KR20210106418A - 다이머 펩타이드-인지질 콘쥬게이트를 위한 최적화 과정 - Google Patents
다이머 펩타이드-인지질 콘쥬게이트를 위한 최적화 과정 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210106418A KR20210106418A KR1020217015727A KR20217015727A KR20210106418A KR 20210106418 A KR20210106418 A KR 20210106418A KR 1020217015727 A KR1020217015727 A KR 1020217015727A KR 20217015727 A KR20217015727 A KR 20217015727A KR 20210106418 A KR20210106418 A KR 20210106418A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- process according
- iii
- compound
- phospholipid
- purification
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title 1
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 26
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 37
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 27
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 22
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 13
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 12
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 12
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 6
- LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) pentanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- -1 succinimidyl ester Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000002961 echo contrast media Substances 0.000 abstract description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 23
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 14
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 12
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 5
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 5
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 5
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000004724 ultra fast liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000006427 angiogenic response Effects 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 1-[4-[6-amino-5-[(Z)-methoxyiminomethyl]pyrimidin-4-yl]oxy-2-chlorophenyl]-3-ethylurea Chemical compound CCNC(=O)Nc1ccc(Oc2ncnc(N)c2\C=N/OC)cc1Cl BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 0.000 description 1
- NWAGXLBTAPTCPR-UHFFFAOYSA-N 5-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O NWAGXLBTAPTCPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- GTFMAONWNTUZEW-UHFFFAOYSA-N glutaramic acid Chemical compound NC(=O)CCCC(O)=O GTFMAONWNTUZEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N glutaric acid Chemical compound OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical group 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
- A61K47/544—Phospholipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
- A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
- A61K49/223—Microbubbles, hollow microspheres, free gas bubbles, gas microspheres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
Abstract
본 발명은 치료 및 진단 조성물에 및 특히 초음파 조영제의 제조에 유용할 수 있는 식 (I)의 KDR-표적화 펩타이드-인지질 콘쥬게이트의 제조를 위한 새로운 효율적인 과정을 개시한다.
Description
본 발명은 치료 및 진단 조성물에 유용한 KDR-표적화 펩타이드-인지질 콘쥬게이트 분야, 및 특히 그것의 제조 방법에 관한 것이다.
혈관신생(Angiogenesis)은 기존의 혈관구조로부터 새로운 혈관의 형성을 나타내며 정상적인 생리적 과정에서뿐만 아니라 암, 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 당뇨병성 미세혈관 질환(diabetic microvascular disease)과 같은 질환의 발병에서도 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 혈관신생은 종양의 과형성으로부터 신생물 성장까지의 전이에 관여한다. 그러므로, 관련된 병리 과정의 억제는 치료 및 진단 암 연구에 매우 중요하다.
혈관신생 성장 인자가 혈관신생 억제제를 초과하여 생성될 때, 내피 세포는 증식하도록 자극된다. 알려져 있고 최상의 특성화된 전-혈관신생제 또는 성장 인자 중에서, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리, 특히 KDR (키나제 삽입 도메인 수용체, 또한 VEGFR-2 또는 Flk-1로도 알려져 있음)이 보다 풍부한 내피 세포 발현을 표시하고 혈관신생 반응을 지배하는 것으로 더 큰 관심을 받는 것들을 나타낸다1. KDR의 발현은 혈관신생 혈관, 특히 종양에서, 강력한 혈관신생 반응을 포함하여, 고도로 상향조절된다2.
생체내에서 KDR의 VEGF 결합 활성은 혈관신생에 중요하며, 따라서 그것의 내피 세포 상에서의 상향조절을 검출하는 능력 또는 VEGF/KDR 결합 복합체를 검출하는 능력은 혈관신생을 검출하거나 모니터링하는 데 매우 유익하게 될 것이다.
진단 및 치료 목적에 대해, 예컨대 예를 들면 혈관 및 내부 장기를 영상화하기 위해, 가스 충전된 초음파 조영제에 원하는 표적, 예컨대 KDR에 대한 높은 결합 친화도를 나타내는 임의의 표적화-벡터 조성물을 통합시키는 것이 특히 유익할 것이라는 것이 알려져 있다.
예를 들어, KDR-표적화 펩타이드-인지질 콘쥬게이트가 표적화된 가스 충전된 초음파 조영제를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
실제로 가스 충전된 초음파 조영제가 초음파검사를 위한 예외적으로 효율적인 초음파 반사기인 것은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 살아있는 신체의 혈류에 담체 액체 중의 가스 충전된 미세기포의 현탁액을 주입하는 것은 초음파 검사 영상화를 강력하게 강화시킬 것이고, 그로써 내부 해부학적 구조, 예컨대 혈관의 시각화를 도울 것이다.
표적 KDR, 또는 VEGF/KDR 복합체에 대해 높은 결합 친화도를 나타내는 표적화 벡터 조성물 중 하나는 예를 들어, 특허 출원 WO2007/067979 A2에서 처음으로 기술되고 KDR-발현 조직에 대해 높은 결합 능력을 나타낸 "펩타이드-인지질 (리포펩타이드)을 표적화하는" 콘쥬게이트인 다음의 화합물 (I)에 의해 표시된다.
본원에서 하기에 및 도 1에서 보다 상세하게 보고된 상기 화합물 (I)은 구조적으로, 둘 다 23개 아미노산인 2개의 상이한 모노머 펩타이드 사슬에 의해 형성되고, 글루타릴 링커에 의해 테더링되며, 제2 글루타릴 링커를 통해 DSPE-PEG2000-NH2와 같은 폴리에틸렌글리콜 모이어티 (PEG)와 콘쥬게이트된 헤테로다이머 펩타이드에 의해 구성된다.
KDR-결합 펩타이드-인지질 콘쥬게이트 (I)의 제조 방법은 WO2007/067979 A2 (상세한 설명에 대해서는 그 안에 기록된 실시예 5, 페이지 52-54, 및 도 4 참조)에 기술되어 있다.
콘쥬게이트는 펩타이드 모노머의 자동 고상 합성으로부터 시작하여, 이어서 석신이미딜 글루타레이트 (DSG)를 사용한 커플링 및 활성화, 및 얻어진 유도체의 글루타릴 결합을 통한 DSPE-PEG2000-NH2와의 후속 콘쥬게이션에 의해 제조된다.
마지막 콘쥬게이션 단계는 또한 다음 도식 1로 예시된다.
도식 1
상기 개시로부터, 콘쥬게이션 단계가 최종 생성물의 수율 및 순도의 관점에서 몇몇 결점을 암시하는 것이 나타난다 ([0063]: "any free phospholipid may complicate the purification and isolation of the final product" 참조). 실제로, 인지질 시약 DSPE-PEG2000-NH2 (III)은 최종 생성물 (I)로부터 공지의 정제 방법을 통해 분리하기 어렵고, 오염물의 형성 및 번거로운 정제의 필요성을 방지하기 위하여 석신이미딜-다이펩타이드 (II)와 관련하여 기본적으로 첨가된다 (DSPE-PEG2000-NH2와 석신이미딜-다이펩타이드 사이의 비율: 0.9 대 1 당량).
그러나, 이 접근법은, 비록 최종 생성물에서의 불순물을 제한하지만, 값비싼 헤테로다이머 (II)의 손실을 유발하고 60%보다 높지 않은, 또는 심지어 30%보다 높지 않은 콘쥬게이션 단계의 수율을 제공한다. 더욱이, WO2007/067979의 실시예 5에서 개시된 것과 같이, 예비 HPLC 정제 후의 최종 화합물은 여전히 거의 2%의 불순물을 보유하며, 의약품에 대해 당국이 설정한 필요조건에 준수하지 못하는 순도 프로파일을 가진다.
공지된 과정의 또 다른 결점은 가용화를 위해 합성 중에 및 예비 HPLC 정제를 위한 이동상에 첨가되는, 고함량의 트라이플루오로아세트산 (TFA)의 존재와 관련이 있다. 실제로, TFA가 제약학적으로 허용되지 않는 염인 것으로 간주되는 것 외에도, 생성물이 5℃에서 동결건조물의 형태로 또는 용액 중에 TFA 염으로서 보관될 때, WO2007/067979의 문단 [0065]-[0066]에서 기술된 것과 같이, 분해가 다이머 콘쥬게이트에서 인지질 지방산 에스테르 중 하나의 TFA-촉진된 산 가수분해에 의해 형성되어 분해-화합물(lyso-화합물)이 원치 않는 불순물로서 얻어질 가능성이 있는 것으로 관찰되었다. 그러므로, 또 다른 보다 안정적인 염으로 "다이머 펩타이드-인지질 콘쥬게이트의 TFA 염을 전환시키기" 위하여 추가의 부담스럽고 시간 소모적인 과정이 수행될 필요가 있다.
간단히 설명하면, 공지된 과정의 주요 문제점은 페길화된 인지질 (III)과의 콘쥬게이션 단계 중에 값비싼 헤테로다이머 (II)의 유해한 손실; 최종 생성물의 순도 및 수율을 손상시키는 어려운 정제 단계; 및 TFA 염으로서 얻어지고 보관되는 최종 생성물의 불안정성으로 대표된다.
그러므로 개시된 접근법은 꽤 효과적이긴 하지만, 매우 부담스러울 수 있고 타당하고 산업적으로 응용 가능한 방법을 나타내지는 않는다. 순도 및 제조 효율 파라미터 또한 충족되지 않는다.
반대로, 그러한 표적화 펩타이드-인지질 콘쥬게이트를 생체내에서 혈관 및 내부 장기의 영상화에 사용하기 위하여, 생성물의 고도로 정제된 형태의 대규모 제조를 위한 효율적인 방법을 갖는 것이 특히 유익할 것이다.
본 발명은 콘쥬게이션 및 정제 단계의 최적화된 조건을 특징으로 하는, 상기 정의된 펩타이드-인지질 화합물 (I)의 제조를 위한 새로운 과정을 제공한다. 이 과정은 가스 충전된 초음파 조영제의 제조에 특히 유용한 결과를 초래한다.
이런 맥락으로, 부산물로부터 최종 화합물의 분리를 현저하게 개선하고, 그로써 콘쥬게이션 중에 출발 물질 (III)의 양을 증가시키고, 전체 과정의 확장성에 유용한 최상의 순도 프로파일 및 적합한 안정성 프로파일을 가지는 화합물 (I)을 더 높은 수율로 얻는 것을 가능하게 하는 효율적인 분석 과정이 발견되었다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은
(i) 상응하는 석신이미딜 에스테르 중간체 (II):
를 DSPE-PEG2000-NH2 인지질 (III):
과 DIEA의 존재 하에 커플링시키는 단계를 포함하는,
화합물 (I):
또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염의 제조 과정이며,
여기서 상기 인지질 (III)은 화합물 (II)와 관련하여 과량으로 존재한다.
바람직한 구체예에서, 커플링은 화합물 (II)의 당량당 1.1 이상의 당량의 인지질 (III)로 수행된다.
보다 바람직한 구체예에서, 커플링은 화합물 (II)의 당량당 2당량의 인지질 (III)로 수행된다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 추가로:
(ii) 단계 (i)의 반응 혼합물로부터 회수된 미정제 생성물 (I)을 분리하는 단계;
(iii) 선택적으로 단계 (ii)에서 얻어진 미정제 생성물을 물에 희석하고 6 내지 8로 구성된 pH에 도달하도록 염기를 첨가하는 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 용액으로부터 미정제 생성물을 정제하는 단계
를 포함하는 상기 과정을 제공한다.
단계 (iii)에서 염기의 첨가는 용액의 pH를 6 내지 8로 유지하면서 물에서 미정제 생성물의 완전한 가용화를 용이하게 할 수 있다. 바람직하게, 6.5 내지 7.5의 pH, 보다 바람직하게는 pH 7.3에 도달하기 위하여 0.1 N의 NaOH의 적합한 양이 첨가된다.
발명에 따르면, 단계 (iv)의 정제는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 또는 RP-HPLC 및 이온 교환 크로마토그래피 둘 다에 의해 수행될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 정제는 RP-HPLC 정제에 의해서만 수행된다. 발명에 따르면, RP-HPLC에 의한 크로마토그래피 분리는 바람직하게 6 내지 8로 구성된 pH를 가지며 쉽게 제거될 휘발성 염을 포함하는 용리액을 사용하여 이루어진다. 최적의 이동상은 예를 들어 물 중의 10 mM AcONH4로 이루어지는 용리액 A, 물/아세토니트릴 1/9 중의 10 mM AcONH4로 이루어지는 용리액 B의 조합에 의해 표시될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 정제는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된다. 바람직하게, 그러한 크로마토그래피는 음이온 교환 수지 (예컨대 ANX 세파로스 수지) 및 바람직하게 7 내지 8의 pH에서 이온 크로마토그래피에 대해 일반적으로 사용되는 것들로부터 선택된 완충제 용액으로, 선택적으로 인지질 모이어티의 가용화를 개선시키는 물 혼화성 용매를 첨가하여 수행된다.
발명의 바람직한 구체예에 따르면, 정제는 용리액으로서 Tris·HCl/NaCl 완충액을 사용함으로써 성공적으로 수행된다. 적합한 크로마토그래피 분리는 예를 들어 0.05 M Tris·HCl + 0.10 M NaCl (pH 7.5) + 35% iPrOH를 고정화 완충액으로서 사용하고 0.05 M Tris·HCl + 1.00 M NaCl (pH 7.5) + 35% iPrOH를 용출 완충액으로서 사용함으로써 얻어진다.
발명의 추가의 측면에서, 다음의 도식 2 (단계 i')에서 나타낸 것과 같이, 화합물 (II)이 식 (IV)의 상응하는 중간체의 말단 알킬-아미노 모이어티의 다이(N-석신이미딜)글루타레이트 (V)로의 활성화에 의해 제조되는 상기 과정이 제공된다.
도식 2
그러므로 발명의 과정은 과량의 인지질 시약 DSPE-PEG2000-NH2 (III)의 사용을 특징으로 하며, 그것은 존재하는 모든 양의 활성화된 헤테로다이머 (II)와 반응하는데, 예컨대 후자의 값비싼 중간체의 어떠한 손실도 피하기 위해서이다. 커플링 단계 (i') 및 특히 (i)의 수율은 이제 이전에 알려진 과정으로 얻어진 것과 비교하여 유리하게 더 높다.
실제로, 이전의 방법은 TFA 염이 보다 안정적인 염으로 전환될 필요가 있는 다이머 펩타이드 인지질 콘쥬게이트의 60%보다 낮은 수율을 제공할 뿐이고, 따라서 최종 생성물의 효과적인 회수율을 한층 더 낮춘다.
반대로, 본 방법은 적어도 69%의 개선된 수율로 화합물 (I)을 얻는 것을 허용하며, 가장 중요하게, 원치 않는 불순물로부터의 최종 생성물의 분석적 분리 및 예비 정제 및 과잉 시약의 제거의 보다 효율적인 방법을 제공한다; 따라서, 최적화된 정제 조건은 RP-HPLC 후에 99%보다 큰 순도의 최종 생성물을 얻는 것을 가능하게 한다.
그러므로, 본 과정에 의해 제공된 여러 장점에 따르면, 화합물 (I)의 합성을 위한 새로운 과정은 이전에 개시된 과정의 결점을 해결하며 확장 및 산업적 제조에 특히 적합할 수 있다.
도 1은 발명에 따라제조된 화합물 (I)의 구조를 도시한다.
도 2는 최종 HPLC 정제 후의 화합물 (I)의 UPLC-ELSD 크로마토그램을 도시한다.
도 2는 최종 HPLC 정제 후의 화합물 (I)의 UPLC-ELSD 크로마토그램을 도시한다.
정의
본 설명에서, 그리고 다르게 제공되지 않는 한, 전술한 용어는 다음의 의미를 가지는 것으로 의도된다.
용어 "헤테로다이머"는 조성, 즉 그것의 아미노산 잔기의 순서, 수, 또는 종류가 상이한 2개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 분자를 나타낸다. 특히, 본원에서 그것은 상기에서 정의된 식 (I)의 화합물 또는 그것의 전구체 (II) 및 (IV)를 참조하여 언급된다.
용어 "페길화된"은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체 사슬에 공유 부착되는 분자를 나타낸다. 페길화된 화합물은 바람직하게는 반응성 모이어티가 있는 한 쪽 또는 양 말단에서의 기능화 후에, PEG의 반응성 유도체의 표적 분자와의 인큐베이션에 의해 이루어질 수 있다.
용어 "음이온 교환 고상"은 그것에 접촉하는 용액 또는 현탁액과 음이온의 교환을 수행할 수 있는 고체 지지체를 의미한다. 상기 접촉은 적절한 고상으로 패킹된 칼럼을 통한 용출에 의해 얻어질 수 있다.
구체예의 상세한 설명
본원에서 기술된 방법은 상기 정의된 식 (I)의 화합물의 제조에 관한 것이며, 최종 생성물을 고수율로 및 최적의 순도로 제공하면서 값비싼 출발 물질의 양을 절약하는 장점을 가진다.
이들 결과는 다른 것들 중에서도, 별도로 또는 함께 적용될 수 있고, 임의의 다른 바람직하지 못한 부산물과 함께, 커플링 단계 (i)에서 과량으로 첨가된 미반응 인지질 (III)의 효과적인 제거를 가능하게 하는, 2개의 효율적인 정제 방법의 발견에 의해 이루어질 수 있다.
WO2007/067979에서 기술된 합성 접근법에 따르면, 화합물 (I)의 제조는 예를 들어 알려져 있는 고상 합성 방법에 의해 제조된 상기 정의된 헤테로다이머 (IV)의 다이(N-석신이미딜)글루타레이트 (V)를 사용한 활성화 및 활성화된 헤테로다이머 (II)의 DSPE-PEG2000-NH2 (III)와의 후속 콘쥬게이션을 제공한다. 후자의 단계는, 상기에서 기술된 것처럼, 인지질 없이 수행되며, 따라서 커플링은 단지 빈약한 수율 결과로 이루어진다.
반대로, 본 발명에 의해 제시된 최적화된 과정은 하기에서 상세하게 기술되는 것과 같이 콘쥬게이션 단계의 현저한 개선을 제공한다.
헤테로다이머 (IV)는 예를 들어 WO2007/067979의 실시예 5 (문단 [00124])에 기록된 동일 과정을 따름으로써, 즉 헤테로다이머 전구체를 과량의 다이(N-석신이미딜)글루타레이트 및, DIEA와 같은 염기와, 예를 들어 헤테로다이머 축합을 피하기 위해 5배 과량의 두 반응물과 반응시킴으로써 활성화될 수 있다. 반응이 완료된 후, 혼합물은 적합한 용매, 예컨대 무수 에틸 아세테이트로 희석되어, 헤테로다이머 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르 (II)가 침전되고 그런 후 회수되어 세척되어 남아있는 미량의 반응물이 제거된다. 대안으로, 혼합물은 농축되어 용매가 제거되고 건조한 미정제물은 예를 들어 EtOAc로 세척되고, 원심분리되고, 플라스크로부터 고체가 회수된다.
인지질과의 커플링
발명에 따르면, 그리고 실험 파트에서 보다 상세하게 기술되는 바, 식 (II)의 화합물은 DMF에 용해된 과량의 DSPE-PEG2000-NH2 (III)와 염기, 예컨대 DIEA의 존재 하에서 인큐베이션된다. 헤테로다이머 전구체 (II)의 당량과 인지질 (III)의 당량 사이의 비율은 적어도 1:1.1이지만, 보다 알맞게는 1:1.1 내지 1:5로 구성된다. 바람직하게, 비율은 1:2이다.
커플링 반응의 완료는 분석 HPLC에 의해 모니터링될 수 있다.
생성물의 분리
미정제 생성물은 반응 혼합물의 농축 후에 수집될 수 있다. 예를 들어, 과잉 시약의 부분은 건조 미정제물의 적합 용매로의 세척 및 혼합물의 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 대안으로, 용매, 예컨대 에틸 아세테이트가 최종 생성물의 침전을 촉진하기 위하여 첨가될 수 있고, 그런 후 침전은 여과에 의해 분리되고 건조될 수 있다.
바람직하게, 혼합물은 하기 기술되는 것과 같이, 크로마토그래피에 의해 정제된다. 크로마토그래피 단계 전에, 반응 혼합물은 미정제 생성물을 회수하기 위해 감압 하에 농축되고, 그런 후 선택적으로 염기, 예를 들면 0.1 NH4OH의 첨가에 의해 물과 같은 수성 매질에 용해되어, 6 내지 8로 구성된 pH, 바람직하게는 약 7.3의 pH에서 완전한 가용화가 촉진된다; 지질 용액은 바람직하게 0.2 μm 필터 상에서 여과된다.
크로마토그래피 정제
발명에 따르면, 미정제 생성물은 RP-HPLC에 의해, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 또는 둘 다에 의해 정제된다.
전형적으로, RP-HPLC에 의한 분리는 그것이 과량의 시약으로부터 순수한 생성물을 분리하는 데 더 효율적이기 때문에 바람직하다. 그러나, 잔류하는 미량 (전형적으로 1% 이상)의 인지질 (III)이 최종 생성물에 남아 있는 경우에, 신속하고 믿을 수 있는 이온 교환 정제 단계가 또한 추가되거나 대안으로 수행될 수 있다.
발명에 따르는 예비 HPLC 정제는 바람직하게 역상 C4 예비 칼럼 상에서 수행되며, AcONH4 염을 포함하는 이동상으로 용출된다. 한 구체예에서 이동상은 인지질로부터 생성물을 잘 분리할 수 있는 구배 조성으로 혼합된, 10 mM AcONH4 및 10 mM AcONH4/아세토니트릴 1/9의 수용액으로 표시된다.
발명에 따르는 이온 교환 정제는 알맞게는 음이온 교환 수지 상에서, 바람직하게는 염기 매트릭스에 부착된 3차 아민기를 가진 약한 음이온 교환기 수지 상에서 수행된다. 과량의 시약 및 다른 불순물로부터 최종 생성물의 분리는 고정 및 용출 상에 적합한 완충액의 선택에 의해 수행된다. 발명에 따르면, 최적의 결과는 백분율의 용매, 예컨대 예를 들면 iPrOH를 첨가하면서, 염의 상이한 농도 및 약 7 내지 약 8로 구성된 pH에서 Tris-HCl/NaCl 완충액 용액을 사용함으로써 얻어졌다.
완충액 중의 염 농도의 조절은 모든 부산물을 용출시키는 한편 생성물을 고체상에 고정시키고, 계속해서 순수한 생성물을 용출시키고 수집할 수 있게 한다.
모든 미량의 인지질 (III)을 제거하기에 이 유용한 방법은 헤테로다이머 (II)와의 콘쥬게이션 반응 중에 과량으로도 이 시약을 사용하는 것을 가능하게 만든다.
그러므로, 상기에서 광범위하게 기술된 것과 같이, 본 발명은 또한 산업적 규모로 적용될 수 있는, 고수율 및 순도를 가진 화합물 (I)의 제조를 위해 보다 편리하고 신뢰할만한 과정을 가능하게 한다.
실제로, 본 과정으로 얻어진 생성물은 실질적으로 부산물이 없고 가스 충전된 초음파 조영제의 제조에 사용하기 위해 필요한 순도 사양과 일직선상에 있다.
본 발명은 이제 발명의 범주에 대해 어떠한 제한을 두는 것으로 의도되지 않은 실시예로 예시될 것이다.
실험 파트
물질 및 장비
DMF 및 에틸 아세테이트와 같은 용매는 항상 순수하고 건조된 것을 사용하여 주변 공기에 대한 노출 시간을 최소화하였다.
헤테로다이머 아세테이트 (IV)를 Bachem (Bubendorf, Switzerland)으로부터 제공받았다. DSPE-PEG2000-NH2 암모늄 염을 Avanti Polar Lipids Inc. (USA)로부터 구입하였다.
분석용 역상 HPLC를 UFLC 바이너리 용매 관리기, UFLC 제어기 (CBM-20A) 및 HPLC UV-VIS 검출기 (SPD-20A)로 이루어지는 SHIMADZU UFLC 시스템 상에서 수행하였다. 분석을 상 A (H2O 중의 10 mM AcONH4) 및 상 B (ACN/H2O 9/1 중의 10 mM AcONH4)의 선형 구배를 사용하여 1.5 mL/분으로 수행하였고, 214 nm에서 UV로 검출하였다. 40 μL를 주입하였고 칼럼 온도는 25℃였다.
예비 RP-HPLC를 HPLC 바이너리 용매 관리기, HPLC 분획 수집기 (FRC-10A), HPLC 제어기 (SCL-10A) 및 HPLC UV/VIS 검출기 (SPD-10AV)로 이루어지는 Shimadzu 예비 시스템 상에서 수행하였다. 시스템에는 Kromasil C4 300 Å (10x250 mm) 칼럼이 장착되어 있다. 정제를 상 A (H2O 중의 10 mM AcONH4) 및 상 B (ACN/H2O 9/1 중의 10 mM AcONH4)의 선형 구배로 1.5 mL/분으로 용출함으로써 수행하였고, 214 nm에서 UV로 검출하였다. 3 mL를 주입하였고 칼럼 온도는 25℃였다.
최종 생성물의 순도를 TUV 검출기 및 Acquity BEH 페닐 1.7 μm (2.1x150 mm) 칼럼이 장착된 AcquityTM 초성능 LC 시스템 (Waters)에 의해 또는 UV 및 증발용 광산란 검출기 (ELSD Sedex 85) 및 Zorbax 300SB 3.5 μm (3x150 mm) 칼럼이 장착된 Agilent 1100 LC 시스템에 의해 분석하였다.
개별 아미노산 잔기에 대한 약어는 관례적이다: 예를 들어, Asp 또는 D는 아스파르트산이고, Gly 또는 G는 글리신이며, Arg 또는 R은 아르기닌이다. 여기서 언급된 아미노산은 다르게 표시되지 않는 한 L-이성질체의 것인 것으로 이해되어야 한다.
약어의 목록
실시예 1: 중간체 (II)의 제조
페길화된 인지질과의 콘쥬게이션 전에, 헤테로다이머 (IV)를 연결제로서 다이(N-석신이미딜)글루타레이트 모이어티와의 커플링에 의해 활성화하였다.
500 μL DMF 중의 헤테로다이머 아세테이트 (49.08 mg)의 용액을 DIEA (130 μL)를 포함한 다이석신이미딜글루타레이트 용액에 2분마다 일부분씩 (7x70 μL) 첨가하였다. 다이머 축합을 피하기 위하여, 과량의 DSG (5 eq.) 및 DIEA (5 eq.)를 사용하였다. 마지막 첨가 후 실온에서 30분 동안 교반한 후, 활성화된 헤테로다이머를 분리하고 HPLC에 의해 분석하여 반응의 완료를 확인하였다. 이들 분석에 대해, 다음의 크로마토그래피 조건을 적용하였다:
칼럼: Phenomenex Luna 5μ C18 (250 x 4.6 mm)
용리액 A: H2O 중의 10 mM AcONH4
용리액 B: H2O/ACN (1/9) 중의 10 mM AcONH4
유량: 1.5 mL/분
검출기: UV 214 nm
구배: 25% 내지 52%의 이동상 A
보유 시간: 12.69분
실시예 2: 화합물 (II)의 분리
실시예 1에서 얻어진 화합물 (II)를 분리하여 반응 혼합물로부터 과량의 DSG를 제거하였다. 현탁액을 감압 하에 농축하여 DMF를 제거하였다. 건조한 미정제물을 10 mL의 EtOAc로 세척한 후 3분 동안 2500 g에서 원심분리하였다. 상층액을 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 조심스럽게 따른 후 고체를 15 mL의 EtOAc로 2회 세척하고 감압 하에 건조시켜서 47.02 mg의 백색 분말을 얻었다.
실시예 3: 화합물 (I)의 합성
화합물 (I)의 합성을 도식 1에서 나타낸 단계에 따라 수행하였다. 반응 진행을 220 nm에서 UV 검출기 또는 ELSD 검출기가 있는 분석용 역상 HPLC 또는 UPLC를 사용하여 따랐다.
단계 i)-iii) 생성물 (I)의 콘쥬게이션 및 분리
DSPE-PEG2000-NH2 암모늄 염 (18 μmol, 50.23 mg, 2 eq.)의 샘플을 300 μL의 무수 DMF에 용해시킨 후 DIEA (2 eq.)를 첨가하여 총 부피를 315 μL가 되게 하였다.
화합물 (II)를 400 μL의 DMF에 용해시킨 후, DSPE-PEG2000-NH2 및 DIEA의 혼합물에 5회 부분으로 나누어 첨가하고 밤새 교반하였다.
분석용 HPLC 모니터링을 위해 부분표본을 수집하였고 프로파일은 약 12.5분의 보유 시간에서 용출되는 주요 피크를 보였다. 그런 후 혼합물을 감압 하에 농축시켜서 105.5 mg의 미정제 생성물을 회수하였다.
5 mL의 물을 먼저 첨가하여 pH를 4.8에 도달하게 하였다; 그러나, 완전한 가용화 및 지질 용액을 얻기 위하여, 약 20 방울의 0.1 N NH4OH를 추가로 첨가하여 pH 7.3에 도달하게 하였다. 그런 후, 용액을 0.2 μm 상에서 여과하고 세정하여 9 mL에 가까운 최종 부피를 얻어 예비 HPLC 정제를 위해 준비하였다.
실시예 4: RP-HPLC에 의한 화합물 (I)의 정제
최종 미정제 생성물 (I)의 예비 HPLC 정제를 커플링 반응의 분석용 모니터링을 위한 것과 동일한 고정상을 사용하여 수행하였다. 그러므로, Kromasil 10μ 300 Å C4 칼럼 (250 x 10 mm)을 물:아세토니트릴 (1:9) 혼합물 중의 10 mM AcONH4로 평형화한 후 3개의 부분표본으로 나눈 샘플을 로딩하였다 (3x3 mL). 상세하게, 정제에 적용한 액체상 및 용출 조건은 하기와 같다:
칼럼: Kromasil 10μ 300 Å C4 (250 x 10 mm)
용리액 A: H2O 중의 10 mM AcONH4
용리액 B: H2O/ACN (1/9) 중의 10 mM AcONH4
유량: 5 mL/분
주입 부피: 3.0 mL
칼럼 온도: 25℃
검출기: UV 214 nm
구배:
수집을 10 mL 분획으로 수행하여 각각의 실행에 대해 30 mL의 정제 생성물을 얻었다. 그런 후, 3회 실행으로부터 얻어진 90 mL을 감압 하에 농축하여 동결건조 전에 대부분의 아세토니트릴을 제거하였다. 최종 생성물을 백색 고체 (51.6 mg)로서 회수하였고, 출발 헤테로다이머 (IV)로부터 69%의 수율이었다.
UPLC-UV 방법으로 수행한 정제된 생성물 (I)의 분석은 99%의 순도를 확인시켜주었다. 어떠한 미량의 DSPE-PEG2000-NH2도 검출되지 않았다 (도 2 참조).
실시예 5: 이온 교환 크로마토그래피에 의한 화합물 (I)의 정제
미량의 DSPE-PEG2000-NH2가 존재하는 경우에 미정제 생성물 (I)을 추가로 정제하기 위하여 이온 교환 크로마토그래피 방법을 최적화하였다.
이 목적을 위해 ANX 세파로스 4 고유속 수지 (GE Healthcare)로 패킹된 칼럼을 다음의 완충액과 함께 사용하였다:
- 고정 단계에 대해: 0.05 M Tris·HCl - 0.10 M NaCl - pH 7.5 + 35 % iPrOH
- 용출 단계에 대해: 0.05 M Tris·HCl - 1.00 M NaCl - pH 7.5 + 35 % iPrOH
- 탈염 단계에 대해: 0.02 M Tris·HCl pH 7.5
화합물 (I)의 두 샘플 (용액 A 및 B, 각각 0.5 mg 및 1.5 mg의 화합물 (I)을 함유함)을 ANX 칼럼 상에 로딩하였다. 별도로, 동일한 실험을 DSPE-PEG2000-NH2 (용액 C 및 D, 각각 0.5 mg 및 1.5 mg의 DSPE-PEG2000-NH2를 함유함)로 수행하였다.
분획 분석은 DSPE-PEG2000-NH2가 고정화 완충액으로 처음 2 칼럼 부피 (CV)로 완전하게 용출되었음을 나타냈다. 다른 한편으로 화합물 (I)은 처음 두 분획 내에서 검출되지 않았고, 이것은 다른 화합물이 수지에 고정된 채로 남아 있을 때 하나가 직접적으로 수지를 통해 통과하기 때문에 분리가 효과적일 수 있음을 의미한다.
실제로, 총 4 CV의 고정화 완충액이 통과한 후, 용출 완충액을 도입하여 화합물 (I)이 2 ㅊㅍ 내에서 분획으로 수집되도록 하였다 (표 1a, 용액 A 및 B 참조). 다시 말하명, 제2 실험으로, 용출 완충액을 사용하여도 제2 분획 후에 DSPE-PEG2000-NH2가 용출하지 않는 것을 확인하였다 (표 1b, 용액 C 및 D).
수집된 분획의 풀(pool)을 탈염 Sephadex G-25M 칼럼을 통해 통과시킨 후 동결건조하였다.
모든 분획을 1100 LC/MSD 시스템 (Agilent)을 통해 분석하였고 화합물 (I)의 경우 UV 검출기, 또는 DSPE-PEG2000-NH2 (III)의 경우 ELSD 검출기를 사용하여 보정 표준으로부터 정량화하였다.
참고문헌
1. Ferrara N. et al., "Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and Clinical Progress", Endocrine Reviews, 2004, 25(4), 581-611;
2. Veikkola T. et al., "Regulation of Angiogenesis via Vascular Endothelial Growth Factor Receptors", Cancer Res., 2000, 60, 203-212.
Claims (12)
- 화합물 (I):
, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염의 제조 방법으로서,
(i) 상응하는 석신이미딜 에스테르 중간체 (II):
를 DSPE-PEG2000-NH2 인지질 (III):
과, DIEA의 존재 하에서 커플링시키는 단계를 포함하며,
상기 인지질 (III)은 화합물 (II)와 관련하여 과량으로 존재하는 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 커플링은 화합물 (II)의 당량당 1.1 이상의 당량의 인지질 (III)로 수행되는 것을 특징으로 하는 과정.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 커플링은 화합물 (II)의 당량당 2 당량의 인지질 (III)로 수행되는 것을 특징으로 하는 과정.
- 제1항에 있어서,
(ii) 단계 (i)의 반응 혼합물로부터 회수된 미정제 생성물 (I)을 분리하는 단계;
(iii) 선택적으로 단계 (ii)에서 얻어진 미정제 생성물을 물에 희석하고 6 내지 8로 구성된 pH에 도달하도록 염기를 첨가하는 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 용액으로부터 미정제 생성물을 정제하는 단계
를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 과정. - 제4항에 있어서, 단계 (iii)의 용액은 7.0 내지 7.5의 pH로 만들어지는 것을 특징으로 하는 과정.
- 제4항에 있어서, 단계 (iv)의 정제는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 과정.
- 제4항에 있어서, 단계 (iv)의 정제는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 과정.
- 제4항에 있어서, 단계 (iv)의 정제는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 및 이온 교환 크로마토그래피 둘 다에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 과정.
- 제6항 또는 제8항에 있어서, RP-HPLC 정제는 AcONH4 염을 포함하는 이동상으로 수행되는 것을 특징으로 하는 과정.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 약한 음이온 교환기 수지 및 7 내지 8의 pH의 완충액 용액으로 수행되는 것을 특징으로 하는 과정.
- 제10항에 있어서, 용출 용액은 완충액 0.05 M Tris·HCl + 1.00 M NaCl + 35% iPrOH인 것을 특징으로 하는 과정.
- 제1항에 있어서, 화합물 (II)는 식 (IV)의 상응하는 중간체의 다이(N-석신이미딜)글루타레이트로의 활성화에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 과정:
.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18213539.2 | 2018-12-18 | ||
| EP18213539 | 2018-12-18 | ||
| PCT/EP2019/085459 WO2020127124A1 (en) | 2018-12-18 | 2019-12-16 | Optimized process for dimeric peptide-phospholipid conjugate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210106418A true KR20210106418A (ko) | 2021-08-30 |
Family
ID=65009520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217015727A KR20210106418A (ko) | 2018-12-18 | 2019-12-16 | 다이머 펩타이드-인지질 콘쥬게이트를 위한 최적화 과정 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11484596B2 (ko) |
| EP (1) | EP3897736B1 (ko) |
| JP (1) | JP7421554B2 (ko) |
| KR (1) | KR20210106418A (ko) |
| CN (1) | CN113164613A (ko) |
| BR (1) | BR112021008753A2 (ko) |
| CA (1) | CA3118523A1 (ko) |
| ES (1) | ES2930177T3 (ko) |
| IL (1) | IL284167A (ko) |
| SG (1) | SG11202104497VA (ko) |
| WO (1) | WO2020127124A1 (ko) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7666979B2 (en) | 2002-03-01 | 2010-02-23 | Bracco International B.V. | Methods for preparing multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications and methods of preparing the same |
| FI20050695A0 (fi) | 2005-06-30 | 2005-06-30 | Ctt Cancer Targeting Tech Oy | Menetelmä fosfolipidi-PEG-biomolekyyli-konjugaattien valmistamiseksi |
| MX2008007321A (es) * | 2005-12-09 | 2008-09-30 | Bracco Int Bv | Conjugados fosfolipido de vector dirigido. |
-
2019
- 2019-12-16 CA CA3118523A patent/CA3118523A1/en active Pending
- 2019-12-16 BR BR112021008753-2A patent/BR112021008753A2/pt unknown
- 2019-12-16 ES ES19817769T patent/ES2930177T3/es active Active
- 2019-12-16 WO PCT/EP2019/085459 patent/WO2020127124A1/en unknown
- 2019-12-16 KR KR1020217015727A patent/KR20210106418A/ko unknown
- 2019-12-16 US US17/413,333 patent/US11484596B2/en active Active
- 2019-12-16 EP EP19817769.3A patent/EP3897736B1/en active Active
- 2019-12-16 CN CN201980077130.6A patent/CN113164613A/zh active Pending
- 2019-12-16 JP JP2021533554A patent/JP7421554B2/ja active Active
- 2019-12-16 SG SG11202104497VA patent/SG11202104497VA/en unknown
-
2021
- 2021-06-17 IL IL284167A patent/IL284167A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20220202944A1 (en) | 2022-06-30 |
| WO2020127124A1 (en) | 2020-06-25 |
| BR112021008753A2 (pt) | 2021-08-10 |
| EP3897736A1 (en) | 2021-10-27 |
| JP2022512406A (ja) | 2022-02-03 |
| SG11202104497VA (en) | 2021-05-28 |
| EP3897736B1 (en) | 2022-10-12 |
| CA3118523A1 (en) | 2020-06-25 |
| US11484596B2 (en) | 2022-11-01 |
| CN113164613A (zh) | 2021-07-23 |
| ES2930177T3 (es) | 2022-12-07 |
| JP7421554B2 (ja) | 2024-01-24 |
| IL284167A (en) | 2021-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7387440B2 (ja) | Ｍｔ１－ｍｍｐに結合するためのペプチドリガンド | |
| JP6942147B2 (ja) | Ｍｔ１−ｍｍｐに対して特異的な二環式ペプチド−毒素コンジュゲート | |
| JP2020079262A (ja) | 新規リンカー、その製造方法およびその応用 | |
| WO2021080008A1 (ja) | １価ｃｃａｐ生成物の製造方法 | |
| KR20110025731A (ko) | 에리트로포이에틴 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이의 용도 | |
| JP2021528430A (ja) | Ｐｓｍａに結合するためのペプチドリガンド | |
| CN112585157A (zh) | 用于结合整联蛋白αvβ3的肽配体 | |
| US11484605B2 (en) | Cysteine modified antibody-drug conjugate and preparation method thereof | |
| US20160168210A1 (en) | Derivatives of collagen-binding hairpin peptides | |
| KR20210106418A (ko) | 다이머 펩타이드-인지질 콘쥬게이트를 위한 최적화 과정 | |
| JP2021528431A (ja) | Ｉｌ−１７に結合するためのペプチドリガンド | |
| RU2784866C1 (ru) | Оптимизированный способ получения димерного пептид-фосфолипидного конъюгата | |
| US20120116027A1 (en) | Process for the purification of human growth hormone polypeptides using affinity resins comprising specific ligands | |
| US11833219B2 (en) | Method for producing antibody-drug conjugate intermediate by addition of acid and use thereof | |
| JP2000510839A (ja) | 触媒イミダゾール（例えばヒスチジン）機能を有する触媒を使用した安定化変遷複合体を用いたアシル移行 | |
| WO2024029242A1 (ja) | 新規ｌｒｐ１結合ペプチド | |
| WO2023054712A1 (ja) | ペプチド | |
| WO2022097500A1 (ja) | ペプチド架橋剤及び当該架橋剤で架橋された架橋ペプチド | |
| CN117007562A (zh) | 一种复合物及其用途 | |
| CN116710138A (zh) | 肽交联剂以及通过该交联剂交联的交联肽 | |
| WO1992019644A1 (en) | Vasorelaxant peptide |