1)的合成。
[化73]
树脂：聚乙二醇的交联物(ChemMatrix(注册商标)树脂)
首先，如下所述进行化合物W的合成。
在装有化合物A(11.5μmol)的3ml带过滤器的聚丙烯制柱中，在利用冰浴冷却的条件下加入50％TFA水溶液(250μl)，温和地搅拌，由此进行溶剂的置换。通过过滤除去清洗液后，再次加入冰冷的50％TFA水溶液(250μl)，反复进行5次同样的清洗。接着，在利用冰浴冷却的条件下加入肽Ac-Ser-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys(tBu)-NH2 (2.06mg，2.30μmol)的50％TFA水溶液(250μl)，在冰冷却下温和地搅拌2小时后，通过过滤除去反应溶液，加入冰冷却的2％抗坏血酸钠溶液(250μl)，温和地搅拌，由此进行树脂的清洗。通过过滤除去清洗液后，再次加入冰冷却的2％抗坏血酸钠水溶液 (250μl)，反复进行10次同样的清洗，由此得到化合物W。
接着，直接使用所得到的化合物W，如下所述进行化合物V的合成。
从反应体系中撤去冰浴，在室温下加入肽Ac-Cys-Ser-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys(tBu)-NH2(1.53mg，1.53μmol)的2％抗坏血酸钠水溶液(250μl)，温和地进行搅拌。自反应开始起30分钟后过滤出固相载体，加入95％TFA水溶液(250μl)，温和地搅拌，由此进行树脂的清洗。反复进行2次同样的清洗，将滤液与清洗液合并，以溶液的形式得到化合物V。直接使用该化合物V的溶液，如下进行化合物W1的合成。
在冰冷却下，在另外准备的装有化合物A(11.5μmol)的3ml带过滤器的聚丙烯制柱中直接加入化合物V的溶液，在冰冷却下搅拌5小时。接着通过过滤除去反应溶液，加入冰冷却的2％抗坏血酸钠水溶液(250μl)，温和地搅拌。通过过滤除去清洗液后，再次加入冰冷却的2％抗坏血酸钠(250μl)，反复进行10次同样的清洗。对清洗液使用pH试纸，由此确认pH＝5，得到了化合物W1。
接着，直接使用所得到的化合物W1，如下进行化合物V1的合成。
从反应体系中撤去冰浴，在室温下加入Ac-Cys-Ser-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys(tBu)-NH2(1.02mg，10.2μmol)的2％抗坏血酸钠水溶液(250μl)，温和地进行搅拌。自反应开始起30分钟后过滤出固相载体，通过反相HPLC(梯度：水 (0.1％TFA)/CH3CN＝10:90至65:35，25分钟以上。流速：0.9mL/分钟；UV：230nm；柱：SunfireTM C18 5μm，4.6×150mm柱)对滤液进行分析，结果与 Ac-Cys-Ser-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys(tBu)-NH2对应的峰消失，观察到新的峰。分取作为主峰的17.04分钟的级分，通过TOF-MS进行分析，由此确认得到了所期待的化合物 V1(HRMS(ES+)C97H146N32O32S5计算值[M+3H]3+811.3206.实测值m/z 811.3179.)。

Claims (19)

1.一种下述式(I)所表示化合物或其盐，
【化1】
式(I)中，
W与其它环原子一起形成选自吡啶、吡嗪、咪唑、噁唑、噻唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、菲咯啉、蝶啶或吖辛因的含氮杂环；
X表示选自氟、氯、溴或碘的卤原子；
Y表示在所述含氮杂环上存在的氢原子或吸电子性取代基；
R表示高分子载体；
L0、L1可以各自独立地存在，在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；
Aa、Ab可以各自独立地存在，在存在的情况下分别表示连接L0-L1、L1-R的官能团；
n表示0～10的整数。
2.如权利要求1所述的化合物或其盐，其中，Aa、Ab在存在的情况下各自独立地选自由烯烃、炔、羰基、酯、醚、氧化烯烃、酰胺、脲、肼、三唑、砜、亚砜、磺酸酯、磺酰胺、亚磺酸酯、亚磺酰胺、哌啶以及二氧六环组成的组。
3.如权利要求1所述的化合物或其盐，其中，所述化合物由下述式(II)所表示，所述含氮杂环为吡啶环，L1不存在，Aa为酰胺基，Ab不存在，n为1，
【化2】
式(II)中，X、Y、R、L0如式(I)中所定义。
4.如权利要求1所述的化合物或其盐，其中，所述化合物由下述式(II-a)所表示，所述含氮杂环为吡啶环，Aa为酰胺基，Ab为酰胺基，n为1～5，
【化3】
式(II-a)中，X、Y、R、L0、L1如式(I)中所定义。
5.如权利要求1～4中任一项所述的化合物或其盐，其中，所述吸电子性取代基为硝基、三氟甲基或卤素。
6.如权利要求1～4中任一项所述的化合物或其盐，其中，L0和L1在存在的情况下各自独立地选自由直链或支链的C1～C20亚烷基、C2～C20亚烯基、C2～C20亚炔基、具有3～20个碳原子的环亚烷基、具有3～20个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、酮、聚乙二醇链和下述式(a)所表示的基团组成的组，这些亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基具有或不具有取代基，
【化4】
式(a)中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基。
7.如权利要求1～4中任一项所述的化合物或其盐，其中，R为固相合成法中使用的高分子载体。
8.如权利要求7所述的化合物或其盐，其中，R选自由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚醚、聚氯乙烯、葡聚糖、丙烯酰胺、聚乙二醇、它们的共聚物和交联物、磁珠、以及这些物质的组合组成的组。
9.一种SH基选择性反应性固相负载型试剂，其含有权利要求1～8中任一项所述的化合物或其盐。
10.一种制造下述式(IV)所表示的化合物的方法，使下述式(I)所表示的化合物与式(III)所表示的化合物反应来制造式(IV)所表示的化合物，
【化5】
式(I)中，W与其它环原子一起形成选自吡啶、吡嗪、咪唑、噁唑、噻唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、菲咯啉、蝶啶或吖辛因的含氮杂环；
X表示选自氟、氯、溴或碘的卤原子；
Y表示氢原子或吸电子性取代基；
R表示高分子载体；
L0、L1在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；
Aa、Ab在存在的情况下分别表示连接L0-L1、L1-R的官能团；
n表示0～10的整数；
【化6】
式(III)中，
Q1表示有机化合物；
L2在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；
A1在存在的情况下表示具有S-PG的官能团；
PG表示SH基的保护基团或氢原子；
【化7】
式(IV)中，W、Y、R、L0、L1、Aa、Ab、n如式(I)中所定义，Q1、L2、A1如式(III)中所定义。
11.如权利要求10所述的方法，其中，L2选自由直链或支链的C1～C10亚烷基、C2～C10亚烯基、C2～C10亚炔基、具有3～10个碳原子的环亚烷基、具有3～10个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、酮、聚乙二醇链、聚酰胺和下述式(a)所表示的基团组成的组，这些亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基具有或不具有取代基，
【化8】
式(a)中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，Q1选自由下述物质组成的组：选自氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸碱基、核苷酸或核苷的生物体来源有机化合物、高分子化合物、低分子化合物、荧光标记物质、酶标记物质、生物素、螯合剂以及它们的包含同位素的衍生物。
13.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述SH基的保护基团选自叔丁基、三苯甲基、二苯甲基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、三甲基苄基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、三甲氧基苄基、硝基苄基、乙酰胺甲基、9-芴基甲基、羰基苄氧基、二苯基苄基、乙基氨基甲酰基、吡啶甲基、磺酰基或其盐。
14.一种制造下述式(VI)所表示的化合物的方法，使式(IV)所表示的化合物与式(V)所表示的化合物反应来制造式(VI)所表示的化合物，
【化9】
式(IV)中，
W与其它环原子一起形成选自吡啶、吡嗪、咪唑、噁唑、噻唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、菲咯啉、蝶啶或吖辛因的含氮杂环；
Y表示氢原子或吸电子性取代基；
R表示高分子载体；
L0、L1、L2在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；
Aa、Ab在存在的情况下分别表示连接L0-L1、L1-R的官能团；
A1在存在的情况下表示具有S-PG的官能团；
Q1表示有机化合物；
n表示0～10的整数；
【化10】
式(V)中，
Q2表示有机化合物；
L3在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团；A2在存在的情况下表示具有S-PG的官能团；PG表示SH基的保护基团或氢原子；
【化11】
式(VI)中，Q1、Q2、L2、L3、A1、A2如上述所定义。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述吸电子性取代基为硝基、三氟甲基或卤素。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中，L2、L3各自独立地选自由直链或支链的C1～C10亚烷基、C2～C10亚烯基、C2～C10亚炔基、具有3～10个碳原子的环亚烷基、具有3～10个碳原子的环亚烯基、亚芳基、单环式杂亚芳基、杂环、胺、酰胺、醚、酯、硫化物、酮、聚乙二醇链、聚酰胺和下述式(a)所表示的基团组成的组，这些亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基和单环式杂亚芳基具有或不具有取代基，
【化12】
式(a)中，Ra表示具有或不具有取代基的C1～C15亚烷基。
17.如权利要求14或15所述的方法，其中，Q1、Q2各自独立地选自由下述物质组成的组：选自氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核酸碱基、核苷酸或核苷的生物体来源有机化合物、高分子化合物、低分子化合物、荧光标记物质、酶标记物质、螯合剂、生物素以及包含稳定同位素的它们的衍生物。
18.一种制造式(II)所表示的化合物的方法，其包括下述工序(a)～工序(f)：
(a)使式(1)所表示的化合物与亚硫酰氯、草酰氯、二氯烷基乙内酰脲、三氯氧磷或五氯化磷反应来制备式(2)所表示的化合物的工序；
【化13】
Y表示氢原子或吸电子性取代基，L0在存在的情况下表示化学上稳定的连接基团；
【化14】
(b)使式(2)所表示的化合物与R’OH反应来制备式(3)所表示的化合物的工序，R’OH中，R’表示C1～C10烷基；
【化15】
(c)在碱性条件下使式(3)所表示的化合物与伯烷基硫醇～叔烷基硫醇反应来制备式(4)所表示的化合物的工序；
【化16】
R”表示成为离去基团的伯碳原子～叔碳原子；
(d)在碱性条件下将式(4)所表示的化合物水解来制备式(5)所表示的化合物的工序；
【化17】
(e)在碱存在下使式(5)所表示的化合物与NH2-R反应来制备式(6)所表示的化合物的工序，NH2-R中，R表示高分子载体；以及
【化18】
(f)使式(6)所表示的化合物与硫酰氯、氯气、三氯氧磷、五氯化磷、溴、氟烷基吡啶、氟化奎宁环或碘反应来制备式(II)所表示的化合物的工序；
【化19】
X表示选自氟、氯、溴或碘的卤原子，Y表示氢原子或吸电子性取代基，R表示高分子载体，L0在存在的情况下表示具有化学上稳定的结构的连接基团。
19.一种制造式(II-a’)所表示的化合物的方法，其包括下述工序(g)～工序(m)：
(g)在脱水缩合剂存在下使式(7)所表示的化合物与NH2-R反应来制备式(8)所表示的化合物的工序，NH2-R中，R表示高分子载体；
【化20】
A表示氨基的具有氨基甲酸酯结构的保护基团，L1表示具有化学上稳定的结构的连接基团；
【化21】
(h)使式(8)所表示的化合物与哌啶、二乙胺、二烷基胺、三氟乙酸、盐酸或氯化氢反应，或者通过式(8)所表示的化合物的催化氢还原来制备式(9)所表示的化合物的工序；
【化22】
(i)在脱水缩合剂的存在下使式(9)的化合物与式(7)的化合物反应来制备式(10)所表示的化合物的工序；
【化23】
(j)通过对式(10)所表示的化合物反复交替进行n-2次工序(h)和(i)的操作来制备式(11)所表示的化合物的工序；
【化24】
(k)使式(11)所表示的化合物与哌啶、二乙胺、二烷基胺、三氟乙酸、盐酸或氯化氢反应，或者通过式(11)所表示的化合物的催化氢还原来制备式(12)所表示的化合物的工序；
【化25】
(l)在脱水缩合剂存在下使式(12)所表示的化合物与式(5)所表示的化合物反应来制备式(13)所表示的化合物的工序；
【化26】
Y表示氢原子或吸电子性取代基；L0在存在的情况下表示化学上稳定的连接基团；R”表示成为离去基团的伯碳原子～叔碳原子；
【化27】
(m)使式(13)所表示的化合物与硫酰氯、氯气、三氯氧磷、五氯化磷、溴、氟烷基吡啶、氟化奎宁环或碘反应来制备式(II-a’)所表示的化合物的工序；
【化28】
式(II-a’)中，X表示选自氟、氯、溴或碘的卤原子，Y表示氢原子或吸电子性取代基，R表示高分子载体，L0若存在则表示化学上稳定的连接基团，L1表示具有化学上稳定的结构的连接基团，n表示1～10的整数。
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