ES2930177T3

ES2930177T3 - Procedimiento optimizado para el conjugado péptido-fosfolípido dimérico

Info

Publication number: ES2930177T3
Application number: ES19817769T
Authority: ES
Inventors: Anthony Clouet; Bernard Lamy
Original assignee: Bracco Suisse SA
Current assignee: Bracco Suisse SA
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2022-12-07
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: SG11202104497VA; JP2022512406A; JP7421554B2; US20220202944A1; IL284167A; EP3897736A1; EP3897736B1; CA3118523A1; CN113164613A; KR20210106418A; BR112021008753A2; CN113164613B; US11484596B2; WO2020127124A1

Abstract

La presente invención describe un nuevo proceso eficaz para la preparación del conjugado de fosfolípido-péptido dirigido a KDR de fórmula (I), que puede ser útil en composiciones terapéuticas y de diagnóstico y particularmente en la preparación de agentes de contraste para ultrasonidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento optimizado para el conjugado péptido-fosfolípido dimérico

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los conjugados péptido-fosfolípido que fijan como objetivo KDR, que son útiles en composiciones terapéuticas y de diagnóstico y, particularmente, a los métodos de preparación de los mismos.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis representa la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasculatura pre-existente y desempeña un papel crítico no solo en los procesos fisiológicos normales, sino también en la patogénesis de enfermedades, tales como el cáncer, la artritis reumatoide y la enfermedad microvascular diabética. Por ejemplo, la angiogénesis está implicada en la transición de un tumor de crecimiento hiperplásico a neoplásico. Por lo tanto, la inhibición de los procesos patológicos relacionados es muy importante en la investigación terapéutica y diagnóstica del cáncer.

Cuando se producen factores de crecimiento angiogénicos que exceden a los inhibidores de la angiogénesis, se estimula la proliferación de las células endoteliales. Entre los agentes pro-angiogénicos o factores de crecimiento conocidos y mejor caracterizados, la familia de factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) y, en particular, KDR (receptor de dominio de inserción de quinasa (por sus siglas en inglés), también conocido como VEGFR-2 o Flk-1), representan los de mayor interés por mostrar una expresión celular endotelial más abundante y dominar la respuesta angiogenética1. La expresión de KDR está altamente regulada al alza en los vasos angiogénicos, especialmente en los tumores, induciendo una fuerte respuesta angiogénica2.

La actividad de unión a VEGF de KDR in vivo es crítica para la angiogénesis, por lo que la capacidad de detectar su regulación al alza en las células endoteliales o de detectar complejos de unión a VEGf/KDR sería extremadamente beneficiosa para detectar o monitorizar la angiogénesis.

Se sabe que para fines diagnósticos y terapéuticos tales como, por ejemplo, para formar imágenes de vasos y órganos internos, sería particularmente ventajoso incorporar en los agentes de contraste de ultrasonido llenos de gas cualquier composición de vector de fijación de objetivo que exhiba una alta afinidad de unión para un objetivo deseado tal como el KDR. Por ejemplo, los conjugados péptido-fosfolípido que fijan como objetivo KDR se pueden utilizar para preparar agentes de contraste de ultrasonidos llenos de gas fijados como objetivo.

De hecho, es bien sabido que los agentes de contraste de ultrasonidos llenos de gas son reflectores de ultrasonidos excepcionalmente eficientes para la ecografía. Por ejemplo, inyectar en el torrente sanguíneo de los cuerpos vivos suspensiones de microburbujas llenas de gas en un líquido portador reforzará fuertemente la formación de imágenes de ecografía ultrasónica, ayudando así en la visualización de estructuras anatómicas internas tales como los vasos sanguíneos.

Una de las composiciones de vectores de fijación de objetivo que exhiben una alta afinidad de unión para el KDR objetivo, o el complejo VEGF/KDR, está representada, por ejemplo, por el siguiente compuesto (I), un conjugado "péptido-fosfolípido de fijación de objetivo" (lipopéptido) que se describió por primera vez en la solicitud de patente WO2007/067979 A2 y ha exhibido una alta capacidad de unirse a tejidos que expresan el KDR.

Dicho compuesto (I), reseñado aquí más adelante y con más detalle en la Figura 1, está constituido estructuralmente por un péptido heterodimérico formado por dos cadenas peptídicas monoméricas diferentes, ambas de 23 aminoácidos, ancladas por un enlazador de glutarilo y conjugadas con un resto de polietilenglicol (PEG) tal como DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²a través de un segundo enlazador de glutarilo.

En el documento WO2007/067979 A2 (véase el Ejemplo 5, páginas 52-54, reseñado en el mismo y la Figura 4 para más detalles) se describió un método para la preparación del conjugado (I) de péptido-fosfolípido de unión a KDR. El conjugado se prepara partiendo de la síntesis automatizada en fase sólida de los monómeros peptídicos, seguida de su acoplamiento y activación mediante el succinimidil glutarato (DSG) y la posterior conjugación del derivado obtenido con DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²mediante enlace glutarilo.

La última etapa de conjugación también se ilustra en el siguiente Esquema 1.

De la divulgación anterior se desprende que la etapa de conjugación podría implicar algunos inconvenientes en términos de rendimiento y pureza del producto final (véase el párrafo [0063]: "cualquier fosfolípido libre puede complicar la purificación y el aislamiento del producto final"). De hecho, el reactivo fosfolípido DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²(III), siendo difícil de separar del producto final (I) a través de los métodos de purificación conocidos, se añade por defecto con respecto al succinimidil-dipéptido (II) (relación entre DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²y el succinimidil-dipéptido: 0,9 a 1 equivalentes) para evitar la formación de contaminantes y la necesidad de purificaciones engorrosas.

Sin embargo, este enfoque, aunque limita las impurezas en el producto final, provoca una pérdida del costoso heterodímero (II) y proporciona rendimientos de la etapa de conjugación, no superiores al 60 %, o incluso no superiores al 30 %. Además, el compuesto final después de la purificación preparativa por HPLC, como se describe en el Ejemplo 5 del documento WO2007/067979, aún conserva casi el 2 % de impurezas, con un perfil de pureza que no cumple con los requisitos establecidos por las autoridades para un producto farmacéutico.

Otro inconveniente del procedimiento conocido está relacionado con la presencia de altos contenidos de ácido trifluoroacético (TFA, por sus siglas en inglés), que se añade durante la síntesis para la solubilización y en las fases móviles para la purificación preparativa por HPLC. De hecho, además del hecho de que el TFA se considera una sal farmacéuticamente inaceptable, cuando el producto se almacena como sal TFA en forma de liofilizado a 5 °C o en solución, se ha observado una degradación probablemente formada por hidrólisis ácida promovida por TFA de uno de los ésteres de ácidos grasos fosfolípidos en el conjugado dímero para proporcionar un liso-compuesto como impureza no deseada, como se describe en los párrafos [0065]-[0066] del documento WO2007/067979. Por lo tanto, se deben llevar a cabo procedimientos más onerosos y lentos para "convertir las sales TFA del conjugado péptidofosfolípido dímérico" en otra sal más estable.

En resumen, los principales problemas del procedimiento conocido están representados por una pérdida perjudicial del costoso heterodímero (II) durante la etapa de conjugación con el fosfolípido pegilado (III); la difícil etapa de purificación que compromete la pureza y el rendimiento del producto final; y la inestabilidad del producto final obtenido y almacenado como sal TFA.

Por lo tanto, el enfoque descrito, aunque bastante eficaz, puede ser muy oneroso y aún no representa un método válido e industrialmente aplicable. Los parámetros de pureza y eficiencia de producción aún no se cumplen.

Por el contrario, con el fin de utilizar un conjugado péptido-fosfolípido de fijación de objetivo in vivo de este tipo en la formación de imágenes de vasos y órganos internos, sería particularmente beneficioso disponer de un método eficiente para la producción a gran escala de formas altamente purificadas del producto.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un nuevo procedimiento para la preparación del compuesto péptido-fosfolípido (I) como se define arriba, caracterizado por condiciones optimizadas de las etapas de conjugación y purificación. Este procedimiento resulta particularmente útil para la fabricación de agentes de contraste por ultrasonidos llenos de gas. En este contexto, se ha encontrado un procedimiento analítico eficiente que mejora notablemente la separación del compuesto final de los subproductos, permitiendo aumentar con ello la cantidad de material de partida (III) durante la conjugación y obtener el compuesto (I) en mayores rendimientos, con el mejor perfil de pureza y un perfil de estabilidad adecuado, útil para la escalabilidad de todo el procedimiento.

Por consiguiente, es un primer aspecto de la presente invención un procedimiento para la preparación de compuesto (I), o sales farmacéuticamente aceptables del mismo,

que comprende la etapa de

(i) acoplar el correspondiente compuesto intermedio éster succinimidílico (II)

en presencia de DIEA,

en donde dicho fosfolípido (III) está presente en exceso con respecto al compuesto (II). En una realización preferida, el acoplamiento se lleva a cabo con 1,1 o más equivalentes de fosfolípidos (III) por equivalente de compuesto (II).

En una realización más preferida, el acoplamiento se lleva a cabo con dos equivalentes de fosfolípidos (III) por equivalente de compuesto (II).

En otro aspecto, la presente invención proporciona dicho procedimiento que comprende, además, las etapas de: ii) aislar el producto bruto (I) recuperado de la mezcla de reacción de la etapa (i);

iii) diluir opcionalmente en agua el producto bruto obtenido en la etapa (ii) y añadir una base para alcanzar un pH comprendido entre 6 y 8; y

iv) purificar el producto bruto a partir de la solución de la etapa (iii).

La adición de una base en la etapa (iii) puede facilitar la solubilización completa del producto bruto en agua, manteniendo el pH de la solución entre 6 y 8. Preferiblemente, se añade una cantidad adecuada de NaOH 0,1 N para alcanzar un pH entre 6,5 y 7,5, más preferiblemente para alcanzar un pH de 7,3.

De acuerdo con la invención, la purificación de la etapa (iv) puede llevarse a cabo mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC, por sus siglas en inglés) o mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante cromatografía RP-HPLC y cromatografía de intercambio iónico.

En una realización preferida, la purificación se lleva a cabo únicamente mediante purificación RP-HPLC. De acuerdo con la invención, la separación cromatográfica por RP-HPLC se consigue preferentemente utilizando eluyentes que tengan un pH comprendido entre 6 y 8 y que comprendan una sal volátil fácil de eliminar. Una fase móvil óptima puede representarse, por ejemplo, mediante la combinación de eluyente A, que consiste en AcONH4 10 mM en agua, y eluyente B, que consiste en AcONH410 mM en agua/acetonitrilo 1/9.

En otra realización preferida, la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de intercambio iónico. Preferiblemente, una cromatografía de este tipo se realiza con una resina de intercambio aniónico (p. ej., resina ANX Sepharose) y una solución tampón seleccionada de las comúnmente utilizadas para la cromatografía iónica a un pH preferiblemente entre 7 y 8, opcionalmente con la adición de disolventes miscibles en agua que mejoran la solubilización de un resto fosfolípido.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la purificación se lleva a cabo con éxito utilizando un tampón Tris-HCl/NaCl como eluyente. Se obtiene una separación cromatográfica adecuada, por ejemplo, utilizando Tris HCl 0,05 M NaCl 0,10 M (pH 7,5) iPrOH al 35 % como tampón de fijación y Tris HCl 0,05 M NaCl 1,00 M (pH 7,5) iPrOH al 35 % como tampón de elución.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona el procedimiento anterior, en el que el compuesto (II) se prepara mediante la activación del resto alquil-amino terminal del compuesto intermedio correspondiente de fórmula (IV) con di(A/-succinimidil)glutarato (V), como se reseña en el siguiente Esquema 2 (etapa i')).

Esquema 2

El procedimiento de la invención se caracteriza, por lo tanto, por el uso de un exceso del reactivo fosfolipídico DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²(III), que reacciona con toda la cantidad presente del heterodímero activado (II), de modo que evite cualquier pérdida de este último compuesto intermedio costoso. Los rendimientos de las etapas de acoplamiento (i') y, en particular, (i) son ahora ventajosamente más altos en comparación con los obtenidos con el procedimiento conocido anteriormente.

De hecho, el método anterior solo proporciona rendimientos inferiores al 60 % del conjugado péptido-fosfolípido péptido dímero, que debe convertirse de sal TFA a una sal más estable, lo que reduce adicionalmente la recuperación efectiva del producto final.

Por el contrario, el presente método permite obtener el compuesto (I) con rendimientos mejorados de al menos el 69 % y, lo que es más importante, proporciona métodos más eficientes de separación analítica y purificación preparativa del producto final a partir de las impurezas no deseadas y eliminación del exceso de reactivos; por lo tanto, las condiciones de purificación optimizadas permiten obtener el producto final con una pureza superior al 99% después de RP-HPLC.

Por lo tanto, de acuerdo con los varios diversos beneficios proporcionados por el presente procedimiento, el nuevo procedimiento para la síntesis de compuesto (I) resuelve los inconvenientes del procedimiento previamente descrito y puede ser particularmente adecuado para la ampliación y la producción industrial.

Descripción de la invención

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra la estructura de compuesto (I) preparado de acuerdo con la invención.

La Fig. 2 muestra un cromatograma UPLC-ELSD de compuesto (I) después de la purificación final por HPLC.

Definiciones

En la presente descripción, y a menos que se disponga lo contrario, se pretende que los siguientes términos y expresiones tengan los siguientes significados.

El término "heterodímero" se refiere a una molécula compuesta por dos cadenas polipeptídicas que difieren en composición, es decir, en el orden, número o tipo de sus residuos de aminoácidos. En particular, en esta memoria se menciona con referencia al compuesto de fórmula (I) o sus precursores (II) y (IV), como se define arriba.

El término "pegilado" se refiere a una molécula que está unida covalentemente a una cadena polimérica de polietilenglicol (PEG). El compuesto pegilado se puede lograr por incubación de un derivado reactivo de PEG, preferiblemente después de la funcionalización en uno o ambos terminales con un resto reactivo, con la molécula diana.

La expresión "fase sólida de intercambio aniónico" significa un soporte sólido capaz de realizar un intercambio de aniones con la solución o suspensión en contacto con ella. Dicho contacto puede obtenerse por elución a través de una columna empaquetada con la fase sólida adecuada.

Descripción detallada de las realizaciones

El método descrito en esta memoria se refiere a la preparación del compuesto de fórmula (I), como se define arriba, y tiene las ventajas de ahorrar cantidades del costoso material de partida al tiempo que proporciona el producto final en altos rendimientos y con un grado de pureza óptimo.

Estos resultados pueden lograrse, entre otros, mediante el hallazgo de dos métodos de purificación eficientes, que se pueden aplicar por separado o en combinación, lo que permite una eliminación efectiva del fosfolípido (III) que no ha reaccionado añadido en exceso en la etapa de acoplamiento (i), junto con cualquier otro subproducto no deseado.

La preparación del compuesto (I), de acuerdo con el enfoque de síntesis descrito en el documento WO2007/067979, prevé una activación del heterodímero (IV) como se ha definido arriba, preparado, por ejemplo, mediante métodos conocidos de síntesis en fase sólida, con un di(N-succinimidil)glutarato (V) y la posterior conjugación del heterodímero activado (II) con DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²(III). La última etapa, como se ha dicho arriba, se lleva a cabo en defecto del fosfolípido, por lo que el acoplamiento solo se logra con resultados de rendimiento deficientes.

Por el contrario, el procedimiento optimizado representado por la presente invención proporciona una mejora notable de la etapa de conjugación, como se describe más adelante en detalle. El heterodímero (IV) puede activarse, por ejemplo, siguiendo el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 5 del documento WO2007/067979 (párrafo [00124]), es decir, haciendo reaccionar el precursor del heterodímero con un exceso de di(N-succinimidil)glutarato y una base, tal como DIEA, por ejemplo con un exceso de 5 veces de ambos reaccionantes para evitar la condensación del heterodímero. Una vez completada la reacción, la mezcla puede diluirse con un disolvente adecuado tal como acetato de etilo anhidro, con el fin de precipitar el heterodímero mono-éster de NHS monoamida de ácido glutárico (II) que luego se recupera y se lava para eliminar las trazas restantes de reaccionantes. Alternativamente, la mezcla puede concentrarse para eliminar el disolvente y el producto bruto seco puede lavarse, por ejemplo con EtOAc, y centrifugarse, recuperando el sólido del matraz.

Acoplamiento con el fosfolípido

De acuerdo con la invención, y como se describe con más detalle en la parte experimental, el compuesto de fórmula (II) se incuba con una cantidad en exceso de DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²(III) disuelto en DMF y en presencia de una base, tal como DIEA. La relación entre los equivalentes del precursor heterodímero (II) y los equivalentes de fosfolípido (III) es al menos 1:1,1, pero más convenientemente está comprendida entre 1:1,1 y 1:5. Preferiblemente, es 1:2.

La compleción de la reacción de acoplamiento puede controlarse mediante HPLC analítica.

Aislamiento del producto

El producto bruto puede recogerse después de la concentración de la mezcla de reacción. Por ejemplo, parte de los reactivos en exceso se puede eliminar mediante lavados del producto bruto seco con un disolvente adecuado y centrifugación de la mezcla. Alternativamente, se puede añadir un disolvente, tal como acetato de etilo, para fomentar la precipitación del producto final, que luego se puede aislar por filtración y secar.

Preferiblemente, la mezcla se purifica por cromatografía, como se describe más adelante. Antes de la etapa de cromatografía, la mezcla de reacción puede concentrarse a presión reducida para recuperar el producto bruto, que luego se disuelve en un medio acuoso tal como agua, opcionalmente mediante la adición de una base tal como, por ejemplo, NH⁴OH 0,1N, para fomentar la solubilización completa a un pH comprendido entre 6 y 8, preferiblemente a pH de aproximadamente 7,3; la solución límpida se filtra preferiblemente en un filtro de 0,2 gm.

Purificación cromatográfica

De acuerdo con la invención, el producto bruto se purifica mediante RP-HPLC, por cromatografía de intercambio iónico o por ambas técnicas.

Típicamente, se prefiere la separación por RP-HPLC, ya que es más eficiente para separar el producto puro de los reactivos en exceso. Sin embargo, en los casos en que quedan trazas residuales de fosfolípido (III) en el producto final (típicamente más del 1 %), también se puede añadir o llevar a cabo, en alternativa, una etapa de purificación de intercambio iónico rápida y fiable. La purificación preparativa por HPLC de acuerdo con la invención se realiza preferiblemente en una columna preparativa C4 de fase inversa, eluida con una fase móvil que comprende sal AcONH4. En una realización las fases móviles están representadas por soluciones acuosas de AcONH 10 mM y AcONH410 mM /acetonitrilo 1/9, mezcladas en una composición de gradiente capaz de separar bien el producto del fosfolípido.

La purificación por intercambio iónico de acuerdo con la invención se realiza convenientemente en una resina intercambiadora de aniones, preferiblemente en una resina intercambiadora de aniones débil con grupos amina terciarios unidos a la matriz base. La separación del producto final del exceso de reactivos y otras impurezas se lleva a cabo mediante la selección de los tampones adecuados para la fase de fijación y elución. De acuerdo con la invención, se obtuvieron resultados óptimos utilizando una solución tampón Tris-HCl/NaCl a diferentes concentraciones de sal y a pH comprendido entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8, con la adición de un porcentaje de un disolvente tal como, por ejemplo, iPrOH.

La modulación de la concentración de sal en el tampón permite fijar el producto a la fase sólida, mientras se eluyen todos los subproductos, y posteriormente eluir y recoger el producto puro.

Este método útil para eliminar todas las trazas del fosfolípido (III) posibilita utilizar este reactivo incluso en un gran exceso durante la reacción de conjugación con el heterodímero (II).

Por lo tanto, como se describió ampliamente arriba, la presente invención permite un procedimiento más conveniente y fiable para la preparación de compuesto (I), con altos rendimientos y grado de pureza, que también puede ser aplicable a escala industrial.

De hecho, el producto obtenido con el presente procedimiento está sustancialmente libre de subproductos y de acuerdo con las especificaciones de pureza requeridas para su uso en la fabricación de agentes de contraste por ultrasonidos llenos de gas.

La presente invención se ilustrará ahora con ejemplos que no pretenden plantear limitación alguna a su alcance. Parte experimental

Materiales y Equipos

Disolventes tales como DMF y acetato de etilo siempre se utilizaron puros y secos para minimizar el tiempo de exposición al aire ambiente.

El acetato heterodímero (IV) fue proporcionado por Bachem (Bubendorf, Suiza). La sal de amonio DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²fue adquirida de Avanti Polar Lipids Inc. (EE.UU.).

La HPLC analítica de fase inversa se realizó en un sistema UFLC de SHIMADZU que consistía en un administrador de disolventes binarios UFLC, un controlador UFLC (CBM-20A) y un detector HPLC UV-VIS (SPD-20A). Los análisis se realizaron utilizando un gradiente lineal de fase A (AcONH4 10 mM en H²O) y fase B (AcONH4 10 mM en ACN/H²O 9/1) a 1,5 mL/min con detección UV a 214 nm. Se inyectaron 40 pL y la temperatura de la columna fue de 25 °C.

La RP-HPLC preparativa se realizó en un sistema preparativo Shimadzu que consistía en un administrador de disolventes binarios HPLC, un colector de fracción HPLC (FRC-10A), un controlador HPLC (SCL-10A) y un detector HPLC UV/VIS (SPD-10AV). El sistema estaba equipado con una columna Kromasil C4 de 300 Á (10 x 250 mm). La purificación se realizó eluyendo con un gradiente lineal de fase A (AcONH4 10 mM en H²O) y fase B (AcONH4 10 mM en ACN/H²O 9/1) a 5 mL/min con detección UV a 214 nm. Se inyectaron 3 mL y la temperatura de la columna fue de 25 °C.

La pureza del producto final ha sido analizada mediante un sistema Acquity™ Ultra Performance LC (Waters) equipado con detector TUV y una columna Acquity BEH fenilo de 1,7 pm (2,1 x 150 mm) o mediante un sistema LC Agilent 1100 equipado con detector de dispersión de luz UV y evaporativa (ELSD Sedex 85) y una columna Zorbax 300SB de 3,5 pm (3 x 150 mm).

Las abreviaturas de residuos de aminoácidos individuales son convencionales: por ejemplo, Asp o D es ácido aspártico, Gly o G es glicina, Arg o R es arginina. Los aminoácidos a los que se alude en esta memoria deben entenderse como de la configuración del isómero L, a menos que se indique lo contrario.

Lista de abreviaturas

AA, aa Aminoácido

ACN Acetonitrilo

AcOEt Acetato de etilo

Adoa Ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico

DIEA N,N-diisopropiletilamina

DMF Dimetilformamida

DSG Di(N-succinimidil)glutarato

DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)-2000]

ELSD Detector de dispersión de luz evaporativa

Eq. Equivalente

Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo

G Aceleración gravitacional

H2O Agua

HPLC Cromatografía líquida de alta resolución

iPrOH Alcohol isopropílico

mg Miligramo(s)

Min Minuto(s)

mL Mililitro(s)

mM Milimolar

Rt Tiempo de retención

TFA Ácido trifluoroacético

THF Tetrahidrofurano

TUV Ultravioleta sintonizable

UV Ultravioleta

Vol. Volumen

UPLC Cromatografía líquida de ultra rendimiento

Ejemplo 1: Preparación del compuesto intermedio (II)

Antes de la conjugación con el fosfolípido pegilado, el heterodímero (IV) se activó mediante el acoplamiento con un resto di(N-succinimidil)glutarato como agente de enlace. Se añadió una solución de acetato de heterodímero (49,08 mg) en 500 pL de DMF en porciones (7x70 pL) cada 2 minutos a una solución de disuccinimidil glutarato con DIEA (130 pL). Para evitar la condensación del dímero, se utilizó un exceso de DSG (5 eq.) y DIEA (5 eq.). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 min después de la última adición, el heterodímero activado se aisló y analizó por HPLC para confirmar la compleción de la reacción. Para estos análisis, se aplicaron las siguientes condiciones cromatográficas:

Columna: Phenomenex Luna 5 p C18 (250 x 4,6 mm)

Eluyente A: AcONH410 mM en H²O

Eluyente B: AcONH410 mM en H²O/ACN (1/9)

Caudal: 1,5 mL/min

Detector: UV 214 nm

Gradiente: del 25% al 52% de la fase móvil A

Tiempo de retención: 12,69 min

Ejemplo 2: Aislamiento del compuesto (II)

Se aisló el compuesto (II) obtenido en el ejemplo 1 para eliminar el exceso de DSG de la mezcla de reacción. La suspensión se concentró a presión reducida para eliminar DMF. El producto bruto seco se lavó con 10 mL de EtOAc y luego se centrifugó durante 3 min a 2500 g. El sobrenadante se decantó en un matraz de fondo redondo de 100 mL, mientras que el sólido se lavó dos veces con 15 mL de EtOAc y se secó a presión reducida, proporcionando 47,02 mg de un polvo blanco.

Ejemplo 3: Síntesis del compuesto (I)

La síntesis de compuesto (I) se realizó de acuerdo con la etapa reseñada en el Esquema 1. El progreso de la reacción se siguió utilizando HPLC analítica de fase inversa o UPLC con detector UV a 220 nm o detector ELSD.

Una muestra de sal de amonio DSPE-PEG ²⁰⁰⁰-NH²(18 pmol, 50,23 mg, 2 eq.) se disolvió en 300 pL de DMF anhidra y luego se añadió DIEA (2 eq.) para alcanzar un volumen total de 315 pL.

El compuesto (II) se solubilizó en 400 pL de DMF, luego se añadió en cinco porciones a la mezcla de DSPE-PEG ²⁰⁰⁰-NH²y DIEA y se dejó durante la noche con agitación.

Se recogió una parte alícuota para la monitorización analítica por HPLC y el perfil mostró un pico principal que eluye en un tiempo de retención de aproximadamente 12,5 min. A continuación, la mezcla se concentró a presión reducida, recuperando 105,5 mg de producto bruto. Primero se añadieron 5 mL de agua alcanzando un pH de 4,8; sin embargo, para obtener una solubilización completa y una solución límpida, se añadieron aproximadamente 20 gotas de NH⁴OH 0,1 N hasta alcanzar un pH de 7,3. Luego, la solución se filtró en 0.2 gm y se enjuagó para obtener un volumen final cercano a 9 mL listo para la purificación por HPLC preparativa.

Ejemplo 4: Purificación del compuesto (I) por RP-HPLC

La purificación por HPLC preparativa del producto bruto final (I) se ha realizado con la misma fase estacionaria que para la monitorización analítica de la reacción de acoplamiento. Por lo tanto, una columna Kromasil 10g 300 Á C4 (250 x 10 mm) se equilibró con AcONH410 mM en una mezcla de agua:acetonitrilo (1:9) antes de cargar la muestra dividida en 3 partes alícuotas (3 x 3 mL). En detalle, las fases líquidas y las condiciones de elución aplicadas para la purificación se reseñan a continuación:

Columna: Kromasil 10g 300 Á C4 (250 x 10 mm)

Eluyente A : AcONH410 mM en H²O

Eluyente B: AcONH410 mM en H²O/ACN (1/9)

Caudal: 5 mL/min

Vol. de inyección: 3,0 mL

Temperatura de la columna: 25 °C

Detector: UV 214 nm

Gradiente:

La recogida se realizó en fracciones de 10 mL que condujeron a 30 mL de producto purificado para cada tanda. Luego, los 90 mL obtenidos de las 3 tandas se concentraron a presión reducida eliminando la mayor parte del acetonitrilo antes de la liofilización. El producto final se recuperó en forma de un sólido blanco (51,6 mg) con un rendimiento del 69 % a partir del heterodímero (IV) de partida.

El análisis del producto (I) purificado, realizado con el método UPLC -UV, confirmó una pureza del 99 %. No se detectó traza alguna de DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²(véase la Figura 2).

Ejemplo 5: Purificación del compuesto (I) por cromatografía de intercambio iónico

Se ha optimizado un método de cromatografía de intercambio iónico con el fin de purificar adicionalmente el producto bruto (I) en caso de presencia de trazas de DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH².

Para tal fin, se utilizó una columna empaquetada con resina ANX Sepharose 4 fast flow (GE Healthcare) con los siguientes tampones:

- para la etapa de fijación: TrisHCl 0,05 M - NaCl 0,10 M - pH 7,5 iPrOH al 35 %

- para la etapa de elución: TrisHCl 0,05 M - NaCl 1,00 M - pH 7,5 iPrOH al 35 %

- para la etapa de desalación: TrisHCl 0,02 M pH 7,5

Dos muestras de compuesto (I) (soluciones A y B, que contenían respectivamente 0,5 mg y 1,5 mg de compuesto (I)) se cargaron en una columna ANX. Por separado, se realizó el mismo experimento con DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²(soluciones C y D, que contenían respectivamente 0,5 mg y 1,5 mg de DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²).

El análisis de las fracciones reveló que DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²eluía completamente con los dos primeros volúmenes de columna (CV, por sus siglas en inglés) con el tampón de fijación. Por otro lado, el compuesto (I) no se detectó dentro de las dos primeras fracciones, lo que significa que la separación podría ser efectiva, ya que uno está pasando directamente cuando el otro compuesto permanece fijado a la resina.

De hecho, después de pasar 4 CV de tampón de fijación en total, se introdujo el tampón de elución permitiendo que el compuesto (I) se recogiera en fracciones dentro de dos CV (véase la Tabla 1a, soluciones A y B). De nuevo, con el segundo experimento se confirmó que no eluía DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²después de la segunda fracción, incluso con tampón de elución (Tabla 1 b, soluciones C y D).

El conjunto de fracciones recogidas se hizo pasar a través de una columna de desalinización Sephadex G-25M antes de la liofilización.

T l 1 - R n i n l i n m I l i n A B n l l mn ANX

Tabla 1b - Retención elución de DSPE²⁰⁰⁰-NH²soluciones C D en columna ANX

Todas las fracciones se analizaron a través de un sistema 1100 LC/MSD (Agilent) y se cuantificaron a partir de un patrón de calibración utilizando un detector UV, para el compuesto (I), o un detector ELSD, para DSPE-PEG²⁰⁰⁰-NH²(III).

Referencias

1. Ferrara N. et al., "Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and Clinical Progress", Endocrine Reviews, 2004, 25(4), 581-611;

2. Veikkola T. et al., "Regulation of Angiogenesis via Vascular Endothelial Growth Factor Receptors", Cancer Res.,2000, 60, 203-212.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la preparación de compuesto (I), o sales farmacéuticamente aceptables del mismo,

en presencia de DIEA,

en donde dicho fosfolípido (III) está presente en exceso con respecto al compuesto (II).

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el acoplamiento se lleva a cabo con 1,1 o más equivalentes de fosfolípido (III) por equivalente de compuesto (II).

3. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que el acoplamiento se lleva a cabo con 2 equivalentes de fosfolípido (III) por equivalente de compuesto (II).

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende, además, las etapas de

(ii) aislar el producto bruto (I) recuperado de la mezcla de reacción de la etapa (i);

(iii) opcionalmente, diluir en agua el producto bruto obtenido en la etapa (ii) y añadir una base hasta alcanzar un pH comprendido entre 6 y 8; y

(iv) purificar el producto bruto de la solución de la etapa (iii).

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la solución de la etapa (iii) se lleva a un pH entre 7,0 y 7,5.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la purificación de la etapa (iv) se lleva a cabo mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC).

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la purificación de la etapa (iv) se lleva a cabo mediante cromatografía de intercambio iónico.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la purificación de la etapa (iv) se lleva a cabo tanto por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) como por cromatografía de intercambio iónico.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 u 8, en el que la purificación por RP-HPLC se realiza con una fase móvil que comprende la sal AcONH4.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la cromatografía de intercambio iónico se realiza con una resina de intercambio aniónico débil y una solución tampón a pH entre 7 y 8.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la solución de elución es el tampón TrisHCl 0,05 M NaCl 1,00 M iPrOH al 35 %.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto (II) se prepara por activación con di(W-succinimidil)glutarato del compuesto intermedio correspondiente de fórmula (IV)