WO2017200109A1 - 含窒素化合物を用いた選択的ジスルフィド化試薬、およびジスルフィド含有化合物の製造方法 - Google Patents

含窒素化合物を用いた選択的ジスルフィド化試薬、およびジスルフィド含有化合物の製造方法 Download PDF

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良雄 林
晃弘 田口
謙太郎 福元
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Definitions

  • the present invention relates to a pyridine derivative that can be used as a selective disulfation reagent for a thiol group (—SH group) contained in an amino acid or a peptide in organic synthesis (particularly peptide synthesis).
  • the present invention also relates to a method for producing a disulfide-containing compound using the disulfide reagent.
  • a protected peptide sequence containing a protected cysteine (Cys) residue is synthesized by a solid phase method or a liquid phase method, and all protecting groups are once removed.
  • a method is known in which a peptide having a free thiol group is obtained by protection, and a disulfide bond (SS bond) is formed in the molecule by using an air oxidation method or an iodine oxidation method.
  • the air oxidation method has a problem that it takes a long time to form a disulfide bond.
  • the iodine oxidation method is known to cause iodine oxidation with respect to tyrosine, histidine and tryptophan during the reaction, and has a problem that the selectivity is not sufficient.
  • disulfide bonds are formed in the molecule using these methods, if the concentration of the free thiol group-containing peptide in the reaction system is too high, disulfide bonds are formed between the molecules and cross-linked isomers are formed.
  • Non-Patent Document 3 thallium (III) trifluoroacetate method
  • S-protected cysteine sulfoxide method see Non-Patent Document 2
  • silyl chloride-sulfoxide The method (see Non-Patent Document 3) has been reported as a reaction for forming a disulfide bond simultaneously with deprotection. It has also been reported that an intermolecular disulfide bond can be easily formed by reacting with a free thiol group using a 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group (Npys group) as a protecting group for the thiol group of cysteine. (See Non-Patent Document 4).
  • Patent Document 1 a cysteine or a cysteine-containing protected peptide in which a thiol group is protected with an Npys group is reacted with a cysteine or a cysteine-containing protected peptide having a free thiol group to thereby form a disulfide bond formation reaction and a peptide bond.
  • a method for producing a disulfide-containing peptide by proceeding with a formation reaction as a sequential reaction has been proposed.
  • Npys-Cl 3-nitro-2-pyridinesulfenyl chloride
  • Patent Document 1 is based on the premise that after two types of protected peptide sequences are first synthesized, disulfide bond formation and peptide bond formation are performed stepwise, and then further deprotection treatment is performed. . For this reason, there is a problem that the operation is complicated, for example, protection / deprotection processing is required.
  • the present invention selectively displaces disulfide bonds with respect to two free thiol groups located in the molecule of an organic compound such as a peptide in a relatively short time by a simple treatment and by a chemically stable technique.
  • the purpose is to provide a means that can be introduced.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems.
  • the above problems can be solved by using a nitrogen-containing compound having a predetermined chemical structure as a disulfating reagent, and the present invention has been completed.
  • most of the nitrogen-containing compounds having the predetermined chemical structure are novel compounds.
  • a compound represented by the following chemical formula 1 or a salt thereof is provided as a novel nitrogen-containing compound:
  • W is selected from the group consisting of pyridine ring, pyrazine ring, imidazole ring, oxazole ring, thiazole ring, quinoline ring, isoquinoline ring, quinoxaline ring, phenanthroline ring, pteridine ring and azocine ring together with other ring member atoms.
  • X is —O— or —NH—.
  • Y represents a substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl group, a substituted or unsubstituted C2-C20 alkenyl group, a substituted or unsubstituted C2-C20 alkynyl group, a substituted or unsubstituted C3-C20 cycloalkyl group.
  • Z represents a hydrogen atom or an electron-withdrawing substituent present on the nitrogen-containing heterocycle
  • p, q and r are each independently 0 or 1
  • s represents an integer of 0 to 10
  • L 0 and L 1 each independently represent a linker having a chemically stable structure
  • a a and A b are each independently —CH ⁇ CH—, —C ⁇ C—, —C ( ⁇ O) —, —C ( ⁇ O) —O—, —O—C ( ⁇ O).
  • a thiol group disulfide reagent comprising the above-mentioned nitrogen-containing compound or a salt thereof, or any one of the above-mentioned compounds (A) to (H).
  • the above compounds (A) to (H) (3-nitro-2-pyridinesulfinic acid derivatives) are known compounds, and it has been conventionally known that the compounds function as a thiol group disulfide reagent. It is not done.
  • a compound having two or more free thiol groups in the molecule is brought into contact with the above-mentioned disulfating reagent to form a disulfide bond between the two free thiol groups.
  • a method for producing a disulfide-containing compound comprising obtaining a disulfide-containing compound.
  • a disulfide bond is selectively bonded to two free thiol groups located in a molecule of an organic compound such as a peptide in a relatively short time by a simple treatment and by a chemically stable technique. Means are provided that can be introduced.
  • Example 2-1 when the peptide 4 was synthesized from the peptide 3, HPLC analysis of the reaction system before the addition of the compound 2a (A), 1 hour after the addition (B) and 6 hours after the addition (C) It is a chart which shows a result.
  • Example 2-2 when peptide 6 was synthesized from peptide 5, before addition of compound 2a (A), 1 hour after addition (B), 6 hours after addition (C), and 24 hours after addition ( It is a chart which shows the HPLC analysis result of the reaction system of D).
  • Example 2-3 when peptide 8 was synthesized from peptide 7, before addition of compound 2a (A), 4 hours after addition (B), 9 hours after addition (C), and 27 hours after addition ( It is a chart which shows the HPLC analysis result of the reaction system of D).
  • Example 2-3 when peptide 9 was synthesized from peptide 8, before addition of iodine (A), 2 minutes after addition (B), 1 hour after addition (C), and after HPLC purification (D) It is a chart which shows the HPLC analysis result of this reaction system.
  • Example 3-2 when peptide 4 was synthesized from peptide 3 using a solid phase disulfide reagent (compound 11), the reaction started within 3 minutes (A), and 1 hour after the start of reaction (B) It is a chart which shows the HPLC analysis result of the reaction system 3 hours after the reaction start (C).
  • Example 5 the results of HPLC analysis of the reaction system before the addition of compound 16a (A), 1 hour after addition (B), and 3 hours after addition (C) when peptide 4 was synthesized from peptide 3 were as follows. It is a chart to show.
  • Example 6 the HPLC of the crude product (B) obtained when oxytocin (peptide 4) was synthesized from oxytocin-resin 17 obtained by peptide solid phase synthesis.
  • Example 7 mentioned later it is a chart which shows the HPLC analysis result at the time of evaluating the stability of the compound 2a.
  • Example 7 mentioned later it is a chart which shows the ⁇ 1 > H NMR analysis result at the time of evaluating the stability of the compound 2a.
  • One embodiment of the present invention relates to a novel nitrogen-containing compound, and specifically relates to a nitrogen-containing compound represented by the following chemical formula 1 or a salt thereof.
  • W is taken together with other ring members to form a pyridine ring, pyrazine ring, imidazole ring, oxazole ring, thiazole ring, quinoline ring, isoquinoline ring, quinoxaline ring, phenanthroline ring, pteridine ring and azocine ring.
  • Forming a nitrogen-containing heterocycle selected from the group consisting of Here, W, together with other ring member atoms, preferably forms a pyridine ring as the nitrogen-containing heterocycle.
  • X is —O— or —NH—. Among these, X is preferably —O—.
  • Y is a substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl group, a substituted or unsubstituted C2-C20 alkenyl group, a substituted or unsubstituted C2-C20 alkynyl group, a substituted or unsubstituted C3-C20 C20 cycloalkyl group, substituted or unsubstituted C3 to C20 cycloalkenyl group, substituted or unsubstituted C6 to C20 aryl group, substituted or unsubstituted C3 to C20 heteroaryl group, and substituted or unsubstituted electron It is a group selected from the group consisting of monovalent groups derived from an aliphatic heterocyclic ring having an attractive property.
  • the “monovalent group derived from an aliphatic heterocyclic ring having an electron-withdrawing property” corresponds to an aliphatic heterocyclic compound having an electron-withdrawing structure, for example, an active ester of a carboxylic acid in peptide synthesis.
  • the “monovalent group derived from an aliphatic heterocyclic ring having an electron-withdrawing property” is a substituted or unsubstituted succinimidyl group, maleimidyl group, phthalimidyl group or 5-norbornene-2,3-dicarboxyimidyl group. It is preferable that Y is preferably a substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl group or a substituted or unsubstituted C6-C20 aryl group, and preferably a substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl group.
  • it is more preferably an unsubstituted C1-C20 alkyl group, even more preferably an unsubstituted C1-C12 alkyl group, and even more preferably an unsubstituted C1-C8 alkyl group.
  • An unsubstituted C1-C4 alkyl group is particularly preferable, and a methyl group is most preferable.
  • examples of the alkyl group include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group.
  • neopentyl group 1,2-dimethylpropyl group, n-hexyl group, 1,3-dimethylbutyl group, 1-isopropylpropyl group, 1,2-dimethylbutyl group, n-heptyl group, 1,4-dimethyl group Pentyl group, 2-methyl-1-isopropylpropyl group, 1-ethyl-3-methylbutyl group, n-octyl group, 2-ethylhexyl group, 3-methyl-1-isopropylbutyl group, 2-methyl-1-isopropyl group 1-tert-butyl-2-methylpropyl group, n-nonyl group, 3,5,5-trimethylhexyl group and the like.
  • examples of the alkenyl group include a vinyl group, an allyl group, an isopropenyl group, a 1-butenyl group, a 2-butenyl group, a 2-methyl-2-propenyl group, a 1-methyl-2-propenyl group, Examples include 2-methyl-1-propenyl group, pentenyl group, 1-hexenyl group, 3,3-dimethyl-1-butenyl group.
  • examples of the alkynyl group include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, 3-methyl-1-propynyl group, 2 -Methyl-3-propynyl group, pentynyl group, 1-hexynyl group, 3-methyl-1-butynyl group, 3,3-dimethyl-1-butynyl group and the like.
  • examples of the cycloalkyl group include a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, and a cyclooctyl group.
  • examples of the cycloalkenyl group include a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclohexenyl group, and the like.
  • examples of the aryl group include a phenyl group, a 1-naphthyl group, a 2-naphthyl group, a 1-anthracenyl group, a 2-anthracenyl group, and a 9-anthracenyl group.
  • heteroaryl group examples include 2-thienyl group, 4-pyridyl group, 3-pyridyl group, 2-pyridyl group, 1-pyridyl group, 2-furyl group, 2-pyrimidinyl group, 2- Examples thereof include a benzothiazolyl group, a 1-imidazolyl group, a 1-pyrazolyl group, a benzotriazol-1-yl group, and a 7-azabenzotriazol-1-yl group.
  • examples of the substituent that can replace the group include halogen atoms such as fluorine, chlorine, bromine, and iodine, alkyl groups, aryl groups, Alkoxy, aryloxy, alkoxycarbonyl, acyloxy, acyl, alkylsulfanyl, arylsulfanyl, alkylamino, dialkylamino, arylamino, hydroxy, carboxy, formyl, mercapto, sulfo Group, sulfinic acid group, guanidino group, carbamoyl group, thiol group, thioether group, mesyl group, p-toluenesulfonyl group, amino group, nitro group, cyano group, trifluoromethyl group, trichloromethyl group, trimethylsilyl group, phosphinico group Phosphono groups, etc.
  • halogen atoms such as fluorine, chlorine, bromine, and i
  • substituents may also be further substituted with a halogen atom, alkyl group, aryl group, alkoxy group, hydroxy group, carboxy group, amino group, nitro group, cyano group or the like. However, substitution that is included in the same definition as the group before substitution after substitution is not considered.
  • Z represents a hydrogen atom or an electron-withdrawing substituent present on the nitrogen-containing heterocycle, and among them, an electron-withdrawing substituent is preferable.
  • the electron-withdrawing substituent for example, nitro group, trifluoromethyl group, halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom), acetyl group, methanesulfonyl group, trifluoroacetyl group, Examples thereof include a trifluoromethanesulfonyl group and a cyano group.
  • a nitro group, a trifluoromethyl group or a halogen atom is preferable, and a nitro group is most preferable.
  • p is 0 or 1.
  • L 0 is not present and A a or A b or R is directly bonded to the nitrogen-containing heterocyclic ring, and when p is 1, L 0 is present.
  • r is 0 or 1. r is absent A b when the 0, r is A b is present at 1.
  • s is an integer of 0 to 10. when s is 0 [(A a) - (L 1) q] is absent, s is when an integer of 1 ⁇ 10 [(A a) - (L 1) q] are present the s repeated . Note that s is preferably 0 to 5, and more preferably 0 or 1.
  • L 0 and L 1 each independently represent a linker having a chemically stable structure.
  • the specific structure of such a linker is not particularly limited, and examples thereof include a substituted or unsubstituted C1-C20 alkylene group, a substituted or unsubstituted C2-C20 alkenylene group, a substituted or unsubstituted C2-C20.
  • L 0 and L 1 are groups represented by the following chemical formula (a):
  • R a represents a substituted or unsubstituted C1-C15 alkylene group, preferably a C1-C8 alkylene group, more preferably a C1-C4 alkylene group, Particularly preferred is a C1-C2 alkylene group, and most preferred is a C2 alkylene group (especially an ethylene group).
  • L 0 and L 1 are preferably C1-C6 alkylene groups (particularly ethylene groups), polyoxyalkylene groups having a molecular weight of 100 to 1000, or groups represented by the above chemical formula (a).
  • a a and A b are each independently —CH ⁇ CH—, —C ⁇ C—, —C ( ⁇ O) —, —C ( ⁇ O) —O—. , —O—C ( ⁇ O) —, —O—, C1 to C20 oxyalkylene, C1 to C20 alkyleneoxy, —C ( ⁇ O) —NH—, —NH—C ( ⁇ O) —, — NH—C ( ⁇ O) —NH—, a group selected from the group consisting of hydrazine, triazole, sulfone, sulfoxide, sulfonic acid ester, sulfonamide, sulfinic acid ester, sulfinamide, piperidine and dioxane.
  • a a and A b —C ( ⁇ O) —, —C ( ⁇ O) —O—, —O—, C1-C20 oxyalkylene, C1-C20 alkyleneoxy, —O —C ( ⁇ O) —, —C ( ⁇ O) —NH— or —NH—C ( ⁇ O) — is used.
  • R is a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl group, a substituted or unsubstituted C2-C20 alkenyl group, a substituted or unsubstituted C2-C20 alkynyl group, substituted or unsubstituted A C3-C20 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted C3-C20 cycloalkenyl group, a substituted or unsubstituted C6-C20 aryl group, a substituted or unsubstituted C3-C20 heteroaryl group, an amino group, Hydroxy group or polymer carrier.
  • the polymer carrier as R is typically a polymer carrier used for solid phase synthesis.
  • Such polymer carriers are, for example, from the group consisting of polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyether, polyvinyl chloride, dextran, acrylamide, polyethylene glycol, copolymers and cross-linked products thereof, magnetic beads, and combinations thereof. Selected.
  • the polymer carrier is more preferably polystyrene, polyethylene glycol, and a crosslinked product of polyethylene glycol.
  • These polymeric carriers, adjacent groups e.g., A, etc. b or L 1
  • the shape of the polymer carrier is not particularly limited, but a spherical shape is more preferable.
  • the average particle size of the polymer carrier is preferably 100 to 400 mesh.
  • Such a polymer carrier is commercially available.
  • an aminomethyl-Chemmatrix (registered trademark) resin manufactured by Sigma-Aldrich is known as a polymer carrier comprising a polyethylene glycol crosslinked product.
  • Examples of the polymer carrier made of polystyrene resin include resins described on pages 283 to 295 of Sequel / Development of pharmaceuticals (Volume 14, Peptide Synthesis) (Yodogawa Shoten).
  • chloromethylated (Merfield) resin aminomethyl resin
  • Wang resin Pam resin
  • Rink acid resin Rink amide resin
  • oxime resin 4-methylbenzhydrylamine resin
  • PAL resin 2-chloro
  • 2-chloro Examples include trityl chloride resin.
  • the nitrogen-containing compound represented by Chemical Formula 1 according to the present invention may be in the form of a salt.
  • such salts can be formed between the anion and a positively charged substituent (eg, an amino group) on the compound described above.
  • suitable anions include chloride, bromide, iodide, sulfate, nitrate, phosphate, citrate, methanesulfonate, trifluoroacetate, acetate, malate, tosylate. , Tartrate, fumarate, glutamate, glucuronate, lactate, glutarate, maleate, and the like.
  • salts can be formed between cations and negatively charged substituents (eg, carboxyl groups) on the compounds described above.
  • suitable cations include sodium ions, potassium ions, magnesium ions, calcium ions, and ammonium cations such as tetramethylammonium ions.
  • the above-mentioned compounds include those salts containing a quaternary nitrogen atom.
  • W, X, Y, Z, p, L 0 and A a are as defined above.
  • R is other than “amino group, hydroxy group, polymer carrier”, that is, a substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl group, a substituted or unsubstituted C2-C20 alkenyl group.
  • R is preferably a substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl group or a substituted or unsubstituted C6-C20 aryl group, and is preferably a substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl group. More preferably an unsubstituted C1-C20 alkyl group, even more preferably an unsubstituted C1-C12 alkyl group, and an unsubstituted C1-C8 alkyl group. Even more preferred is an unsubstituted C1-C4 alkyl group, most preferred is a methyl group.
  • a a is —C ( ⁇ O) —, —C ( ⁇ O) —O—, —O—C ( ⁇ O) —, —O—, —C ( ⁇ O) —.
  • p may be 1 be zero, preferably p is 0 (i.e., L 0 is coupled to A a direct said aromatic heterocycles in the absence Preferably).
  • W, X, Y, Z, p, L 0 and A a are as defined for Chemical Formula 1 as in Chemical Formula 2 above.
  • R is a polymer carrier.
  • symbol (substituent) is the same as that mentioned above about Chemical formula 1.
  • a preferred form of R that is a polymer carrier is a polyethylene glycol cross-linked product (for example, aminomethyl Chemmatrix (registered trademark) resin).
  • a a is preferably —C ( ⁇ O) —NH—.
  • p may be 0 and a be 1, but preferably p is 0 (i.e., L 0 is A a is bonded directly to the aromatic heterocyclic ring in the absence Preferably).
  • An example of a preferable compound in the present embodiment is the following compound 11.
  • R that is a polymer carrier
  • a a is preferably —C ( ⁇ O) —O—.
  • p may be 1 be zero, preferably p is 0 (i.e., L 0 is coupled to A a direct said aromatic heterocycles in the absence Preferably).
  • An example of a preferable compound in the present embodiment is the following compound 12.
  • W, X, Y, Z, p, L 0 , L 1 , A a and A b are as defined for the chemical formula 1.
  • R is a polymer carrier.
  • symbol (substituent) is the same as that mentioned above about Chemical formula 1.
  • a a and A b are —C ( ⁇ O) —NH—
  • L 1 is an alkylene group of C1 to C20
  • R which is a polymer carrier is a polyethylene glycol crosslinked product (for example, aminomethyl Chemmatrix (registered trademark) resin) is preferable.
  • p may be 1 be zero, preferably p is 0 (i.e., L 0 is coupled to A a direct said aromatic heterocycles in the absence Preferably).
  • An example of a preferable compound in the present embodiment is the following compound 13 (in compound 13, L 1 is a C5 alkylene group (pentamethylene group)).
  • the starting material in the production method according to this embodiment is a compound represented by the following chemical formula 5.
  • W, Z, p, q, r, s, L 0 , L 1 , A a and A b are as defined for the chemical formula 1.
  • R ′′ is a leaving group.
  • the compound represented by Chemical Formula 5 can be synthesized, for example, according to the description in International Publication No. 2015/050199 pamphlet.
  • the starting material (compound represented by the chemical formula 5) prepared above is used as a halogen simple substance or a halogen generating reagent (for example, sulfuryl chloride, chlorine gas, phosphorus oxychloride, phosphorus pentachloride, bromine, Fluorinated alkylpyridine, fluorinated quinuclidine or iodine).
  • a halogen simple substance or a halogen generating reagent for example, sulfuryl chloride, chlorine gas, phosphorus oxychloride, phosphorus pentachloride, bromine, Fluorinated alkylpyridine, fluorinated quinuclidine or iodine.
  • W, Z, p, q, r, s, L 0 , L 1 , A a and A b are as defined for Chemical Formula 1.
  • Hal represents a halogen atom selected from fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • a halogen generating reagent such as pyridine and sulfuryl chloride is added to the compound represented by the chemical formula 5, and 1 to 2 Stir for about 2 hours. Thereafter, the reaction solution can be distilled off under reduced pressure and azeotroped with hexane or the like.
  • R is a polymer carrier, it is preferable to swell the compound represented by Chemical Formula 5 with a solvent in advance before the reaction.
  • the compound represented by Chemical Formula 6 obtained above is represented by Y—OH (Y is as defined for Chemical Formula 1) under basic conditions. React with alcohol. Thereby, the compound represented by following Chemical formula 7 is obtained (process (II)).
  • W, Y, Z, p, q, r, s, L 0 , L 1 , A a and A b are as defined for the chemical formula 1.
  • the compound represented by the chemical formula 7 corresponds to a compound in which X is —O— in the chemical formula 1.
  • step (I) When the reaction is performed in step (I), for example, the compound represented by compound 6 obtained above is dissolved in an alcohol represented by Y—OH.
  • Y-O - acts alkoxide ion as a nucleophile represented by, Hal - nucleophilic substitution reactions halide ion is desorbed represented by sulfur Progress on atoms.
  • the compound represented by the chemical formula 7 is generated.
  • the type of base to be added is not particularly limited, but a lower nucleophilic base such as N, N-diisopropylethylamine (DIPEA; Hunig base) is preferably used because it has a lower nucleophilicity.
  • DIPEA N-diisopropylethylamine
  • the method for producing the compound according to the present invention has been described by taking the compound in which X is —O— in the above Chemical Formula 1 (the compound represented by Chemical Formula 7) as an example. If there is, it can be manufactured appropriately.
  • the compound represented by the chemical formula 6 obtained above is reacted with an amine represented by Y—NH 2 in a suitable organic solvent. By the same reaction mechanism, production is possible.
  • the nitrogen-containing compound (or salt thereof) of the present invention described above has a function as a disulfating reagent. It was also found that the nitrogen-containing compound according to the present invention is chemically extremely stable so that it can be stored at room temperature (25 ° C.). Furthermore, by using the nitrogen-containing compound according to the present invention as a disulfide reagent, two free molecules located in the molecule of an organic compound such as a peptide can be obtained in a short time by a simple treatment and by a chemically stable method.
  • the use as a disulfide reagent is novel also about the compound which satisfy
  • An example of a preferable disulfating reagent in the present embodiment is one containing any one of the following compounds 14a to 14j as an active ingredient.
  • R is a polymer carrier used in the solid phase synthesis method in Chemical Formula 1 described above, a nitrogen-containing compound having disulfation activity can be immobilized on the polymer carrier used in the solid phase synthesis method. . Therefore, in this case, it can be used as a solid-phase-supported reagent that selectively acts on two free thiol groups located in the molecule of an organic compound such as a peptide.
  • Still another embodiment of the present invention has two or more free thiol groups in the molecule using the above-described nitrogen-containing compound according to the present invention as a disulfide reagent (preferably, a solid-supported disulfide reagent).
  • the present invention relates to a method for introducing a disulfide bond (—S—S—) into a compound.
  • a compound having two or more free thiol groups in the molecule is brought into contact with the above-described disulfide reagent comprising the nitrogen-containing compound (or a salt thereof) according to the present invention.
  • It is a manufacturing method of a disulfide containing compound including forming a disulfide bond between two said free thiol groups, and obtaining a disulfide containing compound.
  • the structure of the “compound having two or more free thiol groups in the molecule” which is a target for introducing a disulfide bond is not particularly limited.
  • the “compound having two or more free thiol groups in the molecule” include amino acid residue-containing compounds such as amino acids and peptides (oligopeptides, polypeptides (including antibodies and other proteins)), and polymers. Examples thereof include compounds, low molecular weight compounds, and derivatives containing their isotopes.
  • the peptide When the “compound having two or more free thiol groups in the molecule” is a peptide, the peptide may be naturally derived or may be artificially synthesized. When the peptide is artificially synthesized, the synthesis method is not particularly limited, and conventionally known knowledge can be appropriately referred to. As an artificial peptide synthesis method, a “solid phase synthesis method” and a “liquid phase synthesis method” are known, and in the case of a solid phase synthesis method, an Fmoc method and a Boc method are further known. When the “compound having two or more free thiol groups in the molecule” is a peptide, the peptide may be synthesized by any method. The solid phase synthesis method will be briefly described as an example.
  • beads of polystyrene polymer gel having a diameter of about 0.1 mm whose surface is modified with an amino group are used as a solid phase, and N, N′-diisopropyl is used as a condensing agent.
  • Carbodiimide is used.
  • racemization can be suppressed while improving the reaction rate.
  • the amino group of the C-terminal amino acid is protected with an Fmoc group or a Boc group to form a peptide bond with the amino group of the polystyrene polymer gel.
  • the solid phase is thoroughly washed with a solvent, and the remaining reagents and amino acids are washed and removed.
  • a peptide is synthesized on a solid phase by sequentially repeating the same reaction using an amino acid whose amino group is Fmoc group or Boc group protected. Finally, by digesting the solid phase with trifluoroacetic acid (TFA), the peptide can be separated from the solid phase and the peptide can be synthesized.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the “compound having two or more free thiol groups in the molecule” to be a target for introducing a disulfide bond by the above-described method is “a compound having two free thiol groups in the molecule”. According to such a form, a disulfide bond can be formed between the two free thiol groups of the “compound having two free thiol groups in the molecule”, and the desired disulfide-containing compound can be produced in a high yield. It can be produced with high purity.
  • the target for introducing a disulfide bond is a “compound having two free thiol groups in the molecule”
  • the compound is a peptide
  • the cysteine residue or cysteine amide residue is changed to 3
  • Such introduction of a protecting group can be usually achieved by introducing an amino acid having a thiol group protected at a desired position during the synthesis of a peptide as described above.
  • Examples of the protecting group for the thiol group in the “amino acid in which the thiol group is protected” used in peptide synthesis in such a method include, for example, t-butyl group, trityl group, benzhydryl group, benzyl group, methyl group, and the like.
  • Benzyl group dimethylbenzyl group, trimethylbenzyl group, methoxybenzyl group, dimethoxybenzyl group, trimethoxybenzyl group, nitrobenzyl group, acetamidomethyl group, 9-fluorenylmethyl group, carbonylbenzyloxy group, diphenylbenzyl group, ethyl
  • a carbamoyl group, a picolyl group, a sulfonyl group or a salt thereof may be mentioned.
  • disulfation manufacturing a disulfide-containing compound
  • the disulfide reagent according to the present invention is a solid phase supported disulfide reagent.
  • a “compound having two (or more) free thiol groups in the molecule”, which is a target for introducing a disulfide bond, is dissolved in a solvent.
  • the compound is dissolved in water or an organic solvent containing 1% (v / v) or more of water.
  • the pH at this time is preferably near neutral, and is preferably 6.5 to 8.5.
  • it can replace with water and a buffer solution can be used and you may use it combining any of water, a buffer solution, and an organic solvent.
  • an organic solvent miscible with water is preferable, and examples thereof include acetonitrile, dimethylformamide, acetone, dimethyl sulfoxide, alcohol, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane and the like.
  • the solution of “compound having two (or more) free thiol groups in the molecule” prepared above is mixed with the solid-supported disulfide reagent according to the present invention.
  • the solid phase supported disulfide reagent according to the present invention may be added to the container containing the solution, or the solution may be added to the container containing the solid phase supported disulfide reagent according to the present invention.
  • the form and material of a container are not limited, Preferably it is a stirrable container with a filter for filtration, such as a tube with a filter. Mixing may be carried out while the container is left standing, but it is preferable to carry out mixing by shaking, stirring with a shaker for solid phase synthesis, a magnetic stirrer, a vortex mixer, a three-one motor or the like.
  • the reaction can be carried out usually in 5 minutes to 2 hours depending on the reaction caused by the above mixing.
  • the addition amount of the solid phase supported disulfide reagent according to the present invention used in this reaction may be increased or decreased depending on the amount of “compound having two (or more) free thiol groups in the molecule”.
  • Completion of the reaction may be judged based on a general analytical method for consumption of “compound having two (or more) free thiol groups in the molecule” in the solution.
  • applicable analytical methods include HPLC, NMR, TLC, IR, MS spectrum, titration and the like.
  • the raw material compound is a peptide containing three or more cysteine residues or cysteine amide residues, and at least one thiol group of the cysteine residue or cysteine amide residue is protected with a protecting group
  • a conventionally known technique can be used as such a deprotection technique.
  • a disulfide bond can be further introduced between the deprotected thiol groups simultaneously with the deprotection of the thiol groups (Example 2 described later).
  • -3 see “Synthesis of ⁇ -conotoxin ImI”.
  • the compound in which the “compound having a free thiol group” is changed as the reaction proceeds is separated by filtration, and a disulfide-containing compound is obtained in the filtrate.
  • the filtration does not depend on the equipment used or the filtration technique. Examples of the instrument include filter paper, glass fiber, filter aid, filter cloth, membrane filter, and glass filter.
  • filtration methods include natural filtration, suction filtration, centrifugation, decantation, and the like, and can be appropriately selected depending on the application and reaction scale.
  • the separation operation of the product and the disulfide reagent can be simplified as filtration by forming the disulfide reagent in the form of a solid phase reagent comprising a nitrogen-containing compound in a form solidified on a polymer carrier. This is possible only by simple operation. Therefore, it can be said that the disulfide reagent according to the present invention, particularly in the form of a solid phase reagent, is an invention having an extremely high advantage in the technical field of organic synthesis (particularly peptide synthesis).
  • Example 1 As an example of the compound of the present invention, synthesis examples of compounds 2a to 2i are shown below.
  • Compound 1b was synthesized in the same manner as Compound 2a using Compound 1 (100 mg, 0.329 mmol) and n-butanol (6 mL) (yellow solid, 72.3 mg, 77% for 2 steps).
  • Compound 1c was synthesized using Compound 1 (100 mg, 0.329 mmol) and 2-propanol (6 mL) in the same manner as Compound 2a (yellow solid, 25.4 mg, 2 steps 29%).
  • Compound 2d was synthesized in the same manner as Compound 2a using Compound 1 (200 mg, 0.329 mmol) and t-butyl alcohol (3 mL) (yellow solid, 38.0 mg, 2 steps 20%). .
  • Compound 1e was synthesized in the same manner as Compound 2a using Compound 1 (100 mg, 0.329 mmol) and benzyl alcohol (6 mL) (yellow solid, 84.9 mg, 81% for 2 steps).
  • Compound 2g was synthesized in the same manner as Compound 2f using Compound 1 (100 mg, 0.328 mmol) and o-methoxyphenol (0.328 mmol) (yellow viscous substance, 12.9 mg, 2 steps) 12%).
  • Compound 2h was synthesized in the same manner as Compound 2f using Compound 1 (100 mg, 0.328 mmol) and p-bromobenzyl alcohol (61.3 mg, 0.328 mmol) (yellow solid, 65. 1 mg, 50% for 2 steps).
  • the obtained residue was dissolved in 1,2-dichloroethane (1 mL), and protected from light at room temperature in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt ⁇ H 2 O, 49 mg, 0.32 mmol) and pyridine (0.1 mL, 1.29 mmol) was added and stirred at the same temperature for 30 minutes.
  • the reaction solution was evaporated under reduced pressure, and the resulting residue was diluted with chloroform, washed with 5% aqueous citric acid solution, water and saturated brine, and dried over Na 2 SO 4 .
  • Example 2 A disulfide-containing peptide was synthesized by forming a disulfide bond in the molecule of a peptide having two free thiol groups using the nitrogen-containing compound according to the present invention synthesized above as a selective disulfating agent.
  • Example 2-1 (a): Synthesis of Oxytocin Using Compound 2a According to the following scheme, a pair of disulfide bonds (N-terminal side) was formed in the molecule using Compound 2a synthesized above as a selective disulfating agent.
  • oxytocin (peptide 4), which is a nonapeptide (9 amino acids) having the first and sixth cysteine residues).
  • the peptide chain was elongated by the Fmoc-solid phase peptide synthesis method.
  • TFA H 2 O: triisopropylsilane: 1,2-ethanedithiol (94: 2.5: 1.0: 2.5 (volume ratio), 10 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After the reaction solution was filtered and TFA was removed, ether was added to precipitate the peptide.
  • the disulfide can be introduced into the peptide molecule in a short time by a very simple treatment and in a chemically stable manner. It has been shown that it is possible to synthesize disulfide-containing peptides by introducing bonds.
  • the presumed reaction mechanism in which a disulfide bond is introduced in this example is as follows.
  • Oxytocin (peptide 4) was synthesized by the method. Then, the synthesis of oxytocin (peptide 4) was confirmed by analyzing the fraction detected as the main peak by TOF-MS in the same manner as described above.
  • Example 2-1 (c) Synthesis of oxytocin using compound 2c The same as Example 2-1 (a) described above, except that compound 2c was used as the selective disulfating agent instead of compound 2a.
  • Oxytocin (peptide 4) was synthesized by the method. Then, the synthesis of oxytocin (peptide 4) was confirmed by analyzing the fraction detected as the main peak by TOF-MS in the same manner as described above.
  • Example 2-1 (d) Synthesis of oxytocin using compound 2d The same as Example 2-1 (a) described above, except that compound 2d was used as the selective disulfating agent instead of compound 2a.
  • Oxytocin (peptide 4) was synthesized by the method. Then, the synthesis of oxytocin (peptide 4) was confirmed by analyzing the fraction detected as the main peak by TOF-MS in the same manner as described above.
  • Example 2-1 (a) to Example 2-1 (d) analysis of the reaction solution after 1 hour, 3 hours and 6 hours after the addition of the selective disulfating agent by HPLC was used to measure the yield of oxytocin (peptide 4). The results are shown in Table 1 below.
  • Example 2-2 Synthesis of Human Atrial Natriuretic Peptide (Human ANP) (Peptide 6) According to the following scheme, a pair of disulfide bonds (in the 7th and 23rd cysteine residues from the N-terminal side) was formed in the molecule. ) was synthesized as a human atrial natriuretic peptide (human ANP) (peptide 6).
  • the disulfide reagent comprising the nitrogen-containing compound (or salt thereof) according to the present invention introduces a disulfide bond into the molecule and contains disulfide even if a relatively large polypeptide of 28 amino acids is used as a raw material. It can be seen that it is possible to synthesize peptides.
  • Example 2-3 Synthesis of ⁇ -conotoxin ImI (peptide 9) According to the following scheme, two pairs of disulfide bonds (between the 1st and 10th cysteine residues from the N-terminal side and the 5th and 11th in the molecule) ⁇ -conotoxin ImI (peptide 9), which is a polypeptide (between 12 th cysteine residues) (12 amino acids), was synthesized.
  • the thiol groups of the 3rd and 12th cysteine residues from the N-terminal side of peptide 7 are protected with an N- (acetyl) aminomethyl group (Acm group), and this Acm group is selectively oxidized by iodine oxidation. Can be deprotected.
  • the nitrogen-containing compound (or a salt thereof) according to the present invention is disulfidated. It can be seen that the method for producing a disulfide-containing peptide used as a reagent provides an extremely powerful synthetic means.
  • Example 3 Forming a disulfide bond in the molecule of a peptide having two free thiol groups using the nitrogen-containing compound according to the present invention synthesized above as a selective disulfating agent on a polymer carrier. was used to synthesize disulfide-containing peptides.
  • Example 3-1 Synthesis of Solid-Phase Disulfide Reagent (Compound 11) A nitrogen-containing compound (Compound 11) in which R in Chemical Formula 1 is a polymer carrier (polyethylene glycol crosslinked product) was synthesized according to the following scheme.
  • Example 3-2 Synthesis of Oxytocin (Peptide 4) Using Immobilized Disulfide Reagent (Compound 11) According to the following scheme, Example 2-1 was conducted using Compound 11 as an immobilized disulfide reagent. Oxytocin (peptide 4) was synthesized from peptide 3 by the same method as in (a).
  • disulfide reagent used in this example is a solid phase reagent, it is recovered by filtration of the reaction solution and does not appear as a peak in the HPLC chart. In this way, disulfide-containing peptides can be produced in a high yield in a very short time by using a solid-phased reagent consisting of a nitrogen-containing compound in the form of a solid-phased polymer support. It is.
  • the separation operation of the product and the disulfide reagent can be performed only by a simple operation of filtration. Therefore, it can be said that the disulfide reagent according to the present invention, particularly in the form of a solid phase reagent, is an invention having an extremely high advantage in the technical field of organic synthesis (particularly peptide synthesis).
  • Example 4 As an example of the compound of the present invention, synthesis examples of compounds 16a to 16j are shown below.
  • N, N-diisopropylethylamine (2.72 mL, 18.9 mmol) was added to a methanol (150 mL) solution of Npys-Cl (2.4 g, 12.6 mmol) under ice-cooling and stirring at room temperature. Stir for 3 hours. The reaction solution was evaporated under reduced pressure, and the resulting residue was diluted with chloroform, washed with 10% aqueous citric acid solution, water and saturated brine, and dried over Na 2 SO 4 .
  • Npys-Cl 50 mg, 0.26 mmol
  • 1,2-dichloroethane 0.8 mL
  • benzyl alcohol 28.4 mg, 0.26 mmol
  • N, N-diisopropylethylamine 174 ⁇ L, 1.04 mmol
  • the reaction solution was evaporated under reduced pressure, and the resulting residue was diluted with chloroform, washed with 5% aqueous citric acid solution, water and saturated brine, and dried over Na 2 SO 4 .
  • Example 5 Synthesis of Oxytocin Using Compound 16a
  • Oxytocin (peptide 4) was synthesized.
  • disulfide reagents consisting of nitrogen-containing compounds (or their salts) that do not have an ester structure can also be used to introduce disulfide bonds into peptide molecules in a short time and using a chemically stable method.
  • disulfide-containing peptides can be synthesized.
  • Example 6 A disulfide-containing peptide was synthesized by forming a disulfide bond between two free thiol groups of a peptide supported on a resin using the nitrogen-containing compound according to the present invention synthesized above as a selective disulfating agent.
  • a selective disulfating reagent comprising a nitrogen-containing compound (or a salt thereof) can synthesize a disulfide-containing peptide by forming a disulfide bond between two free thiol groups of the peptide supported on the resin. It was shown that there is.
  • Example 7 Stability evaluation of compound 2a
  • 1 H NMR analysis charts are shown in FIGS. 9 and 10, respectively.
  • Example 8 (Confirmation of presence or absence of side reaction by compound 2a) As a side reaction of iodine oxidation, iodination reaction on the side chains of tryptophan, tyrosine and histidine has been reported (B. Kamber, et al., Helv. Chim. Acta. 1980, 899-915.). Then, the presence or absence of the side reaction of the compound 2a which is the nitrogen-containing compound of the present invention was confirmed by the same method as in the above paper.

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Abstract

【課題】簡便な処理によって短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチド等の有機化合物の分子内に位置する２つの遊離チオール基に対して選択的にジスルフィド結合を導入しうる手段を提供する。 【解決手段】下記化学式１で表される含窒素化合物またはその塩： 化学式１中の符号は、明細書において定義されている通りである。

Description

含窒素化合物を用いた選択的ジスルフィド化試薬、およびジスルフィド含有化合物の製造方法
　本発明は、有機合成（特に、ペプチド合成等）において、アミノ酸またはペプチド等に含まれるチオール基（－ＳＨ基）の選択的ジスルフィド化試薬として使用可能なピリジン誘導体に関する。また、本発明は、当該ジスルフィド化試薬を用いるジスルフィド含有化合物の製造方法に関する。
　従来、ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）含有ペプチドの合成方法として、固相法または液相法により、保護されたシステイン（Ｃｙｓ）残基を含む保護ペプチドシーケンスを合成し、全保護基を一旦脱保護することにより遊離のチオール基を有するペプチドを得て、さらに空気酸化法またはヨウ素酸化法を用いて分子内にジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）を形成する方法が知られている。
　しかしながら、空気酸化法はジスルフィド結合の形成に長時間を必要とするという問題点がある。また、ヨウ素酸化法は反応時にチロシン、ヒスチジンおよびトリプトファンに対してもヨウ素酸化が起こることが知られており、選択性が十分ではないという問題がある。また、これらの方法を用いて分子内にジスルフィド結合を形成させる際、反応系内における遊離チオール基含有ペプチドの濃度が高すぎると、分子間でジスルフィド結合が形成されて架橋異性体が生成してしまい、所望のジスルフィド含有ペプチドの収率が低下するばかりか、所望のペプチドを架橋異性体から分離精製する操作が必要となるという問題もあり、さらに、一般に高希釈下に反応を行う必要があるという問題もある。
　その他、ジスルフィド結合を化学的に形成させる方法として、タリウム（ＩＩＩ）トリフルオロアセテート法（非特許文献１を参照）、Ｓ－保護システインスルホキシド法（非特許文献２を参照）、およびシリルクロライド－スルホキシド法（非特許文献３を参照）が脱保護と同時にジスルフィド結合を形成させる反応として報告されている。また、システインのチオール基の保護基として３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ基）を用い、遊離のチオール基と反応させることにより容易に分子間ジスルフィド結合を形成できることも報告されている（非特許文献４を参照）。
　さらに、特許文献１には、チオール基をＮｐｙｓ基で保護したシステインまたはシステイン含有保護ペプチドを遊離のチオール基を有するシステインまたはシステイン含有保護ペプチドと反応させることにより、ジスルフィド結合の形成反応とペプチド結合の形成反応とを逐次反応として進行させて、ジスルフィド含有ペプチドを製造する方法が提案されている。
特開平６－８０６９１号公報
Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９８７，　１６３－１６４ Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９８７，　１６７６－１６７８ Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９９１，　１６７－１６８ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　１９８２，　９２１－９２４
　しかしながら、特許文献１に記載の方法においてチオール基を保護するためのＮｐｙｓ基の導入に用いられる試薬である３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニルクロライド（Ｎｐｙｓ－Ｃｌ）は反応性に富み化学的に不安定な化合物であることから、チオール基のみならず種々の官能基（アミノ基、水酸基など）と反応するという問題がある。ここで、文献（Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．２，１９８１）には、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニルハライドに関して、「Ｔｈｅｙ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｉｌｙ　ｓｔａｂｌｅ　ｓｏｌｉｄｓ　ｔｈａｔ　ｃａｎ　ｂｅ　ｓａｆｅｌｙ　ｓｔｏｒｅｄ　ａｔ　ｌｅａｓｔ　ｏｎｅ　ｙｅａｒ　ｉｎ　ａ　ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒ．」との記載がある。しかしながら、実際にはその反応性の高さから、上記化合物を室温で保存することはできず、また保存中に湿気（水分）などで分解したり、アルコールやアミンなどを含む溶液やわずかに塩基性の溶液においても不安定であるなど、実際の保存は容易ではない。さらに、特許文献１に記載の方法は、２種の保護ペプチドシーケンスをまず合成した後にジスルフィド結合の形成とペプチド結合の形成とを段階的に行い、その後さらに脱保護処理を施すことを前提としている。このため、保護・脱保護の処理が必要となるなど、操作が煩雑であるという問題もある。
　そこで本発明は、簡便な処理によって比較的短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチド等の有機化合物の分子内に位置する２つの遊離チオール基に対して選択的にジスルフィド結合を導入しうる手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その過程で、驚くべきことに、所定の化学構造を有する含窒素化合物をジスルフィド化試薬として用いることで上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。なお、上記所定の化学構造を有する含窒素化合物の大部分は新規な化合物である。
　すなわち、本発明の一形態によれば、新規な含窒素化合物として、下記化学式１で表される化合物またはその塩が提供される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
化学式１において、
　Ｗは、他の環員原子と一緒になって、ピリジン環、ピラジン環、イミダゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、フェナントロリン環、プテリジン環およびアゾシン環からなる群から選択される含窒素複素環を形成し、
　Ｘは、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
　Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基であり、
　Ｚは、前記含窒素複素環上に存在する水素原子または電子吸引性の置換基を表し、
　ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立して、０または１であり、
　ｓは、０～１０の整数を表し、
　Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表し、
　ＡａおよびＡｂは、それぞれ独立して、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、Ｃ１～Ｃ２０のオキシアルキレン、Ｃ１～Ｃ２０のアルキレンオキシ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基であり、
　ｓは、０～１０の整数を表し、
　Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基、または高分子担体である；
　ただし、上記窒素含有化合物の範囲からは、以下の化合物を除くものとする：
（Ａ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸メチル
（Ｂ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸エチル
（Ｃ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル
（Ｄ）Ｎ－（３’－ニトロ－２’－ピリジンスルフェニルオキシ）－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミド
（Ｅ）（Ｓ）－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）プロパン酸
（Ｆ）（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）ブタン酸
（Ｇ）４－（（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）メチル）安息香酸
（Ｈ）（Ｓ）－２－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）－３－フェニルプロパン酸。
　また、本発明の他の形態によれば、上述した含窒素化合物またはその塩、あるいは、上記の化合物（Ａ）～（Ｈ）のいずれかからなる、チオール基のジスルフィド化試薬が提供される。ここで、上記（Ａ）～（Ｈ）の化合物（３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸誘導体）は公知の化合物であるが、当該化合物がチオール基のジスルフィド化試薬として機能することについては従来知られていない。
　また、本発明のさらに他の形態によれば、分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物を、上述したジスルフィド化試薬と接触させ、２つの前記遊離チオール基の間でジスルフィド結合を形成させてジスルフィド含有化合物を得ることを含む、ジスルフィド含有化合物の製造方法が提供される。
　また、本発明のさらに他の形態によれば、上述した含窒素化合物またはその塩の製造方法が提供される。
　本発明によれば、簡便な処理によって比較的短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチド等の有機化合物の分子内に位置する２つの遊離チオール基に対して選択的にジスルフィド結合を導入しうる手段が提供される。
後述する実施例２－１において、ペプチド３からペプチド４を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）および添加６時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例２－２において、ペプチド５からペプチド６を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）、添加６時間後（Ｃ）および添加２４時間後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例２－３において、ペプチド７からペプチド８を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加４時間後（Ｂ）、添加９時間後（Ｃ）および添加２７時間後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例２－３において、ペプチド８からペプチド９を合成した際の、ヨウ素の添加前（Ａ）、添加２分後（Ｂ）、添加１時間後（Ｃ）およびＨＰＬＣ精製後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 （Ａ）後述する実施例２－３で合成されたα－コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）、（Ｂ）市販のα－コノトキシンＩｍＩの標品サンプル、（Ｃ）これらの混合サンプルのそれぞれについてＨＰＬＣ分析を行った結果を示すチャートである。 後述する実施例３－２において、固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）を用いてペプチド３からペプチド４を合成した際の、反応開始３分以内（Ａ）、反応開始１時間後（Ｂ）および反応開始３時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例５において、ペプチド３からペプチド４を合成した際の、化合物１６ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）および添加３時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例６において、ペプチド固相合成により得たオキシトシン－樹脂１７からオキシトシン（ペプチド４）を合成した際の、得られた粗生成物（Ｂ）のＨＰＬＣ 後述する実施例７において、化合物２ａの安定性を評価した際の、ＨＰＬＣ分析結果を示すチャートである。 後述する実施例７において、化合物２ａの安定性を評価した際の、１Ｈ　ＮＭＲ分析結果を示すチャートである。
　以下、本発明の実施形態を説明する。
　本発明の一形態は、新規な含窒素化合物に関し、具体的には、下記化学式１で表される含窒素化合物またはその塩に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　化学式１において、Ｗは、他の環員原子と一緒になって、ピリジン環、ピラジン環、イミダゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、フェナントロリン環、プテリジン環およびアゾシン環からなる群から選択される含窒素複素環を形成する。ここで、Ｗは、他の環員原子と一緒になって、前記含窒素複素環としてのピリジン環を形成することが好ましい。
　化学式１において、Ｘは、－Ｏ－または－ＮＨ－である。なかでも、Ｘは－Ｏ－であることが好ましい。
　化学式１において、Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基である。ここで、「電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基」は、電子吸引性構造を有する脂肪族ヘテロ環化合物などに相当するものとして、例えば、ペプチド合成におけるカルボン酸の活性エステルを形成するアルコールからヒドロキシ基を除いた１価の基が挙げられる。より詳細には、続・医薬品の開発（第１４巻、ペプチド合成）（廣川書店）の第１６４～１７３頁の表５．７～５．１１に記載されている１価の基、または当該頁に記載されている化合物由来の１価の基が挙げられる。なお、これらの基の具体例は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　なかでも、「電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基」は、置換または非置換の、スクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基または５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミジル基であることが好ましい。また、Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、または置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基であることが好ましく、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基であることがより好ましく、非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基であることがさらに好ましく、非置換のＣ１～Ｃ１２のアルキル基であることがいっそう好ましく、非置換のＣ１～Ｃ８のアルキル基であることがさらにより好ましく、非置換のＣ１～Ｃ４のアルキル基であることが特に好ましく、メチル基であることが最も好ましい。
　本明細書において、アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、ｎ－ヘキシル基、１，３－ジメチルブチル基、１－イソプロピルプロピル基、１，２－ジメチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、１，４－ジメチルペンチル基、２－メチル－１－イソプロピルプロピル基、１－エチル－３－メチルブチル基、ｎ－オクチル基、２－エチルヘキシル基、３－メチル－１－イソプロピルブチル基、２－メチル－１－イソプロピル基、１－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルプロピル基、ｎ－ノニル基、３，５，５－トリメチルヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書において、アルケニル基の例としては、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、ペンテニル基、１－ヘキセニル基、３，３－ジメチル－１－ブテニル基などが挙げられる。
　本明細書において、アルキニル基の例としては、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、１－ブチニル基、２－ブチニル基、３－ブチニル基、３－メチル－１－プロピニル基、２－メチル－３－プロピニル基、ペンチニル基、１－ヘキシニル基、３－メチル－１－ブチニル基、３，３－ジメチル－１－ブチニル基などが挙げられる。
　本明細書において、シクロアルキル基の例としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基などが挙げられる。
　本明細書において、シクロアルケニル基の例としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
　本明細書において、アリール基の例としては、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、１－アントラセニル基、２－アントラセニル基、９－アントラセニル基などが挙げられる。
　本明細書において、ヘテロアリール基の例としては、２－チエニル基、４－ピリジル基、３－ピリジル基、２－ピリジル基、１－ピリジル基、２－フリル基、２－ピリミジニル基、２－ベンゾチアゾリル基、１－イミダゾリル基、１－ピラゾリル基、ベンゾトリアゾール－１－イル基、７－アザベンゾトリアゾール－１－イル基などが挙げられる。
　また、本明細書において、ある基が「置換されている」という場合、当該基を置換しうる置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アシル基、アルキルスルファニル基、アリールスルファニル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ホルミル基、メルカプト基、スルホ基、スルフィン酸基、グアニジノ基、カルバモイル基、チオール基、チオエーテル基、メシル基、ｐ－トルエンスルホニル基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、トリメチルシリル基、ホスフィニコ基、ホスホノ基などが挙げられる。これらの置換基もまた、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基などによってさらに置換されていてもよい。ただし、置換された後の基が置換される前の基と同じ定義に含まれるような置換は考えないものとする。
　化学式１において、Ｚは、前記含窒素複素環上に存在する水素原子または電子吸引性の置換基を表し、なかでも、電子吸引性の置換基であることが好ましい。ここで、電子吸引性の置換基としては、例えば、ニトロ基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アセチル基、メタンスルホニル基、トリフルオロアセチル基、トリフルオロメタンスルホニル基、シアノ基などが挙げられる。なかでも、ニトロ基、トリフルオロメチル基またはハロゲン原子が好ましく、ニトロ基が最も好ましい。
　化学式１において、ｐは、０または１である。ｐが０のときにはＬ０は存在せずにＡａまたはＡｂまたはＲが直接含窒素複素環に結合し、ｐが１のときにはＬ０が存在する。
　化学式１において、ｑは、０または１である。ｑが０のときにはＬ１は存在せず、ｑが１のときにはＬ１が存在する。
　化学式１において、ｒは、０または１である。ｒが０のときにはＡｂは存在せず、ｒが１のときにはＡｂが存在する。
　化学式１において、ｓは、０～１０の整数である。ｓが０のときには［（Ａａ）－（Ｌ１）ｑ］が存在せず、ｓが１～１０の整数のときには［（Ａａ）－（Ｌ１）ｑ］がｓ個繰り返して存在する。なお、ｓは好ましくは０～５であり、より好ましくは０または１である。
　Ｌ０およびＬ１は、存在する場合にはそれぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表す。このようなリンカーの具体的な構造について特に制限はないが、例えば、置換または非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキレン基、置換または非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニレン基、置換または非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換のＣ６～Ｃ２０のアリーレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、ポリオキシアルキレン基が挙げられる。また、Ｌ０およびＬ１は、下記化学式（ａ）で表される基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
であってもよい。ここで、化学式（ａ）において、Ｒａは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１５のアルキレン基を表し、好ましくはＣ１～Ｃ８のアルキレン基を表し、より好ましくはＣ１～Ｃ４のアルキレン基を表し、特に好ましくはＣ１～Ｃ２のアルキレン基を表し、最も好ましくはＣ２のアルキレン基（特にはエチレン基）を表す。Ｌ０およびＬ１として好ましくは、Ｃ１－Ｃ６のアルキレン基（特にはエチレン基）、分子量１００～１０００のポリオキシアルキレン基、または上記化学式（ａ）で表される基が用いられる。
　化学式１において、ＡａおよびＡｂは、存在する場合にはそれぞれ独立して、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、Ｃ１～Ｃ２０のオキシアルキレン、Ｃ１～Ｃ２０のアルキレンオキシ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基である。なかでも、ＡａおよびＡｂとして好ましくは、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－、Ｃ１～Ｃ２０のオキシアルキレン、Ｃ１～Ｃ２０のアルキレンオキシ、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－または－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－が用いられる。
　化学式１において、Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基または高分子担体である。Ｒとしての高分子担体は、典型的には、固相合成法に用いられる高分子担体である。このような高分子担体は、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエーテル、ポリ塩化ビニル、デキストラン、アクリルアミド、ポリエチレングリコール、これらの共重合体および架橋体、磁性ビーズ、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。当該高分子担体は、より好ましくはポリスチレン、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールの架橋体である。これらの高分子担体は、隣接する基（例えば、ＡｂやＬ１など）との間でメチル基などのアルキル基などを介して結合していてもよい。なお、高分子担体の形状については特に制限はないが、球状がより好ましく、この際、高分子担体の平均粒径は、好ましくは１００～４００ｍｅｓｈである。このような高分子担体は市販されており、例えば、ポリエチレングリコール架橋体からなる高分子担体としては、シグマ－アルドリッチ社製のアミノメチル－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂が知られている。また、ポリスチレン樹脂からなる高分子担体としては、続・医薬品の開発（第１４巻、ペプチド合成）（廣川書店）の第２８３～２９５頁に記載されているような樹脂が挙げられる。具体的には、例えば、クロロメチル化（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂、アミノメチル樹脂、Ｗａｎｇ樹脂、Ｐａｍ樹脂、Ｒｉｎｋ　ａｃｉｄ樹脂、Ｒｉｎｋアミド樹脂、オキシム樹脂、４－メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＬ樹脂、２－クロロトリチルクロライド樹脂などが挙げられる。
　なお、本発明に係る化学式１の含窒素化合物は、塩の形態であってもよい。例えば、このような塩は、上述した化合物上に、アニオンと正に帯電した置換基（例えば、アミノ基）との間で形成されうる。この際、適切なアニオンとしては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、トシル酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩（ｆｕｍｕｒａｔｅ）、グルタミン酸塩、グルクロン酸塩、乳酸塩、グルタル酸塩、およびマレイン酸塩などが挙げられる。同様に、このような塩は、上述した化合物上で、カチオンと負に帯電した置換基（例えば、カルボキシル基）との間で形成されうる。この際、適切なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオンのようなアンモニウムカチオンが挙げられる。上述した化合物には、４級窒素原子を含むこれらの塩も含まれる。
　本発明の一形態に係る新規な含窒素化合物またはその塩の概念からは、以下の化合物は除かれている（すなわち、以下の化合物は公知の化合物である）。
（Ａ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸メチル
（Ｂ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸エチル
（Ｃ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル
（Ｄ）Ｎ－（３’－ニトロ－２’－ピリジンスルフェニルオキシ）－５－ノルボルネン－２，３ジカルボキシイミド
（Ｅ）（Ｓ）－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）プロパン酸
（Ｆ）（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）ブタン酸
（Ｇ）４－（（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）メチル）安息香酸
（Ｈ）（Ｓ）－２－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）－３－フェニルプロパン酸。
　なお、これらの化合物（Ａ）～（Ｈ）はいずれも、上記化学式１においてｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０を満たし、かつ、Ｒが水素原子である化合物に相当する。本形態に係る含窒素化合物またはその塩は、上記化学式１において、「ｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０、かつ、Ｒ＝水素原子」の条件を満たすものではないことが好ましい。
　以下では、本発明に係る化学式１の含窒素化合物について、いくつかの好ましい実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は以下の形態のみには限定されない。
　（第１の好ましい実施形態）
　本発明に係る化学式１の含窒素化合物についての第１の好ましい実施形態は、ｑが０であり、ｒが０であり、ｓが１である。これにより、化学式１の化合物は、下記化学式２で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　そして、化学式２において、
　Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０およびＡａは、上記で定義した通りである。
　また、本実施形態において、Ｒは、「アミノ基、ヒドロキシ基、高分子担体」以外のもの、すなわち、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、または置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基である。
　本実施形態においても、各符号（置換基）の好ましい形態は化学式１について上述したのと同様である。ただし、本実施形態において、Ｒは、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、または置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基であることが好ましく、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基であることがより好ましく、非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基であることがさらに好ましく、非置換のＣ１～Ｃ１２のアルキル基であることがいっそう好ましく、非置換のＣ１～Ｃ８のアルキル基であることがさらにより好ましく、非置換のＣ１～Ｃ４のアルキル基であることが特に好ましく、メチル基であることが最も好ましい。
　さらに、本実施形態において、Ａａは、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－および－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択される基であることが好ましく、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－および－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択される基であることがより好ましく、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－または－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－であることが特に好ましく、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－であることが最も好ましい。
　また、本実施形態において、ｐは０であっても１であってもよいが、好ましくはｐは０である（すなわち、Ｌ０は存在せずにＡａが直接上記芳香族複素環に結合していることが好ましい）。
　本実施形態に係る化合物の例を挙げると、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　（第２の好ましい実施形態）
　本発明に係る化学式１の含窒素化合物についての第２の好ましい実施形態は、ｑが０であり、ｒが０であり、ｓが１である。これにより、化学式１の化合物は、上記化学式２と同様、下記化学式３で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　そして、化学式３において、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０およびＡａは、上記化学式２と同様、前記化学式１について定義した通りである。一方、本実施形態において、Ｒは、高分子担体である。ここで、本実施形態においても、各符号（置換基）の好ましい形態は化学式１について上述したのと同様である。
　ただし、本実施形態において、高分子担体であるＲの好ましい一形態はポリエチレングリコール架橋体（例えば、アミノメチルＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂）である。この場合、Ａａは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－であることが好ましい。そして、この場合において、ｐは０であっても１であってもよいが、好ましくはｐは０である（すなわち、Ｌ０は存在せずにＡａが直接上記芳香族複素環に結合していることが好ましい）。本実施形態における好ましい化合物の一例は、以下の化合物１１である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　同様に、本実施形態において、高分子担体であるＲの好ましい他の形態はポリスチレン樹脂である。この場合、Ａａは、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－であることが好ましい。そして、この場合においても、ｐは０であっても１であってもよいが、好ましくはｐは０である（すなわち、Ｌ０は存在せずにＡａが直接上記芳香族複素環に結合していることが好ましい）。本実施形態における好ましい化合物の一例は、以下の化合物１２である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　（第３の好ましい実施形態）
　本発明に係る化学式１の含窒素化合物についての第３の好ましい実施形態は、ｑが１であり、ｒが１であり、ｓが１である。これにより、化学式１の化合物は、下記化学式４で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　そして、化学式４において、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、前記化学式１について定義した通りである。一方、本実施形態において、Ｒは、高分子担体である。ここで、本実施形態においても、各符号（置換基）の好ましい形態は化学式１について上述したのと同様である。
　ただし、本実施形態においては、ＡａおよびＡｂが－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－であり、Ｌ１がＣ１～Ｃ２０のアルキレン基であり、高分子担体であるＲがポリエチレングリコール架橋体（例えば、アミノメチルＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂）であることが好ましい。そして、この場合においても、ｐは０であっても１であってもよいが、好ましくはｐは０である（すなわち、Ｌ０は存在せずにＡａが直接上記芳香族複素環に結合していることが好ましい）。本実施形態における好ましい化合物の一例は、以下の化合物１３である（化合物１３において、Ｌ１はＣ５のアルキレン基（ペンタメチレン基）である）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　以上、本発明に係る化学式１の含窒素化合物について好ましい実施形態をいくつか説明したが、本発明に係る化学式１の化合物はこれら以外のものであってももちろんよい。上述した実施形態には包含されない化合物の例としては、例えば、以下の化合物１４および化合物１５があるがこれには限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　（本発明の化合物の製造方法）
　本発明に係る含窒素化合物の製造方法について特に制限はない。当業者であれば、後述する実施例の欄の記載に基づき、本願の出願時における技術常識を参酌して、本発明に係る化合物を製造することが可能である。以下では、本発明に係る化合物のうち、上記化学式１においてＸが－Ｏ－である化合物を例に挙げて、その製造方法を説明する。
　本形態に係る製造方法における出発物質は、下記化学式５で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　ここで、化学式５において、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、前記化学式１について定義した通りである。
　また、化学式５において、Ｒ”は、脱離基である。Ｒ”を構成する脱離基の具体的な種類について特に制限はなく、従来公知の脱離基が用いられうるが、例えば、ベンジル基、メトキシベンジル基、ジメチルアミノベンジル基、トリチル基、クロロトリチル基、メチルトリチル基、メトキシトリチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基などが挙げられる。
　化学式５で表される化合物は、例えば、国際公開第２０１５／０５０１９９号パンフレットの記載に従って合成することが可能である。
　本形態に係る製造方法では、上記で準備した出発物質（化学式５で表される化合物）を、ハロゲン単体またはハロゲン生成試薬（例えば、塩化スルフリル、塩素ガス、オキシ塩化リン、五塩化リン、臭素、フッ化アルキルピリジン、フッ化キヌクリジンまたはヨウ素）と反応させる。これにより、下記化学式６で表される化合物が得られる（工程（Ｉ））。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　ここで、化学式６において、Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、前記化学式１について定義した通りである。
　また、化学式６において、Ｈａｌは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素から選択されるハロゲン原子を表す。
　工程（Ｉ）において上記反応を行う場合には、例えば、化学式５で表される化合物に１，２－ジクロロエタン等の溶媒のほか、ピリジン、塩化スルフリル等のハロゲン生成試薬を加え、穏やかに１～２時間程度撹拌する。その後、反応溶液を減圧留去し、ヘキサン等を用いて共沸させることができる。この際、Ｒが高分子担体である場合には、予め反応前に化学式５で表される化合物を溶媒で膨潤させておくことが好ましい。
　本形態に係る製造方法では、続いて、上記で得られた化学式６で表される化合物を、塩基性条件下でＹ－ＯＨ（Ｙは、前記化学式１について定義した通りである）で表されるアルコールと反応させる。これにより、下記化学式７で表される化合物が得られる（工程（ＩＩ））。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　ここで、化学式７において、Ｗ、Ｙ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、前記化学式１について定義した通りである。なお、上記化学式７で表される化合物は、上記化学式１においてＸが－Ｏ－である化合物に相当する。
　工程（Ｉ）において上記反応を行う場合には、例えば、上記で得られた化合物６で表される化合物を、Ｙ－ＯＨで表されるアルコールに溶解させる。そして、反応系を撹拌しながら塩基を添加すると、Ｙ－Ｏ－で表されるアルコキシドイオンが求核剤として作用し、Ｈａｌ－で表されるハロゲン化物イオンが脱離する求核置換反応が硫黄原子上で進行する。その結果、上記化学式７で表される化合物が生成する。なお、添加する塩基の種類について特に制限はないが、求核性が低いほど好ましいことから、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；ヒューニッヒ塩基）などの低求核性の塩基が好ましく用いられる。得られた生成物については、常法に従って精製することができる。
　以上、上記化学式１においてＸが－Ｏ－である化合物（化学式７で表される化合物）を例に挙げて本発明に係る化合物の製造方法を説明したが、その他の化合物についても、当業者であれば適宜製造が可能である。例えば、上記化学式１においてＸが－ＮＨ－である化合物については、上記で得られた化学式６で表される化合物をＹ－ＮＨ２で表されるアミンと適当な有機溶媒中で反応させることで、同様の反応機構により、製造が可能である。
　（本発明の化合物の用途）
　本発明者らは、上述した本発明の含窒素化合物（またはその塩）が、驚くべきことに、ジスルフィド化試薬としての機能を有していることを発見した。そして、本発明に係る含窒素化合物は室温（２５℃）での保管が可能なほど、化学的に極めて安定であることも見出した。さらに、本発明に係る含窒素化合物をジスルフィド化試薬として用いることで、簡便な処理によって短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチド等の有機化合物の分子内に位置する２つの遊離チオール基に対して選択的にジスルフィド結合を導入することが可能となるという、従来公知のジスルフィド化試薬では発揮されなかった優れた効果も奏される。さらに、公知の化合物として上述した化合物（Ａ）～（Ｈ）についても、上記のようなチオール基のジスルフィド化試薬としての用途は知られていなかったが、本発明によれば、これらの化合物（Ａ）～（Ｈ）についてもまた、ジスルフィド化試薬としての用途発明が提供される。したがって、本発明の他の形態によれば、上述した含窒素化合物またはその塩、あるいは、以下の化合物（Ａ）～（Ｈ）からなる、チオール基のジスルフィド化試薬が提供される。
（Ａ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸メチル
（Ｂ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸エチル
（Ｃ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル
（Ｄ）Ｎ－（３’－ニトロ－２’－ピリジンスルフェニルオキシ）－５－ノルボルネン－２，３ジカルボキシイミド
（Ｅ）（Ｓ）－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）プロパン酸
（Ｆ）（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）ブタン酸
（Ｇ）４－（（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）メチル）安息香酸
（Ｈ）（Ｓ）－２－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）－３－フェニルプロパン酸。
　ここで、本発明に係る化学式１の含窒素化合物については、上記化学式１において、「ｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０、かつ、Ｒ＝水素原子」の条件を満たすものではないことが好ましいことを上述した。これに対し、この条件を満たす化合物についてもジスルフィド化試薬としての用途は新規である。したがって、本発明に係るジスルフィド化試薬の好ましい一実施形態は、本発明に係る化学式１の含窒素化合物のうち、上記化学式１において、「ｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０、かつ、Ｒ＝水素原子」の条件を満たすもの（下記化学式８）を有効成分とするものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　化学式８において、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、前記化学式１について定義した通りである。ここで、各符号（置換基）の好ましい形態は化学式１について上述したのと同様である。
　本実施形態における好ましいジスルフィド化試薬の一例は、以下の化合物１４ａ～化合物１４ｊのいずれかを有効成分とするものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　また、上述した化学式１においてＲが固相合成法に用いられる高分子担体である場合には、ジスルフィド化活性を有する含窒素化合物を固相合成法に用いられる高分子担体に固定させることができる。したがってこの場合には、ペプチド等の有機化合物の分子内に位置する２つの遊離チオール基に対して選択的に作用する固相担持型試薬として使用することができる。
　本発明のさらに他の形態は、上述した本発明に係る含窒素化合物をジスルフィド化試薬（好ましくは、固相担持型ジスルフィド化試薬）として用いて、分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物にジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）を導入する方法に関する。換言すれば、本形態に係る方法は、分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物を、上述した本発明に係る含窒素化合物（またはその塩）からなるジスルフィド化試薬と接触させ、２つの前記遊離チオール基の間でジスルフィド結合を形成させてジスルフィド含有化合物を得ることを含む、ジスルフィド含有化合物の製造方法である。
　ここで、ジスルフィド結合を導入する対象となる「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」の構造は特に制限されない。「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」としては、例えば、アミノ酸、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド（抗体等のタンパク質を含む））などのアミノ酸残基含有化合物のほか、高分子化合物、低分子化合物、並びにそれらの同位体を含む誘導体が挙げられる。また、当該化合物における遊離チオール基の存在形態についても特に制限はなく、例えば、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質におけるシステイン残基、システインアミド残基のほか、有機化合物におけるシステアミノ基、チオアルキルアミノ基などが挙げられる。
　「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」がペプチドである場合、当該ペプチドは、天然由来のものであってもよいし、人工的に合成されたものであってもよい。ペプチドが人工的に合成されたものである場合、その合成方法について特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。ペプチドの人工的な合成方法としては、「固相合成法」および「液相合成法」が知られており、固相合成法の場合はさらにＦｍｏｃ法およびＢｏｃ法が知られている。「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」がペプチドである場合、当該ペプチドはいずれの方法で合成してもよい。固相合成法を例に挙げて簡単に説明すると、例えば、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミドを用いる。この際、１－ヒドロキシベンゾトリアゾールを併用することで、反応速度を向上させつつ、ラセミ化を抑制することもできる。具体的には、まず、Ｃ末端のアミノ酸のアミノ基をＦｍｏｃ基またはＢｏｃ基で保護して、上記ポリスチレン高分子ゲルのアミノ基との間でペプチド結合を形成させる。次いで、固相を溶媒でよく洗い、残存する試薬やアミノ酸を洗浄・除去する。その後、固相に結合しているアミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。続いて、アミノ基をＦｍｏｃ基またはＢｏｃ基保護したアミノ酸を用いて、順次、同様の反応を繰り返すことで、固相上でペプチドを合成する。最後に、固相をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で温浸させることで、ペプチドを固相から切り離し、ペプチドを合成することができる。
　なお、上述した方法によってジスルフィド結合を導入する対象となる「分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物」は、「分子内に２つの遊離チオール基を有する化合物」であることが好ましい。かような形態によれば、「分子内に２つの遊離チオール基を有する化合物」の当該２つの遊離チオール基の間でジスルフィド結合を形成させることができ、所望のジスルフィド含有化合物を高収率かつ高純度で製造することができる。ジスルフィド結合を導入する対象が「分子内に２つの遊離チオール基を有する化合物」である場合であっても、当該化合物がペプチドであるような場合には、システイン残基やシステインアミド残基を３つ以上含んでいる可能性がある。したがって、このような場合にジスルフィド結合を導入する対象を「分子内に２つの遊離チオール基を有する化合物」とするためには、システイン残基やシステインアミド残基の１つ以上のチオール基を保護基で保護しておく必要がある。このような保護基の導入は、通常、上述したようなペプチドの合成の際に、所望の位置にチオール基が保護されたアミノ酸を導入しておくことで達成されうる。なお、かような手法においてペプチドの合成の際に用いられる「チオール基が保護されたアミノ酸」におけるチオール基の保護基としては、例えば、ｔ－ブチル基、トリチル基、ベンズヒドリル基、ベンジル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、トリメチルベンジル基、メトキシベンジル基、ジメトキシベンジル基、トリメトキシベンジル基、ニトロベンジル基、アセトアミドメチル基、９－フルオレニルメチル基、カルボニルベンジルオキシ基、ジフェニルベンジル基、エチルカルバモイル基、ピコリル基、スルホニル基またはこれらの塩が挙げられる。
　続いて、本発明に係るジスルフィド化試薬が固相担持型ジスルフィド化試薬である場合を例に挙げて、ジスルフィド化を行う（ジスルフィド含有化合物を製造する）方法について説明する。
　まず、ジスルフィド結合を導入する対象である「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」を溶媒に溶解させる。好ましい形態によれば、上記化合物を水、または１％（ｖ／ｖ）以上の水を含む有機溶媒に溶解させる。また、この際のｐＨは中性付近が好ましく、ｐＨ６．５～８．５が好ましい。また、水に代えて緩衝液を用いることができ、水、緩衝液および有機溶媒のいずれかを組み合わせて用いてもよい。一方、有機溶媒を組み合わせて用いる場合は、水と混和する有機溶媒が好ましく、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド、アルコール、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサンなどが挙げられる。
　次いで、上記で調製した「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」の溶液と本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬とを混和する。この際、溶液の入った容器に本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬を添加してもよいし、本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬の入った容器に溶液を添加してもよい。なお、容器の形態、材質は限定されないが、好ましくはフィルター付きチューブ等の濾過用フィルターの付いた攪拌可能な容器である。混和は容器を静置しておいてもよいが、振とうや、固相合成用振とう機、マグネチックスターラー、ボルテックスミキサー、スリーワンモーター等による攪拌により行うことが好ましい。
　上記の混和により起こる反応により、通常５分～２時間で反応を行うことができる。この反応で用いられる本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬の添加量は、「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」の量に応じて増減すればよい。例えば、「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」１当量に対し、本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬の量は過剰量用いるのが好ましく、より好ましくは１．２当量から１０等量用いる。反応の完結は、溶液中の「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」の消費を一般的な分析手法に基づいて判断すればよい。例えば、適用可能な分析手法として、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＴＬＣ、ＩＲ、ＭＳスペクトル、滴定等が挙げられる。
　原料化合物がシステイン残基やシステインアミド残基を３つ以上含んだペプチドである場合であって、システイン残基やシステインアミド残基の１つ以上のチオール基が保護基で保護されているような場合には、本発明に係る固相担持型ジスルフィド化試薬を用いてジスルフィド結合を導入した後に当該保護基を脱保護する必要がある場合もある。このような脱保護の手法としては従来公知の手法が用いられうる。また、例えばヨウ素酸化法を用いて脱保護処理を行うことで、チオール基の脱保護と同時に脱保護されたチオール基の間にさらにジスルフィド結合を導入することも可能である（後述する実施例２－３「α－コノトキシンＩｍＩの合成」を参照）。
　反応後、固相担持型ジスルフィド化試薬、目的生成物であるジスルフィド含有化合物、未反応の「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」、および「分子内に２つ（以上）の遊離チオール基を有する化合物」が反応の進行と共に変化した化合物はろ過により分別され、ろ液にジスルフィド含有化合物が得られる。ろ過には使用器具、ろ過手法にとらわれない。器具としてろ紙、グラスファイバー、ろ過助剤、ろ布によるろ過や、メンブランフィルター、グラスフィルター等が挙げられる。ろ過手法としても、自然ろ過、吸引ろ過、遠心分離、デカンテーション等が挙げられ、それぞれ用途や反応スケールに応じて適宜選択できる。このように、ジスルフィド化試薬を高分子担体に固相化されてなる形態の含窒素化合物からなる固相化試薬の形態とすることで、生成物とジスルフィド化試薬との分離操作をろ過という簡便な操作のみによって可能である。したがって、特に固相化試薬の形態の本発明に係るジスルフィド化試薬は、有機合成（特に、ペプチド合成）の技術分野において極めて高い優位性を備えた発明であると言える。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
　［実施例１］
　本発明の化合物の一例として、化合物２ａ～２ｉの合成例を以下に示す。
　以下のスキームにより、化合物２ａ～２ｉを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　その具体的な手法は、以下の通りである。
　実施例１－１：化合物２ａの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　化合物１（３００　ｍｇ，　０．９９　ｍｍｏｌ）の１，２－ジクロロエタン（２．５　ｍＬ）溶液に室温にて塩化スルフリル（１７６　μＬ，　２．１８　ｍｍｏｌ）、ピリジン（４０．３　μＬ，　０．５０　ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、ヘキサンで共沸した。このものは精製することなく次の反応に用いた。得られた残渣をメタノール（４　ｍＬ）に溶解させ、氷冷撹拌下、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．８５　ｍＬ，　１９．８　ｍｍｏｌ）を添加し、室温にて２時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製することで、黄色固体（化合物２ａ）を得た（１９０　ｍｇ，　０．７８０　ｍｍｏｌ，　２工程　７９％）
。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　実施例１－２：化合物２ｂの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　化合物１（１００　ｍｇ，　０．３２９　ｍｍｏｌ）、ｎ－ブタノール（６　ｍＬ）を用い、化合物２ａと同様の方法で、化合物２ｂを合成した（黄色固体，　７２．３　ｍｇ，　２工程７７％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　実施例１－３：化合物２ｃの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　化合物１（１００　ｍｇ，　０．３２９　ｍｍｏｌ）、２－プロパノール（６　ｍＬ）を用い、化合物２ａと同様の方法で、化合物２ｃを合成した（黄色固体，　２５．４　ｍｇ，　２工程２９％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　実施例１－４：化合物２ｄの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　化合物１（２００　ｍｇ，　０．３２９　ｍｍｏｌ）、ｔ－ブチルアルコール（３　ｍＬ）を用い、化合物２ａと同様の方法で、化合物２ｄを合成した（黄色固体，　３８．０　ｍｇ，　２工程２０％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　実施例１－５：化合物２ｅの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　化合物１（１００　ｍｇ，　０．３２９　ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（６　ｍＬ）を用い、化合物２ａと同様の方法で、化合物２ｅを合成した（黄色固体，　８４．９　ｍｇ，　２工程８１％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　実施例１－６：化合物２ｆの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　化合物１（２００　ｍｇ，　０．６５７　ｍｍｏｌ）の１，２－ジクロロエタン（１．５　ｍＬ）溶液に室温にて塩化スルフリル（１１７　μＬ，　１．４５　ｍｍｏｌ）、ピリジン（２６．５　μＬ，　０．３２９　ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、ヘキサンで共沸した。このものは精製することなく次の反応に用いた。得られた残渣をＴＨＦ（３．３　ｍＬ）に溶解し、遮光中、室温にてフェノール（５７．８　μＬ，　０．６５７　ｍｍｏｌ）を添加後、氷塩浴撹拌下、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１４２　μＬ，　０．９８６　ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて２時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム）で精製することで、黄色固体（化合物２ｆ）を得た（１１６　ｍｇ，　０．３７９　ｍｍｏｌ，　２工程　５８％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　実施例１－７：化合物２ｇの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　化合物１（１００　ｍｇ，　０．３２８　ｍｍｏｌ）、ｏ－メトキシフェノール（０．３２８　ｍｍｏｌ）を用い、化合物２ｆと同様の方法で、化合物２ｇを合成した（黄色粘性物質，　１２．９　ｍｇ，　２工程１２％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　実施例１－８：化合物２ｈの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　化合物１（１００　ｍｇ，　０．３２８　ｍｍｏｌ）、ｐ－ブロモベンジルアルコール（６１．３　ｍｇ，　０．３２８　ｍｍｏｌ）を用い、化合物２ｆと同様の方法で、化合物２ｈを合成した（黄色固体，　６５．１　ｍｇ，　２工程５０％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　実施例１－９：化合物２ｉの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　化合物１（１００　ｍｇ，　０．３３　ｍｍｏｌ）の１，２－ジクロロエタン（０．７５　ｍＬ）溶液に室温にて塩化スルフリル（５９　μＬ，　０．７２　ｍｍｏｌ）、ピリジン（１３　μＬ，　０．１６　ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて２時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、ヘキサンで共沸した。このものは精製することなく次の反応に用いた。得られた残渣を１，２－ジクロロエタン（１　ｍＬ）に溶解し、遮光中、室温にて１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ，　４９　ｍｇ，　０．３２　ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．１　ｍＬ，　１．２９　ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて３０分間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル　＝　５：１）で精製することで、黄色固体（化合物２ｉ）を得た（１７　ｍｇ，　４８．９　μｍｏｌ，　２工程　１５％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　［実施例２］
　上記で合成した本発明に係る含窒素化合物を選択的ジスルフィド化剤として用いて、２つの遊離チオール基を有するペプチドの分子内にジスルフィド結合を形成することにより、ジスルフィド含有ペプチドを合成した。
　実施例２－１（ａ）：化合物２ａを用いたオキシトシンの合成
　以下のスキームにより、上記で合成した化合物２ａを選択的ジスルフィド化剤として用いて、分子内に１対のジスルフィド結合（Ｎ末端側から１番目および６番目のシステイン残基間）を有するノナペプチド（９アミノ酸）であるオキシトシン（ペプチド４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　その具体的な手法は、以下の通りである。
　（Ｈ－Ｃｙｓ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｓｎ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－ＮＨ２（ペプチド３）の合成）
　Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ａｍｉｄｅ樹脂（０．５８　ｍｍｏｌ／ｇ，　２００　ｍｇ，　０．１１６　ｍｍｏｌ）に２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ジメチルホルムアミド溶液を添加し、室温にて振とうした。ろ過にて反応溶液を除去した後、Ｆｍｏｃ－アミノ酸誘導体（３当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、３当量）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ、３当量）を用い、Ｆｍｏｃ－固相ペプチド合成法にてペプチド鎖を伸長した。得られたＨ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－ＮＨ－樹脂（３３１　ｍｇ）にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：１，２－エタンジチオール（９４：２．５：１．０：２．５（体積比），　１０　ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過、ＴＦＡを除去した後、エーテルを添加し、ペプチドを析出させた。エーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　（０．１％ＴＦＡ）　＝　７９　：　２１　ｔｏ　７４　：２６　ｏｖｅｒ　１５　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　５　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ　Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　ＯＢＤＴＭ５　μｍ，　１９　ｘ　１５０　ｍｍ　Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することでペプチド３を得た（４９．６　ｍｇ，　４４．２　μｍｏｌ，　３８％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　（オキシトシン（ペプチド４）の合成）
　ペプチド３（０．７１　ｍｇ，　０．６３　μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３（体積比）、０．１　ｍＭ）に化合物２ａ（０．３１，　２当量）を室温にて添加、遮光し同温度にて６時間撹拌した。主ピークとして検出された画分をＴＯＦ－ＭＳにて分析して、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　なお、ペプチド３からペプチド４を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）および添加６時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　８５　：　１５　ｔｏ　６５　：３５　ｏｖｅｒ　２０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍ）による分析結果を図１に示す。なお、図中の＊は非ペプチド性のピークである（以下同様）。図１に示すように、化合物２ａの添加１時間後でペプチド３のピークはほとんど消失し、生成物（ペプチド４）のピークが確認された。また、添加６時間後にはペプチド３のピークは完全に消失し、化合物２ａのピークもわずかに残るのみとなった。このことから、本発明に係る含窒素化合物（またはその塩）をジスルフィド化試薬として用いることで、極めて簡便な処理によって短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチドの分子内にジスルフィド結合を導入してジスルフィド含有ペプチドを合成することが可能であることが示された。なお、本実施例においてジスルフィド結合が導入される推定反応機構は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　実施例２－１（ｂ）：化合物２ｂを用いたオキシトシンの合成
　化合物２ａに代えて化合物２ｂを選択的ジスルフィド化剤として用いたこと以外は、上述した実施例２－１（ａ）と同様の手法により、オキシトシン（ペプチド４）を合成した。そして、上記と同様にして、主ピークとして検出された画分をＴＯＦ－ＭＳにて分析することにより、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
　実施例２－１（ｃ）：化合物２ｃを用いたオキシトシンの合成
　化合物２ａに代えて化合物２ｃを選択的ジスルフィド化剤として用いたこと以外は、上述した実施例２－１（ａ）と同様の手法により、オキシトシン（ペプチド４）を合成した。そして、上記と同様にして、主ピークとして検出された画分をＴＯＦ－ＭＳにて分析することにより、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
　実施例２－１（ｄ）：化合物２ｄを用いたオキシトシンの合成
　化合物２ａに代えて化合物２ｄを選択的ジスルフィド化剤として用いたこと以外は、上述した実施例２－１（ａ）と同様の手法により、オキシトシン（ペプチド４）を合成した。そして、上記と同様にして、主ピークとして検出された画分をＴＯＦ－ＭＳにて分析することにより、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
　ここで、実施例２－１（ａ）～実施例２－１（ｄ）のそれぞれについて、選択的ジスルフィド化剤の添加から１時間後、３時間後および６時間後の反応溶液のＨＰＬＣによる分析により、オキシトシン（ペプチド４）の収率を測定した。結果を下記の表１に示す。
　なお、実施例２－１（ａ）～実施例２－１（ｄ）のＨＰＬＣ条件は以下の通りである。実施例２－１（ａ）ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　８５　：　１５　ｔｏ　６５　：　３５　ｏｖｅｒ　２０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍであり、実施例２－１（ｂ）ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　８５　：　１５　ｔｏ　４５　：　５５　ｏｖｅｒ　４０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍであり、実施例２－１（ｃ）および（ｄ）ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　８５　：　１５　ｔｏ　５５　：　４５　ｏｖｅｒ　３０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
　実施例２－２：ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＡＮＰ）（ペプチド６）の合成
　以下のスキームにより、分子内に１対のジスルフィド結合（Ｎ末端側から７番目および２３番目のシステイン残基間）を有するポリペプチド（２８アミノ酸）であるヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＡＮＰ）（ペプチド６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　その具体的な手法は、以下の通りである。
　（Ｈ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ－ＯＨ（ペプチド５）の合成）
　Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＴｒｔＡ－ＰＥＧ－樹脂（０．２２　ｍｍｏｌ／ｇ，　１８２　ｍｇ，　８０．０　μｍｏｌ）を用い、Ｐｒｅｌｕｄｅ（登録商標）６チャンネルペプチド合成装置にてペプチド鎖を伸長した。得られたＨ－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｐｈｅ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｏ－樹脂（７１０　ｍｇ）の一部（２４４　ｍｇ）にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：１，２－エタンジチオール（９４：２．５：１．０：２．５（体積比），　５　ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過、ＴＦＡを除去した後、エーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらにエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　（０．１％ＴＦＡ）　＝　８０　：　２０　ｔｏ　６７　：　３３　ｏｖｅｒ　１３　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　５　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ　Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　ＯＢＤＴＭ５　μｍ，　１９　ｘ　１５０　ｍｍ　Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することでペプチド５を得た（１１．３　ｍｇ，　３．０１　
μｍｏｌ，　１０％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　（ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＡＮＰ）（ペプチド６）の合成）
　ペプチド５（１．５２　ｍｇ，　０．４０３　μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３、４０３　μＬ）に化合物２ａ（０．４９　ｍｇ，　２．０２　μｍｏｌ）を添加、遮光し、室温にて２４時間撹拌した。反応溶液をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　（０．１％ＴＦＡ）　＝　８０　：　２０　ｔｏ　６７　：　３３　ｏｖｅｒ　１３　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　５　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ　Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　ＯＢＤＴＭ５　μｍ，　１９　ｘ　１５０　ｍｍ　Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＡＮＰ）（ペプチド６）を得た（０．７６　ｍｇ，　２．０２　μｍｏｌ，　５０％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　なお、ペプチド５からペプチド６を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）、添加６時間後（Ｃ）および添加２４時間後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　９５　：　５　ｔｏ　３５　：　６５　ｏｖｅｒ　３０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍ）による分析結果を図２に示す。図２に示すように、化合物２ａの添加１時間後でペプチド５のピークは約半分に減少し、生成物（ペプチド６）のピークが確認された。また、添加６時間後にはペプチド５のピークはごくわずかとなり、生成物（ペプチド６）のピークが増大した。そして、添加２４時間後にはペプチド５のピークは完全に消失し、化合物２ａのピークについても大幅な減少が見られた。このことから、本発明に係る含窒素化合物（またはその塩）からなるジスルフィド化試薬は、２８アミノ酸という比較的大きめのポリペプチドを原料として用いても、分子内にジスルフィド結合を導入してジスルフィド含有ペプチドを合成することが可能であることがわかる。
　実施例２－３：α－コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）の合成
　以下のスキームにより、分子内に２対のジスルフィド結合（Ｎ末端側から１番目および１０番目のシステイン残基間、並びに５番目および１１番目のシステイン残基間）を有するポリペプチド（１２アミノ酸）であるα－コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　その具体的な手法は、以下の通りである。
　（Ｈ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＮＨ２（ペプチド７）の合成）
　Ｆｍｏｃ－ＳＡＬ－ａｍｉｄｅ樹脂（０．５４　ｍｍｏｌ／ｇ，　１４８　ｍｇ，　８０．０　μｍｏｌ）を用い、Ｐｒｅｌｕｄｅ（登録商標）６チャンネルペプチド合成装置にてペプチド鎖を伸長した。得られたＨ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ａｓｐ（ｔ－Ｂｕ）－Ｐｒｏ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｌａ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＮＨ－樹脂（３６２　ｍｇ）にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：１，２－エタンジオール（９４：２．５：１．０：２．５（体積比），　５　ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過、ＴＦＡを除去した後、エーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらにエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　（０．１％ＴＦＡ）　＝　８５　：　１５　ｔｏ　７２　：　２８　ｏｖｅｒ　１３　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　５　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ　Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　ＯＢＤＴＭ５　μｍ，　１９　ｘ　１５０　ｍｍ　Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することでペプチド７を得た（３９．９　ｍｇ，　２１．７　μｍｏｌ，　２７％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　なお、ペプチド７のＮ末端側から３番目および１２番目のシステイン残基のチオール基はＮ－（アセチル）アミノメチル基（Ａｃｍ基）で保護されており、このＡｃｍ基はヨウ素酸化法によって選択的に脱保護されうる。
　（ペプチド８（ペプチド７のＮ末端側から２番目および８番目のシステイン残基間にジスルフィド結合が形成されたもの）の合成）
　ペプチド７（６．１４　ｍｇ，　３．３４　μｍｏｌ）に化合物２ａ（０．３３　ｍｇ，　１．３６　μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３（体積比），　３．３４　ｍＬ）を室温にて添加、同温度で遮光下２７時間撹拌した。反応溶液をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　（０．１％ＴＦＡ）　＝　８５　：　１５　ｔｏ　７７　：　２３　ｏｖｅｒ　１６　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　５　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ　Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　ＯＢＤＴＭ５　μｍ，　１９　ｘ　１５０　ｍｍ　Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで、ペプチド８を得た（３．７５　ｍｇ，　２．０４　μｍｏｌ，　６１％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　なお、ペプチド７からペプチド８を合成した際の、化合物２ａの添加前（Ａ）、添加４時間後（Ｂ）、添加９時間後（Ｃ）および添加２７時間後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　９５　：　５　ｔｏ　３５　：　６５　ｏｖｅｒ　３０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍ）による分析結果を図３に示す。図３に示すように、化合物２ａの添加４時間後でペプチド７のピークは約半分に減少し、生成物（ペプチド８）のピークが確認された。また、添加９時間後にはペプチド７のピークはごくわずかとなり、生成物（ペプチド８）のピークが増大した。そして、添加２７時間後にはペプチド７のピークは完全に消失し、化合物２ａのピークについても大幅な減少が見られた。ここで、反応溶液をＨＰＬＣにて精製した後のサンプルについてのＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　９５　：　５　ｔｏ　３５　：　６５　ｏｖｅｒ　３０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍ）による分析結果を図３の（Ｅ）に示す。この結果からわかるように、精製によって得られた生成物のピークはペプチド８のピークと保持時間が一致した。
　（α－コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）の合成）
　ペプチド８（２．９４　ｍｇ，　１．６０　μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（５：１（体積比），　１．６０　ｍＬ）にヨウ素（Ｉ２）（２．０３　ｍｇ，　８．００　μｍｏｌ）を室温にて添加、遮光し同温度にて１時間撹拌した。これにより、ペプチド７における２箇所のＡｃｍ基を脱保護すると同時に対応する２つのチオール基の間にジスルフィド結合を形成した（ヨウ素酸化法）。反応溶液に１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液（５０　μＬ）を加え、ＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　（０．１％ＴＦＡ）　＝　８５　：　１５　ｔｏ　７７　：　２３　ｏｖｅｒ　１６　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　５　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ　Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　ＯＢＤＴＭ５　μｍ，　１９　ｘ　１５０　ｍｍ　Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで、α－コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）を得た（１．２５　ｍｇ，　０．７３８　
μｍｏｌ，　４６％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　なお、ペプチド８からペプチド９を合成した際の、ヨウ素の添加前（Ａ）、添加２分後（Ｂ）、添加１時間後（Ｃ）およびＨＰＬＣ精製後（Ｄ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　９５　：　５　ｔｏ　３５　：　６５　ｏｖｅｒ　３０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍ）による分析結果を図４に示す。図４に示すように、ヨウ素の添加２分後でペプチド８のピークは大幅に減少し、生成物（ペプチド９）のピークの増大が見られた。また、添加１時間後にはペプチド８のピークは完全に消失し、生成物（ペプチド９）のピークのみが確認された。ここで、反応溶液をＨＰＬＣにて精製した後のＨＰＬＣ分析結果（図４の（Ｄ））からわかるように、精製によって得られた生成物のピークはペプチド９のピークと保持時間が一致した。さらに、図５には、（Ａ）上記実施例で合成されたα－コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）、（Ｂ）市販のα－コノトキシンＩｍＩの標品サンプル（株式会社ペプチド研究所より購入）、（Ｃ）これらの混合サンプルのそれぞれについてＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　９５　：　５　ｔｏ　３５　：　６５　ｏｖｅｒ　３０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍ）による分析を行った結果を示す。この結果からわかるように、上記実施例で合成されたα－コノトキシンＩｍＩ（ペプチド９）の保持時間は市販のものと一致した。このように、α－コノトキシンＩｍＩのように分子内に２つのジスルフィド結合を有するペプチドについても高純度での合成が可能であることから、本発明に係る含窒素化合物（またはその塩）をジスルフィド化試薬として用いるジスルフィド含有ペプチドの製造方法は、極めて強力な合成手段を提供するものであることがわかる。
　［実施例３］
　上記で合成した本発明に係る含窒素化合物を高分子担体に固相化させたものを選択的ジスルフィド化剤として用いて、２つの遊離チオール基を有するペプチドの分子内にジスルフィド結合を形成することにより、ジスルフィド含有ペプチドを合成した。
　実施例３－１：固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）の合成
　以下のスキームにより、化学式１におけるＲが高分子担体（ポリエチレングリコール架橋体）である含窒素化合物（化合物１１）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
　その具体的な手法は、以下の通りである。
　（化合物１０の合成）
　まず、国際公開第２０１５／０５０１９９号パンフレットの記載に従って、高分子担体であるアミノメチル－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂（シグマ－アルドリッチ社製、表面に多数のアミノメチル基が存在、官能基置換率０．７０ｍｍｏｌ／ｇ）の表面に上記の化学構造を有する含窒素化合物が固相化されてなる化合物１０を合成した（国際公開第２０１５／０５０１９９号パンフレットの実施例における化合物６と同じである）。
　（化合物１１の合成）
　続いて、化合物１０（２６．６　ｍｇ，　１５．７　μｍｏｌ）に氷冷下、２％（ｗ／ｖ）塩化スルフリル／１，２－ジクロロエタン（１．２５　ｍＬ）およびピリジン（６．３５　μＬ，　７８．６　μｍｏｌ）の混合溶液を添加し、同温度にて２０分撹拌した。反応溶液を除去した後、氷冷下、上記の混合溶媒を添加し、同温度にて２０分撹拌した。さらにこの操作を１回行った。ろ過により反応溶液を除去した後、氷冷したジクロロメタンにて樹脂を５回洗浄した。得られた樹脂に３０％（ｗ／ｖ）ＤＩＰＥＡ／メタノール混合溶媒（８００　μＬ）を室温にて添加し、１．５時間撹拌した。ろ過により反応溶液を除去した後、ジクロロメタンで５回、メタノールで５回洗浄した。さらにこの操作を２回行った後、樹脂を乾燥した（２２．０　ｍｇ）。このようにして、化合物１１を得た。
　実施例３－２：固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）を用いたオキシトシン（ペプチド４）の合成
　以下のスキームにより、固相化ジスルフィド化試薬である化合物１１を用いて、実施例２－１（ａ）と同様の手法により、ペプチド３からオキシトシン（ペプチド４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　その具体的な手法は、以下の通りである。
　（化合物１１を用いたオキシトシン（ペプチド４）の合成）
　ペプチド３（１．５６　ｍｇ，　１．３９　μｍｏｌ）のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３（体積比）、１．３９　ｍＬ）を固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）（１１．８　ｍｇ，　６．９４　μｍｏｌ）に室温にて添加、遮光し同温度にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、ＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　（０．１％ＴＦＡ）　＝　７９　：　２１　ｔｏ　７４　：　２６　ｏｖｅｒ　１５　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　６　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ　Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　ＯＢＤＴＭ５　μｍ，　１９　ｘ　１５０　ｍｍ　Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することにより、オキシトシン（ペプチド４）を得た（０．５５　ｍｇ，　０．４９１　μｍｏｌ，　３５％）。
　なお、固相化ジスルフィド化試薬（化合物１１）を用いてペプチド３からペプチド４を合成した際の、反応開始３分以内（Ａ）、反応開始１時間後（Ｂ）および反応開始３時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　８５　：　１５　ｔｏ　６５　：３５　ｏｖｅｒ　２０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍ）による分析結果を図６に示す。図６に示すように、反応開始３分以内でペプチド４のピークが確認された。また、反応開始１時間後でペプチド３のピークはごくわずかとなり、生成物（ペプチド４）のピークが増大した。そして、添加３時間後にはペプチド３のピークは完全に消失した。なお、本実施例において用いたジスルフィド化試薬は固相化試薬であることから、反応溶液のろ過によって回収されており、ＨＰＬＣのチャートにはピークとして出現しない。このように、ジスルフィド化試薬を高分子担体に固相化されてなる形態の含窒素化合物からなる固相化試薬の形態とすることで、極めて短時間に高収率でジスルフィド含有ペプチドを製造可能である。そればかりか、生成物とジスルフィド化試薬との分離操作もろ過という簡便な操作のみによって可能である。したがって、特に固相化試薬の形態の本発明に係るジスルフィド化試薬は、有機合成（特に、ペプチド合成）の技術分野において極めて高い優位性を備えた発明であると言える。
　［実施例４］
　本発明の化合物の一例として、化合物１６ａ～１６ｊの合成例を以下に示す。
　以下のスキームにより、化合物１６ａ～１６ｊを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　その具体的な手法は、以下の通りである。
　実施例４－１：化合物１６ａの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（２．４　ｇ，　１２．６　ｍｍｏｌ）のメタノール（１５０　ｍＬ）溶液に氷冷撹拌下、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．７２　ｍＬ，　１８．９　ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、１０％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製することで、黄色固体（化合物１６ａ）を得た（１．９６　ｇ，　１０．５　ｍｍｏｌ，　８４％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
　実施例４－２：化合物１６ｂの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（５０　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）の１，２－ジクロロエタン（０．８　ｍＬ）溶液に室温にてベンジルアルコール（２８．４　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４　μＬ，　１．０４　ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムで希釈し、５％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製することで、黄色固体（化合物１６ｂ）を得た（４８．２　ｍｇ，　７０％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
　実施例４－３：化合物１６ｃの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（５０　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、フェノール（２９．６　ｍｇ，　０．３１　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４　μＬ，　１．０４　ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｃを合成した（黄色固体，　３７　ｍｇ，　５７％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
　実施例４－４：化合物１６ｄの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（５０　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、２－フルオロフェノール（２９．０　μＬ，　０．３１４　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４　μＬ，　１．０４　ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｄを合成した（黄色固体，　３８　ｍｇ，　５４％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　実施例４－５：化合物１６ｅの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（５０　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、２－フルオロフェノール（２８．５　μＬ，　０．３１４　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４　μＬ，　１．０４　ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｅを合成した（黄色固体，　２７　ｍｇ，　３９％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　実施例４－６：化合物１６ｆの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（５０　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、４－フルオロフェノール（３５．３　ｍｇ，　０．３１４　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４　μＬ，　１．０４　ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｆを合成した（黄色固体，　５１　ｍｇ，　７３％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
　実施例４－７：化合物１６ｇの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（５０　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、４－クロロフェノール（２５．８　μＬ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４　μＬ，　１．０４　ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｇを合成した（黄色固体，　３７　ｍｇ，　５０％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
　実施例４－８：化合物１６ｈの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（５０　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、４－メトキシフェノール（３２．６　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４　μＬ，　１．０４　ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｈを合成した（黄色固体，　５０　ｍｇ，　６８％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
　実施例４－９：化合物１６ｉの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（５０　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、４－ヒドロキシフェニルアセテート（３９．９　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４　μＬ，　１．０４　ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｉを合成した（黄色固体，　２６　ｍｇ，　３２％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
　実施例４－１０：化合物１６ｊの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
　Ｎｐｙｓ－Ｃｌ（５０　ｍｇ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、ｐ－クレゾール（２７．３　μＬ，　０．２６　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４　μＬ，　１．０４　ｍｍｏｌ）を用い、化合物１６ｂと同様の手法により化合物１６ｊを合成した（黄色固体，　３６．３　ｍｇ，　５３％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
　［実施例５］
　（化合物１６ａを用いたオキシトシンの合成）
　以下のスキームにより、上記で合成した化合物１６ａを選択的ジスルフィド化剤として用いて、分子内に１対のジスルフィド結合（Ｎ末端側から１番目および６番目のシステイン残基間）を有するノナペプチド（９アミノ酸）であるオキシトシン（ペプチド４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
　その具体的な手法は、以下の通りである。
　ペプチド３のアセトニトリル／水の混合溶液（１：３（体積比）、１　ｍＭ、８．９４　ｍＬ）に化合物１６ａ（０．９４７　ｍｇ，　５．０９　μｍｏｌ）を室温にて添加、遮光し同温度にて３時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。　なお、ペプチド３からペプチド４を合成した際の、化合物１６ａの添加前（Ａ）、添加１時間後（Ｂ）および添加３時間後（Ｃ）の反応系のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　８５　：　１５　ｔｏ　６５　：　３５　ｏｖｅｒ　２０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍ）による分析結果を図７に示す。図７に示すように、化合物１６ａの添加１時間後でペプチド３のピークはほとんど消失し、生成物（ペプチド４）のピークが確認された。また、添加３時間後にはペプチド３のピークは完全に消失した。このことから、エステル構造を有さない含窒素化合物（またはその塩）からなるジスルフィド化試薬も同様に、短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチドの分子内にジスルフィド結合を導入してジスルフィド含有ペプチドを合成することが可能であることが示された。
　［実施例６］
　上記で合成した本発明に係る含窒素化合物を選択的ジスルフィド化剤として用いて、樹脂に担持したペプチドの２つの遊離チオール基間のジスルフィド結合を形成することにより、ジスルフィド含有ペプチドを合成した。
　（化合物１６ａを用いた樹脂上におけるジスルフィド結合の形成）
　以下のスキームにより、ペプチド固相合成により得たオキシトシン－樹脂１７のＮ末端側から１番目および６番目のシステインの側鎖（－ＳＨ基）の保護基（ｔｅｒｔ－ブチルチオ（－Ｓ－Ｃ（ＣＨ３）３）基）を脱保護してペプチド－樹脂１８とした後、選択的ジスルフィド化剤である上記で合成した化合物１６ａを用い、樹脂上でジスルフィド結合を構築し、脱樹脂および保護基の脱保護基によって、オキシトシン（ペプチド４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
　（オキシトシン－樹脂１７の合成）
　Ｆｍｏｃ－ＳＡＬ－ａｍｉｄｅ樹脂（０．５６　ｍｍｏｌ／ｇ，　７１．４　ｍｇ，　４０．０　μｍｏｌ）を用い、Ｐｒｅｌｕｄｅ（登録商標）６チャンネルペプチド合成装置にてペプチド鎖を伸長し、Ｈ　－Ｃｙｓ（Ｓｔ－Ｂｕ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ（Ｓｔ－Ｂｕ）－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－ＮＨ－樹脂を１２０　ｍｇ得た。
　（オキシトシン（ペプチド４））の合成
　オキシトシン－樹脂１７（６．９　ｍｇ，　３．８６　μｍｏｌ）にＮ－メチルモルホリンの２０％（ｖ／ｖ）β－メルカプトエタノール／ＤＭＦ混合溶液（Ｎ－メチルモルホリンの最終濃度０．１　Ｍ，　１　ｍＬ）を室温にて加え、８時間撹拌し、システイン側鎖ｔｅｒｔ－ブチルチオ基の脱保護を行いペプチド－樹脂１８とした。この樹脂をＤＭＦで５回洗浄した後、化合物１６ａ（１．４４　ｍｇ，　７．７３　μｍｏｌ）のＤＭＦ（３８６　μＬ）溶液を室温にて添加し、１時間撹拌した。撹拌後、樹脂をＤＭＦ、メタノール、エーテルで各５回洗浄して、乾燥した。得られた樹脂にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：（９５：２．５　：　２．５（体積比），　１　ｍＬ）を添加し、室温にて１時間撹拌した。反応溶液をろ過、ＴＦＡを除去した後、エーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらにエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣにて分析し、オキシトシン（ペプチド４）の合成を確認した。
　なお、ペプチド－樹脂１８を脱樹脂し、得られた粗生成物（Ａ）、化合物１６ａを添加後、脱樹脂し、得られた粗生成物（Ｂ）のＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　８５　：　１５　ｔｏ　５５　：　４５　ｏｖｅｒ　３０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　０．９　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　Ｓｕｎ　Ｆｉｒｅ　Ｃ１８　５　μｍ　４．６ｘ１５０　ｍｍ　ｃｏｌｕｍｎ）による分析結果を図８に示す。図８に示すように、ペプチド－樹脂１８を化合物１６ａにて処理することで、生成物（ペプチド４）のピークが確認された。このことから、含窒素化合物（またはその塩）からなる選択的ジスルフィド化試薬が、樹脂に担持したペプチドの２つの遊離チオール基間のジスルフィド結合を形成してジスルフィド含有ペプチドを合成することが可能であることが示された。
　［実施例７］
　（化合物２ａの安定性評価）
　上記で合成した本発明に係る含窒素化合物２ａの安定性を、ＨＰＬＣ分析およびＮＭＲ測定により評価した。その結果、化合物２ａは、特別な処理をすることなく少なくとも６ヶ月以上、室温にて安定であることが確認された。ここで、室温保存にて６ヶ月以上経過した化合物２ａのＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ　：　ｍｉｌｌｉＱ　（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ　＝　９５　：　５　ｔｏ　３５　：　６５　ｏｖｅｒ　３０　ｍｉｎ，　ｆｌｏｗ　ｌａｔｅ　１　ｍＬ／ｍｉｎ，　ＵＶ：　２３０　ｎｍ，　ｃｏｌｕｍｎ：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｏｌｕｍｎ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　４．６ＩＤ　ｘ　１５０　ｍｍ）分析結果、および１Ｈ　ＮＭＲ分析結果を示すチャートをそれぞれ図９および図１０に示す。
　［実施例８］
　（化合物２ａによる副反応の有無の確認）
　ヨウ素酸化の副反応として、トリプトファン、チロシン、ヒスチジンの側鎖に対するヨウ素化反応が報告されている（Ｂ．　Ｋａｍｂｅｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｅｌｖ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ．　１９８０，　８９９－９１５．）。そこで、本発明の含窒素化合物である化合物２ａの副反応の有無を、上記論文と同様の手法により確認した。すなわち、以下のスキームに示すようにトリプトファン、チロシン、ヒスチジンの誘導体３種（Ｃｂｚ－Ｔｒｐ－ＮＨ２、Ｃｂｚ－Ｔｙｒ－ＯＭｅ、Ｃｂｚ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ－ＯＭｅ）のメタノール／水またはＤＭＦ溶液に対し、室温にて化合物２ａ（３当量）を添加し、同温度にて２４時間撹拌した。その結果、これらのアミノ酸誘導体と化合物２ａとの反応は全く進行せず、副反応はないことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
　この出願は、２０１６年５月２０日に出願された日本国特許出願第２０１６－１０１８１２号に基づいており、その出願は全体として参照により引用されている。

Claims (30)

  1. 　下記化学式１で表される含窒素化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     化学式１において、
    　Ｗは、他の環員原子と一緒になって、ピリジン環、ピラジン環、イミダゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、フェナントロリン環、プテリジン環およびアゾシン環からなる群から選択される含窒素複素環を形成し、
    　Ｘは、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
    　Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基であり、
    　Ｚは、前記含窒素複素環上に存在する水素原子または電子吸引性の置換基を表し、
    　ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立して、０または１であり、
    　ｓは、０～１０の整数を表し、
    　Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表し、
    　ＡａおよびＡｂは、それぞれ独立して、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、Ｃ１～Ｃ２０のオキシアルキレン基、Ｃ１～Ｃ２０のアルキレンオキシ基、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基であり、
    　Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基または高分子担体である；
    　ただし、以下の（Ａ）～（Ｈ）の化合物を除く：
    （Ａ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸メチル
    （Ｂ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸エチル
    （Ｃ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル
    （Ｄ）Ｎ－（３’－ニトロ－２’－ピリジンスルフェニルオキシ）－５－ノルボルネン－２，３ジカルボキシイミド
    （Ｅ）（Ｓ）－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）プロパン酸
    （Ｆ）（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）ブタン酸
    （Ｇ）４－（（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）メチル）安息香酸
    （Ｈ）（Ｓ）－２－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）－３－フェニルプロパン酸。
  2. 　以下の条件を満たすものではない、請求項１に記載の含窒素化合物またはその塩：
    　条件：ｐ＝０、ｓ＝０、ｒ＝０、かつ、Ｒ＝水素原子
  3. 　Ｗは、他の環員原子と一緒になって、前記含窒素複素環としてのピリジン環を形成する、請求項１または２に記載の含窒素化合物またはその塩。
  4. 　Ｘは、－Ｏ－である、請求項１～３のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩。
  5. 　Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、または置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基である、請求項１～４のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩。
  6. 　Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基である、請求項５に記載の含窒素化合物またはその塩。
  7. 　Ｚは、電子吸引性の置換基である、請求項１～６のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩。
  8. 　前記電子吸引性の置換基は、ニトロ基、トリフルオロメチル基またはハロゲン原子である、請求項７に記載の含窒素化合物またはその塩。
  9. 　Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、置換または非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキレン基、置換または非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニレン基、置換または非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換のＣ６～Ｃ２０のアリーレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、ポリオキシアルキレン基および下記化学式（ａ）で表される基：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     化学式（ａ）において、
    　Ｒａは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１５のアルキレン基を表す、
    からなる群から選択される（ここで、これらのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、アリーレン基およびヘテロアリーレン基は置換基を有していてもよい）、請求項１～８のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩。
  10. 　下記化学式２で表される、請求項１～９のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     化学式２において、
    　Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０およびＡａは、請求項１において定義した通りであり、
    　Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、または置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基である。
  11. 　Ｒが、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基である、請求項１０に記載の含窒素化合物またはその塩。
  12. 　Ａａが、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－および－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択される基である、請求項１０または１１に記載の含窒素化合物またはその塩。
  13. 　Ａａが、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－である、請求項１２に記載の含窒素化合物またはその塩。
  14. 　ｐが０である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩。
  15. 　Ｒが、高分子担体である、請求項１～９のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩。
  16. 　Ｒが、固相合成法に用いられる高分子担体である、請求項１５に記載の含窒素化合物またはその塩。
  17. 　Ｒが、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエーテル、ポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、これらの共重合体および架橋体、磁性ビーズ、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の含窒素化合物またはその塩。
  18. 　下記化学式３で表される、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     化学式３において、
    　Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０およびＡａは、請求項１において定義した通りであり、
    　Ｒは、高分子担体である。
  19. 　Ａａが、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－および－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択される基である、請求項１８に記載の含窒素化合物またはその塩。
  20. 　Ａａが、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－であり、Ｒが、ポリエチレングリコール架橋体である、請求項１９に記載の含窒素化合物またはその塩。
  21. 　Ａａが、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－であり、Ｒが、ポリスチレン樹脂である、請求項１９に記載の含窒素化合物またはその塩。
  22. 　ｐが０である、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩。
  23. 　下記化学式４で表される、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     化学式４において、
    　Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、請求項１において定義した通りであり、
    　Ｒは、高分子担体である。
  24. 　ＡａおよびＡｂが－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－であり、Ｌ１がＣ１～Ｃ２０のアルキレン基であり、Ｒがポリエチレングリコール架橋体である、請求項２３に記載の含窒素化合物またはその塩。
  25. 　ｐが０である、請求項２３または２４に記載の含窒素化合物またはその塩。
  26. 　請求項１～２５のいずれか１項に記載の含窒素化合物またはその塩、あるいは、以下の化合物（Ａ）～（Ｈ）のいずれかからなる、チオール基のジスルフィド化試薬：
    （Ａ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸メチル
    （Ｂ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸エチル
    （Ｃ）３－ニトロ－２－ピリジンスルフィン酸Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル
    （Ｄ）Ｎ－（３’－ニトロ－２’－ピリジンスルフェニルオキシ）－５－ノルボルネン－２，３ジカルボキシイミド
    （Ｅ）（Ｓ）－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）プロパン酸
    （Ｆ）（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）ブタン酸
    （Ｇ）４－（（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）メチル）安息香酸
    （Ｈ）（Ｓ）－２－（（（３－ニトロピリジン－２－イル）チオ）オキシ）－３－フェニルプロパン酸。
  27. 　前記含窒素化合物においてＲが固相合成法に用いられる高分子担体である、請求項２６に記載のジスルフィド化試薬。
  28. 　分子内に２つ以上の遊離チオール基を有する化合物を、請求項２６または２７に記載のジスルフィド化試薬と接触させ、２つの前記遊離チオール基の間でジスルフィド結合を形成させてジスルフィド含有化合物を得ることを含む、ジスルフィド含有化合物の製造方法。
  29. 　前記ジスルフィド含有化合物がジスルフィド含有ペプチドである、請求項２８に記載のジスルフィド含有化合物の製造方法。
  30. 　（Ｉ）下記化学式５で表される化合物を、ハロゲン単体またはハロゲン生成試薬と反応させて、下記化学式６で表される化合物を調製する工程と、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     化学式５において、
    　Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、請求項１において定義した通りであり、
    　Ｒ”は、脱離基である、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     化学式６において、
    　Ｗ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、請求項１において定義した通りであり、
    　Ｈａｌは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素から選択されるハロゲン原子を表す、
    　（ＩＩ）化学式６で表される化合物を、塩基性条件下でＹ－ＯＨ（Ｙは、前記化学式１について定義した通りである）で表されるアルコール、またはＹ－ＮＨ２で表されるアミンと反応させて、下記化学式１で表される含窒素化合物を調製する工程と、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     化学式１において、
    　Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、Ｌ０、Ｌ１、ＡａおよびＡｂは、請求項１において定義した通りである、
    を含む、請求項１に記載の含窒素化合物またはその塩の製造方法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54128578A (en) * 1978-03-25 1979-10-05 Sankyo Co Ltd Pyridine sulfenic acid amide and ester, their preparation, and carcinostatic action improver
WO2015050199A2 (ja) * 2013-10-04 2015-04-09 学校法人 東京薬科大学 新規化合物、その製造方法及びその用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6080691A (ja) 1983-10-08 1985-05-08 植村　厚一 土留方法
JPH0680691A (ja) 1992-09-02 1994-03-22 Sankyo Kagaku Kk シスチン含有ペプチドの製造方法
JP2016101812A (ja) 2014-11-27 2016-06-02 シャープ株式会社 走行装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54128578A (en) * 1978-03-25 1979-10-05 Sankyo Co Ltd Pyridine sulfenic acid amide and ester, their preparation, and carcinostatic action improver
WO2015050199A2 (ja) * 2013-10-04 2015-04-09 学校法人 東京薬科大学 新規化合物、その製造方法及びその用途

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATSUEDA, R. ET AL. ET AL.: "3-NITRO-2-PYRIDINESULFENYL PROTECTING GROUP: ACTIVATABLE PROTECTING GROUP FOR PEPTIDE SYNTHESIS AND ENZYME MODIFICATION", PEPTIDE CHEMISTRY, vol. 18, 1980, pages 31 - 36 *
MATSUEDA, R. ET AL.: "3-NITRO-2-PYRIDINESULFENYL(Npys)GROUP A Novel Selective Protecting Group Which Can Be Activated for Peptide Bond Formation", INT. J. PEPTIDE PROTEIN RES., vol. 16, no. 5, November 1980 (1980-11-01), pages 392 - 401, XP055275689 *
MATSUEDA, R. ET AL.: "Syntheses of 3-nitro-2-pyridinesulfenates", HETEROCYCLES, vol. 15, no. 8, 1980, pages 1089 - 1092 *
OLSEN, F. N. ET AL.: "Npys-Mediated Elimination Reactions of Alcohols and Thiols: A Facile Route to Dehydroalanine and Dehydrobutyrine Building Blocks", SYNLETT, vol. 26, no. 19, 6 November 2015 (2015-11-06), pages 2697 - 2701, XP055598368 *
ROSEN, 0. ET AL.: "Thiolysis of the 3-nitro-2-pyridinesulfenyl(Npys) protecting group", INT. J. PEPTIDE PROTEIN RES., vol. 35, no. 6, 1990, pages 545 - 549, XP000127614 *
TAGUCHI, A. ET AL.: "3-Nitro-2-pyridinesulfenates as Efficient Solution- and Solid-Phase Disulfide Bond Forming Agents", CHEMISTRY EUR. J., vol. 23, no. 34, 16 June 2017 (2017-06-16), pages 8262 - 8267, XP055598365 *

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