CN117007562A - 一种复合物及其用途 - Google Patents

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代道国
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Abstract

本申请涉及一种由血清白蛋白或其部分和花菁染料分子形成的复合物及其制备方法和用途。本申请还涉及包含所述复合物的试剂盒，一种靶向细胞的方法，以及所述复合物或试剂盒在荧光分子成像中的应用。与现有技术相比，本申请制备的复合物：(1)具有较高的荧光强度；(2)在注射入体内后主要进入肾脏，通过肾脏快速代谢；与现有的有机探针相比，在体内药代动力学性质明显改善；和/或(3)对细胞有更强的靶向性和富集作用，可用于手术中的导航(例如，可以用于淋巴结手术导航)。

Description

一种复合物及其用途
技术领域
本申请涉及一种由白蛋白或其部分和花菁染料分子形成的复合物及其制备方法和用途。本申请还涉及包含所述复合物的试剂盒，一种靶向细胞的方法，以及所述复合物或试剂盒在荧光分子成像中的应用。
背景技术
近红外荧光成像技术是最重要的生物医学成像手段之一，有较多的探针选择，并且通过无毒害的光照射进行活体成像，极大地提升了成像的便利性并降低了机体损伤和潜在危害，同时由于它不依赖于图层重建模拟，因此可进行实时、广域、较高分辨率的图像采集，具有灵敏度高、成像速度快、安全性高、费用低等突出优势，在临床导航手术等方面广泛应用。
近红外二区(NIR-II)成像具有深度组织的高穿透性和高信噪比，是荧光成像的研究前沿和引领性技术。目前的NIR-II荧光探针主要包括无机探针和有机探针两种，无机探针一般量子产率高，但多数生物毒性较大；有机探针通常生物相容性较好，但多存在量子产率低或药代动力学不良等缺点。难以获得同时具有高量子产率、良好的生物相容性和药代动力学性质、易于编辑和修饰等特点的NIR-II探针，以易于临床转化应用。
中国专利申请CN 110201191 A中公开了一种功能性蛋白质和花菁染料分子的复合物及其制备方法和应用，该发明提供了一种新的方法，利用功能性蛋白与花菁染料分子相互作用提升量子产率和生物相容性。但是，该方法制备的探针量子产率仍然不够，药代动力学性质单一，难以应用于肿瘤、淋巴结等多种成像场景。
因此，仍然需要开发可以调节的一系列荧光量子产率高、蛋白外壳可编辑、生物相容性好、易于临床转化、应用范围广的NIR-II荧光探针。
发明内容
为了解决上述问题，本申请的发明人将白蛋白的部分或所述部分的多聚体与花菁染料分子制备成复合物，还可以进一步对其进行改造，使其能够更好的靶向目的细胞，并测试其做为荧光探针的潜力，由此完成了本发明。
在第一方面，本申请提供了一种复合物，其由白蛋白的部分或所述部分的多聚体与花菁染料分子共价结合形成；
所述白蛋白的部分选自白蛋白第三结构域，白蛋白第三结构域的突变体，白蛋白第三结构域a亚基，或白蛋白第三结构域a亚基的突变体；所述多聚体是白蛋白第三结构域的多聚体。
在某些实施方案中，所述白蛋白是哺乳动物血清白蛋白。
在某些实施方案中，所述白蛋白是人血清白蛋白。
在某些实施方案中，所述第三结构域由人血清白蛋白的第384-585位氨基酸残基组成。
在某些实施方案中，所述人血清白蛋白的第三结构域具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述复合物是由所述白蛋白亚基或其变体上的巯基与所述花菁染料分子上的反应性基团(例如Cl-或Br-)通过亲核取代形成的。
在某些实施方案中，所述巯基位于SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中第93位氨基酸残基上。
在某些实施方案中，所述复合物包含的白蛋白亚基或其变体与所述花菁染料分子的摩尔比为1：5至5：1。
在某些实施方案中，所述复合物包含的白蛋白亚基或其变体与所述花菁染料分子的摩尔比为1：5，1：3，1：1，3：1或5：1。
在一些实施方式中，花菁染料分子与血清白蛋白共价连接，例如共价结合。在一些实施方式中，花菁染料分子含有反应性基团(例如，Br，Cl)以使其与白蛋白连接。在一些实施方式中，花菁染料分子的反应性基团与血清白蛋白的连接基团(如巯基、硫醇、羟基、羧基或氨基)反应，在所述花菁染料分子和血清白蛋白之间形成连接。在一些实施方式中，血清白蛋白分子的连接基团是巯基。因此，在一些实施方式中，所述花菁染料分子与血清白蛋白的巯基共价结合。
在某些实施方案中，所述复合物由白蛋白第三结构域的多聚体与花菁染料分子共价结合形成。
在某些实施方案中，所述多聚体是三聚体。
在某些实施方案中，所述多聚体中，多个(例如三个)白蛋白第三结构域之间由接头连接。
在某些实施方案中，所述接头的序列选自SEQ ID NO:8或9。
在某些实施方案中，所述三聚体具有如SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述复合物包含的多聚体与所述花菁染料分子的摩尔比为1：3。
在某些实施方案中，所述复合物由白蛋白第三结构域与花菁染料分子共价结合形成。
在某些实施方案中，所述白蛋白第三结构域与所述花菁染料分子的摩尔比为1：1。
在某些实施方案中，所述复合物由白蛋白第三结构域的亚基与花菁染料分子共价结合形成，所述白蛋白第三结构域的亚基由人血清白蛋白第381-494位氨基酸组成。
在某些实施方案中，所述白蛋白第三结构域的亚基具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述白蛋白第三结构域的亚基与所述花菁染料分子的摩尔比为1：1。
在某些实施方案中，所述花菁染料分子具有选自下列任意一种骨架结构：
骨架1
骨架2
骨架3
骨架4
在某些实施方案中，所述花菁染料分子具有选自下列任意一种结构：
或以上结构中将骨架中的Cl替换为F、Br或I获得的结构；或者
或以上结构中将骨架中的Cl替换为F、Br或I获得的结构；
或者
在某些实施方案中，所述复合物上还共价连接有一个或多个靶向分子。
在某些实施方案中，所述靶向分子为多肽或非氨基酸类小分子。
在某些实施方案中，所述多肽选自RGD肽，奥曲肽(Octreotate)，血管内皮生长因子(VEGF)，OVA肽，或其任何组合。
RGD肽是指含有由Arg-Gly-Asp三个氨基酸组成的序列多肽，可以是直线肽或环肽。它们是许多细胞外基质蛋白(如VN、FN、FGN、胶原等)等最小识别短肽序列。可通过商购或合成获得RGD三肽、四肽、五肽等。示例性的RGD肽的序列参见SEQ ID NO:13。
奥曲肽是一种人工合成的生长抑素(somatostatin，SST)类似物。生长抑素受体(somatostatin receptor，SSTR)在多种肿瘤组织内高密度、高亲和力表达，与正常组织相比，肿瘤组织及其转移灶中SSTR表达水平高，与生长抑素(somatostatin，SST)及其类似物的亲和力大，可以作为肿瘤诊断和治疗分子水平的新的靶物质。奥曲肽性质与SST相似，因而可作为药物递送系统的主动靶向分子。
血管内皮生长因子(VEGF)及其受体的表达增加与肿瘤生长中的血管生成有关，通过VEGF靶向其受体为肿瘤选择性成像提供了潜在的靶点。
OVA肽是OVA(卵清蛋白)上的一段肽。OVA上的257-264位肽可作为模式抗原。
在某些实施方案中，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12或SEQID NO:13。
在某些实施方案中，所述非氨基酸类小分子是PSMA-617，CAS为1702967-37-0，分子式为C49H71N9O16，结构式如下：
在另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含至少1个如前所述的复合物；任选的，所述试剂盒还包含选自下列的任意一项或多项：抗体，引物，用于固定和/或透化细胞的试剂，或其任意组合。
在另一方面，本申请提供了一种制备如前所述的复合物的方法，所述方法包括：使所述白蛋白亚基或其变体与所述花菁染料分子在常温或加热条件下发生反应。
在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
步骤1：获得溶液A：包含所述白蛋白亚基或其变体的溶液，并获得溶液B：包含所述花菁染料分子的溶液；
步骤2：在涡旋条件下，将溶液A与溶液B混合；
步骤3：使混合后的溶液在常温或加热条件下保持一段时间，形成所述复合物。
在某些实施方案中，所述溶液A是包含所述白蛋白亚基或其变体的PBS缓冲液。
在某些实施方案中，所述溶液A中，所述白蛋白亚基或其变体的浓度为1μM-1mM(例如1μM-10μM、10μM-50μM、50μM-100μM、100μM-500μM、500μM-800μM或800μM-1mM)。
在某些实施方案中，所述溶液B是包含所述花菁染料分子的DMSO溶液。
在某些实施方案中，所述溶液B中，所述花菁染料分子的浓度为0.1mM-100mM(例如0.1mM-1mM、1mM-10mM、10mM-50mM或50mM-100mM)。
在某些实施方案中，所述白蛋白亚基或其变体与所述花菁染料分子的摩尔投料比为10：1至1:10(例如10:1、10:2、10:3、10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10)。
在某些实施方案中，步骤2中的混合是涡旋混合。
在某些实施方案中，步骤3中的加热条件为20℃-70℃(例如20℃-30℃、30℃-40℃、40℃-50℃、50℃-60℃或60℃-70℃)。
在某些实施方案中，步骤3中的时间为5min-15min(例如5min、10min或15min)。
在某些实施方案中，所述方法还包括步骤4：对所述复合物进行修饰。
在某些实施方案中，所述修饰包括将一个或多个靶向分子共价连接至所述复合物包含的所述白蛋白的部分或所述部分的多聚体。
在某些实施方案中，所述靶向分子为多肽或非氨基酸类小分子。
在某些实施方案中，所述多肽选自RGD肽，奥曲肽Octreotate，VEGF，OVA肽或其任何组合。
在某些实施方案中，所述非氨基酸类小分子是PSMA-617。
在某些实施方案中，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12或SEQID NO:13。
在某些实施方案中，所述修饰包括以下步骤：
步骤(1)：获得马来酰亚胺基团修饰的复合物，并获得巯基修饰的靶向分子，
步骤(2)：通过马来酰亚胺基团与巯基的共价结合，将所述靶向分子连接至所述复合物。
在某些实施方案中，步骤(1)中，通过使所述复合物包含的所述白蛋白亚基或其变体与马来酰亚胺-(聚乙二醇)n-羟基琥珀酰亚胺酯反应，获得所述马来酰亚胺基团修饰的复合物。
在某些实施方案中，所述马来酰亚胺-(聚乙二醇)n-羟基琥珀酰亚胺酯为马来酰亚胺-(聚乙二醇)2-羟基琥珀酰亚胺酯。
在某些实施方案中，步骤(1)包括：将所述复合物与马来酰亚胺-(聚乙二醇)n-羟基琥珀酰亚胺酯以1：20至1：1(例如，1：20，1：15，1：10，1：5，1：1)的摩尔投料比混合并在室温下反应。
在某些实施方案中，步骤(2)包括：将马来酰亚胺基团修饰的复合物和巯基修饰的靶向分子以1：20至1：1(例如，1：20，1：15，1：10，1：5，1：1)的摩尔投料比混合并常温孵育。
在另一方面，本申请提供了一种靶向细胞的方法，所述方法包括将如前所述的复合物与所述细胞接触；任选地，在接触后，对所述细胞进行激光照射，以获得所述细胞的成像。
在某些实施方案中，所述复合物通过与所述细胞上表达的细胞表面分子、细胞表面蛋白或细胞表面受体的结合以靶向所述细胞。
在某些实施方案中，所述细胞选自干细胞、增殖性细胞、增生中的细胞、炎性细胞、负调节免疫细胞、被病原体感染的细胞、神经元、脂肪细胞或脂细胞。
在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、T细胞/组织细胞的富B细胞淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤，脊轴肿瘤，脑干神经胶质瘤。
在某些实施方案中，所述细胞存在于组织或活体生物中。
在另一方面，本申请提供了如前所述的复合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于靶向细胞，或者用于获得细胞的成像。
在某些实施方案中，所述复合物通过与所述细胞上表达的细胞表面分子、细胞表面蛋白或细胞表面受体的结合以靶向所述细胞。
在某些实施方案中，所述细胞选自干细胞、增殖性细胞、增生中的细胞、炎性细胞、负调节免疫细胞、被病原体感染的细胞、神经元、脂肪细胞或脂细胞。
在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、T细胞/组织细胞的富B细胞淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤，脊轴肿瘤，脑干神经胶质瘤。
在某些实施方案中，所述细胞存在于组织或活体生物中。
在另一方面，本申请提供了一种成像方法，所述方法包括以如前所述的复合物作为成像显像剂。
在某些实施方案中，所述成像为近红外二区(NIR-II)荧光成像。在某些实施方案中，所述近红外二区的波长为1000-1700nm(例如1000-1100nm、1100-1200nm、1200-1300nm、1300-1400nm、1400-1500nm、1500-1600nm或1600-1700nm)。
在某些实施方案中，所述成像方法为细胞、组织或活体生物的荧光成像。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“野生的人血清白蛋白”是指具有生物学活性的、天然存在的人血清白蛋白。可方便地从各种公共数据库(例如，GenBank数据库)获得野生的人血清白蛋白的氨基酸序列。在某些实施方案中，人血清白蛋白的GenBank数据库编号为AEE60908.1。
如本文中所使用的，术语“半胱氨酸”又可简称为“Cys”，是生物体内常见的氨基酸。半胱氨酸是组成蛋白质的20多种氨基酸中惟一具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸。
如本文中所使用的，术语“巯基”，又称氢硫基或硫醇基，是由一个硫原子和一个氢原子相连组成的负一价官能团，其化学式为-SH。
如本文中所使用的，术语“蛋白质三级结构”是指蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上进一步盘曲或折叠成具有一定规律的三维空间结构。
如本文中所使用的，术语“蛋白质四级结构”是指具有两条或两条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。
如本文中所使用的，术语“亚基(subunit)”是指蛋白质四级结构中每一条具有独立三级结构的多肽链。
如本文中所使用的，术语“结构域(domain)”是指构成蛋白质三级结构的基本单元，其具有独特的空间构象。通常，在空间上可以明显的区分蛋白质不同的结构域。在某些实施方案中，当蛋白质由多条多肽链组成时，所述蛋白质的结构域包含多个亚基。
发明的有益效果
与现有技术相比，本申请制备的复合物具有以下有益效果：
(1)具有较高的荧光强度；
(2)在注射入体内后主要进入肾脏，通过肾脏快速代谢；与现有的有机探针相比，在体内药代动力学性质明显改善；和/或
(3)对细胞有更强的靶向性和富集作用，可用于手术中的导航(例如，可以用于淋巴结手术导航)。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例1中人血清白蛋白第一结构域(DI)、第二结构域(DII)和第三结构域(DIII)分别与花菁染料IR-783复合后荧光增强的比较结果，其中，图1a为NIR-I窗口的结果，图1b为NIR-II窗口的结果，图1c显示了构建的表达第三结构域(DIII)的质粒中插入片段的结构。
图2显示了重组蛋白DIII及其与花菁染料IR-783的复合物的超高分辨率LC-MS的表征结果，其中，图2a为IR-783与DIII在室温下形成复合物后的超高分辨率LC-MS结果，图2b分别为游离的DIII和IR-783与DIII在室温下形成复合物后的LC-MS结果。
图3显示了含氯基团的花菁染料和蛋白质残基之间的亲核取代反应位点的鉴定，其中，图3a为鉴定亲核取代反应位点的过程，图3b为人血清白蛋白第三结构域(DIII)上的4种酶切位点，图3c图3d和图3e为质谱表征结果。
图4显示了重组蛋白DIII及其与花菁染料IR-780，IR-820，ICG复合的LC-MS的表征结果，其中，图4a为重组蛋白DIII的超高分辨率LC-MS结果，图4b为IR-783与DIII在室温下形成复合物后的超高分辨率LC-MS结果，图4c为IR-820与DIII在室温下形成复合物后的超高分辨率LC-MS结果，图4d为未含Cl-的染料ICG(作为对照)的超高分辨率LC-MS结果，显示了未含Cl-的染料ICG未与重组蛋白DIII发生亲核取代反应。
图5显示了白蛋白(BSA和HSA)与含Br-基团花菁染料和含Cl-基团花菁染料(IR-783)复合后在NIR-II窗口的荧光检测结果，其中，图5a为在NIR-II荧光成像下对游离BSA、游离IR-783、IR-783@BSA、Br-dye@BSA、Br-dye@HSA进行凝胶电泳分析的结果；图5b为量化的图5c；图5c为游离Br-dye、游离IR-783(Cl-dye)、Br-dye@BSA和IR-783@BSA的NIR-II成像结果。
图6显示了实施例2中不同花菁染料与人血清白蛋白第三结构域(DIII)复合后荧光增强的测试结果，其中，图6a为IR-12N3、DiR、HITC-1、IR-26、IR-1048、IR-1061、IRdye800cw、cy7、cy7.5、ICG、IR-780、IR-783、IR-140、IR-820、IR-830和IR-775的测试结果，图6b为图6a中IR-12N3、DiR、HITC-1、IR-26、IR-1048、IR-1061、IRdye800cw和cy7的测试结果的放大图。
图7显示了实施例5中人血清白蛋白第三结构域(DIII)和花菁染料IR-783复合物的修饰与鉴定结果，其中，图7a显示了通过对复合物IR-783@DIII进行修饰得到复合物IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII-PSMA-617的过程，以及复合物IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII-PSMA-617的NIR-II成像结果；图7b从左到右依次为：(1)图7a中复合物IR-783@DIII-TATE中TATE部分的结构放大图，(2)图7a中复合物IR-783@DIII-PSMA-617中PSMA-617部分的结构放大图；图7c和7d分别为复合物IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII-PSMA-617的的高分辨率LC-MS表征结果。
图8显示了实施例6中复合物IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII修饰靶向分子前后对细胞的成像和富集效果。
图9显示了实施例6中修饰了靶向分子的复合物在小鼠肿瘤模型中对肿瘤组织的成像和富集效果，图9a显示了IR-783@DIII-TATE实验组小鼠在5min、30min、1h、2h、3h、6h、8h的近红外二区荧光图像；其中，Tu代表tumor(肿瘤)，Li代表liver(肝脏)、Bl代表bladder(膀胱)、Supine代表仰卧(NIR-II图像的小鼠是仰卧姿势)；图9b显示了12h时IR-783@DIII-TATE(实验组)和IR-783@DIII在小鼠各器官的富集情况；图9c显示了PC3-PIP荷瘤小鼠和PC3荷瘤小鼠在12h的近红外二区荧光图像。
图10显示了实施例7中人血清白蛋白第三结构域(DIII)、人血清白蛋白第三结构域a亚基(DIIIa)和人血清白蛋白第三结构域b亚基(DIIIb)与花菁染料形成的复合物过程及结果，其中，图10a显示了构建的表达第三结构域亚基(DIIIa)的质粒中插入片段的结构，图10b显示了人血清白蛋白第三结构域(DIII)、人血清白蛋白第三结构域a亚基(DIIIa)和人血清白蛋白第三结构域b亚基(DIIIb)与花菁染料形成的复合物的荧光增强效果。
图11显示了实施例8中三聚DⅢ(TDⅢ)的结构，以及DIII,HSA,BSA和TDIII分别与IR-783复合后的荧光增强效果，其中，图11a为三聚DⅢ(TDⅢ)的三维结构图，图11b为染料、HSA与染料的复合物，TDIII1与染料的复合物，以及TDIII2与染料的复合物的凝胶结果，图11c显示了IR-783分别与DIII、TDIII、血清白蛋白(albumin)在摩尔比为0.25:1,0.5:1,0.75:1,1:1,1.5:1,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,8:1和16:1的条件下形成复合物的荧光强度的折线图，横坐标为染料与蛋白的比例，纵坐标为荧光强度；图11d显示了IR-783与DIII、TDIII、血清白蛋白(albumin)在摩尔比为0.25:1,0.5:1,0.75:1,1:1,1.5:1,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,8:1和16:1的条件下形成复合物的荧光强度的柱形图，横坐标为荧光强度，纵坐标为四个复合物的中染料与蛋白的比例。
图12显示了复合物IR-783@TDⅢ在脑血管成像和淋巴系统NIR-II成像中的应用，其中，图12a为IR-783@TDIII对剃光的小鼠头部颅骨和脑皮肤下方的血管进行NIR-II高倍(2.5×)成像的记录，图12b显示了图像中的五个选定的血管上感兴趣区域(ROI)的血管肌肉比，图12c显示了通过2.5倍NIR-II成像描绘了先天性淋巴水肿小鼠的变异扭曲结点和异常增多的淋巴分支(白色箭头显示腹股沟淋巴结周围淋巴管的曲折形态，黄色箭头显示水肿淋巴结)。
图13显示了复合物IR-783@TDⅢ与IR-783@HSA对淋巴结成像的亮度比较，其中，图13a为对淋巴结进行成像的示意图，从小鼠左、右脚垫分别注射IR-783@TDIII和IR-783@HSA；图13b为对脱完毛小鼠的13a成像窗口进行持续激光照射的NIR-II成像；图13c显示了对应的IR-783@TDIII和IR-783@HSA感兴趣区域(ROI)在持续激光照射下荧光强度随时间的变化，上方曲线为IR-783@TDIII，下方曲线为IR-783@HSA。
图14显示了IR-783@DIII-cRGD复合物的表征结果，其中，图14a和图14b显示了通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，验证了DIII-cRGD的成功合成；图14c为游离染料IR-783、IR-783@HSA、IR-783@DIII、IR-783@DIII-cRGD的NIR-II荧光图像；图14d为量化的图14c不同样品对应的荧光强度；将IR-783@DIII-cRGD与U87细胞共孵育不同的时间，图14e是通过流式细胞术监测的结果。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
注：表1的SEQ ID NO:10中具有下划线的氨基酸序列代表“接头1”的氨基酸序列；表1的SEQ ID NO:11中具有下划线的氨基酸序列代表“接头2”的氨基酸序列。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.白蛋白第三结构域与花菁染料IR-783的复合
1、人血清白蛋白第一结构域(DI)、第二结构域(DII)、第三结构域(DIII)重组蛋白的制备：
重组蛋白DI由人血清白蛋白1-195位氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)组成，重组蛋白DII由人血清白蛋白196-383位氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)组成，重组蛋白DIII由人血清白蛋白384-585位氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)组成。在DI/DII/DIII基因序列下游加入GST-tag基因表达序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)，在tag和DI/DII/DIII之间插入一个凝血酶裂解位点(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)基因表达序列，便于纯化重组蛋白DI/DII/DIII。将上述的序列分别插入pPIC9质粒(Addgene,#163143)中以构建重组质粒(以DIII为例，质粒的插入片段的结构如图1c所示)，构建好的pPIC9K-DI/DII/DIII重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中，挑选单克隆菌株，经PCR鉴定以及测序鉴定确定阳性载体菌株。提取表达质粒，分别用XhoI、EcoR1酶切线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞。然后进行诱导表达，经过表达条件优化后，检测重组蛋白的表达产量，选取表达量较高的菌株作为表达菌。
接种重组蛋白DI/DII/DIII的表达工程菌于10ml BMMD培养基(2％w/v葡萄糖)中，200rpm，30℃摇动培养48h，然后取4ml培养物接种到2×200ml BMMD培养基中，并200rpm，30℃摇动培养120h。重组蛋白分泌表达于培养基上清中，经0.2μm滤膜过滤后，用10KDa超滤管离心收集上清。使用AlbuPure基质(ProMetic BioSciences)纯化HSA变体，其中将上清液应用于填充床，用50mM pH 5.3的醋酸钠预平衡，用10倍柱体积(CV)的平衡缓冲液洗涤，然后用10CV的50mM pH 8.0的醋酸铵洗涤。用50mM乙酸铵、10mM pH 8.0辛酸、50mM乙酸铵、30mMpH 8.0辛酸钠或200mM硫氰酸钾洗脱蛋白质。用Vivaspin20 10kDa PES(Sartorius)将洗脱的级分浓缩并用10CV的50mM NaCl过滤。用TSK G3000SWXL柱(Tosoh Bioscience)通过GP-HPLC对HSA变体进行定量。样品在25mM磷酸钠、100mM硫酸钠、0.05％(w/v)叠氮化钠、pH 7.0(1ml min-1)中进行色谱分离，并通过相对于HSA标准品的280nm紫外检测进行定量。在MOPSSDS缓冲液(Invitrogen)中用NuPAGE 4-12％Bis-Tris预制胶分析蛋白质。最后，用凝血酶切割GST标签得到重组蛋白DI/DII/DIII。
2、DI、DII、DIII与IR-783的复合：
将DI、DII、DIII的重组蛋白粉末以855μM的浓度溶于磷酸缓冲液(PBS)中，IR-783粉末以26.7mM的浓度溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中。控制白蛋白亚基与IR-783达到1:1的摩尔投料比，先将500μL DI、DII、DIII的PBS溶液在轻微涡旋的条件下分别加入到500μLPBS中，然后再分别加入16μL IR-783的DMSO溶液，最后分别将混合物涡旋30秒后在常温或60℃加热10分钟两种条件下形成复合物。用铟镓砷探测器分别对复合物的近红外二区(NIR-II)的荧光强度进行测量。图1显示了测量结果，其中，图1a为NIR-I窗口的结果，图1a为NIR-II窗口的结果。
如图1所示，在NIR-I和NIR-II两个窗口检测到DIII与IR-783混合后有显著的荧光增强，而DI或DII与IR-783混合后无显著荧光增强。证明DIII是与花菁染料IR-783混合后荧光增强的关键结构域。
3、复合物的表征
将DIII的重组蛋白粉末以855μM的浓度溶于磷酸缓冲液(PBS)中，IR-783粉末以0.1mM的浓度溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中。将DIII与IR-783以1:1的摩尔比混合。先将DIII的PBS母液用PBS稀释到10μM，将100μL 10μM DIII的PBS溶液加入10μL IR-783的DMSO溶液，最后将混合物涡旋30秒后在60℃加热10分钟条件下形成IR-783@DIII复合物。使用超高分辨率LC-MS分别对IR-783@DIII复合物和重组蛋白DIII进行表征，研究了重组蛋白DIII与花菁染料IR-783的结合行为和负载能力，表征结果如图2所示。结果说明：一分子重组蛋白DIII仅与一个含氯花菁染料分子结合，且两者以共价的方式结合。
通过鸟枪蛋白质组学方法，鉴定染料和蛋白质残基之间的亲核取代反应位点。如图3所示，将重组蛋白DIII和IR-783的混合物分别用四种不同的消化酶(胰蛋白酶Trpsin、胞内蛋白酶Asp-N、葡萄球菌蛋白酶Glu-C和重组赖氨酰内切酶Lys-C)通过切割其特定的切割位点进行消化，使用数据相关采集(DDA)模式在超高分辨率LC-MS/MS上分析所得肽。所有肽段均以随机的方式进行筛选，每次全MS扫描中的前10个离子将接受MS/MS扫描。然后，搜索UniProt人类数据库(约23000个序列)并将染料标记设置为可变修饰(H46C38O6N2S2，质量＝690.2797)。基于计算的分析表明，最有可能用染料标记的肽序列是C(染料)C(氨基甲酰甲基化)TESLVNR。通过进一步分析b和y离子系列，确定了该序列上的确切结合残基。该肽的全质量(MS1)为1770.749(测量精度<5ppm)，碎片(MS/MS)小于10ppm并且是连续的(y离子系列，y1-y8)，表明染料结合在这段肽上，并且结合位点是野生的人血清白蛋白第476位氨基酸Cys(以下简称“Cys 476”)，也即SEQ ID NO：3所示的人血清白蛋白第三结构域的第93位氨基酸Cys。实验结果表明含氯花菁染料的Cl-基团会通过亲核取代与Cys 476的SH-反应。进一步的，鉴定了其他含Cl-基团花菁染料和DIII蛋白的共价结合反应。结果显示含氯染料与DIII为1:1共价结合，超高分辨率LC-MS结果显示(图4)，含氯染料发生亲核取代反应(去HCl)，推测亲核取代发生位点与上述鉴定的位点一致；而未含氯的染料(ICG，作为对照)则未发生共价反应。
按照如上所述的方法，进一步鉴定了含Br-基团花菁染料(结构式如下所示)和DIII蛋白的共价结合反应。将含Br-基团花菁染料和含Cl-基团花菁染料(IR-783)分别与牛血清白蛋白(BSA)混合以摩尔比1:1混合后，在60℃加热10分钟条件下形成复合物。对复合物在近红外二区(NIR-II)测量荧光强度。
实验结果如图5所示，在NIR-II窗口检测到BSA分别与含Br-基团花菁染料和含Cl-基团花菁染料混合后有显著的荧光增强。根据实验结果含溴花菁染料的Br-基团也可以与白蛋白结合并诱导相当的亮度增强，推测其会通过亲核取代与人血清白蛋白的Cys 476的SH-反应。
实施例2.不同花菁染料与DIII的复合
将白蛋白第一结构域(DI)、第二结构域(DII)、第三结构域(DIII)的重组蛋白分别与不同的花菁染料(IR-12N3、HITC-1、IR-26、DiR、IR-1048、IR-1061、IRdye800cw、cy7、cy7.5、ICG、IR-780、IR-783、IR-140、IR-820、IR-830和IR-775共16种花菁染料，购买来源见下述表2)混合后，测试荧光增强效果。这些实验组中每种复合物的合成方法与实施例1相同。将每种花菁染料用PBS稀释到与实验组中的花菁染料浓度一致作为对照组。对照组的每种花菁染料稀释方法类似，取IR-783为例，将16μL IR-783的DMSO溶液加入到1mLPBS溶液中，震荡均匀作为对照。用铟镓砷探测器在808nm激发波长条件下分别对实验组和对照组在近红外二区(NIR-II)的荧光强度进行测量。定义荧光增强倍数为混合物在近红外二区的荧光强度除以相应花菁染料对照组在近红外二区的荧光强度。
表2.花菁染料购买来源
名称 公司 货号
IR-1048 Sigma-Aldrich 405175
IR-1061 Sigma-Aldrich 405124
ICG Sigma-Aldrich 1340009
IR-780 Sigma-Aldrich 425311
IR-783 Sigma-Aldrich 543292
IR-140 Sigma-Aldrich 260932
IR-820 Sigma-Aldrich 54336
IR-775 Sigma-Aldrich 544914
HITC-1 Sigma-Aldrich 252034
DiR 百灵威 2327732
IRdye800cw LiCor Biosciences -
Cy5 aladdin C196716
Cy7.5 aladdin C171437
IR-830 aladdin I157517
IR-12N3 Nirmidas Biotech NBDY-0002
IR-26 Exciton 11930
实验结果如图6所示，图6结果再次证明DIII是与花菁染料混合后荧光增强的关键结构域，不同的花菁染料与DIII混合后的荧光增强效果不同，其中ICG，IR-780，IR-783等花菁染料与DIII混合后的荧光增强较高。
实施例3.IR-783@DIII复合物的体内药代动力学
该实验包括IR-783、IR-783@DIII复合物共两组，每组3只小鼠。将200μL 3μM IR-783或IR-783@DIII复合物分别通过尾静脉注射于麻醉的脱毛小鼠体内，用808nm外置激光器照射小鼠，并在5分钟、15分钟、50分钟、90分钟、120分钟分别开展NIR-II活体荧光成像。
结果显示IR-783在注射入体内后主要进入肝脏，通过肝脏代谢；而IR-783@DIII复合物在注射入体内后主要进入肾脏，通过肾脏快速代谢。因此，IR-783@DIII复合物相比IR-783在体内药代动力学性质明显改善。
实施例4.IR-783@DIII复合物的修饰
奥曲肽是人工合成的天然生长抑素的八肽衍生物，能够与生长抑素受体特异性结合；小分子PSMA-617可以特异性结合前列腺特异性膜抗原；而AR42J细胞高表达生长抑素受体，PC3细胞高表达前列腺特异性膜抗原，因此奥曲肽和小分子PSMA-617可以相应地增加AR42J细胞和PC3细胞地摄取。本实施例中，以多肽分子奥曲肽(TATE)和小分子PSMA-617为例，将预先巯基化修饰的TATE或PSMA-617分子与Mal-DⅢ进行接枝反应，获得IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII-PSMA-617，并对二者的近红外二区荧光性能进行测试。
1、IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII-PSMA-617的制备
将IR-783@DIII复合物先与马来酰亚胺-(聚乙二醇)n-羟基琥珀酰亚胺酯(Maleimide-(PEG)n-NHS ester,Mal-(PEG)n-NHS)反应，成为可以与游离巯基(Thiolgroup，SH-)完成一步高效率连接反应的Mal-D Ⅲ平台。利用预先巯基化修饰的多肽分子奥曲肽(Octreotate，也称为TATE)和非氨基酸类小分子PSMA-617，通过Mal-DⅢ平台上的马来酰亚胺基团与含巯基的分子共价结合，得到IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII-PSMA-617。制备路径如图7a所示，具体过程如下：
(1)马来酰亚胺-(PEG)2-NHS酯(Sigma-Aldrich)以10mM的浓度溶于超纯水中。控制IR-783@DIII与马来酰亚胺-(PEG)2-NHS酯达到1:10的摩尔投料比，向990μL 10μM IR-783@DIII复合物中加入10μL马来酰亚胺-(PEG)2-NHS酯，在室温下振荡反应4h。用10KDa超滤管过滤5次以除去未反应的马来酰亚胺-(PEG)2-NHS酯，得到Mal-DⅢ平台。
(2)控制马来酰亚胺-(PEG)2-NHS酯标记的IR-783@DIII与PSMA-SH或TATE-SH肽达到1:10的摩尔投料比，将马来酰亚胺-(PEG)2-NHS酯标记的IR-783@DIII复合物与PSMA-SH或TATE-SH一起常温孵育4h。用10KDa超滤管、PBS洗涤缀合物5次，获得IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII-PSMA-617。
2、近红外二区荧光性能测试
NIR-II成像显示，多肽修饰后的IR-783@DIII复合物仍然保持较强的近红外二区荧光性能(图7a)。高分辨率LC-MS结果显示3-5个TATE或者PSMA-617分子与IR-783@DIII成功结合，偶联成功(图7c，图7d)。
实施例5.细胞靶向性和富集性的测试
本实施例验证IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII-PSMA-617的靶向性和富集作用。
1、细胞实验
AR42J(大鼠胰腺外分泌细胞)、PC3(人前列腺癌细胞)细胞系购自ATCC。PC3细胞是PSMA(前列腺特异性膜抗原)低表达的细胞，通过转染得到的PC3-PIP细胞(受赠于NIBIB/LOMIN实验室)是PSMA高表达的细胞。将AR42J、PC3、PC3-PIP细胞用含10％胎牛血清和1％双抗(青链霉素混合液)的DMEM培养基、在5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养。选取2盘对数生长期、状态好的AR42J细胞，分别与用无菌PBS溶液稀释成浓度为3μM的IR-783@DIII-TATE和IR-783@DIII共孵育4小时后，进行近红外二区荧光成像。选取对数生长期、状态好的PC3、PC3-PIP细胞，分别与用无菌PBS溶液稀释成浓度为3μM的IR-783@DIII-PSMA-617共孵育4小时后，进行近红外二区荧光成像。
细胞实验显示，IR-783@DIII-TATE相对于IR-783@DIII对AR42J细胞具有更强的靶向性和富集作用；IR-783@DIII-PSMA-617对PC3-PIP细胞较PC3细胞具有更强的靶向性和富集作用。结果显示修饰后的IR-783@DIII具有显著的靶向性(图8)。
2、动物实验
(1)评价IR-783@DIII-TATE在AR42J裸鼠肿瘤模型中靶向性和富集作用
实验过程如下：设置IR-783@DIII-TATE实验组和IR-783@DIII对照组，每组3只裸鼠。先构建AR42J皮下瘤模型，以5.0×106个细胞/只裸鼠剂量注射AR42J细胞于裸鼠右侧肩部。待肿瘤达到约200-350mm3时进行活体近红外二区荧光成像。在实验组中，将200μL 3μM的IR-783@DIII-TATE尾静脉注射到荷瘤小鼠体内；在对照组中，将200μL 3μM的IR-783@DIII尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，分别在5min、30min、1h、2h、3h、6h、8h、12h和24h时间点记录近红外二区荧光图像。
图9a显示了IR-783@DIII-TATE实验组小鼠在5min、30min、1h、2h、3h、6h、8h的近红外二区荧光图像(其中，Tu代表tumor(肿瘤)，Li代表liver(肝脏)、Bl代表bladder(膀胱)、Supine代表仰卧(NIR-II图像的小鼠是仰卧姿势))；图9b显示了12h时IR-783@DIII-TATE(实验组)和IR-783@DIII在小鼠各器官的富集情况。结果表明，IR-783@DIII-TATE相对于IR-783@DIII对AR42J裸鼠肿瘤模型中的肿瘤组织具有更强的靶向性和富集作用。
(2)评价IR-783@DIII-PSMA-617在PC3-PIP裸鼠肿瘤模型和PC3细胞肿瘤模型的靶向性和富集作用。
实验过程如下：设置包括PC3-PIP荷瘤小鼠模型组和PC3荷瘤小鼠模型组，每组3只裸鼠。先构建PC3-PIP、PC3皮下瘤模型，以5.0×106个细胞/只裸鼠剂量注射PC3-PIP、PC3细胞于裸鼠右侧肩部。待肿瘤达到约200-350mm3时进行活体近红外二区荧光成像。将200μL 3μM的IR-783@DIII-PSMA-617分别尾静脉注射到PC3-PIP、PC3荷瘤小鼠体内，分别在5min、30min、1h、2h、3h、6h、8h、12h和24h时间点记录近红外二区荧光图像。
图9c显示了PC3-PIP荷瘤小鼠和PC3荷瘤小鼠在12h的近红外二区荧光图像。结果表明，IR-783@DIII-PSMA-617对PC3-PIP裸鼠肿瘤模型中的肿瘤组织较PC3细胞肿瘤模型具有更强的靶向性和富集作用。
上述结果显示修饰后的IR-783@DIII具有显著的靶向性。
实施例6.亚基与花菁染料的复合
DIII结构上可以分为DIIIa和DIIIb两个亚基，使用基因工程技术和酵母表达系统体外表达纯化出DIIIa和DIIIb，具体过程如下：
重组蛋白DIIIa由人血清白蛋白381-494位氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)组成，重组蛋白DIIIb由人血清白蛋白490-585位氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)组成。在DIIIa/DIIIb基因序列下游加入His-tag或GST-tag基因表达序列，在tag和DIIIa/DIIIb中间插入一个凝血酶裂解位点(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)基因表达序列，便于纯化重组蛋白DIIIa/DIIIb。将上述的序列分别插入pPIC9质粒(Addgene,#163143)中以构建重组质粒(质粒的插入片段的结构如图10a所示)，构建好的pPIC9K-DIIIa/DIIIb重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中，挑选单克隆菌株，经PCR鉴定以及测序鉴定确定阳性载体菌株。提取表达质粒，分别用XhoI、EcoR1酶切线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞。然后进行诱导表达，经过表达条件优化后，检测重组蛋白的表达产量，选取表达量较高的菌株作为表达菌。
接种重组蛋白DIIIa/DIIIb的表达工程菌于10ml BMMD培养基(2％w/v葡萄糖)中，200rpm，30℃摇动培养48h，然后取4ml培养物接种到2×200ml BMMD培养基中，并200rpm，30℃摇动培养120h。重组蛋白分泌表达于培养基上清中，经0.2μm滤膜过滤后，用10KDa超滤管离心收集上清。使用Ni-NTA亲和层析(GE Healthcare)纯化含His标签的HSA变体，用10倍柱体积(CV)50mM pH 8.0的Tris base缓冲液平衡Ni柱后，将上诉蛋白表达上清上样，纯化过程中逐渐提高咪唑的浓度,梯度洗杂,最后用含有100mM咪唑的缓冲液进行目的蛋白的洗脱，洗脱下来的目的蛋白在50mM pH 8.0的Tris base缓冲液中透析。用TSK G3000SWXL柱(Tosoh Bioscience)通过GP-HPLC对HSA变体进行定量。样品在25mM磷酸钠、100mM硫酸钠、0.05％(w/v)叠氮化钠、pH 7.0(1ml min-1)中进行色谱分离，并通过相对于HSA标准品的280nm紫外检测进行定量。在MOPS SDS缓冲液(Invitrogen)中用NuPAGE 4-12％Bis-Tris预制胶分析蛋白质。最后，用凝血酶切割GST标签得到重组蛋白DIIIa/DIIIb。使用Glutathione Sepharose High Performance亲和层析(GE Healthcare)纯化含GST标签的HSA变体.用10倍柱体积(CV)50mM pH 8.0的Tris base缓冲液平衡柱子，用10倍柱体积(CV)GST再生液I和II缓冲液再生介质，将上述蛋白表达上清上样，然后用10mM还原型谷光甘肽缓冲液进行目的蛋白的洗脱。洗脱下来的目的蛋白在50mM pH 8.0的Tris base缓冲液中透析。用TSK G3000SWXL柱(Tosoh Bioscience)通过GP-HPLC对HSA变体进行定量。样品在25mM磷酸钠、100mM硫酸钠、0.05％(w/v)叠氮化钠、pH 7.0(1ml min-1)中进行色谱分离，并通过相对于HSA标准品的280nm紫外检测进行定量。在MOPS SDS缓冲液(Invitrogen)中用NuPAGE4-12％Bis-Tris预制胶分析蛋白质。最后，用凝血酶切割GST标签得到重组蛋白DIIIa/DIIIb。
将上述获得的重组蛋白DIIIa/DIIIb分别与花菁染料IR-783，IR-780，ICG混合后检测NIR-II成像。具体来说，将DIIIa/DIIIb的重组蛋白粉末以855μM的浓度溶于磷酸缓冲液(PBS)中，IR-783、IR-780或ICG粉末以26.7mM的浓度溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中。控制白蛋白亚基与花菁染料达到1:1的摩尔投料比，合成复合物的方法类似。以IR-783@DIIIa为例：先将500μL DIIIa的PBS溶液在轻微涡旋的条件下分别加入到500μL PBS中，然后再加入16μL IR-783的DMSO溶液，最后分别将混合物涡旋30秒后在60℃加热10分钟形成复合物。用铟镓砷探测器分别对复合物的近红外二区(NIR-II)的荧光强度进行测量。
图10b结果显示DIIIa与花菁染料混合形成复合物后的荧光增强效果与DIII一致。
实施例7.三聚DIII(TDⅢ)与花菁染料复合物
本实施例使用linker基因将三个DⅢ基因串联后插入pPIC9载体质粒，通过毕赤酵母表达系统表达纯化出TDⅢ。将BSA,HSA,DⅢ,TDⅢ与花菁染料IR-783分别复合并检测NIR-II荧光强度。进一步地，使用TDⅢ与IR-783形成的复合物(IR-783@TDⅢ)在小鼠模型中进行NIR-II成像，并与HSA与IR-783形成的复合物(IR-783@HSA)进行比较。
1、重组表达载体pPIC9K-TDIII的构建、表达及纯化：
用接头(其中，TDIII 1的串连使用接头1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；TDIII 2的串联使用接头2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)将三个DⅢ基因串联后插入pPIC9载体质粒，通过毕赤酵母表达系统表达纯化出TDⅢ。具体过程如下：
重组蛋白TDIII由3个人血清白蛋白381-585位氨基酸组成，本实施例使用了两种不同的linker(氨基酸序列如SEQ ID NO:8和9所示)，分别与DⅢ基因串联，获得了TDIII 1(氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)和TDIII 2(具体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)。在TDIII基因序列下游加入His-tag基因表达序列，在tag和TDIII中间插入一个凝血酶裂解位点(LVPRGS)基因表达序列，便于纯化重组蛋白TDIII。将上述的序列分别插入pPIC9质粒中以构建重组质粒，构建好的pPIC9K-TDIII重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中，挑选单克隆菌株，经PCR鉴定以及测序鉴定确定阳性载体菌株。提取表达质粒，分别用EcoR1、XhoI酶切线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞。然后进行诱导表达，经过表达条件优化后，检测重组蛋白的表达产量，选取表达量较高的菌株作为表达菌。
接种重组蛋白TDIII的表达工程菌于10ml BMMD培养基(2％w/v葡萄糖)中，200rpm，30℃摇动培养48h，然后取4ml培养物接种到2×200ml BMMD培养基中，并200rpm，30℃摇动培养120h。重组蛋白分泌表达于培养基上清中，经0.2μm滤膜过滤后，用50KDa超滤管离心收集上清。使用AlbuPure基质(ProMetic BioSciences)纯化HSA变体，其中将上清液应用于填充床，用50mM pH 5.3的醋酸钠预平衡，用10倍柱体积(CV)的平衡缓冲液洗涤，然后用10CV的50mM pH 8.0的醋酸铵洗涤。用50mM乙酸铵、10mM pH 8.0辛酸、50mM乙酸铵、30mMpH 8.0辛酸钠或200mM硫氰酸钾洗脱蛋白质。用Vivaspin20 10kDa PES(Sartorius)将洗脱的级分浓缩并用10CV的50mM NaCl过滤。用TSK G3000SWXL柱(Tosoh Bioscience)通过GP-HPLC对HSA变体进行定量。样品在25mM磷酸钠、100mM硫酸钠、0.05％(w/v)叠氮化钠、pH 7.0(1ml min-1)中进行色谱分离，并通过相对于HSA标准品的280nm紫外检测进行定量。在MOPSSDS缓冲液(Invitrogen)中用NuPAGE 4-12％Bis-Tris预制胶分析蛋白质。最后，用凝血酶切割His标签得到重组蛋白TDIII。
图11a为重组蛋白DⅢ(TDⅢ)的三维结构图。
2、复合物的制备和NIR-II荧光强度的检测
将BSA，HSA，DⅢ，TDⅢ与IR-783分别以1:0.5,1:1,1:2,1:3和1:4的摩尔比混合以制备复合物，并检测复合物的NIR-II荧光强度。具体过程如下：
将DIII、TDIII的重组蛋白粉末和HSA、BSA(Sigma-Aldrich)以855μM的浓度溶于磷酸缓冲液(PBS)中，IR-783粉末以0.1mM的浓度溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中。将BSA,HSA,DIII,TDIII与IR-783分别以1:0.5,1:1,1:2,1:3和1:4的摩尔比混合。先将BSA,HSA,DIII,TDIII的PBS母液用PBS稀释到1μM，将100μL 1μM BSA,HSA,DIII,TDIII的PBS溶液分别加入0.5，1，2，3，4μL IR-783的DMSO溶液，最后分别将混合物涡旋30秒后在60℃加热10分钟条件下形成复合物。用铟镓砷探测器在808nm激发波长条件下分别对复合物在1100-1300nm波长范围内的近红外二区(NIR-II)的荧光强度进行测量。
结果显示，BSA,HSA,DⅢ与IR-783的结合在1:1时荧光强度最高，而TDⅢ在1:3时为最高，最高亮度比1:1时增加2.7倍，证明TDⅢ可以结合更多的IR-783从而增加亮度。
进一步的，研究了IR-783与DIII、TDIII、血清白蛋白(albumin)在摩尔比为0.25:1,0.5:1,0.75:1,1:1,1.5:1,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,8:1和16:1的条件下形成复合物的荧光强度。其中，与血清白蛋白的结合分别在常温和加热2h的条件下进行。实验结果(图11c和图11d)表明DIII和albumin在与IR-783的结合在1:1时荧光强度最高，而TDIII在1:3时为最高，最高亮度比1:1时增加2.7倍。证明TDⅢ的染料负载能力大约是DIII的三倍，可以结合更多的IR-783从而增加亮度。然而，TDIII较高的染料负载量(>3:1)也会出现类似于albumin在较高染料负载量(>1:1)观察到的荧光自淬灭。
3、复合物IR-783@TDⅢ和复合物IR-783@HSA在小鼠模型中的NIR-II成像将TDIII的重组蛋白粉末以855μM的浓度溶于磷酸缓冲液(PBS)中，IR-783粉末以1mM的浓度溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中。将TDIII与IR-783以1:3的摩尔比混合。先将TDIII的PBS母液用PBS稀释到1μM，将1mL 1μM TDIII的PBS溶液加入3μL IR-783的DMSO溶液，最后分别将混合物涡旋30秒后在60℃加热10分钟条件下形成IR-783@TDIII复合物。
取200μL 3μM IR-783@TDIII复合物通过尾静脉注射于麻醉的脱毛小鼠体内，用808nm外置激光器照射小鼠，1300nm长通滤光片下可进行脑血管的近红外二区荧光成像。
取10μL 3μM IR-783@TDIII复合物从脚垫注射到麻醉的脱毛小鼠体内，在780nm波长激发下，850-900nm波长范围内可进行淋巴系统的近红外一区成像；用808nm外置激光器照射小鼠，1100-1500nm波长范围内可进行淋巴系统的近红外二区成像。
图12显示了IR-783@TDⅢ复合物在小鼠模型中的脑血管成像和淋巴系统NIR-II成像结果。结果表明IR-783@TDⅢ复合物具有高分辨的成像效果。
分别取10μL 3μM IR-783@HSA(IR-783@HSA的制备方法与实施例8中描述的IR-783@TDIII的制备方法相同)、IR-783@TDIII复合物从左、右脚垫注射到麻醉的脱毛小鼠体内，用808nm外置激光器照射小鼠，1100-1500nm波长范围内可进行淋巴系统的近红外二区成像。
比较两种复合物探针对淋巴结的成像效果，见图13。图13a为对淋巴结进行成像的示意图，从小鼠左、右脚垫分别注射IR-783@TDIII和IR-783@HSA；图13b为对脱完毛小鼠的13a成像窗口进行持续激光照射的NIR-II成像；图13c显示了对应的IR-783@TDIII和IR-783@HSA感兴趣区域(ROI)在持续激光照射下荧光强度随时间的变化，上方曲线为IR-783@TDIII，下方曲线为IR-783@HSA。
结果显示注射后淋巴结成像亮度IR-783@TDⅢ显著强于IR-783@HSA，可以用于淋巴结手术导航。
实施例8.细胞靶向性和富集性的测试
本实施例测试复合了RGD肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)的复合物，即IR-783@DIII-cRGD对细胞的靶向能力。
结果如图14所示，其中图14a和图14b显示了通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)验证了DIII-cRGD的成功合成。图14c为游离染料IR-783、IR-783@HSA、IR-783@DIII、IR-783@DIII-cRGD的NIR-II荧光图像。图14d为量化的图14c不同样品对应的荧光强度。即使IR-783@DIII-cRGD的荧光强度相比于IR-783@DIII还是受到了化学修饰cRGD的影响，但与IR-783@HSA相比，其荧光增强约1.4倍，与游离染料IR-783相比亮度增强数十倍，具有靶向能力的IR-783@DIII-cRGD仍可获得很好的NIR-II生物成像。结果说明，IR-783@DIII-cRGD仍然具有良好的荧光性能，即在DIII上偶联靶向性多肽或小分子不会对探针的荧光性能造成明显的影响。
将IR-783@DIII-cRGD与U87细胞共孵育不同的时间，图14e是通过流式细胞术监测的结果，从图中可以看出，随着时间的增加，荧光信号逐渐蹭墙，表明U87细胞对IR-783@DIII-cRGD的摄取逐渐增加，空白组是未加IR-783@DIII-cRGD孵育的U87细胞。上述结果可以说明IR-783@DIII-cRGD对U87细胞的靶向性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> 一种复合物及其用途
<130> IDC220052
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 195
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 人血清白蛋白第一结构域（DI）的氨基酸序列
<400> 1
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys
195
<210> 2
<211> 161
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 人血清白蛋白第二结构域（DII）的氨基酸序列
<400> 2
Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe
1 5 10 15
Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr
35 40 45
Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp
50 55 60
Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu
65 70 75 80
Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala
85 90 95
Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala
100 105 110
Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys
115 120 125
Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro
130 135 140
Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr
145 150 155 160
Thr
<210> 3
<211> 205
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 人血清白蛋白第三结构域（DIII）的氨基酸序列
<400> 3
Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys
1 5 10 15
Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile
20 25 30
Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln
35 40 45
Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr
50 55 60
Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys
65 70 75 80
Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr
85 90 95
Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro
100 105 110
Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg
115 120 125
Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys
130 135 140
Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu
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Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu
165 170 175
Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met
180 185 190
Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
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<210> 4
<211> 244
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> GST-tag
<400> 4
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu
210 215 220
Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg
225 230 235 240
Pro His Arg Asp
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 凝血酶裂解位点
<400> 5
Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 114
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白DIIIa亚基的氨基酸序列
<400> 6
Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys
1 5 10 15
Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile
20 25 30
Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln
35 40 45
Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr
50 55 60
Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys
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Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr
85 90 95
Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro
100 105 110
Val Ser
<210> 7
<211> 96
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白DIIIb亚基的氨基酸序列
<400> 7
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
1 5 10 15
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
20 25 30
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
35 40 45
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
50 55 60
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
65 70 75 80
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
85 90 95
<210> 8
<211> 2
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 接头1
<400> 8
Leu Glu
1
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 接头1
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 614
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白TDIII 1的氨基酸序列
<400> 10
Met Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val
1 5 10 15
Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys
20 25 30
Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn
35 40 45
Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro
50 55 60
Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys
65 70 75 80
Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu
85 90 95
Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val
100 105 110
Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg
115 120 125
Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu
130 135 140
Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser
145 150 155 160
Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val
165 170 175
Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp
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Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Leu Glu Lys Cys
195 200 205
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
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565 570 575
Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala
580 585 590
Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val
595 600 605
Glu Lys Cys Cys Lys Ala
610
<210> 11
<211> 630
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 重组蛋白TDIII 2 的氨基酸序列
<400> 11
Met Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val
1 5 10 15
Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys
20 25 30
Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn
35 40 45
Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro
50 55 60
Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys
65 70 75 80
Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu
85 90 95
Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val
100 105 110
Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg
115 120 125
Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu
130 135 140
Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser
145 150 155 160
Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val
165 170 175
Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp
180 185 190
Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
210 215 220
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
225 230 235 240
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
245 250 255
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
260 265 270
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
275 280 285
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
290 295 300
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
305 310 315 320
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
325 330 335
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
340 345 350
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
355 360 365
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
370 375 380
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
385 390 395 400
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
405 410 415
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Cys Cys Ala Ala
420 425 430
Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro
435 440 445
Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe
450 455 460
Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr
465 470 475 480
Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser
485 490 495
Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala
500 505 510
Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln
515 520 525
Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys
530 535 540
Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu
545 550 555 560
Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe
565 570 575
Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile
580 585 590
Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala
595 600 605
Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val
610 615 620
Glu Lys Cys Cys Lys Ala
625 630
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 奥曲肽
<400> 12
Phe Cys Phe Trp Cys Thr Cys Thr
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> RGD肽
<400> 13
Arg Gly Asp Phe Lys
1 5

Claims (11)

1.一种复合物，其由白蛋白的部分或所述部分的多聚体与花菁染料分子共价结合形成；
所述白蛋白的部分选自白蛋白第三结构域，白蛋白第三结构域的突变体，白蛋白第三结构域a亚基，或白蛋白第三结构域a亚基的突变体；所述多聚体是白蛋白第三结构域的多聚体；
优选地，所述白蛋白是哺乳动物血清白蛋白；
优选地，所述白蛋白是人血清白蛋白；
优选地，所述第三结构域由人血清白蛋白的第384-585位氨基酸残基组成；
优选地，所述人血清白蛋白的第三结构域具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
优选地，所述复合物是由所述白蛋白亚基或其变体上的巯基与所述花菁染料分子上的反应性基团(例如Cl-或Br-)通过亲核取代形成的；
优选地，所述巯基位于SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中第93位氨基酸残基上；
优选地，所述复合物包含的白蛋白亚基或其变体与所述花菁染料分子的摩尔比为1：5至5：1。
2.权利要求1的复合物，其中，所述复合物由白蛋白第三结构域的多聚体与花菁染料分子共价结合形成；
优选地，所述多聚体是三聚体；
优选地，所述多聚体中，多个(例如三个)白蛋白第三结构域之间由接头连接；
优选地，所述接头的序列选自SEQ ID NO:8或9；
优选地，所述三聚体具有如SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列；
优选地，所述复合物包含的多聚体与所述花菁染料分子的摩尔比为1：3。
3.权利要求1的复合物，其中，所述复合物由白蛋白第三结构域与花菁染料分子共价结合形成；
优选地，所述白蛋白第三结构域与所述花菁染料分子的摩尔比为1：1。
4.权利要求1的复合物，其中，所述复合物由白蛋白第三结构域的亚基与花菁染料分子共价结合形成，所述白蛋白第三结构域的亚基由人血清白蛋白第381-494位氨基酸组成；
优选地，所述白蛋白第三结构域的亚基具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
优选地，所述白蛋白第三结构域的亚基与所述花菁染料分子的摩尔比为1：1。
5.权利要求1-4任一项的复合物，其中，所述花菁染料分子具有选自下列任意一种骨架结构：
优选地，所述花菁染料分子具有选自下列任意一种结构：
或以上结构中将骨架中的Cl替换为F、Br或I获得的结构；
或者
或以上结构中将骨架中的Cl替换为F、Br或I获得的结构；
或者
6.权利要求1-5任一项所述的复合物，其中，所述复合物上还共价连接有一个或多个靶向分子；
优选地，所述靶向分子为多肽或非氨基酸类小分子；
优选地，所述多肽选自RGD肽，奥曲肽，VEGF，OVA肽或其任何组合；
优选地，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13；
优选地，所述非氨基酸类小分子是PSMA-617。
7.一种试剂盒，其包含至少1个权利要求1-6任一项所述的复合物；任选的，所述试剂盒还包含选自下列的任意一项或多项：抗体，引物，用于固定和/或透化细胞的试剂，或其任意组合。
8.一种制备权利要求1-6任一项所述的复合物的方法，所述方法包括：使所述白蛋白亚基或其变体与所述花菁染料分子在常温或加热条件下发生反应；
优选地，所述方法包括以下步骤：
步骤1：获得溶液A：包含所述白蛋白亚基或其变体的溶液，并获得溶液B：包含所述花菁染料分子的溶液；
步骤2：在涡旋条件下，将溶液A与溶液B混合；
步骤3：使混合后的溶液在常温或加热条件下保持一段时间，形成所述复合物。
优选地，所述方法还包括步骤4：对所述复合物进行修饰；
优选地，所述修饰包括将一个或多个靶向分子共价连接至所述复合物包含的所述白蛋白的部分或所述部分的多聚体；
优选地，所述靶向分子为多肽或非氨基酸类小分子；
优选地，所述多肽选自RGD肽，奥曲肽，VEGF，OVA或其任何组合；
优选地，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13；
优选地，所述非氨基酸类小分子是PSMA-617；
优选地，所述修饰包括以下步骤：
步骤(1)：获得马来酰亚胺基团修饰的复合物，并获得巯基修饰的靶向分子，
步骤(2)：通过马来酰亚胺基团与巯基的共价结合，将所述靶向分子连接至所述复合物；
优选地，步骤(1)中，通过使所述复合物包含的所述白蛋白亚基或其变体与马来酰亚胺-(聚乙二醇)n-羟基琥珀酰亚胺酯反应，获得所述马来酰亚胺基团修饰的复合物；
步骤(2)：通过马来酰亚胺基团与巯基的共价结合，将所述靶向分子连接至所述复合物；
优选地，步骤(1)中，通过使所述复合物包含的所述白蛋白亚基或其变体与马来酰亚胺-(聚乙二醇)n-羟基琥珀酰亚胺酯反应，获得所述马来酰亚胺基团修饰的复合物。
9.一种靶向细胞的方法，所述方法包括将权利要求6所述的复合物与所述细胞接触；任选地，在接触后，对所述细胞进行激光照射，以获得所述细胞的成像；
优选地，所述复合物通过与所述细胞上表达的细胞表面分子、细胞表面蛋白或细胞表面受体的结合以靶向所述细胞；
优选地，所述细胞选自干细胞、增殖性细胞、增生中的细胞、炎性细胞、负调节免疫细胞、被病原体感染的细胞、神经元、脂肪细胞或脂细胞；
优选地，所述细胞是肿瘤细胞；
优选地，所述肿瘤选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、T细胞/组织细胞的富B细胞淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤，脊轴肿瘤，脑干神经胶质瘤；
优选地，所述细胞存在于组织或活体生物中。
10.权利要求1-6任一项所述的复合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于靶向细胞，或者用于获得细胞的成像；
优选地，所述复合物通过与所述细胞上表达的细胞表面分子、细胞表面蛋白或细胞表面受体的结合以靶向所述细胞；
优选地，所述细胞选自干细胞、增殖性细胞、增生中的细胞、炎性细胞、负调节免疫细胞、被病原体感染的细胞、神经元、脂肪细胞或脂细胞；
优选地，所述细胞是肿瘤细胞；
优选地，所述肿瘤选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、T细胞/组织细胞的富B细胞淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤，脊轴肿瘤，脑干神经胶质瘤；
优选地，所述细胞存在于组织或活体生物中。
11.一种成像方法，所述方法包括以权利要求1-6任一项所述的复合物作为成像显像剂；
优选地，所述成像为近红外二区荧光成像；
优选地，所述成像方法为细胞、组织或活体生物的荧光成像。
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