JP6967245B2 - 含窒素化合物を用いた選択的ジスルフィド化試薬、およびジスルフィド含有化合物の製造方法 - Google Patents

含窒素化合物を用いた選択的ジスルフィド化試薬、およびジスルフィド含有化合物の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、有機合成（特に、ペプチド合成等）において、アミノ酸またはペプチド等に含まれるチオール基（−ＳＨ基）の選択的ジスルフィド化試薬として使用可能なピリジン誘導体に関する。また、本発明は、当該ジスルフィド化試薬を用いるジスルフィド含有化合物の製造方法に関する。
従来、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）含有ペプチドの合成方法として、固相法または液相法により、保護されたシステイン（Ｃｙｓ）残基を含む保護ペプチドシーケンスを合成し、全保護基を一旦脱保護することにより遊離のチオール基を有するペプチドを得て、さらに空気酸化法またはヨウ素酸化法を用いて分子内にジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を形成する方法が知られている。
しかしながら、空気酸化法はジスルフィド結合の形成に長時間を必要とするという問題点がある。また、ヨウ素酸化法は反応時にチロシン、ヒスチジンおよびトリプトファンに対してもヨウ素酸化が起こることが知られており、選択性が十分ではないという問題がある。また、これらの方法を用いて分子内にジスルフィド結合を形成させる際、反応系内における遊離チオール基含有ペプチドの濃度が高すぎると、分子間でジスルフィド結合が形成されて架橋異性体が生成してしまい、所望のジスルフィド含有ペプチドの収率が低下するばかりか、所望のペプチドを架橋異性体から分離精製する操作が必要となるという問題もあり、さらに、一般に高希釈下に反応を行う必要があるという問題もある。
その他、ジスルフィド結合を化学的に形成させる方法として、タリウム（ＩＩＩ）トリフルオロアセテート法（非特許文献１を参照）、Ｓ−保護システインスルホキシド法（非特許文献２を参照）、およびシリルクロライド−スルホキシド法（非特許文献３を参照）が脱保護と同時にジスルフィド結合を形成させる反応として報告されている。また、システインのチオール基の保護基として３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ基）を用い、遊離のチオール基と反応させることにより容易に分子間ジスルフィド結合を形成できることも報告されている（非特許文献４を参照）。
さらに、特許文献１には、チオール基をＮｐｙｓ基で保護したシステインまたはシステイン含有保護ペプチドを遊離のチオール基を有するシステインまたはシステイン含有保護ペプチドと反応させることにより、ジスルフィド結合の形成反応とペプチド結合の形成反応とを逐次反応として進行させて、ジスルフィド含有ペプチドを製造する方法が提案されている。
特開平６−８０６９１号公報
Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９８７， １６３−１６４ Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９８７， １６７６−１６７８ Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９９１， １６７−１６８ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８２， ９２１−９２４
しかしながら、特許文献１に記載の方法においてチオール基を保護するためのＮｐｙｓ基の導入に用いられる試薬である３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルクロライド（Ｎｐｙｓ−Ｃｌ）は反応性に富み化学的に不安定な化合物であることから、チオール基のみならず種々の官能基（アミノ基、水酸基など）と反応するという問題がある。ここで、文献（Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．２，１９８１）には、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルハライドに関して、「Ｔｈｅｙ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｉｌｙ ｓｔａｂｌｅ ｓｏｌｉｄｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｓａｆｅｌｙ ｓｔｏｒｅｄ ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｙｅａｒ ｉｎ ａ ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒ．」との記載がある。しかしながら、実際にはその反応性の高さから、上記化合物を室温で保存することはできず、また保存中に湿気（水分）などで分解したり、アルコールやアミンなどを含む溶液やわずかに塩基性の溶液においても不安定であるなど、実際の保存は容易ではない。さらに、特許文献１に記載の方法は、２種の保護ペプチドシーケンスをまず合成した後にジスルフィド結合の形成とペプチド結合の形成とを段階的に行い、その後さらに脱保護処理を施すことを前提としている。このため、保護・脱保護の処理が必要となるなど、操作が煩雑であるという問題もある。
そこで本発明は、簡便な処理によって比較的短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチド等の有機化合物の分子内に位置する２つの遊離チオール基に対して選択的にジスルフィド結合を導入しうる手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その過程で、驚くべきことに、所定の化学構造を有する含窒素化合物をジスルフィド化試薬として用いることで上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。なお、上記所定の化学構造を有する含窒素化合物の大部分は新規な化合物である。
すなわち、本発明の一形態によれば、新規な含窒素化合物として、下記化学式１で表される化合物またはその塩が提供される：
Figure 0006967245
化学式１において、
Ｗは、他の環員原子と一緒になって、ピリジン環、ピラジン環、イミダゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、フェナントロリン環、プテリジン環およびアゾシン環からなる群から選択される含窒素複素環を形成し、
Ｘは、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基であり、
Ｚは、前記含窒素複素環上に存在する水素原子または電子吸引性の置換基を表し、
ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立して、０または１であり、
ｓは、０〜１０の整数を表し、
Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表し、
ＡａおよびＡｂは、それぞれ独立して、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、Ｃ１〜Ｃ２０のオキシアルキレン、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキレンオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基であり、
ｓは、０〜１０の整数を表し、
Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基、または高分子担体である；
ただし、上記窒素含有化合物の範囲からは、以下の化合物を除くものとする：
（Ａ）３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸メチル
（Ｂ）３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸エチル
（Ｃ）３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル
（Ｄ）Ｎ−（３’−ニトロ−２’−ピリジンスルフェニルオキシ）−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
（Ｅ）（Ｓ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）プロパン酸
（Ｆ）（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）ブタン酸
（Ｇ）４−（（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）メチル）安息香酸
（Ｈ）（Ｓ）−２−（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）−３−フェニルプロパン酸。
また、本発明の他の形態によれば、上述した含窒素化合物またはその塩、あるいは、上記の化合物（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかからなる、チオール基のジスルフィド化試薬が提供される。ここで、上記（Ａ）〜（Ｈ）の化合物（３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸誘導体）は公知の化合物であるが、当該化合物がチオール基のジスルフィド化試薬として機能することについては従来知られていない。
また、本発明のさらに他の形態によれば、分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物を、上述したジスルフィド化試薬と接触させ、２つの前記遊離チオール基の間でジスルフィド結合を形成させてジスルフィド含有化合物を得ることを含む、ジスルフィド含有化合物の製造方法が提供される。
また、本発明のさらに他の形態によれば、上述した含窒素化合物またはその塩の製造方法が提供される。
本発明によれば、簡便な処理によって比較的短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチド等の有機化合物の分子内に位置する２つの遊離チオール基に対して選択的にジスルフィド結合を導入しうる手段が提供される。
後述する実施例２−１において、ペプチド３からペプチド４を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）および添加６時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例２−２において、ペプチド５からペプチド６を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）、添加６時間後（Ｃ）および添加２４時間後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例２−３において、ペプチド７からペプチド８を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加４時間後（Ｂ）、添加９時間後（Ｃ）および添加２７時間後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例２−３において、ペプチド８からペプチド９を合成した際の、ヨウ素の添加前（Ａ）、添加２分後（Ｂ）、添加１時間後（Ｃ）およびＨＰＬＣ精製後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 （Ａ）後述する実施例２−３で合成されたα−コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）、（Ｂ）市販のα−コノトキシンＩｍＩの標品サンプル、（Ｃ）これらの混合サンプルのそれぞれについてＨＰＬＣ分析を行った結果を示すチャートである。 後述する実施例３−２において、固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）を用いてペプチド３からペプチド４を合成した際の、反応開始３分以内（Ａ）、反応開始１時間後（Ｂ）および反応開始３時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例５において、ペプチド３からペプチド４を合成した際の、化合物１６ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）および添加３時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例６において、ペプチド固相合成により得たオキシトシン−樹脂１７からオキシトシン（ペプチド４）を合成した際の、得られた粗生成物（Ｂ）のＨＰＬＣ 後述する実施例７において、化合物２ａの安定性を評価した際の、ＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例７において、化合物２ａの安定性を評価した際の、１Ｈ ＮＭＲ分析結果を示すチャートである。
以下、本発明の実施形態を説明する。
本発明の一形態は、新規な含窒素化合物に関し、具体的には、下記化学式１で表される含窒素化合物またはその塩に関する。
Figure 0006967245
化学式１において、Ｗは、他の環員原子と一緒になって、ピリジン環、ピラジン環、イミダゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、フェナントロリン環、プテリジン環およびアゾシン環からなる群から選択される含窒素複素環を形成する。ここで、Ｗは、他の環員原子と一緒になって、前記含窒素複素環としてのピリジン環を形成することが好ましい。
化学式１において、Ｘは、−Ｏ−または−ＮＨ−である。なかでも、Ｘは−Ｏ−であることが好ましい。
化学式１において、Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基である。ここで、「電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基」は、電子吸引性構造を有する脂肪族ヘテロ環化合物などに相当するものとして、例えば、ペプチド合成におけるカルボン酸の活性エステルを形成するアルコールからヒドロキシ基を除いた１価の基が挙げられる。より詳細には、続・医薬品の開発（第１４巻、ペプチド合成）（廣川書店）の第１６４〜１７３頁の表５．７〜５．１１に記載されている１価の基、または当該頁に記載されている化合物由来の１価の基が挙げられる。なお、これらの基の具体例は、以下の通りである。
Figure 0006967245
なかでも、「電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基」は、置換または非置換の、スクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基または５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミジル基であることが好ましい。また、Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、または置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基であることが好ましく、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基であることがより好ましく、非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基であることがさらに好ましく、非置換のＣ１〜Ｃ１２のアルキル基であることがいっそう好ましく、非置換のＣ１〜Ｃ８のアルキル基であることがさらにより好ましく、非置換のＣ１〜Ｃ４のアルキル基であることが特に好ましく、メチル基であることが最も好ましい。
本明細書において、アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１，３−ジメチルブチル基、１−イソプロピルプロピル基、１，２−ジメチルブチル基、ｎ−ヘプチル基、１，４−ジメチルペンチル基、２−メチル−１−イソプロピルプロピル基、１−エチル−３−メチルブチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、３−メチル−１−イソプロピルブチル基、２−メチル−１−イソプロピル基、１−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メチルプロピル基、ｎ−ノニル基、３，５，５−トリメチルヘキシル基などが挙げられる。
本明細書において、アルケニル基の例としては、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、ペンテニル基、１−ヘキセニル基、３，３−ジメチル−１−ブテニル基などが挙げられる。
本明細書において、アルキニル基の例としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、３−メチル−１−プロピニル基、２−メチル−３−プロピニル基、ペンチニル基、１−ヘキシニル基、３−メチル−１−ブチニル基、３，３−ジメチル−１−ブチニル基などが挙げられる。
本明細書において、シクロアルキル基の例としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基などが挙げられる。
本明細書において、シクロアルケニル基の例としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
本明細書において、アリール基の例としては、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アントラセニル基、２−アントラセニル基、９−アントラセニル基などが挙げられる。
本明細書において、ヘテロアリール基の例としては、２−チエニル基、４−ピリジル基、３−ピリジル基、２−ピリジル基、１−ピリジル基、２−フリル基、２−ピリミジニル基、２−ベンゾチアゾリル基、１−イミダゾリル基、１−ピラゾリル基、ベンゾトリアゾール−１−イル基、７−アザベンゾトリアゾール−１−イル基などが挙げられる。
また、本明細書において、ある基が「置換されている」という場合、当該基を置換しうる置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アシル基、アルキルスルファニル基、アリールスルファニル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ホルミル基、メルカプト基、スルホ基、スルフィン酸基、グアニジノ基、カルバモイル基、チオール基、チオエーテル基、メシル基、ｐ−トルエンスルホニル基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、トリメチルシリル基、ホスフィニコ基、ホスホノ基などが挙げられる。これらの置換基もまた、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基などによってさらに置換されていてもよい。ただし、置換された後の基が置換される前の基と同じ定義に含まれるような置換は考えないものとする。
化学式１において、Ｚは、前記含窒素複素環上に存在する水素原子または電子吸引性の置換基を表し、なかでも、電子吸引性の置換基であることが好ましい。ここで、電子吸引性の置換基としては、例えば、ニトロ基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アセチル基、メタンスルホニル基、トリフルオロアセチル基、トリフルオロメタンスルホニル基、シアノ基などが挙げられる。なかでも、ニトロ基、トリフルオロメチル基またはハロゲン原子が好ましく、ニトロ基が最も好ましい。
化学式１において、ｐは、０または１である。ｐが０のときにはＬ０は存在せずにＡａまたはＡｂまたはＲが直接含窒素複素環に結合し、ｐが１のときにはＬ０が存在する。
化学式１において、ｑは、０または１である。ｑが０のときにはＬ１は存在せず、ｑが１のときにはＬ１が存在する。
化学式１において、ｒは、０または１である。ｒが０のときにはＡｂは存在せず、ｒが１のときにはＡｂが存在する。
化学式１において、ｓは、０〜１０の整数である。ｓが０のときには［（Ａａ）−（Ｌ１）ｑ］が存在せず、ｓが１〜１０の整数のときには［（Ａａ）−（Ｌ１）ｑ］がｓ個繰り返して存在する。なお、ｓは好ましくは０〜５であり、より好ましくは０または１である。
Ｌ０およびＬ１は、存在する場合にはそれぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表す。このようなリンカーの具体的な構造について特に制限はないが、例えば、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキレン基、置換または非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニレン基、置換または非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニレン基、置換または非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキレン基、置換または非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリーレン基、置換または非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリーレン基、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、ポリオキシアルキレン基が挙げられる。また、Ｌ０およびＬ１は、下記化学式（ａ）で表される基：
Figure 0006967245
であってもよい。ここで、化学式（ａ）において、Ｒａは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１５のアルキレン基を表し、好ましくはＣ１〜Ｃ８のアルキレン基を表し、より好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキレン基を表し、特に好ましくはＣ１〜Ｃ２のアルキレン基を表し、最も好ましくはＣ２のアルキレン基（特にはエチレン基）を表す。Ｌ０およびＬ１として好ましくは、Ｃ１−Ｃ６のアルキレン基（特にはエチレン基）、分子量１００〜１０００のポリオキシアルキレン基、または上記化学式（ａ）で表される基が用いられる。
化学式１において、ＡａおよびＡｂは、存在する場合にはそれぞれ独立して、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、Ｃ１〜Ｃ２０のオキシアルキレン、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキレンオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基である。なかでも、ＡａおよびＡｂとして好ましくは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−、Ｃ１〜Ｃ２０のオキシアルキレン、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキレンオキシ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−が用いられる。
化学式１において、Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基または高分子担体である。Ｒとしての高分子担体は、典型的には、固相合成法に用いられる高分子担体である。このような高分子担体は、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエーテル、ポリ塩化ビニル、デキストラン、アクリルアミド、ポリエチレングリコール、これらの共重合体および架橋体、磁性ビーズ、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。当該高分子担体は、より好ましくはポリスチレン、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールの架橋体である。これらの高分子担体は、隣接する基（例えば、ＡｂやＬ１など）との間でメチル基などのアルキル基などを介して結合していてもよい。なお、高分子担体の形状については特に制限はないが、球状がより好ましく、この際、高分子担体の平均粒径は、好ましくは１００〜４００ｍｅｓｈである。このような高分子担体は市販されており、例えば、ポリエチレングリコール架橋体からなる高分子担体としては、シグマ−アルドリッチ社製のアミノメチル−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂が知られている。また、ポリスチレン樹脂からなる高分子担体としては、続・医薬品の開発（第１４巻、ペプチド合成）（廣川書店）の第２８３〜２９５頁に記載されているような樹脂が挙げられる。具体的には、例えば、クロロメチル化（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂、アミノメチル樹脂、Ｗａｎｇ樹脂、Ｐａｍ樹脂、Ｒｉｎｋ ａｃｉｄ樹脂、Ｒｉｎｋアミド樹脂、オキシム樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＬ樹脂、２−クロロトリチルクロライド樹脂などが挙げられる。
なお、本発明に係る化学式１の含窒素化合物は、塩の形態であってもよい。例えば、このような塩は、上述した化合物上に、アニオンと正に帯電した置換基（例えば、アミノ基）との間で形成されうる。この際、適切なアニオンとしては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、トシル酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩（ｆｕｍｕｒａｔｅ）、グルタミン酸塩、グルクロン酸塩、乳酸塩、グルタル酸塩、およびマレイン酸塩などが挙げられる。同様に、このような塩は、上述した化合物上で、カチオンと負に帯電した置換基（例えば、カルボキシル基）との間で形成されうる。この際、適切なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオンのようなアンモニウムカチオンが挙げられる。上述した化合物には、４級窒素原子を含むこれらの塩も含まれる。
本発明の一形態に係る新規な含窒素化合物またはその塩の概念からは、以下の化合物は除かれている（すなわち、以下の化合物は公知の化合物である）。
（Ａ）３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸メチル
（Ｂ）３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸エチル
（Ｃ）３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル
（Ｄ）Ｎ−（３’−ニトロ−２’−ピリジンスルフェニルオキシ）−５−ノルボルネン−２，３ジカルボキシイミド
（Ｅ）（Ｓ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）プロパン酸
（Ｆ）（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）ブタン酸
（Ｇ）４−（（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）メチル）安息香酸
（Ｈ）（Ｓ）−２−（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）−３−フェニルプロパン酸。
なお、これらの化合物（Ａ）〜（Ｈ）はいずれも、上記化学式１においてｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０を満たし、かつ、Ｒが水素原子である化合物に相当する。本形態に係る含窒素化合物またはその塩は、上記化学式１において、「ｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０、かつ、Ｒ＝水素原子」の条件を満たすものではないことが好ましい。
以下では、本発明に係る化学式１の含窒素化合物について、いくつかの好ましい実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は以下の形態のみには限定されない。
（第１の好ましい実施形態）
本発明に係る化学式１の含窒素化合物についての第１の好ましい実施形態は、ｑが０であり、ｒが０であり、ｓが１である。これにより、化学式１の化合物は、下記化学式２で表される。
Figure 0006967245
そして、化学式２において、
Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０およびＡａは、上記で定義した通りである。
また、本実施形態において、Ｒは、「アミノ基、ヒドロキシ基、高分子担体」以外のもの、すなわち、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基、または置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリール基である。
本実施形態においても、各符号（置換基）の好ましい形態は化学式１について上述したのと同様である。ただし、本実施形態において、Ｒは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、または置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基であることが好ましく、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基であることがより好ましく、非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基であることがさらに好ましく、非置換のＣ１〜Ｃ１２のアルキル基であることがいっそう好ましく、非置換のＣ１〜Ｃ８のアルキル基であることがさらにより好ましく、非置換のＣ１〜Ｃ４のアルキル基であることが特に好ましく、メチル基であることが最も好ましい。
さらに、本実施形態において、Ａａは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される基であることが好ましく、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される基であることがより好ましく、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−であることが特に好ましく、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−であることが最も好ましい。
また、本実施形態において、ｐは０であっても１であってもよいが、好ましくはｐは０である（すなわち、Ｌ０は存在せずにＡａが直接上記芳香族複素環に結合していることが好ましい）。
本実施形態に係る化合物の例を挙げると、以下の通りである。
Figure 0006967245
（第２の好ましい実施形態）
本発明に係る化学式１の含窒素化合物についての第２の好ましい実施形態は、ｑが０であり、ｒが０であり、ｓが１である。これにより、化学式１の化合物は、上記化学式２と同様、下記化学式３で表される。
Figure 0006967245
そして、化学式３において、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０およびＡａは、上記化学式２と同様、前記化学式１について定義した通りである。一方、本実施形態において、Ｒは、高分子担体である。ここで、本実施形態においても、各符号（置換基）の好ましい形態は化学式１について上述したのと同様である。
ただし、本実施形態において、高分子担体であるＲの好ましい一形態はポリエチレングリコール架橋体（例えば、アミノメチルＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂）である。この場合、Ａａは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であることが好ましい。そして、この場合において、ｐは０であっても１であってもよいが、好ましくはｐは０である（すなわち、Ｌ０は存在せずにＡａが直接上記芳香族複素環に結合していることが好ましい）。本実施形態における好ましい化合物の一例は、以下の化合物１１である。
Figure 0006967245
同様に、本実施形態において、高分子担体であるＲの好ましい他の形態はポリスチレン樹脂である。この場合、Ａａは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−であることが好ましい。そして、この場合においても、ｐは０であっても１であってもよいが、好ましくはｐは０である（すなわち、Ｌ０は存在せずにＡａが直接上記芳香族複素環に結合していることが好ましい）。本実施形態における好ましい化合物の一例は、以下の化合物１２である。
Figure 0006967245
（第３の好ましい実施形態）
本発明に係る化学式１の含窒素化合物についての第３の好ましい実施形態は、ｑが１であり、ｒが１であり、ｓが１である。これにより、化学式１の化合物は、下記化学式４で表される。
Figure 0006967245
そして、化学式４において、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、前記化学式１について定義した通りである。一方、本実施形態において、Ｒは、高分子担体である。ここで、本実施形態においても、各符号（置換基）の好ましい形態は化学式１について上述したのと同様である。
ただし、本実施形態においては、ＡａおよびＡｂが−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｌ１がＣ１〜Ｃ２０のアルキレン基であり、高分子担体であるＲがポリエチレングリコール架橋体（例えば、アミノメチルＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂）であることが好ましい。そして、この場合においても、ｐは０であっても１であってもよいが、好ましくはｐは０である（すなわち、Ｌ０は存在せずにＡａが直接上記芳香族複素環に結合していることが好ましい）。本実施形態における好ましい化合物の一例は、以下の化合物１３である（化合物１３において、Ｌ１はＣ５のアルキレン基（ペンタメチレン基）である）。
Figure 0006967245
以上、本発明に係る化学式１の含窒素化合物について好ましい実施形態をいくつか説明したが、本発明に係る化学式１の化合物はこれら以外のものであってももちろんよい。上述した実施形態には包含されない化合物の例としては、例えば、以下の化合物１４および化合物１５があるがこれには限定されない。
Figure 0006967245
（本発明の化合物の製造方法）
本発明に係る含窒素化合物の製造方法について特に制限はない。当業者であれば、後述する実施例の欄の記載に基づき、本願の出願時における技術常識を参酌して、本発明に係る化合物を製造することが可能である。以下では、本発明に係る化合物のうち、上記化学式１においてＸが−Ｏ−である化合物を例に挙げて、その製造方法を説明する。
本形態に係る製造方法における出発物質は、下記化学式５で表される化合物である。
Figure 0006967245
ここで、化学式５において、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、前記化学式１について定義した通りである。
また、化学式５において、Ｒ”は、脱離基である。Ｒ”を構成する脱離基の具体的な種類について特に制限はなく、従来公知の脱離基が用いられうるが、例えば、ベンジル基、メトキシベンジル基、ジメチルアミノベンジル基、トリチル基、クロロトリチル基、メチルトリチル基、メトキシトリチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。
化学式５で表される化合物は、例えば、国際公開第２０１５／０５０１９９号パンフレットの記載に従って合成することが可能である。
本形態に係る製造方法では、上記で準備した出発物質（化学式５で表される化合物）を、ハロゲン単体またはハロゲン生成試薬（例えば、塩化スルフリル、塩素ガス、オキシ塩化リン、五塩化リン、臭素、フッ化アルキルピリジン、フッ化キヌクリジンまたはヨウ素）と反応させる。これにより、下記化学式６で表される化合物が得られる（工程（Ｉ））。
Figure 0006967245
ここで、化学式６において、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、前記化学式１について定義した通りである。
また、化学式６において、Ｈａｌは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素から選択されるハロゲン原子を表す。
工程（Ｉ）において上記反応を行う場合には、例えば、化学式５で表される化合物に１，２−ジクロロエタン等の溶媒のほか、ピリジン、塩化スルフリル等のハロゲン生成試薬を加え、穏やかに１〜２時間程度撹拌する。その後、反応溶液を減圧留去し、ヘキサン等を用いて共沸させることができる。この際、Ｒが高分子担体である場合には、予め反応前に化学式５で表される化合物を溶媒で膨潤させておくことが好ましい。
本形態に係る製造方法では、続いて、上記で得られた化学式６で表される化合物を、塩基性条件下でＹ−ＯＨ（Ｙは、前記化学式１について定義した通りである）で表されるアルコールと反応させる。これにより、下記化学式７で表される化合物が得られる（工程（ＩＩ））。
Figure 0006967245
ここで、化学式７において、Ｗ、Ｙ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、前記化学式１について定義した通りである。なお、上記化学式７で表される化合物は、上記化学式１においてＸが−Ｏ−である化合物に相当する。
工程（Ｉ）において上記反応を行う場合には、例えば、上記で得られた化合物６で表される化合物を、Ｙ−ＯＨで表されるアルコールに溶解させる。そして、反応系を撹拌しながら塩基を添加すると、Ｙ−Ｏ−で表されるアルコキシドイオンが求核剤として作用し、Ｈａｌ−で表されるハロゲン化物イオンが脱離する求核置換反応が硫黄原子上で進行する。その結果、上記化学式７で表される化合物が生成する。なお、添加する塩基の種類について特に制限はないが、求核性が低いほど好ましいことから、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；ヒューニッヒ塩基）などの低求核性の塩基が好ましく用いられる。得られた生成物については、常法に従って精製することができる。
以上、上記化学式１においてＸが−Ｏ−である化合物（化学式７で表される化合物）を例に挙げて本発明に係る化合物の製造方法を説明したが、その他の化合物についても、当業者であれば適宜製造が可能である。例えば、上記化学式１においてＸが−ＮＨ−である化合物については、上記で得られた化学式６で表される化合物をＹ−ＮＨ２で表されるアミンと適当な有機溶媒中で反応させることで、同様の反応機構により、製造が可能である。
（本発明の化合物の用途）
本発明者らは、上述した本発明の含窒素化合物（またはその塩）が、驚くべきことに、ジスルフィド化試薬としての機能を有していることを発見した。そして、本発明に係る含窒素化合物は室温（２５℃）での保管が可能なほど、化学的に極めて安定であることも見出した。さらに、本発明に係る含窒素化合物をジスルフィド化試薬として用いることで、簡便な処理によって短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチド等の有機化合物の分子内に位置する２つの遊離チオール基に対して選択的にジスルフィド結合を導入することが可能となるという、従来公知のジスルフィド化試薬では発揮されなかった優れた効果も奏される。さらに、公知の化合物として上述した化合物（Ａ）〜（Ｈ）についても、上記のようなチオール基のジスルフィド化試薬としての用途は知られていなかったが、本発明によれば、これらの化合物（Ａ）〜（Ｈ）についてもまた、ジスルフィド化試薬としての用途発明が提供される。したがって、本発明の他の形態によれば、上述した含窒素化合物またはその塩、あるいは、以下の化合物（Ａ）〜（Ｈ）からなる、チオール基のジスルフィド化試薬が提供される。
（Ａ）３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸メチル
（Ｂ）３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸エチル
（Ｃ）３−ニトロ−２−ピリジンスルフィン酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル
（Ｄ）Ｎ−（３’−ニトロ−２’−ピリジンスルフェニルオキシ）−５−ノルボルネン−２，３ジカルボキシイミド
（Ｅ）（Ｓ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）プロパン酸
（Ｆ）（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）ブタン酸
（Ｇ）４−（（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）メチル）安息香酸
（Ｈ）（Ｓ）−２−（（（３−ニトロピリジン−２−イル）チオ）オキシ）−３−フェニルプロパン酸。
ここで、本発明に係る化学式１の含窒素化合物については、上記化学式１において、「ｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０、かつ、Ｒ＝水素原子」の条件を満たすものではないことが好ましいことを上述した。これに対し、この条件を満たす化合物についてもジスルフィド化試薬としての用途は新規である。したがって、本発明に係るジスルフィド化試薬の好ましい一実施形態は、本発明に係る化学式１の含窒素化合物のうち、上記化学式１において、「ｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０、かつ、Ｒ＝水素原子」の条件を満たすもの（下記化学式８）を有効成分とするものである。
Figure 0006967245
化学式８において、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、前記化学式１について定義した通りである。ここで、各符号（置換基）の好ましい形態は化学式１について上述したのと同様である。
本実施形態における好ましいジスルフィド化試薬の一例は、以下の化合物１６ａ〜化合物１６ｊのいずれかを有効成分とするものである。
Figure 0006967245
また、上述した化学式１においてＲが固相合成法に用いられる高分子担体である場合には、ジスルフィド化活性を有する含窒素化合物を固相合成法に用いられる高分子担体に固定させることができる。したがってこの場合には、ペプチド等の有機化合物の分子内に位置する２つの遊離チオール基に対して選択的に作用する固相担持型試薬として使用することができる。
本発明のさらに他の形態は、上述した本発明に係る含窒素化合物をジスルフィド化試薬（好ましくは、固相担持型ジスルフィド化試薬）として用いて、分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物にジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を導入する方法に関する。換言すれば、本形態に係る方法は、分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物を、上述した本発明に係る含窒素化合物（またはその塩）からなるジスルフィド化試薬と接触させ、２つの前記遊離チオール基の間でジスルフィド結合を形成させてジスルフィド含有化合物を得ることを含む、ジスルフィド含有化合物の製造方法である。
ここで、ジスルフィド結合を導入する対象となる「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」の構造は特に制限されない。「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」としては、例えば、アミノ酸、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド（抗体等のタンパク質を含む））などのアミノ酸残基含有化合物のほか、高分子化合物、低分子化合物、並びにそれらの同位体を含む誘導体が挙げられる。また、当該化合物における遊離チオール基の存在形態についても特に制限はなく、例えば、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質におけるシステイン残基、システインアミド残基のほか、有機化合物におけるシステアミノ基、チオアルキルアミノ基などが挙げられる。
「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」がペプチドである場合、当該ペプチドは、天然由来のものであってもよいし、人工的に合成されたものであってもよい。ペプチドが人工的に合成されたものである場合、その合成方法について特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。ペプチドの人工的な合成方法としては、「固相合成法」および「液相合成法」が知られており、固相合成法の場合はさらにＦｍｏｃ法およびＢｏｃ法が知られている。「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」がペプチドである場合、当該ペプチドはいずれの方法で合成してもよい。固相合成法を例に挙げて簡単に説明すると、例えば、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを用いる。この際、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを併用することで、反応速度を向上させつつ、ラセミ化を抑制することもできる。具体的には、まず、Ｃ末端のアミノ酸のアミノ基をＦｍｏｃ基またはＢｏｃ基で保護して、上記ポリスチレン高分子ゲルのアミノ基との間でペプチド結合を形成させる。次いで、固相を溶媒でよく洗い、残存する試薬やアミノ酸を洗浄・除去する。その後、固相に結合しているアミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。続いて、アミノ基をＦｍｏｃ基またはＢｏｃ基保護したアミノ酸を用いて、順次、同様の反応を繰り返すことで、固相上でペプチドを合成する。最後に、固相をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で温浸させることで、ペプチドを固相から切り離し、ペプチドを合成することができる。
なお、上述した方法によってジスルフィド結合を導入する対象となる「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」は、「分子内に２つの遊離チオール基を有する化合物」であることが好ましい。かような形態によれば、「分子内に２つの遊離チオール基を有する化合物」の当該２つの遊離チオール基の間でジスルフィド結合を形成させることができ、所望のジスルフィド含有化合物を高収率かつ高純度で製造することができる。ジスルフィド結合を導入する対象が「分子内に２つの遊離チオール基を有する化合物」である場合であっても、当該化合物がペプチドであるような場合には、システイン残基やシステインアミド残基を３つ以上含んでいる可能性がある。したがって、このような場合にジスルフィド結合を導入する対象を「分子内に２つの遊離チオール基を有する化合物」とするためには、システイン残基やシステインアミド残基の１つ以上のチオール基を保護基で保護しておく必要がある。このような保護基の導入は、通常、上述したようなペプチドの合成の際に、所望の位置にチオール基が保護されたアミノ酸を導入しておくことで達成されうる。なお、かような手法においてペプチドの合成の際に用いられる「チオール基が保護されたアミノ酸」におけるチオール基の保護基としては、例えば、ｔ−ブチル基、トリチル基、ベンズヒドリル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、トリメチルベンジル基、メトキシベンジル基、ジメトキシベンジル基、トリメトキシベンジル基、ニトロベンジル基、アセトアミドメチル基、９−フルオレニルメチル基、カルボニルベンジルオキシ基、ジフェニルベンジル基、エチルカルバモイル基、ピコリル基、スルホニル基またはこれらの塩が挙げられる。
続いて、本発明に係るジスルフィド化試薬が固相担持型ジスルフィド化試薬である場合を例に挙げて、ジスルフィド化を行う（ジスルフィド含有化合物を製造する）方法について説明する。
まず、ジスルフィド結合を導入する対象である「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」を溶媒に溶解させる。好ましい形態によれば、上記化合物を水、または１％（ｖ／ｖ）以上の水を含む有機溶媒に溶解させる。また、この際のｐＨは中性付近が好ましく、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。また、水に代えて緩衝液を用いることができ、水、緩衝液および有機溶媒のいずれかを組み合わせて用いてもよい。一方、有機溶媒を組み合わせて用いる場合は、水と混和する有機溶媒が好ましく、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド、アルコール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサンなどが挙げられる。
次いで、上記で調製した「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」の溶液と本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬とを混和する。この際、溶液の入った容器に本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬を添加してもよいし、本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬の入った容器に溶液を添加してもよい。なお、容器の形態、材質は限定されないが、好ましくはフィルター付きチューブ等の濾過用フィルターの付いた攪拌可能な容器である。混和は容器を静置しておいてもよいが、振とうや、固相合成用振とう機、マグネチックスターラー、ボルテックスミキサー、スリーワンモーター等による攪拌により行うことが好ましい。
上記の混和により起こる反応により、通常５分〜２時間で反応を行うことができる。この反応で用いられる本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬の添加量は、「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」の量に応じて増減すればよい。例えば、「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」１当量に対し、本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬の量は過剰量用いるのが好ましく、より好ましくは１．２当量から１０等量用いる。反応の完結は、溶液中の「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」の消費を一般的な分析手法に基づいて判断すればよい。例えば、適用可能な分析手法として、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＴＬＣ、ＩＲ、ＭＳスペクトル、滴定等が挙げられる。
原料化合物がシステイン残基やシステインアミド残基を３つ以上含んだペプチドである場合であって、システイン残基やシステインアミド残基の１つ以上のチオール基が保護基で保護されているような場合には、本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬を用いてジスルフィド結合を導入した後に当該保護基を脱保護する必要がある場合もある。このような脱保護の手法としては従来公知の手法が用いられうる。また、例えばヨウ素酸化法を用いて脱保護処理を行うことで、チオール基の脱保護と同時に脱保護されたチオール基の間にさらにジスルフィド結合を導入することも可能である（後述する実施例２−３「α−コノトキシンＩｍＩの合成」を参照）。
反応後、固相担持型ジスルフィド化試薬、目的生成物であるジスルフィド含有化合物、未反応の「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」、および「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」が反応の進行と共に変化した化合物はろ過により分別され、ろ液にジスルフィド含有化合物が得られる。ろ過には使用器具、ろ過手法にとらわれない。器具としてろ紙、グラスファイバー、ろ過助剤、ろ布によるろ過や、メンブランフィルター、グラスフィルター等が挙げられる。ろ過手法としても、自然ろ過、吸引ろ過、遠心分離、デカンテーション等が挙げられ、それぞれ用途や反応スケールに応じて適宜選択できる。このように、ジスルフィド化試薬を高分子担体に固相化されてなる形態の含窒素化合物からなる固相化試薬の形態とすることで、生成物とジスルフィド化試薬との分離操作をろ過という簡便な操作のみによって可能である。したがって、特に固相化試薬の形態の本発明に係るジスルフィド化試薬は、有機合成（特に、ペプチド合成）の技術分野において極めて高い優位性を備えた発明であると言える。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
本発明の化合物の一例として、化合物２ａ〜２ｉの合成例を以下に示す。
以下のスキームにより、化合物２ａ〜２ｉを合成した。
Figure 0006967245
その具体的な手法は、以下の通りである。
実施例１−１：化合物２ａの合成
Figure 0006967245
化合物１（３００ ｍｇ， ０．９９ ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン（２．５ ｍＬ）溶液に室温にて塩化スルフリル（１７６ μＬ， ２．１８ ｍｍｏｌ）、ピリジン（４０．３ μＬ， ０．５０ ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、ヘキサンで共沸した。このものは精製することなく次の反応に用いた。得られた残渣をメタノール（４ ｍＬ）に溶解させ、氷冷撹拌下、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．８５ ｍＬ， １９．８ ｍｍｏｌ）を添加し、室温にて２時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製することで、黄色固体（化合物２ａ）を得た（１９０ ｍｇ， ０．７８０ ｍｍｏｌ， ２工程 ７９％）
。
Figure 0006967245
実施例１−２：化合物２ｂの合成
Figure 0006967245
化合物１（１００ ｍｇ， ０．３２９ ｍｍｏｌ）、ｎ−ブタノール（６ ｍＬ）を用い、化合物２ａと同様の方法で、化合物２ｂを合成した（黄色固体， ７２．３ ｍｇ， ２工程７７％）。
Figure 0006967245
実施例１−３：化合物２ｃの合成
Figure 0006967245
化合物１（１００ ｍｇ， ０．３２９ ｍｍｏｌ）、２−プロパノール（６ ｍＬ）を用い、化合物２ａと同様の方法で、化合物２ｃを合成した（黄色固体， ２５．４ ｍｇ， ２工程２９％）。
Figure 0006967245
実施例１−４：化合物２ｄの合成
Figure 0006967245
化合物１（２００ ｍｇ， ０．３２９ ｍｍｏｌ）、ｔ−ブチルアルコール（３ ｍＬ）を用い、化合物２ａと同様の方法で、化合物２ｄを合成した（黄色固体， ３８．０ ｍｇ， ２工程２０％）。
Figure 0006967245
実施例１−５：化合物２ｅの合成
Figure 0006967245
化合物１（１００ ｍｇ， ０．３２９ ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（６ ｍＬ）を用い、化合物２ａと同様の方法で、化合物２ｅを合成した（黄色固体， ８４．９ ｍｇ， ２工程８１％）。
Figure 0006967245
実施例１−６：化合物２ｆの合成
Figure 0006967245
化合物１（２００ ｍｇ， ０．６５７ ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン（１．５ ｍＬ）溶液に室温にて塩化スルフリル（１１７ μＬ， １．４５ ｍｍｏｌ）、ピリジン（２６．５ μＬ， ０．３２９ ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、ヘキサンで共沸した。このものは精製することなく次の反応に用いた。得られた残渣をＴＨＦ（３．３ ｍＬ）に溶解し、遮光中、室温にてフェノール（５７．８ μＬ， ０．６５７ ｍｍｏｌ）を添加後、氷塩浴撹拌下、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１４２ μＬ， ０．９８６ ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて２時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム）で精製することで、黄色固体（化合物２ｆ）を得た（１１６ ｍｇ， ０．３７９ ｍｍｏｌ， ２工程 ５８％）。
Figure 0006967245
実施例１−７：化合物２ｇの合成
Figure 0006967245
化合物１（１００ ｍｇ， ０．３２８ ｍｍｏｌ）、ｏ−メトキシフェノール（０．３２８ ｍｍｏｌ）を用い、化合物２ｆと同様の方法で、化合物２ｇを合成した（黄色粘性物質， １２．９ ｍｇ， ２工程１２％）。
Figure 0006967245
実施例１−８：化合物２ｈの合成
Figure 0006967245
化合物１（１００ ｍｇ， ０．３２８ ｍｍｏｌ）、ｐ−ブロモベンジルアルコール（６１．３ ｍｇ， ０．３２８ ｍｍｏｌ）を用い、化合物２ｆと同様の方法で、化合物２ｈを合成した（黄色固体， ６５．１ ｍｇ， ２工程５０％）。
Figure 0006967245
実施例１−９：化合物２ｉの合成
Figure 0006967245
化合物１（１００ ｍｇ， ０．３３ ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン（０．７５ ｍＬ）溶液に室温にて塩化スルフリル（５９ μＬ， ０．７２ ｍｍｏｌ）、ピリジン（１３ μＬ， ０．１６ ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて２時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、ヘキサンで共沸した。このものは精製することなく次の反応に用いた。得られた残渣を１，２−ジクロロエタン（１ ｍＬ）に溶解し、遮光中、室温にて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ， ４９ ｍｇ， ０．３２ ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．１ ｍＬ， １．２９ ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて３０分間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル ＝ ５：１）で精製することで、黄色固体（化合物２ｉ）を得た（１７ ｍｇ， ４８．９ μｍｏｌ， ２工程 １５％）。
Figure 0006967245
［実施例２］
上記で合成した本発明に係る含窒素化合物を選択的ジスルフィド化剤として用いて、２つの遊離チオール基を有するペプチドの分子内にジスルフィド結合を形成することにより、ジスルフィド含有ペプチドを合成した。
実施例２−１（ａ）：化合物２ａを用いたオキシトシンの合成
以下のスキームにより、上記で合成した化合物２ａを選択的ジスルフィド化剤として用いて、分子内に１対のジスルフィド結合（Ｎ末端側から１番目および６番目のシステイン残基間）を有するノナペプチド（９アミノ酸）であるオキシトシン（ペプチド４）を合成した。
Figure 0006967245
その具体的な手法は、以下の通りである。
（Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（ペプチド３）の合成）
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ａｍｉｄｅ樹脂（０．５８ ｍｍｏｌ／ｇ， ２００ ｍｇ， ０．１１６ ｍｍｏｌ）に２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ジメチルホルムアミド溶液を添加し、室温にて振とうした。ろ過にて反応溶液を除去した後、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体（３当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、３当量）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ、３当量）を用い、Ｆｍｏｃ−固相ペプチド合成法にてペプチド鎖を伸長した。得られたＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ−樹脂（３３１ ｍｇ）にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：１，２−エタンジチオール（９４：２．５：１．０：２．５（体積比）， １０ ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過、ＴＦＡを除去した後、エーテルを添加し、ペプチドを析出させた。エーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ （０．１％ＴＦＡ） ＝ ７９ ： ２１ ｔｏ ７４ ：２６ ｏｖｅｒ １５ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ５ μｍ， １９ ｘ １５０ ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することでペプチド３を得た（４９．６ ｍｇ， ４４．２ μｍｏｌ， ３８％）。
Figure 0006967245
（オキシトシン（ペプチド４）の合成）
ペプチド３（０．７１ ｍｇ， ０．６３ μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３（体積比）、０．１ ｍＭ）に化合物２ａ（０．３１， ２当量）を室温にて添加、遮光し同温度にて６時間撹拌した。主ピークとして検出された画分をＴＯＦ−ＭＳにて分析して、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
Figure 0006967245
なお、ペプチド３からペプチド４を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）および添加６時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ６５ ：３５ ｏｖｅｒ ２０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍ）による分析結果を図１に示す。なお、図中の＊は非ペプチド性のピークである（以下同様）。図１に示すように、化合物２ａの添加１時間後でペプチド３のピークはほとんど消失し、生成物（ペプチド４）のピークが確認された。また、添加６時間後にはペプチド３のピークは完全に消失し、化合物２ａのピークもわずかに残るのみとなった。このことから、本発明に係る含窒素化合物（またはその塩）をジスルフィド化試薬として用いることで、極めて簡便な処理によって短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチドの分子内にジスルフィド結合を導入してジスルフィド含有ペプチドを合成することが可能であることが示された。なお、本実施例においてジスルフィド結合が導入される推定反応機構は以下の通りである。
Figure 0006967245
実施例２−１（ｂ）：化合物２ｂを用いたオキシトシンの合成
化合物２ａに代えて化合物２ｂを選択的ジスルフィド化剤として用いたこと以外は、上述した実施例２−１（ａ）と同様の手法により、オキシトシン（ペプチド４）を合成した。そして、上記と同様にして、主ピークとして検出された画分をＴＯＦ−ＭＳにて分析することにより、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
実施例２−１（ｃ）：化合物２ｃを用いたオキシトシンの合成
化合物２ａに代えて化合物２ｃを選択的ジスルフィド化剤として用いたこと以外は、上述した実施例２−１（ａ）と同様の手法により、オキシトシン（ペプチド４）を合成した。そして、上記と同様にして、主ピークとして検出された画分をＴＯＦ−ＭＳにて分析することにより、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
実施例２−１（ｄ）：化合物２ｄを用いたオキシトシンの合成
化合物２ａに代えて化合物２ｄを選択的ジスルフィド化剤として用いたこと以外は、上述した実施例２−１（ａ）と同様の手法により、オキシトシン（ペプチド４）を合成した。そして、上記と同様にして、主ピークとして検出された画分をＴＯＦ−ＭＳにて分析することにより、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
ここで、実施例２−１（ａ）〜実施例２−１（ｄ）のそれぞれについて、選択的ジスルフィド化剤の添加から１時間後、３時間後および６時間後の反応溶液のＨＰＬＣによる分析により、オキシトシン（ペプチド４）の収率を測定した。結果を下記の表１に示す。
なお、実施例２−１（ａ）〜実施例２−１（ｄ）のＨＰＬＣ条件は以下の通りである。実施例２−１（ａ）ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ６５ ： ３５ ｏｖｅｒ ２０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍであり、実施例２−１（ｂ）ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ４５ ： ５５ ｏｖｅｒ ４０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍであり、実施例２−１（ｃ）および（ｄ）ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ５５ ： ４５ ｏｖｅｒ ３０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍである。
Figure 0006967245
実施例２−２：ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＡＮＰ）（ペプチド６）の合成
以下のスキームにより、分子内に１対のジスルフィド結合（Ｎ末端側から７番目および２３番目のシステイン残基間）を有するポリペプチド（２８アミノ酸）であるヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＡＮＰ）（ペプチド６）を合成した。
Figure 0006967245
その具体的な手法は、以下の通りである。
（Ｈ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ（ペプチド５）の合成）
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ−樹脂（０．２２ ｍｍｏｌ／ｇ， １８２ ｍｇ， ８０．０ μｍｏｌ）を用い、Ｐｒｅｌｕｄｅ（登録商標）６チャンネルペプチド合成装置にてペプチド鎖を伸長した。得られたＨ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｍｅｔ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｏ−樹脂（７１０ ｍｇ）の一部（２４４ ｍｇ）にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：１，２−エタンジチオール（９４：２．５：１．０：２．５（体積比）， ５ ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過、ＴＦＡを除去した後、エーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらにエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ （０．１％ＴＦＡ） ＝ ８０ ： ２０ ｔｏ ６７ ： ３３ ｏｖｅｒ １３ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ５ μｍ， １９ ｘ １５０ ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することでペプチド５を得た（１１．３ ｍｇ， ３．０１
μｍｏｌ， １０％）。
Figure 0006967245
（ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＡＮＰ）（ペプチド６）の合成）
ペプチド５（１．５２ ｍｇ， ０．４０３ μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３、４０３ μＬ）に化合物２ａ（０．４９ ｍｇ， ２．０２ μｍｏｌ）を添加、遮光し、室温にて２４時間撹拌した。反応溶液をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ （０．１％ＴＦＡ） ＝ ８０ ： ２０ ｔｏ ６７ ： ３３ ｏｖｅｒ １３ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ５ μｍ， １９ ｘ １５０ ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＡＮＰ）（ペプチド６）を得た（０．７６ ｍｇ， ２．０２ μｍｏｌ， ５０％）。
Figure 0006967245
なお、ペプチド５からペプチド６を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）、添加６時間後（Ｃ）および添加２４時間後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ９５ ： ５ ｔｏ ３５ ： ６５ ｏｖｅｒ ３０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍ）による分析結果を図２に示す。図２に示すように、化合物２ａの添加１時間後でペプチド５のピークは約半分に減少し、生成物（ペプチド６）のピークが確認された。また、添加６時間後にはペプチド５のピークはごくわずかとなり、生成物（ペプチド６）のピークが増大した。そして、添加２４時間後にはペプチド５のピークは完全に消失し、化合物２ａのピークについても大幅な減少が見られた。このことから、本発明に係る含窒素化合物（またはその塩）からなるジスルフィド化試薬は、２８アミノ酸という比較的大きめのポリペプチドを原料として用いても、分子内にジスルフィド結合を導入してジスルフィド含有ペプチドを合成することが可能であることがわかる。
実施例２−３：α−コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）の合成
以下のスキームにより、分子内に２対のジスルフィド結合（Ｎ末端側から１番目および１０番目のシステイン残基間、並びに５番目および１１番目のシステイン残基間）を有するポリペプチド（１２アミノ酸）であるα−コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）を合成した。
Figure 0006967245
その具体的な手法は、以下の通りである。
（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＨ２（ペプチド７）の合成）
Ｆｍｏｃ−ＳＡＬ−ａｍｉｄｅ樹脂（０．５４ ｍｍｏｌ／ｇ， １４８ ｍｇ， ８０．０ μｍｏｌ）を用い、Ｐｒｅｌｕｄｅ（登録商標）６チャンネルペプチド合成装置にてペプチド鎖を伸長した。得られたＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ａｓｐ（ｔ−Ｂｕ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＨ−樹脂（３６２ ｍｇ）にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：１，２−エタンジオール（９４：２．５：１．０：２．５（体積比）， ５ ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過、ＴＦＡを除去した後、エーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらにエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ （０．１％ＴＦＡ） ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ７２ ： ２８ ｏｖｅｒ １３ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ５ μｍ， １９ ｘ １５０ ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することでペプチド７を得た（３９．９ ｍｇ， ２１．７ μｍｏｌ， ２７％）。
Figure 0006967245
なお、ペプチド７のＮ末端側から３番目および１２番目のシステイン残基のチオール基はＮ−（アセチル）アミノメチル基（Ａｃｍ基）で保護されており、このＡｃｍ基はヨウ素酸化法によって選択的に脱保護されうる。
（ペプチド８（ペプチド７のＮ末端側から２番目および８番目のシステイン残基間にジスルフィド結合が形成されたもの）の合成）
ペプチド７（６．１４ ｍｇ， ３．３４ μｍｏｌ）に化合物２ａ（０．３３ ｍｇ， １．３６ μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３（体積比）， ３．３４ ｍＬ）を室温にて添加、同温度で遮光下２７時間撹拌した。反応溶液をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ （０．１％ＴＦＡ） ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ７７ ： ２３ ｏｖｅｒ １６ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ５ μｍ， １９ ｘ １５０ ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで、ペプチド８を得た（３．７５ ｍｇ， ２．０４ μｍｏｌ， ６１％）。
Figure 0006967245
なお、ペプチド７からペプチド８を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加４時間後（Ｂ）、添加９時間後（Ｃ）および添加２７時間後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ９５ ： ５ ｔｏ ３５ ： ６５ ｏｖｅｒ ３０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍ）による分析結果を図３に示す。図３に示すように、化合物２ａの添加４時間後でペプチド７のピークは約半分に減少し、生成物（ペプチド８）のピークが確認された。また、添加９時間後にはペプチド７のピークはごくわずかとなり、生成物（ペプチド８）のピークが増大した。そして、添加２７時間後にはペプチド７のピークは完全に消失し、化合物２ａのピークについても大幅な減少が見られた。ここで、反応溶液をＨＰＬＣにて精製した後のサンプルについてのＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ９５ ： ５ ｔｏ ３５ ： ６５ ｏｖｅｒ ３０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍ）による分析結果を図３の（Ｅ）に示す。この結果からわかるように、精製によって得られた生成物のピークはペプチド８のピークと保持時間が一致した。
（α−コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）の合成）
ペプチド８（２．９４ ｍｇ， １．６０ μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（５：１（体積比）， １．６０ ｍＬ）にヨウ素（Ｉ２）（２．０３ ｍｇ， ８．００ μｍｏｌ）を室温にて添加、遮光し同温度にて１時間撹拌した。これにより、ペプチド７における２箇所のＡｃｍ基を脱保護すると同時に対応する２つのチオール基の間にジスルフィド結合を形成した（ヨウ素酸化法）。反応溶液に１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液（５０ μＬ）を加え、ＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ （０．１％ＴＦＡ） ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ７７ ： ２３ ｏｖｅｒ １６ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ５ μｍ， １９ ｘ １５０ ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで、α−コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）を得た（１．２５ ｍｇ， ０．７３８
μｍｏｌ， ４６％）。
Figure 0006967245
なお、ペプチド８からペプチド９を合成した際の、ヨウ素の添加前（Ａ）、添加２分後（Ｂ）、添加１時間後（Ｃ）およびＨＰＬＣ精製後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ９５ ： ５ ｔｏ ３５ ： ６５ ｏｖｅｒ ３０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍ）による分析結果を図４に示す。図４に示すように、ヨウ素の添加２分後でペプチド８のピークは大幅に減少し、生成物（ペプチド９）のピークの増大が見られた。また、添加１時間後にはペプチド８のピークは完全に消失し、生成物（ペプチド９）のピークのみが確認された。ここで、反応溶液をＨＰＬＣにて精製した後のＨＰＬＣ分析結果（図４の（Ｄ））からわかるように、精製によって得られた生成物のピークはペプチド９のピークと保持時間が一致した。さらに、図５には、（Ａ）上記実施例で合成されたα−コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）、（Ｂ）市販のα−コノトキシンＩｍＩの標品サンプル（株式会社ペプチド研究所より購入）、（Ｃ）これらの混合サンプルのそれぞれについてＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ９５ ： ５ ｔｏ ３５ ： ６５ ｏｖｅｒ ３０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍ）による分析を行った結果を示す。この結果からわかるように、上記実施例で合成されたα−コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）の保持時間は市販のものと一致した。このように、α−コノトキシンＩｍＩのように分子内に２つのジスルフィド結合を有するペプチドについても高純度での合成が可能であることから、本発明に係る含窒素化合物（またはその塩）をジスルフィド化試薬として用いるジスルフィド含有ペプチドの製造方法は、極めて強力な合成手段を提供するものであることがわかる。
［実施例３］
上記で合成した本発明に係る含窒素化合物を高分子担体に固相化させたものを選択的ジスルフィド化剤として用いて、２つの遊離チオール基を有するペプチドの分子内にジスルフィド結合を形成することにより、ジスルフィド含有ペプチドを合成した。
実施例３−１：固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）の合成
以下のスキームにより、化学式１におけるＲが高分子担体（ポリエチレングリコール架橋体）である含窒素化合物（化合物１１）を合成した。
Figure 0006967245
その具体的な手法は、以下の通りである。
（化合物１０の合成）
まず、国際公開第２０１５／０５０１９９号パンフレットの記載に従って、高分子担体であるアミノメチル−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂（シグマ−アルドリッチ社製、表面に多数のアミノメチル基が存在、官能基置換率０．７０ｍｍｏｌ／ｇ）の表面に上記の化学構造を有する含窒素化合物が固相化されてなる化合物１０を合成した（国際公開第２０１５／０５０１９９号パンフレットの実施例における化合物６と同じである）。
（化合物１１の合成）
続いて、化合物１０（２６．６ ｍｇ， １５．７ μｍｏｌ）に氷冷下、２％（ｗ／ｖ）塩化スルフリル／１，２−ジクロロエタン（１．２５ ｍＬ）およびピリジン（６．３５ μＬ， ７８．６ μｍｏｌ）の混合溶液を添加し、同温度にて２０分撹拌した。反応溶液を除去した後、氷冷下、上記の混合溶媒を添加し、同温度にて２０分撹拌した。さらにこの操作を１回行った。ろ過により反応溶液を除去した後、氷冷したジクロロメタンにて樹脂を５回洗浄した。得られた樹脂に３０％（ｗ／ｖ）ＤＩＰＥＡ／メタノール混合溶媒（８００ μＬ）を室温にて添加し、１．５時間撹拌した。ろ過により反応溶液を除去した後、ジクロロメタンで５回、メタノールで５回洗浄した。さらにこの操作を２回行った後、樹脂を乾燥した（２２．０ ｍｇ）。このようにして、化合物１１を得た。
実施例３−２：固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）を用いたオキシトシン（ペプチド４）の合成
以下のスキームにより、固相化ジスルフィド化試薬である化合物１１を用いて、実施例２−１（ａ）と同様の手法により、ペプチド３からオキシトシン（ペプチド４）を合成した。
Figure 0006967245
その具体的な手法は、以下の通りである。
（化合物１１を用いたオキシトシン（ペプチド４）の合成）
ペプチド３（１．５６ ｍｇ， １．３９ μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３（体積比）、１．３９ ｍＬ）を固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）（１１．８ ｍｇ， ６．９４ μｍｏｌ）に室温にて添加、遮光し同温度にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、ＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ （０．１％ＴＦＡ） ＝ ７９ ： ２１ ｔｏ ７４ ： ２６ ｏｖｅｒ １５ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ６ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ５ μｍ， １９ ｘ １５０ ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することにより、オキシトシン（ペプチド４）を得た（０．５５ ｍｇ， ０．４９１ μｍｏｌ， ３５％）。
なお、固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）を用いてペプチド３からペプチド４を合成した際の、反応開始３分以内（Ａ）、反応開始１時間後（Ｂ）および反応開始３時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ６５ ：３５ ｏｖｅｒ ２０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍ）による分析結果を図６に示す。図６に示すように、反応開始３分以内でペプチド４のピークが確認された。また、反応開始１時間後でペプチド３のピークはごくわずかとなり、生成物（ペプチド４）のピークが増大した。そして、添加３時間後にはペプチド３のピークは完全に消失した。なお、本実施例において用いたジスルフィド化試薬は固相化試薬であることから、反応溶液のろ過によって回収されており、ＨＰＬＣのチャートにはピークとして出現しない。このように、ジスルフィド化試薬を高分子担体に固相化されてなる形態の含窒素化合物からなる固相化試薬の形態とすることで、極めて短時間に高収率でジスルフィド含有ペプチドを製造可能である。そればかりか、生成物とジスルフィド化試薬との分離操作もろ過という簡便な操作のみによって可能である。したがって、特に固相化試薬の形態の本発明に係るジスルフィド化試薬は、有機合成（特に、ペプチド合成）の技術分野において極めて高い優位性を備えた発明であると言える。
［実施例４］
本発明の化合物の一例として、化合物１６ａ〜１６ｊの合成例を以下に示す。
以下のスキームにより、化合物１６ａ〜１６ｊを合成した。
Figure 0006967245
その具体的な手法は、以下の通りである。
実施例４−１：化合物１６ａの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（２．４ ｇ， １２．６ ｍｍｏｌ）のメタノール（１５０ ｍＬ）溶液に氷冷撹拌下、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．７２ ｍＬ， １８．９ ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、１０％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製することで、黄色固体（化合物１６ａ）を得た（１．９６ ｇ， １０．５ ｍｍｏｌ， ８４％）。
Figure 0006967245
実施例４−２：化合物１６ｂの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（５０ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン（０．８ ｍＬ）溶液に室温にてベンジルアルコール（２８．４ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４ μＬ， １．０４ ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製することで、黄色固体（化合物１６ｂ）を得た（４８．２ ｍｇ， ７０％）。
Figure 0006967245
実施例４−３：化合物１６ｃの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（５０ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、フェノール（２９．６ ｍｇ， ０．３１ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４ μＬ， １．０４ ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｃを合成した（黄色固体， ３７ ｍｇ， ５７％）。
Figure 0006967245
実施例４−４：化合物１６ｄの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（５０ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、２−フルオロフェノール（２９．０ μＬ， ０．３１４ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４ μＬ， １．０４ ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｄを合成した（黄色固体， ３８ ｍｇ， ５４％）。
Figure 0006967245
実施例４−５：化合物１６ｅの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（５０ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、２−フルオロフェノール（２８．５ μＬ， ０．３１４ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４ μＬ， １．０４ ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｅを合成した（黄色固体， ２７ ｍｇ， ３９％）。
Figure 0006967245
実施例４−６：化合物１６ｆの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（５０ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、４−フルオロフェノール（３５．３ ｍｇ， ０．３１４ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４ μＬ， １．０４ ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｆを合成した（黄色固体， ５１ ｍｇ， ７３％）。
Figure 0006967245
実施例４−７：化合物１６ｇの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（５０ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、４−クロロフェノール（２５．８ μＬ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４ μＬ， １．０４ ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｇを合成した（黄色固体， ３７ ｍｇ， ５０％）。
Figure 0006967245
実施例４−８：化合物１６ｈの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（５０ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、４−メトキシフェノール（３２．６ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４ μＬ， １．０４ ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｈを合成した（黄色固体， ５０ ｍｇ， ６８％）。
Figure 0006967245
実施例４−９：化合物１６ｉの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（５０ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシフェニルアセテート（３９．９ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４ μＬ， １．０４ ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｉを合成した（黄色固体， ２６ ｍｇ， ３２％）。
Figure 0006967245
実施例４−１０：化合物１６ｊの合成
Figure 0006967245
Ｎｐｙｓ−Ｃｌ（５０ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、ｐ−クレゾール（２７．３ μＬ， ０．２６ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４ μＬ， １．０４ ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｊを合成した（黄色固体， ３６．３ ｍｇ， ５３％）。
Figure 0006967245
［実施例５］
（化合物１６ａを用いたオキシトシンの合成）
以下のスキームにより、上記で合成した化合物１６ａを選択的ジスルフィド化剤として用いて、分子内に１対のジスルフィド結合（Ｎ末端側から１番目および６番目のシステイン残基間）を有するノナペプチド（９アミノ酸）であるオキシトシン（ペプチド４）を合成した。
Figure 0006967245
その具体的な手法は、以下の通りである。
ペプチド３のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３（体積比）、１ ｍＭ、８．９４ ｍＬ）に化合物１６ａ（０．９４７ ｍｇ， ５．０９ μｍｏｌ）を室温にて添加、遮光し同温度にて３時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。 なお、ペプチド３からペプチド４を合成した際の、化合物１６ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）および添加３時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ６５ ： ３５ ｏｖｅｒ ２０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍ）による分析結果を図７に示す。図７に示すように、化合物１６ａの添加１時間後でペプチド３のピークはほとんど消失し、生成物（ペプチド４）のピークが確認された。また、添加３時間後にはペプチド３のピークは完全に消失した。このことから、エステル構造を有さない含窒素化合物（またはその塩）からなるジスルフィド化試薬も同様に、短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチドの分子内にジスルフィド結合を導入してジスルフィド含有ペプチドを合成することが可能であることが示された。
［実施例６］
上記で合成した本発明に係る含窒素化合物を選択的ジスルフィド化剤として用いて、樹脂に担持したペプチドの２つの遊離チオール基間のジスルフィド結合を形成することにより、ジスルフィド含有ペプチドを合成した。
（化合物１６ａを用いた樹脂上におけるジスルフィド結合の形成）
以下のスキームにより、ペプチド固相合成により得たオキシトシン−樹脂１７のＮ末端側から１番目および６番目のシステインの側鎖（−ＳＨ基）の保護基（ｔｅｒｔ−ブチルチオ（−Ｓ−Ｃ（ＣＨ３）３）基）を脱保護してペプチド−樹脂１８とした後、選択的ジスルフィド化剤である上記で合成した化合物１６ａを用い、樹脂上でジスルフィド結合を構築し、脱樹脂および保護基の脱保護基によって、オキシトシン（ペプチド４）を合成した。
Figure 0006967245
（オキシトシン−樹脂１７の合成）
Ｆｍｏｃ−ＳＡＬ−ａｍｉｄｅ樹脂（０．５６ ｍｍｏｌ／ｇ， ７１．４ ｍｇ， ４０．０ μｍｏｌ）を用い、Ｐｒｅｌｕｄｅ（登録商標）６チャンネルペプチド合成装置にてペプチド鎖を伸長し、Ｈ −Ｃｙｓ（Ｓｔ−Ｂｕ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｓｔ−Ｂｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ−樹脂を１２０ ｍｇ得た。
（オキシトシン（ペプチド４））の合成
オキシトシン−樹脂１７（６．９ ｍｇ， ３．８６ μｍｏｌ）にＮ−メチルモルホリンの２０％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール／ＤＭＦ混合溶液（Ｎ−メチルモルホリンの最終濃度０．１ Ｍ， １ ｍＬ）を室温にて加え、８時間撹拌し、システイン側鎖ｔｅｒｔ−ブチルチオ基の脱保護を行いペプチド−樹脂１８とした。この樹脂をＤＭＦで５回洗浄した後、化合物１６ａ（１．４４ ｍｇ， ７．７３ μｍｏｌ）のＤＭＦ（３８６ μＬ）溶液を室温にて添加し、１時間撹拌した。撹拌後、樹脂をＤＭＦ、メタノール、エーテルで各５回洗浄して、乾燥した。得られた樹脂にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：（９５：２．５ ： ２．５（体積比）， １ ｍＬ）を添加し、室温にて１時間撹拌した。反応溶液をろ過、ＴＦＡを除去した後、エーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらにエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣにて分析し、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
なお、ペプチド−樹脂１８を脱樹脂し、得られた粗生成物（Ａ）、化合物１６ａを添加後、脱樹脂し、得られた粗生成物（Ｂ）のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ８５ ： １５ ｔｏ ５５ ： ４５ ｏｖｅｒ ３０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ０．９ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： Ｓｕｎ Ｆｉｒｅ Ｃ１８ ５ μｍ ４．６ｘ１５０ ｍｍ ｃｏｌｕｍｎ）による分析結果を図８に示す。図８に示すように、ペプチド−樹脂１８を化合物１６ａにて処理することで、生成物（ペプチド４）のピークが確認された。このことから、含窒素化合物（またはその塩）からなる選択的ジスルフィド化試薬が、樹脂に担持したペプチドの２つの遊離チオール基間のジスルフィド結合を形成してジスルフィド含有ペプチドを合成することが可能であることが示された。
［実施例７］
（化合物２ａの安定性評価）
上記で合成した本発明に係る含窒素化合物２ａの安定性を、ＨＰＬＣ分析およびＮＭＲ測定により評価した。その結果、化合物２ａは、特別な処理をすることなく少なくとも６ヶ月以上、室温にて安定であることが確認された。ここで、室温保存にて６ヶ月以上経過した化合物２ａのＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ： ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ ＝ ９５ ： ５ ｔｏ ３５ ： ６５ ｏｖｅｒ ３０ ｍｉｎ， ｆｌｏｗ ｌａｔｅ １ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ： ２３０ ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ： ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ４−ＡＲ−３００ ４．６ＩＤ ｘ １５０ ｍｍ）分析結果、および１Ｈ ＮＭＲ分析結果を示すチャートをそれぞれ図９および図１０に示す。
［実施例８］
（化合物２ａによる副反応の有無の確認）
ヨウ素酸化の副反応として、トリプトファン、チロシン、ヒスチジンの側鎖に対するヨウ素化反応が報告されている（Ｂ． Ｋａｍｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ． １９８０， ８９９−９１５．）。そこで、本発明の含窒素化合物である化合物２ａの副反応の有無を、上記論文と同様の手法により確認した。すなわち、以下のスキームに示すようにトリプトファン、チロシン、ヒスチジンの誘導体３種（Ｃｂｚ−Ｔｒｐ−ＮＨ２、Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−ＯＭｅ、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）のメタノール／水またはＤＭＦ溶液に対し、室温にて化合物２ａ（３当量）を添加し、同温度にて２４時間撹拌した。その結果、これらのアミノ酸誘導体と化合物２ａとの反応は全く進行せず、副反応はないことが示された。
Figure 0006967245
この出願は、２０１６年５月２０日に出願された日本国特許出願第２０１６−１０１８１２号に基づいており、その出願は全体として参照により引用されている。

Claims (23)

  1. 下記化学式１で表される含窒素化合物またはその塩からなる、分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物における２つの前記遊離チオール基の間でジスルフィド結合を形成させるためのジスルフィド化剤：
    Figure 0006967245
    化学式１において、
    Ｗは、他の環員原子と一緒になって、ピリジン環を形成し、
    Ｘは、−Ｏ−であり、
    Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基であり、
    Ｚは、前記ピリジン環の３位に置換されたニトロ基を表し、
    ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立して、０または１であり、
    ｓは、０〜１０の整数を表し、
    Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表し、
    ＡａおよびＡｂは、それぞれ独立して、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、Ｃ１〜Ｃ２０のオキシアルキレン基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキレンオキシ基、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基であり、
    Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基または高分子担体である。
  2. 前記分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物がペプチドである、請求項１に記載のジスルフィド化剤。
  3. 前記含窒素化合物が、以下の条件を満たすものではない、請求項１または２に記載のジスルフィド化剤：
    条件：ｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０、かつ、Ｒ＝水素原子
  4. Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、または置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のジスルフィド化剤。
  5. Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基である、請求項４に記載のジスルフィド化剤。
  6. Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキレン基、置換または非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニレン基、置換または非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニレン基、置換または非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキレン基、置換または非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリーレン基、置換または非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリーレン基、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、ポリオキシアルキレン基および下記化学式（ａ）で表される基：
    Figure 0006967245
    化学式（ａ）において、
    Ｒａは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１５のアルキレン基を表す、
    からなる群から選択される（ここで、これらのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、アリーレン基およびヘテロアリーレン基は置換基を有していてもよい）、請求項１〜５のいずれか１項に記載のジスルフィド化剤。
  7. 前記含窒素化合物が、下記化学式２で表される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のジスルフィド化剤：
    Figure 0006967245
    化学式２において、
    Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０およびＡａは、請求項１において定義した通りであり、
    Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ２０のアリール基、または置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ２０のヘテロアリール基である。
  8. Ｒが、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル基である、請求項７に記載のジスルフィド化剤。
  9. Ａａが、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される基である、請求項７または８に記載のジスルフィド化剤。
  10. Ａａが、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−である、請求項９に記載のジスルフィド化剤。
  11. ｐが０である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のジスルフィド化剤。
  12. Ｒが、高分子担体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のジスルフィド化剤。
  13. Ｒが、固相合成法に用いられる高分子担体である、請求項１２に記載のジスルフィド化剤。
  14. Ｒが、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエーテル、ポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、これらの共重合体および架橋体、磁性ビーズ、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２または１３に記載のジスルフィド化剤。
  15. 下記化学式３で表される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のジスルフィド化剤：
    Figure 0006967245
    化学式３において、
    Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０およびＡａは、請求項１において定義した通りであり、
    Ｒは、高分子担体である。
  16. Ａａが、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される基である、請求項１５に記載のジスルフィド化剤。
  17. Ａａが、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｒが、ポリエチレングリコール架橋体である、請求項１６に記載のジスルフィド化剤。
  18. Ａａが、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−であり、Ｒが、ポリスチレン樹脂である、請求項１６に記載のジスルフィド化剤。
  19. ｐが０である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載のジスルフィド化剤。
  20. 下記化学式４で表される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のジスルフィド化剤：
    Figure 0006967245
    化学式４において、
    Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、請求項１において定義した通りであり、
    Ｒは、高分子担体である。
  21. ＡａおよびＡｂが−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｌ１がＣ１〜Ｃ２０のアルキレン基であり、Ｒがポリエチレングリコール架橋体である、請求項２０に記載のジスルフィド化剤。
  22. ｐが０である、請求項２０または２１に記載のジスルフィド化剤。
  23. 前記含窒素化合物が、以下の化合物１６ａ〜化合物１６ｊのいずれかである、請求項１に記載のジスルフィド化剤：
    Figure 0006967245
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