JP2024048806A - トリプトファン選択的修飾剤、およびこれを用いたＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】従来法のような過酷な反応条件を用いずとも、高い効率でペプチドやタンパク質のような生体分子の化学修飾を達成しうる手段を提供する。【解決手段】下記化学式１で表される化合物またはその塩を、チオエーテル基を有する化合物の存在下で、トリプトファン残基を含有する分子における前記トリプトファン残基を選択的に修飾するためのトリプトファン選択的修飾剤として用いる：JPEG2024048806000036.jpg26161化学式１中の符号は、明細書において定義されている通りである。【選択図】図４
Description
本発明は、トリプトファン選択的修飾剤、およびこれを用いたＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法に関する。
ペプチドやタンパク質のような生体分子の化学修飾は、医薬品の創製や生理機能の解明に繋がる重要な基盤技術である。そのため、より効率的な化学修飾法の技術開発や新たな方法論の構築は、創薬やケミカルバイオロジー研究の分野において、画期的な機能性分子の創製に貢献できる可能性がある。
ペプチドやタンパク質のような生体分子への一般的な化学修飾は、リジン残基やシステイン残基のような求核性アミノ酸残基に対し、それぞれＮ－ヒドロキシスクシンイミドを用いた活性エステル法や、マレイミド誘導体を用いた共役付加反応法を用いて行われる。しかしながら、両残基は生体分子の生理機能発現に重要な役割を果たすことが多く、化学修飾によりその機能が損なわれる可能性がある。また、タンパク質中には両残基が複数存在する場合があり、均質性の高い修飾体を得ることは困難である。
一方で、生体分子中のトリプトファン残基を標的とした化学修飾法が開発されてきた。トリプトファンは真核生物において最も希少なアミノ酸であり、全アミノ酸の約１％しか占めていないが（非特許文献１）、ほとんどのタンパク質に存在する。そのため、当該残基に対する特異的、選択的な反応は有望な化学修飾法の創製に繋がる可能性がある。これまでに、Ｎ－ブロモスクシンイミド、スルホキシドなどの酸化剤を用いた「酸化法」（従来法１；非特許文献２）やパラジウム触媒等を用いた重金属試薬によるインドール環の「Ｃ－Ｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ法」による修飾法が報告されている（従来法２；非特許文献３）。しかしながら、求核性アミノ酸とは異なりトリプトファンは反応性が低いため、従来法を用いてトリプトファンを修飾するには強酸性、高温、有害な重金属試薬や有機溶媒の使用など過酷な反応条件が必要であり、生体分子への適応は難しいものが多い。また、酸化剤を用いる場合、過酸化体の副生も問題となる。
近年では、トリプトファンが天然アミノ酸の中で最大のモル吸光率および光イオン化能を有していることに着目し、光誘導電子移動を利用した電気化学的修飾法が報告されている（非特許文献４）。また、このような手法はチロシン残基に対しても応用可能である（非特許文献５）。これらの電気化学的修飾法は、生体分子に対して温和な条件（水性緩衝液、低濃度）での化学修飾を可能にするが、スケールアップ時の反応効率について検討する必要がある。
以上のことから、従来法とは異なる独自かつ効率的な化学修飾法の開発が求められる。
D. Gilis et al., Genome Biol., 2001, 2(11), research0049.1-0049.12.
D. Manzanares et al., Biochemistry, 2007, 46, 5604-5615.
J. Ruiz-Rodriguez et al., Chem. Eur. J., 2010, 16, 1124-1127.
S. J. Tower et al., J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 9112-9118.
S. Sato et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 8681-8684.
本発明は、従来法のような過酷な反応条件を用いずとも、高い効率でペプチドやタンパク質のような生体分子の化学修飾を達成しうる手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その過程で、驚くべきことに、所定の化学構造を有する化合物が、チオエーテル化合物の存在下でトリプトファン残基との間で共有結合を形成することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の一形態によれば、下記化学式１で表される化合物またはその塩からなり、チオエーテル基を有する化合物の存在下で、トリプトファン残基を含有する分子における前記トリプトファン残基を選択的に修飾するための、トリプトファン選択的修飾剤が提供される：
化学式１において、
Ｖは、窒素原子または炭素原子であり、
Ｗは、他の環員原子と一緒になって、Ｖが窒素原子のときにはピリジン環、ピラジン環、イミダゾール環、オキサゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、フェナントロリン環、プテリジン環およびアゾシン環からなる群から選択される含窒素複素環を形成し、Ｖが炭素原子のときにはベンゼン環、１Ｈ－ピロール環、フラン環、ナフタレン環、ベンゾ［ｈ］キノリン環、ピリド［２，３－ｂ］ピラジン環、シクロオクタ－１，３，５，７－テトラエン環からなる群から選択される芳香環を形成し、
Ｘは、－Ｏ－、－ＮＨ－または単結合であり、
Ｙは、Ｘが単結合のときには塩素原子であり、Ｘが－Ｏ－または－ＮＨ－のときには、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基であり、
Ｚは、前記含窒素複素環または前記芳香環上に存在するニトロ基を表し、
ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立して、０または１であり、
ｓは、０～１０の整数を表し、
Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表し、
ＡａおよびＡｂは、それぞれ独立して、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、Ｃ１～Ｃ２０のオキシアルキレン基、Ｃ１～Ｃ２０のアルキレンオキシ基、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基であり、
Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基、任意の化合物が有する特定の官能基と共有結合しうる基を末端に含む基Ｇ、または機能性物質に由来する基ＦＭである。
Ｖは、窒素原子または炭素原子であり、
Ｗは、他の環員原子と一緒になって、Ｖが窒素原子のときにはピリジン環、ピラジン環、イミダゾール環、オキサゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、フェナントロリン環、プテリジン環およびアゾシン環からなる群から選択される含窒素複素環を形成し、Ｖが炭素原子のときにはベンゼン環、１Ｈ－ピロール環、フラン環、ナフタレン環、ベンゾ［ｈ］キノリン環、ピリド［２，３－ｂ］ピラジン環、シクロオクタ－１，３，５，７－テトラエン環からなる群から選択される芳香環を形成し、
Ｘは、－Ｏ－、－ＮＨ－または単結合であり、
Ｙは、Ｘが単結合のときには塩素原子であり、Ｘが－Ｏ－または－ＮＨ－のときには、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基であり、
Ｚは、前記含窒素複素環または前記芳香環上に存在するニトロ基を表し、
ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立して、０または１であり、
ｓは、０～１０の整数を表し、
Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表し、
ＡａおよびＡｂは、それぞれ独立して、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、Ｃ１～Ｃ２０のオキシアルキレン基、Ｃ１～Ｃ２０のアルキレンオキシ基、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基であり、
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また、本発明の他の形態によれば、分子内にトリプトファン残基を有する化合物Ａを、チオエーテル基を有する化合物Ｂが存在する反応系で、上記形態に係るトリプトファン選択的修飾剤と接触させて、前記化学式１で表される化合物に含まれる硫黄原子と前記トリプトファン残基との間に共有結合を形成させることを含む、Ｔｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法が提供される。
本発明によれば、従来法のような過酷な反応条件を用いずともトリプトファン残基の化学修飾を達成することができる。これを利用することにより、例えば、ペプチドやタンパク質等の分子内に含まれるメチオニン残基の近傍に位置するトリプトファン残基を選択的に修飾することも可能となる。また、本発明を利用することにより、トリプトファン残基に種々の機能性物質を連結することも可能である。
以下、本発明の実施形態を説明する。
本発明の一形態は、下記化学式１で表される化合物またはその塩からなり、チオエーテル基を有する化合物の存在下で、トリプトファン残基を含有する分子における前記トリプトファン残基を選択的に修飾するための、トリプトファン選択的修飾剤である：
化学式１において、Ｖは、窒素原子または炭素原子であり、好ましくは窒素原子である。また、Ｗは、他の環員原子と一緒になって、Ｖが窒素原子のときにはピリジン環、ピラジン環、イミダゾール環、オキサゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、フェナントロリン環、プテリジン環およびアゾシン環からなる群から選択される含窒素複素環を形成し、Ｖが炭素原子のときにはベンゼン環、１Ｈ－ピロール環、フラン環、ナフタレン環、ベンゾ［ｈ］キノリン環、ピリド［２，３－ｂ］ピラジン環、シクロオクタ－１，３，５，７－テトラエン環からなる群から選択される芳香環を形成する。すなわち、好ましい一実施形態において、Ｖは窒素原子であり、Ｗは、他の環員原子と一緒になって上記含窒素複素環を形成する。さらに好ましくは、Ｖは窒素原子であり、Ｗは、他の環員原子と一緒になってピリジン環を形成する。
化学式１において、Ｘは、－Ｏ－、－ＮＨ－または単結合である。なかでも、Ｘは－Ｏ－であることが好ましい。
化学式１において、Ｙは、Ｘが単結合のときには塩素原子である。ここで、Ｖが窒素原子である（Ｗがピリジン環を形成する）場合に、Ｘが単結合でありＹが塩素原子である化合物としては、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニルクロリド（Ｎｐｙｓ－Ｃｌ）が挙げられる。一方、Ｙは、Ｘが－Ｏ－または－ＮＨ－のときには、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基である。ここで、「電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基」は、電子吸引性構造を有する脂肪族ヘテロ環化合物などに相当するものとして、例えば、ペプチド合成におけるカルボン酸の活性エステルを形成するアルコールからヒドロキシ基を除いた１価の基が挙げられる。より詳細には、続・医薬品の開発（第１４巻、ペプチド合成）（廣川書店）の第１６４～１７３頁の表５．７～５．１１に記載されている１価の基、または当該頁に記載されている化合物由来の１価の基が挙げられる。なお、これらの基の具体例は、以下の通りである。
なかでも、「電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基」は、置換または非置換の、スクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基または５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミジル基であることが好ましい。
また、Ｙは、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、またはもしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基であることが好ましく、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基であることがより好ましく、置換されたＣ６～Ｃ２０のアリール基であることがさらに好ましく、置換されたＣ６～Ｃ１２のアリール基であることがいっそう好ましく、置換されたフェニル基であることが特に好ましく、ハロゲン原子で置換されたフェニル基であることが最も好ましい。Ｙがハロゲン原子で置換されたフェニル基である化合物としては、例えば、４－フルオロフェニル ３－ニトロ－２－ピリジンスルフェナート（Ｎｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）；後述の実施例参照）が挙げられる。
本明細書において、アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、ｎ－ヘキシル基、１，３－ジメチルブチル基、１－イソプロピルプロピル基、１，２－ジメチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、１，４－ジメチルペンチル基、２－メチル－１－イソプロピルプロピル基、１－エチル－３－メチルブチル基、ｎ－オクチル基、２－エチルヘキシル基、３－メチル－１－イソプロピルブチル基、２－メチル－１－イソプロピル基、１－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルプロピル基、ｎ－ノニル基、３，５，５－トリメチルヘキシル基などが挙げられる。
本明細書において、アルケニル基の例としては、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、ペンテニル基、１－ヘキセニル基、３，３－ジメチル－１－ブテニル基などが挙げられる。
本明細書において、アルキニル基の例としては、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、１－ブチニル基、２－ブチニル基、３－ブチニル基、３－メチル－１－プロピニル基、２－メチル－３－プロピニル基、ペンチニル基、１－ヘキシニル基、３－メチル－１－ブチニル基、３，３－ジメチル－１－ブチニル基などが挙げられる。
本明細書において、シクロアルキル基の例としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基などが挙げられる。
本明細書において、シクロアルケニル基の例としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
本明細書において、アリール基の例としては、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、１－アントラセニル基、２－アントラセニル基、９－アントラセニル基などが挙げられる。
本明細書において、ヘテロアリール基の例としては、２－チエニル基、４－ピリジル基、３－ピリジル基、２－ピリジル基、１－ピリジル基、２－フリル基、２－ピリミジニル基、２－ベンゾチアゾリル基、１－イミダゾリル基、１－ピラゾリル基、ベンゾトリアゾール－１－イル基、７－アザベンゾトリアゾール－１－イル基などが挙げられる。
本明細書において、アジド基の例としては、メチルアジド基、エチルアジド基、ｎ－プロピルアジド基、ｉ－プロピルアジド基、ｎ－ブチルアジド基、ｓ－ブチルアジド基、ｉ－ブチルアジド基、ｔ－ブチルアジド基、ｎ－ペンチルアジド基、ｎ－ヘキシルアジド基、ｎ－へプチルアジド基、ｎ－オクチルアジド基などが挙げられる。
また、本明細書において、ある基が「置換されている」という場合、当該基を置換しうる置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、アシル基、アルキルスルファニル基、アリールスルファニル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ホルミル基、メルカプト基、スルホ基、スルフィン酸基、グアニジノ基、カルバモイル基、チオール基、チオエーテル基、メシル基、ｐ－トルエンスルホニル基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、トリメチルシリル基、ホスフィニコ基、ホスホノ基などが挙げられる。これらの置換基もまた、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基などによってさらに置換されていてもよい。ただし、置換された後の基が置換される前の基と同じ定義に含まれるような置換は考えないものとする。
化学式１において、Ｚは、Ｗが形成する前記含窒素複素環または前記芳香環上に存在するニトロ基を表す。
化学式１において、ｐは、０または１である。ｐが０のときにはＬ０は存在せずにＡａまたはＡｂまたはＲが直接、Ｗが形成する環に結合し、ｐが１のときにはＬ０が存在する。好ましい一実施形態において、ｐは０である。
化学式１において、ｑは、０または１である。ｑが０のときにはＬ１は存在せず、ｑが１のときにはＬ１が存在する。
化学式１において、ｒは、０または１である。ｒが０のときにはＡｂは存在せず、ｒが１のときにはＡｂが存在する。
化学式１において、ｓは、０～１０の整数である。ｓが０のときには［（Ａａ）－（Ｌ１）ｑ］が存在せず、ｓが１～１０の整数のときには［（Ａａ）－（Ｌ１）ｑ］がｓ個繰り返して存在する。なお、ｓは好ましくは０～５であり、より好ましくは０または１である。
化学式１において、Ｌ０およびＬ１は、存在する場合にはそれぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表す。このようなリンカーの具体的な構造について特に制限はないが、例えば、置換または非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキレン基、置換または非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニレン基、置換または非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換のＣ６～Ｃ２０のアリーレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、ポリオキシアルキレン基が挙げられる。また、Ｌ０およびＬ１は、下記化学式（ａ）で表される基：
であってもよい。ここで、化学式（ａ）において、Ｒａは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１５のアルキレン基を表し、好ましくはＣ１～Ｃ８のアルキレン基を表し、より好ましくはＣ１～Ｃ４のアルキレン基を表し、特に好ましくはＣ１～Ｃ２のアルキレン基を表し、最も好ましくはＣ２のアルキレン基（特にはエチレン基）を表す。Ｌ０およびＬ１として好ましくは、Ｃ１～Ｃ６のアルキレン基（特にはエチレン基）、分子量１００～１０００のポリオキシアルキレン基、または上記化学式（ａ）で表される基が用いられる。
化学式１において、ＡａおよびＡｂは、存在する場合にはそれぞれ独立して、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、Ｃ１～Ｃ２０のオキシアルキレン、Ｃ１～Ｃ２０のアルキレンオキシ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基である。なかでも、ＡａおよびＡｂとして好ましくは、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－、Ｃ１～Ｃ２０のオキシアルキレン、Ｃ１～Ｃ２０のアルキレンオキシ、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－または－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－が用いられる。
化学式１において、Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基、任意の化合物が有する特定の官能基と共有結合しうる基を末端に含む基Ｇ、または機能性物質に由来する基ＦＭである。
Ｒとしての「任意の化合物が有する特定の官能基と共有結合しうる基を末端に含む基Ｇ」とは、クリックケミストリーを活用した１，３－双極子付加環化反応を行うことができる官能基を意味する。「１，３－双極子（１，３－ｄｉｐｏｌｅ）」とは、三原子からなる４π電子化学種であり、アルケニル基やアルキニル基などの親双極子（ｄｉｐｏｌａｒｏｐｈｉｌｅ）を有する化合物と付加環化反応を起こし、５員複素環化合物を形成するものを意味する。よって、Ｒが「１，３－双極子」を有するとき、任意の化合物の特定の官能基は「親双極子」を有し、逆にＲが「親双極子」を有するとき、任意の化合物の特定の官能基は「１，３－双極子」を有することができる。
ここで、Ｒに適用可能な「１，３－双極子」としては、アゾメチンイリド基、ニトロン基、ニトリルイリド基、ジアゾメチル基、アジド基、ニトリルオキシド基などが挙げられる。また、Ｒに適用可能な「親双極子」としては、アルケニル基、アルキニル基が挙げられる。例えば、Ｒがニトロン基を末端に含む基であるとき、アルケニル基を有する化合物と付加環化反応を起こし、イソオキサゾール環を形成する。また、Ｒがアジド基を末端に含む基であるとき、アルキニル基を有する化合物と付加環化反応を起こし、トリアゾール環を形成する（ヒュスゲン環化付加反応）。また、Ｒがニトリルオキシド基を末端に含む基であるとき、アルケニル基を有する化合物と付加環化反応を起こし、イソオキサゾール環を形成する。上述の例において、Ｒが「１，３－双極子」を有し、任意の化合物が「親双極子」を有する場合について例示したが、Ｒが「親双極子」を有し、任意の化合物が「１，３－双極子」を有する場合であっても同様の反応を行うことができる。なかでも、Ｒは、アルキニル基またはアジド基を末端に含む基が好ましく、無置換または置換基を有する炭素数２～８の直鎖状または分岐鎖状のアルキニル基、あるいは、炭素数１～８の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基を有するアジド基がより好ましい。高い親水性を保つ観点から、炭素数２～３の直鎖状または分岐鎖状のアルキニル基もしくは、炭素数１～２の直鎖状のアルキル基を有するアジド基であることが特に好ましい。
Ｒとしての「機能性物質に由来する基ＦＭ」とは、種々の機能を有する任意の物質から生じた１価の基である。ここで、機能性物質としては、例えば、薬物、放射性物質、蛍光化学物質、発光団、蛍光タンパク質、発光タンパク質、磁性体、酵素、補酵素、生理活性物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＥＧ等の特定の機能を有する物質が挙げられる。
ここで例えば、機能性物質として放射性物質、蛍光化学物質、発光団、蛍光タンパク質、発光タンパク質、磁性体等を採用した場合、これらの物質はシグナルを発しうるものであることから、当該シグナルを検出することにより、本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤が結合した分子を検出することができる。また、がん等の特定の疾患のイメージング、診断等にも用いることができる。
さらに、機能性物質として薬物、酵素、補酵素、生理活性物質等を採用した場合、本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤の作用により特定の部位にこれらの機能性物質を送達することが可能であり、本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤をＤＤＳの薬物送達担体として用いることができる。また、機能性物質として放射性物質を採用した場合、放射性物質をがんの放射線治療剤として利用することもできる。
さらに、機能性物質としてＤＮＡやＲＮＡを採用した場合、これらのＤＮＡまたはＲＮＡを介してさらに他の物質と結合したり、他の物質を捕捉したりすることができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを介して基板に結合させることにより、バイオセンサーやマイクロアレイとして用いることができる。また、機能性物質としてＤＮＡやＲＮＡを採用した場合には、細胞特異的にＤＮＡやＲＮＡを導入することも可能である。この際、導入するＤＮＡやＲＮＡとしては、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を引き起こすｄｓＲＮＡ等のＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖、およびこれらのＲＮＡを発現するＤＮＡ鎖、アンチセンスＤＮＡ鎖等が挙げられ、この場合、細胞内で特定の遺伝子の転写・発現を抑制することができる。また、形質転換のための導入遺伝子を本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤を用いて導入することもできる。
また、機能性物質としてＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を採用した場合には、本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤に対して、安定性が向上し、体内での半減期が長くなる等の新たな機能を付与することが可能である。
（本発明の化合物の用途）
本発明者らは、上述した本発明の化合物（またはその塩）が、驚くべきことに、チオエーテル基を有する化合物の存在下で、トリプトファン残基と選択的に反応して結合するというトリプトファン選択的修飾剤としての機能を有していることを発見した。そして、本発明に係る化合物をトリプトファン選択的修飾剤として用いることで、従来の手法のように過酷な反応条件を用いなくとも、簡便な処理によって短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチドやタンパク質等の有機化合物を選択的に修飾することが可能となるという優れた効果も奏される。すなわち、本発明の他の形態によれば、Ｔｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法もまた、提供される。この製造方法は、分子内にトリプトファン残基を有する化合物（以下、「化合物Ａ」とも称する）を、チオエーテル基を有する化合物（以下、「化合物Ｂ」とも称する）の存在下、上述した本発明の一形態に係るトリプトファン選択的修飾剤と接触させて、前記化学式１で表される化合物に含まれる硫黄原子と前記トリプトファン残基との間に共有結合を形成させることを含む点に特徴がある。
本発明者らは、上述した本発明の化合物（またはその塩）が、驚くべきことに、チオエーテル基を有する化合物の存在下で、トリプトファン残基と選択的に反応して結合するというトリプトファン選択的修飾剤としての機能を有していることを発見した。そして、本発明に係る化合物をトリプトファン選択的修飾剤として用いることで、従来の手法のように過酷な反応条件を用いなくとも、簡便な処理によって短時間に、かつ、化学的に安定な手法により、ペプチドやタンパク質等の有機化合物を選択的に修飾することが可能となるという優れた効果も奏される。すなわち、本発明の他の形態によれば、Ｔｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法もまた、提供される。この製造方法は、分子内にトリプトファン残基を有する化合物（以下、「化合物Ａ」とも称する）を、チオエーテル基を有する化合物（以下、「化合物Ｂ」とも称する）の存在下、上述した本発明の一形態に係るトリプトファン選択的修飾剤と接触させて、前記化学式１で表される化合物に含まれる硫黄原子と前記トリプトファン残基との間に共有結合を形成させることを含む点に特徴がある。
ここで、トリプトファン選択的修飾剤による修飾の対象となる「分子内にトリプトファン残基を有する化合物（化合物Ａ）」の構造は特に制限されない。化合物Ａとしては、例えば、アミノ酸、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド）、タンパク質などのアミノ酸残基含有化合物のほか、高分子化合物、低分子化合物、並びにそれらの同位体を含む誘導体が挙げられる。なかでも、化合物Ａはペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
化合物Ａがペプチドまたタンパク質である場合、これらのペプチドまたはタンパク質は、天然由来のものであってもよいし、人工的に合成されたものであってもよい。ペプチドまたはタンパク質が人工的に合成されたものである場合、その合成方法について特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。ペプチドの人工的な合成方法としては、「固相合成法」および「液相合成法」が知られており、固相合成法の場合はさらにＦｍｏｃ法およびＢｏｃ法が知られている。化合物Ａがペプチドである場合、当該ペプチドはいずれの方法で合成してもよい。また、タンパク質の合成方法としては、所望のタンパク質を合成するように形質転換された、形質転換体を用いる方法が挙げられる。一例において、上記形質転換体は、細菌（大腸菌など）、酵母（出芽酵母、油性酵母など）、昆虫、動物または植物である。合成されたタンパク質は、宿主細胞または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋かつ均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離および精製は、通常のタンパク質の分離および精製で使用されている分離方法および精製方法を使用すればよい。
なお、上述した方法によってトリプトファン残基を修飾する対象となる化合物Ａは、例えば、「分子内に１つのトリプトファン残基を有する化合物」である。かような形態によれば、化合物Ａに含まれるトリプトファン残基との間で選択的にＴｒｐ－Ｓ結合を形成することができ、所望のＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物を高収率かつ高純度で製造することができる。
ここで、トリプトファン残基を修飾する対象となる化合物Ａがペプチドであるような場合、この化合物Ａは分子内に２つ以上のトリプトファン残基を含んでいる可能性がある。したがって、このような場合に特定のトリプトファン残基のみを選択的に修飾したい場合には、修飾したくないトリプトファン残基を保護基で保護しておく必要がある。化合物Ａがペプチドである場合、このような保護基の導入は、上述したペプチドの合成の際に、所望の位置にトリプトファン残基が保護されたアミノ酸を導入しておくことで達成されうる。なお、かような手法においてペプチドの合成の際に用いられる「トリプトファン残基が保護されたアミノ酸」におけるトリプトファン残基の保護基としては、例えば、側鎖のアミノ基に対するＢｏｃ保護基、Ａｃ保護基、ベンジルオキシカルボニル保護基、２、４－ジクロロベンジルオキシカルボニル保護基、２－クロロベンジルオキシカルボニル保護基、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル保護基、ホルミル保護基、４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル基、メシチレンベンゼンスルホニル保護基などが挙げられる。
また、「チオエーテル基を有する化合物（化合物Ｂ）」の構造についても特に制限されない。なお、「チオエーテル基」とは、エーテル基の酸素原子を硫黄原子で置換した基である。化合物Ｂの具体例としては、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド、ジメチルトリスルフィド、ジエチルスルフィド、ジペンチルスルフィド、ｔｅｒｔ－ブチルメチルスルフィド、ジビニルスルフィド、ジフェニルスルフィド、ジフェニルジスルフィド、ジフェニルトリスルフィド、チオアニソール、ビス（ヒドロキシフェニル）スルフィド、ジトリルスルフィド、ジトリルジスルフィド、ビス（ニトロフェニル）スルフィド、ビス（アミノフェニル）スルフィド、ビス（クロロフェニル）スルフィド、ビス（メトキシフェニル）スルフィド、ジベンゾイルスルフィド、ジベンゾイルジスルフィド、ジベンジルスルフィド、ジベンジルジスルフィド、ジベンジルトリスルフィド、ジベンジルテトラスルフィド、ジベンジルペンタスルフィド、ジベンジルヘキサスルフィド、ジベンジルヘプタスルフィド、ジベンジルオクタスルフィド、ジシクロヘキシルスルフィド、ジシクロヘキシルジスルフィド、メチルシクロヘキシルスルフィド、メチルフェニルスルフィド、メチルアリルスルフィド、メチルベンジルスルフィド、フェニルアリルスルフィド、フェニルビニルスルフィド、フェニルベンジルスルフィド、フェニルスチリルスルフィド、フェニルシンナミルスルフィド、フェニルベンゾイルスルフィド、フェニルフェナシルスルフィド、フェニルシクロヘキシルスルフィド、トリルベンジルスルフィド、ベンジルアリルスルフィド、トリメチレンスルフィド、トリメチレンジスルフィド、テトラメチレンスルフィド、テトラメチレンジスルフィド、ペンタメチレンスルフィド、チオフェン、４Ｈ－チイン、ベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン、チアクロマン、チアキサンテン、ジエチルチオアセタール、α－フェニル－ジエチルチオアセタール、１，１－ビス（エチルチオ）プロパン、１，１－ビス（エチルチオ）プロペン、１，４－ビス（メチルジチオ）シクロヘキサン、１，３－ジチオラン、１，３－ジチアン、１，４－ジチアン、１，４－ジチエン、１，４－ジチアジエン、チアントレン、１，３，５－トリチアン、ポリフェニレンスルフィド、メチオニン；エチオニン、Ｎ－ホルミルエチオニン、Ｓ－アデノシルメチオニン等のメチオニン誘導体などが挙げられる。これらの化合物は、単独で使用しても２種以上を混合して使用してもよい。
さらに、「チオエーテル基を有する化合物（化合物Ｂ）」は、メチオニン（Ｍｅｔ）残基を有するペプチドやタンパク質であってもよい。この場合、化合物Ｂは、修飾の対象である化合物Ａとは異なる分子であってもよいが、化合物Ｂは化合物Ａと同じ分子であり（つまり、化合物Ａと化合物Ｂとが単一の化合物であり）、化合物Ｂが提供するチオエーテル基が、当該ペプチドまたはタンパク質において修飾の対象とされるトリプトファン残基の近傍に存在するメチオニン残基に由来する基であることが好ましい。このような実施形態によれば、本発明の一形態に係るトリプトファン選択的修飾剤と修飾の対象である化合物（ペプチドまたはタンパク質）のみを溶媒中で混合するという極めて簡便な操作によってトリプトファン残基に対する選択的な修飾を行うことができるという利点がある。なお、メチオニン残基がトリプトファン残基の「近傍」に位置するとは、上述した修飾反応が進行する位置にこれらの残基が存在する限り特に制限されない。例えば、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の一次構造におけるこれらの残基間の距離は、例えば１～２０アミノ酸残基であり、好ましくは１～１５アミノ酸残基であり、より好ましくは１～１０アミノ酸残基であり、さらに好ましくは１～５アミノ酸残基であり、特に好ましくは１～３アミノ酸残基であり、最も好ましくは１アミノ酸残基（上記残基はペプチド結合を介して連結されている）である。ただし、アミノ酸配列の一次構造において遠く離れたメチオニン残基とトリプトファン残基とがペプチドやタンパク質の三次構造等の立体構造に起因して「近傍」に存在することもよくあることである。本発明においては、このような場合ももちろん、技術的範囲に包含されるものである。
ここで、本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤を用いて修飾したい対象がペプチドである場合に、当該ペプチドがトリプトファン残基および／またはメチオニン残基を含んでいないこともありうる。このような場合には、当該ペプチドの合成の際に、所望の位置にトリプトファン残基および／またはメチオニン残基が導入されるように当該ペプチドのアミノ酸配列を改変することで、修飾対象のペプチドにトリプトファン残基および／またはメチオニン残基を導入して、化合物Ａとすることができる。この場合、トリプトファン残基および／またはメチオニン残基を導入する部位は、上記ペプチドの活性の発現に悪影響を及ぼさない部位であることが好ましい。
また、本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤を用いて修飾したい対象がタンパク質である場合には、遺伝子組み換えの手法を用いて上記タンパク質のアミノ酸配列を改変したものに対して修飾を施すことでより選択的かつ効率的にトリプトファン残基の修飾が可能となる。
例えば、化合物Ａがタンパク質である場合に、当該タンパク質は、遺伝子組み換えにより、所望の位置にトリプトファン残基が挿入されたものであるか、または、所望の位置のアミノ酸残基がトリプトファン残基に改変されたものでありうる。この手法は、上記タンパク質の三次構造において、タンパク質粒子の表面に修飾可能なトリプトファン残基が存在しないような場合に、修飾可能なトリプトファン残基をタンパク質粒子の表面に導入するといった目的で用いられうる。
また、化合物Ａがタンパク質である場合に、当該タンパク質は、遺伝子組み換えにより、所望の位置のトリプトファン残基が欠失されたものであるか、または、所望の位置のトリプトファン残基が他のアミノ酸残基に改変されたものでありうる。この手法は、上記タンパク質の三次構造において、タンパク質粒子の表面に修飾可能なトリプトファン残基が複数存在しているような場合に、修飾したくないトリプトファン残基を除去するといった目的で用いられうる。
さらに、化合物Ａがタンパク質である場合に、当該タンパク質は、遺伝子組み換えにより、所望の位置にメチオニン残基が挿入されたものであるか、または、所望の位置のアミノ酸残基がメチオニン残基に改変されたものでありうる。この手法は、上記タンパク質の三次構造において、タンパク質粒子の表面のトリプトファン残基の近傍にメチオニン残基が存在しないような場合に、トリプトファン残基の近傍にメチオニン残基を導入するといった目的で用いられうる。
また、化合物Ａがタンパク質である場合に、当該タンパク質は、遺伝子組み換えにより、所望の位置のメチオニン残基が欠失されたものであるか、または、所望の位置のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に改変されたものでありうる。この手法は、上記タンパク質の三次構造において、タンパク質粒子の表面に修飾可能なトリプトファン残基がその近傍のメチオニン残基とともに複数存在しているような場合に、修飾したくないトリプトファン残基の近傍のメチオニン残基を除去するといった目的で用いられうる。
ところで、本発明に係る化学式１で表される化合物の一部は、分子内に２つ（以上）の還元型チオール基を有する化合物（例えば、ペプチドやタンパク質）と接触させることにより、上記２つ（以上）の還元型チオール基の間にジスルフィド結合を形成させる機能を有する（つまり、ジスルフィド化試薬として働く）ことが知られている（国際公開第２０１７／２００１０９号）。したがって、本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤を用いた修飾の対象である化合物Ａがペプチドまたはタンパク質である場合に、上記修飾剤によってジスルフィド結合が形成されうる還元型チオール基を含む構造（例えば、システイン残基）が２つ以上含まれている場合（つまり、化合物Ａが、還元型チオール基を有するシステイン残基を２以上有するペプチドまたはタンパク質である場合）には、化合物Ａを上記トリプトファン選択的修飾剤と接触させる前に、保護基を用いて上記化合物Ａに含まれる還元型チオール基を保護し、次いで、還元型チオール基が保護された化合物Ａをトリプトファン選択的修飾剤と接触させた後に、当該還元型チオール基を脱保護することが好ましい。このような構成とすることにより、本発明に係る化学式１で表される化合物がジスルフィド化試薬として働くのを防止しつつ、トリプトファン選択的修飾剤としてのみ機能させることが可能となる。
本形態に係るＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法においては、化合物Ａを、化合物Ｂが存在する反応系で、本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤と接触させることにより行う。これにより、化学式１で表される化合物に含まれる硫黄原子と、化合物Ａに含まれるトリプトファン残基との間に共有結合が形成されて、Ｔｒｐ－Ｓ結合含有化合物が得られる。
化合物Ａと化合物Ｂとを接触させる具体的な手法について特に制限はないが、通常は溶媒中において化合物Ａと化合物Ｂとを接触させる。溶媒についても特に制限はないが、溶媒は水を含むことが好ましい。また、溶媒としては水に代えて緩衝液を用いることができ、水、緩衝液および有機溶媒のいずれかを組み合わせて用いてもよい。一方、有機溶媒を組み合わせて用いる場合は、水と混和する有機溶媒が好ましく、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド、アルコール、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサンなどが挙げられ、この有機溶媒としてはアセトニトリルが好ましい。
また、反応の収率を向上させるという観点から、反応系には、酸がさらに存在することが好ましい。この酸の酸解離定数（ｐＫａ）は、６以下であることが好ましく、５以下であることがより好ましく、４以下であることがさらに好ましく、３以下であることがいっそう好ましく、２以下であることが特に好ましく、１以下であることが最も好ましい。ｐＫａが６以下の酸としては、例えば、酢酸、スルホン酸、塩酸、硝酸、リン酸、リン酸モノエステル、リン酸ジエステル、亜リン酸、亜リン酸エステル、次亜リン酸や、トリフルオロ酢酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸等のハロゲン化アルキルカルボン酸、ペンタフルオロ安息香酸、２，４，６－トリフルオロメチル安息香酸等のハロゲン化アリールカルボン酸などが挙げられる。なかでも、酢酸またはハロゲン化アルキルカルボン酸が好ましく、ハロゲン化アルキルカルボン酸がより好ましく、トリフルオロ酢酸がさらに好ましい。反応系における酸の濃度について特に制限はないが、好ましくは５～８５体積％であり、より好ましくは２０～８０体積％であり、さらに好ましくは３０～８０体積％である。
反応条件についても特に制限はなく、反応温度は例えば１０～４０℃、好ましくは２０～３０℃であり、反応時間は例えば０．５～９６時間、好ましくは２～７２時間、より好ましくは５～６０時間、さらに好ましくは１０～５４時間である。反応圧力についても制限はなく、通常は常圧（大気圧）下で行えばよい。また、反応で用いられる本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤および化合物Ｂの添加量は、化合物Ａの量に応じて増減すればよい。例えば、化合物Ａ １当量に対し、本発明に係るトリプトファン選択的修飾剤および化合物Ｂの量は１当量～過剰量用いることが好ましく、より好ましくは１当量～２当量用いる。反応の完結は、溶液中の化合物Ａの消費を一般的な分析手法に基づいて判断すればよい。例えば、適用可能な分析手法として、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＴＬＣ、ＩＲ、ＭＳスペクトル、滴定等が挙げられる。
反応後、トリプトファン選択的修飾剤、目的生成物であるＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物、未反応の化合物Ａおよび化合物Ｂ、並びに化合物Ａおよび／または化合物Ｂが反応の進行とともに変化した化合物は、一般的な精製手法により精製することができる。
本形態に係る製造方法において用いられるトリプトファン選択的修飾剤が例えば化学式１のＲとして機能性物質に由来する基ＦＭを有している場合には、当該製造方法によって製造されたＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物も上記基ＦＭを有するものとなる。このようにして、原料である化合物Ａに対して基ＦＭに起因する種々の機能を付与することが可能となる。そして、上述したように基ＦＭとしては極めて広範かつ多様な機能性物質に由来するものを用いることが可能である。したがって、本発明は、種々の化合物に対して広範かつ多様な機能を付与することにより化合物のバリエーションを著しく増加させることができるという非常に優位性の高い技術を提供するものである。
なお、以下の実施形態も本発明の範囲に含まれる：請求項２の特徴を有する請求項１に記載の修飾剤；請求項３の特徴を有する請求項１または２に記載の修飾剤；請求項４の特徴を有する請求項１～３のいずれかに記載の修飾剤；請求項５の特徴を有する請求項１～４のいずれかに記載の修飾剤；請求項６の特徴を有する請求項１～５のいずれかに記載の修飾剤；請求項７の特徴を有する請求項１～６のいずれかに記載の修飾剤；請求項１～８のいずれかに記載の修飾剤を用いる請求項９に記載の製造方法；請求項１０の特徴を有する請求項９に記載の製造方法；請求項１１の特徴を有する請求項９または１０に記載の製造方法；請求項１２の特徴を有する請求項９～１１のいずれかに記載の製造方法；請求項１３の特徴を有する請求項９～１２のいずれかに記載の製造方法；請求項１４の特徴を有する請求項９～１３のいずれかに記載の製造方法。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
［１．一般情報］
核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）の測定には、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ－ＩＩＩ（４００ＭＨｚ）を用いた。質量分析スペクトル（ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ）は、ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴで測定した。１Ｈ－ＮＭＲデータ中、ＮＭＲシグナルのパターンで、ｓはシングレット、ｄはダブレット、ｔはトリプレット、ｑはカルテット、ｍはマルチプレット、Ｊはカップリング定数、Ｈｚはヘルツ、ＣＤＣｌ３は重クロロホルム、ＣＤ３ＯＤは重メタノールを意味する。１Ｈ－ＮＭＲデータ中、水酸基（ＯＨ）、アミノ基（ＮＨ２）、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）のプロトン等は、ブロードバンドになり確認ができない場合には、データに記載しない。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚのデータ中、Ｍは分子量、［Ｍ＋Ｈ］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋は分子イオンピークを意味する。
核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）の測定には、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ－ＩＩＩ（４００ＭＨｚ）を用いた。質量分析スペクトル（ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ）は、ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴで測定した。１Ｈ－ＮＭＲデータ中、ＮＭＲシグナルのパターンで、ｓはシングレット、ｄはダブレット、ｔはトリプレット、ｑはカルテット、ｍはマルチプレット、Ｊはカップリング定数、Ｈｚはヘルツ、ＣＤＣｌ３は重クロロホルム、ＣＤ３ＯＤは重メタノールを意味する。１Ｈ－ＮＭＲデータ中、水酸基（ＯＨ）、アミノ基（ＮＨ２）、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）のプロトン等は、ブロードバンドになり確認ができない場合には、データに記載しない。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚのデータ中、Ｍは分子量、［Ｍ＋Ｈ］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋は分子イオンピークを意味する。
［２．Ｎｐｙｓ誘導体の合成］
まず、論文（Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ．， ２０１８， ２４， ｅ３０７０．）の記載に基づき、Ｎｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）を合成した。
まず、論文（Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ．， ２０１８， ２４， ｅ３０７０．）の記載に基づき、Ｎｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）を合成した。
［３．Ｎｐｙｓ修飾トリプトファン誘導体合成における溶媒検討］
Ｃｂｚ－Ｔｒｐ－ＯＨ（１．０当量）を含む溶媒（下記の表１、Ｅｎｔｒｙ１～７）に、室温にてエチルスルフィド（１．０当量）およびＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）（１．０当量）を添加し、同温度にて４８時間撹拌した。反応溶液の一部を採取し、生成したＮｐｙｓ修飾Ｔｒｐ誘導体Ｐ１をＨＰＬＣにて分析した。また、化合物Ｐ１の検量線に基づきＨＰＬＣ収率を算出した。結果を下記の表１に示す。
反応溶媒を７５％酢酸水溶液で行なったところ、化合物Ｐ１は５５％の収率で得られた（エントリー１）。また、エントリー２のように添加剤として塩化リチウム（Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０２０， １８， ７０９４－７０９７．）を用いると、若干の収率向上が見られた（収率６０％）。酸濃度３７．５％において、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような解離定数（ｐＫａ）が低い（ｐＫａ＝０．２３）酸を用いると、酢酸と比較して反応は効率的に進行することが示された（エントリー４：収率９５％）。一方で、エントリー５～エントリー７のようにヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）または２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）などの酸を用いた場合や、酸を用いない場合には、低収率であることもわかった。
ここで、エントリー１における反応条件での反応の経時的な様子を表すＨＰＬＣチャートを図１に示す。ここで、図１に示す＊は４－フルオロフェノールに対応するピークであり、＊＊はＮｐｙｓの二量体に対応するピークである。図１に示すチャートから、反応１時間後に、まずピロロインドリン誘導体Ｐ２、Ｐ３が生成し、時間経過に伴いＮｐｙｓ修飾Ｔｒｐ誘導体Ｐ１に収束したことが確認された。これらの結果から、図２に示すような反応機構により本スルフェニル化反応は進行すると考えられる。
［４．Ｎｐｙｓ修飾トリプトファン誘導体（(S)-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-3-(2-((3-nitropyridin-2-yl)thio)-1H-indol-3-yl)propanoic acid、Ｐ１）の合成］
Ｃｂｚ－Ｔｒｐ－ＯＨ（５０．０ｍｇ，１４８μｍｏｌ）の酢酸水溶液（３：１，ｖ／ｖ，１．５ｍＬ）に、室温にてエチルスルフィド（１５．９μＬ，１４８μｍｏｌ）およびＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）（５９．０ｍｇ，２２２μｍｏｌ）を添加し、同温度にて７２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：アセトン＝７０：１：１）で精製することで、Ｎｐｙｓ修飾トリプトファン誘導体（Ｐ１）を黄色固体として得た（２３．９ｍｇ，４８．５μｍｏｌ，収率３３％）。
なお、上述したピロロインドリン誘導体Ｐ２およびＰ３の化学構造を同定する目的で、以下ではこれらの化合物を合成し、各種機器データを取得した。
［５．ピロロインドリン誘導体（(2S)-1-((benzyloxy)carbonyl)-3a-((3-nitropyridin-2-yl)thio)-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indole-2-carboxylic acid, Ｐ２）の合成］
Ｃｂｚ－Ｔｒｐ－ＯＨ（１００．０ｍｇ，２９６μｍｏｌ）の７５％酢酸水溶液（１．５ｍＬ）に、室温にてエチルスルフィド（３１．８μＬ，２９６μｍｏｌ）およびＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）（７８．７ｍｇ，２９６μｍｏｌ）を添加し、４℃にて４２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：アセトン＝７０：１：１）で精製することで、ピロロインドリン誘導体（Ｐ２）を黄色固体として得た（１５．５ｍｇ，３１．５μｍｏｌ，収率１１％）。
［ピロロインドリン誘導体（(2S)-1-((benzyloxy)carbonyl)-3a-((3-nitropyridin-2-yl)thio)-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indole-2-carboxylic acid, Ｐ３）の合成
Ｃｂｚ－Ｔｒｐ－ＯＨ（５０．０ｍｇ，１４８μｍｏｌ）の酢酸水溶液（３：１，ｖ／ｖ，１．５ｍＬ）に、室温にてエチルスルフィド（１５．９μＬ，１４８μｍｏｌ）およびＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）（５９．０ｍｇ，２２２μｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：アセトン＝７０：１：１）およびＨＰＬＣで精製することで、ピロロインドリン誘導体（Ｐ３）を黄色固体として得た（２６．８ｍｇ，５４．３μｍｏｌ，収率３７％）。
［６．アミノ酸に対する反応選択性］
Ｎｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）（１当量）に、室温にてＣｂｚ保護アミノ酸誘導体（１当量）の酢酸水溶液（３：１，ｖ／ｖ，１００ｍＭ）を添加した。次いで、エチルスルフィド（１当量）を添加し、同温度にて１．５時間撹拌した。反応溶液の一部を希釈し、その溶液中に含まれるＮｐｙｓ修飾されたアミノ酸誘導体の分子量を質量分析測定（ＨＲＭＳ）により解析した。結果を下記の表２に示す。
［７．ペプチドにおけるトリプトファン残基の修飾］
（７－１．ペプチド合成）
Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＮＨ２（ペプチドａ；Ａｃ－ＡＡＷＡＡ－ＮＨ２；配列番号１）の合成
Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（９０．９ｍｇ，４０．０ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を添加し、室温にて振とうした。ろ過にて反応溶液を除去した後、Ｆｍｏｃ－アミノ酸誘導体（３当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、３当量）およびＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ、３当量）を用い、Ｆｍｏｃ－固相ペプチド合成法にてペプチド鎖を伸長した。得られたＨ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ（配列番号２）にＤＭＦ、無水酢酸（３当量）およびＤＩＰＥＡ（３当量）を添加し、室温にて６０分振とうして、ペプチドのＮ末端のＡｃ化を行った。得られた樹脂（Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ；配列番号３）をＤＭＦ、メタノールおよびジエチルエーテルで洗浄した後、乾燥した。乾燥樹脂にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ（９５：５，ｖ／ｖ，５ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、窒素吹きつけにて反応溶液を留去した。得られた残渣に氷冷したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらに氷冷したジエチルエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｍｉｌｌｉＱ（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＝７６：２４ ｔｏ ６０：４０ ｏｖｅｒ １６ｍｉｎ，ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ：２３０ｎｍ，ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ ５μｍ，１９ｘ１５０ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで目的のペプチド（ペプチドａ）を得た（１２．５ｍｇ，２３．７μｍｏｌ，収率５９％）。
（７－１．ペプチド合成）
Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＮＨ２（ペプチドａ；Ａｃ－ＡＡＷＡＡ－ＮＨ２；配列番号１）の合成
Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（９０．９ｍｇ，４０．０ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を添加し、室温にて振とうした。ろ過にて反応溶液を除去した後、Ｆｍｏｃ－アミノ酸誘導体（３当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、３当量）およびＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ、３当量）を用い、Ｆｍｏｃ－固相ペプチド合成法にてペプチド鎖を伸長した。得られたＨ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ（配列番号２）にＤＭＦ、無水酢酸（３当量）およびＤＩＰＥＡ（３当量）を添加し、室温にて６０分振とうして、ペプチドのＮ末端のＡｃ化を行った。得られた樹脂（Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ；配列番号３）をＤＭＦ、メタノールおよびジエチルエーテルで洗浄した後、乾燥した。乾燥樹脂にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ（９５：５，ｖ／ｖ，５ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、窒素吹きつけにて反応溶液を留去した。得られた残渣に氷冷したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらに氷冷したジエチルエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｍｉｌｌｉＱ（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＝７６：２４ ｔｏ ６０：４０ ｏｖｅｒ １６ｍｉｎ，ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ：２３０ｎｍ，ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ ５μｍ，１９ｘ１５０ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで目的のペプチド（ペプチドａ）を得た（１２．５ｍｇ，２３．７μｍｏｌ，収率５９％）。
Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｍｅｔ－ＮＨ２（ペプチドｂ；Ａｃ－ＡＡＷＡＭ－ＮＨ２；配列番号４）の合成
Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（９０．９ｍｇ，４０．０ｍｍｏｌ）を用い、ペプチドａと同様の合成により乾燥樹脂Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｍｅｔ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ（配列番号５）を得た。得られた乾燥樹脂にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ（９５：５，ｖ／ｖ，５ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、窒素吹きつけにて反応溶液を留去した。得られた残渣に氷冷したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらに氷冷したジエチルエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｍｉｌｌｉＱ（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＝７３：２７ ｔｏ ６０：４０ ｏｖｅｒ １３ｍｉｎ，ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ：２３０ｎｍ，ｃｏｌｕｍｎ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ４－ＡＲ－３００，Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ４．６ ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ）にて精製することで目的のペプチド（ペプチドｂ）を得た（１２．４ｍｇ，２１．０μｍｏｌ，収率５２％）。
Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（９０．９ｍｇ，４０．０ｍｍｏｌ）を用い、ペプチドａと同様の合成により乾燥樹脂Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｍｅｔ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ（配列番号５）を得た。得られた乾燥樹脂にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ（９５：５，ｖ／ｖ，５ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、窒素吹きつけにて反応溶液を留去した。得られた残渣に氷冷したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらに氷冷したジエチルエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｍｉｌｌｉＱ（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＝７３：２７ ｔｏ ６０：４０ ｏｖｅｒ １３ｍｉｎ，ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ：２３０ｎｍ，ｃｏｌｕｍｎ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ４－ＡＲ－３００，Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ４．６ ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ）にて精製することで目的のペプチド（ペプチドｂ）を得た（１２．４ｍｇ，２１．０μｍｏｌ，収率５２％）。
Ａｃ－ニューロメジンＢ（Ａｃ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｐｈｅ－Ｍｅｔ－ＮＨ２；配列番号６）の合成
Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（６８１ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を用い、ペプチドａと同様の合成により乾燥樹脂Ｈ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ－Ｍｅｔ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ（配列番号７）（１１６８ｍｇ）を得た。このうち、５８４ｍｇをペプチドＡｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＮＨ２の合成と同様の方法にて、ペプチドのＮ末端のＡｃ化を行った。得られた乾燥樹脂Ａｃ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ－Ｍｅｔ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ（配列番号８）をＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：１，３－ジメトキシベンゼン：１，２－エタンジチオール（９０：２．５：５．０：２．５，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ， ５ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、窒素吹きつけにて反応溶液を留去した。得られた残渣に氷冷したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらに氷冷したジエチルエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｍｉｌｌｉＱ（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＝７０：３０ ｔｏ ５５：４５ ｏｖｅｒ １５ ｍｉｎ，ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ：２３０ｎｍ，ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ ５μｍ，１９ｘ１５０ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで目的のＡｃ－ニューロメジンＢを得た（３７．９ｍｇ，３２．３μｍｏｌ，収率２２％）。
Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ（６８１ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を用い、ペプチドａと同様の合成により乾燥樹脂Ｈ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ－Ｍｅｔ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ（配列番号７）（１１６８ｍｇ）を得た。このうち、５８４ｍｇをペプチドＡｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＮＨ２の合成と同様の方法にて、ペプチドのＮ末端のＡｃ化を行った。得られた乾燥樹脂Ａｃ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ－Ｍｅｔ－ＮＨ－ｒｅｓｉｎ（配列番号８）をＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：１，３－ジメトキシベンゼン：１，２－エタンジチオール（９０：２．５：５．０：２．５，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ， ５ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、窒素吹きつけにて反応溶液を留去した。得られた残渣に氷冷したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらに氷冷したジエチルエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｍｉｌｌｉＱ（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＝７０：３０ ｔｏ ５５：４５ ｏｖｅｒ １５ ｍｉｎ，ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ：２３０ｎｍ，ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ ５μｍ，１９ｘ１５０ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで目的のＡｃ－ニューロメジンＢを得た（３７．９ｍｇ，３２．３μｍｏｌ，収率２２％）。
グルカゴンの合成
Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｔｒｔ－Ｐｅｇ－ｒｅｓｉｎ（０．２０ｍｍｏｌ/ｇ，５００ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を用い、ペプチドａと同様の合成により乾燥樹脂Ｈ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｏ－ｒｅｓｉｎ（配列番号９）を得た。得られた乾燥樹脂にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：１，２－エタンジチオール（９４：２．５：１．０：２．５，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ，１０ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、窒素吹きつけにて反応溶液を留去した。得られた残渣に氷冷したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらに氷冷したジエチルエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＝７０：３０ ｔｏ ５５：４５ ｏｖｅｒ １５ｍｉｎ，ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ：２３０ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ ５μｍ，１９ｘ１５０ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで目的のグルカゴンを得た（１０５ｍｇ，２６．７μｍｏｌ，２７％）。
Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｔｒｔ－Ｐｅｇ－ｒｅｓｉｎ（０．２０ｍｍｏｌ/ｇ，５００ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を用い、ペプチドａと同様の合成により乾燥樹脂Ｈ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｏ－ｒｅｓｉｎ（配列番号９）を得た。得られた乾燥樹脂にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：１，２－エタンジチオール（９４：２．５：１．０：２．５，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ，１０ｍＬ）を添加し、室温にて３時間撹拌した。反応溶液をろ過し、窒素吹きつけにて反応溶液を留去した。得られた残渣に氷冷したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを析出させた。さらに氷冷したジエチルエーテルで２回洗浄し、乾燥した。粗生成物をＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｍｉｌｌｉＱ （０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＝７０：３０ ｔｏ ５５：４５ ｏｖｅｒ １５ｍｉｎ，ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ：２３０ｎｍ， ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ ５μｍ，１９ｘ１５０ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで目的のグルカゴンを得た（１０５ｍｇ，２６．７μｍｏｌ，２７％）。
メラニン凝集ホルモン（Melanin-concentrating hormone（MCH））の合成
論文（Eur. J. Org. Chem., 2021, 956-963.）の記載に基づき、ＭＣＨを合成した。
論文（Eur. J. Org. Chem., 2021, 956-963.）の記載に基づき、ＭＣＨを合成した。
（７－２．ペプチドへの化学修飾の検討）
ペプチドに対するスルフェニル化反応を調べるために、Ｔｒｐ／Ｍｅｔ残基含有ペプチドとしてペプチドｂ（Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｍｅｔ－ＮＨ２）を用いた。下記の表３のエントリー１に示すように、７５％酢酸水溶液中、Ｎｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）（１当量）を用いて上記ペプチドのスルフェニル化反応を行なったところ、７２時間後のＮｐｙｓ修飾体のＨＰＬＣ収率は９１％であった。この反応の経時的な様子を表すＨＰＬＣチャートを図３に示す。
ペプチドに対するスルフェニル化反応を調べるために、Ｔｒｐ／Ｍｅｔ残基含有ペプチドとしてペプチドｂ（Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｍｅｔ－ＮＨ２）を用いた。下記の表３のエントリー１に示すように、７５％酢酸水溶液中、Ｎｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）（１当量）を用いて上記ペプチドのスルフェニル化反応を行なったところ、７２時間後のＮｐｙｓ修飾体のＨＰＬＣ収率は９１％であった。この反応の経時的な様子を表すＨＰＬＣチャートを図３に示す。
上述したＺ－Ｔｒｐ－ＯＨに対するスルフェニル化反応のように、本実験においても時間経過に伴い収束するピークが見られた。このため、ペプチドを対象とした場合においてもピロロインドリン型修飾体Ｐ１、Ｐ２を経由し、Ｎｐｙｓ修飾ペプチドＰ３に収束されたものと考えられる。一方で、Ｍｅｔ残基を有さないペプチドａ（Ａｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＮＨ２）を用いた場合、反応は進行せずＮｐｙｓ修飾体の生成は確認されなかった（エントリー２）。この結果から、ペプチドにおいてもＭｅｔ残基の側鎖チオエーテル構造を触媒とし、Ｔｒｐ残基へのスルフェニル化が進行することが示唆された。
続いて、より複雑な構造を有する生理活性ペプチドにおけるＮｐｙｓ修飾を検討した。ａ－ヘリックス構造を有するグルカゴン（３０残基）では収率６０％（Ｎｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）を２当量使用すると収率７４％）であり（エントリー３）、ジスルフィド結合を有するＭＣＨ（１９残基、７番目および１６番目のＣｙｓ残基間にジスルフィド結合）では、７４％のＨＰＬＣ収率にて修飾体が確認された（エントリー４）。
ここで、上記の表３に示す各エントリーの実験方法を以下に記載する。
Ａｃ－ＡＡＷＡＭ－ＮＨ２（ペプチドｂ）の化学修飾（表３のエントリー１）
Ａｃ－ＡＡＷＡＭ－ＮＨ２（ペプチドｂ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）を添加し、同温度にて７２時間攪拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した（ＨＰＬＣ条件：０．１％ＴＦＡ水溶液中で５％ＣＨ３ＣＮから７５％ＣＨ３ＣＮへの線形濃度勾配（３５分間）、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２３０ｎｍで検出、Ｃｏｌｕｍｎ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ ４．６ＩＤｘ１５０ｍｍ）。７２時間後におけるＮｐｙｓ修飾ペプチドＰ３のＨＰＬＣ収率は９１％であった。
Ａｃ－ＡＡＷＡＭ－ＮＨ２（ペプチドｂ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）を添加し、同温度にて７２時間攪拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した（ＨＰＬＣ条件：０．１％ＴＦＡ水溶液中で５％ＣＨ３ＣＮから７５％ＣＨ３ＣＮへの線形濃度勾配（３５分間）、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２３０ｎｍで検出、Ｃｏｌｕｍｎ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ ４．６ＩＤｘ１５０ｍｍ）。７２時間後におけるＮｐｙｓ修飾ペプチドＰ３のＨＰＬＣ収率は９１％であった。
Ａｃ－ＡＡＷＡＡ－ＮＨ２（ペプチドａ）の化学修飾（表３のエントリー２）
Ａｃ－ＡＡＷＡＡ－ＮＨ２（ペプチドａ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）を添加し、同温度にて７２時間攪拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した。７２時間後の反応溶液を質量分析したところ、Ｎｐｙｓ修飾ペプチドの質量は検出されなかった。
Ａｃ－ＡＡＷＡＡ－ＮＨ２（ペプチドａ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）を添加し、同温度にて７２時間攪拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した。７２時間後の反応溶液を質量分析したところ、Ｎｐｙｓ修飾ペプチドの質量は検出されなかった。
グルカゴンの化学修飾（表３のエントリー３）
グルカゴンのＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）を添加し、同温度にて７２時間攪拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した。７２時間後におけるＮｐｙｓ修飾ペプチドのＨＰＬＣ収率は６０％であった。また、Ｎｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）を２当量用いた場合のＮｐｙｓ修飾ペプチドのＨＰＬＣ収率は７４％であった。
グルカゴンのＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）を添加し、同温度にて７２時間攪拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した。７２時間後におけるＮｐｙｓ修飾ペプチドのＨＰＬＣ収率は６０％であった。また、Ｎｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）を２当量用いた場合のＮｐｙｓ修飾ペプチドのＨＰＬＣ収率は７４％であった。
メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）の化学修飾（表３のエントリー４）
メラニン凝集ホルモンのＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）を添加し、同温度にて７２時間攪拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した。７２時間後におけるＮｐｙｓ修飾ペプチドのＨＰＬＣ収率は７４％であった。
メラニン凝集ホルモンのＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）のＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（３：１，ｖ／ｖ）溶液（１当量，１ｍＭ）を添加し、同温度にて７２時間攪拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した。７２時間後におけるＮｐｙｓ修飾ペプチドのＨＰＬＣ収率は７４％であった。
（７－３．ペプチドの化学修飾における反応溶媒の検討）
Ａｃ－ニューロメジンＢの溶液（１当量、１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）の溶液（１当量、１ｍＭ）を添加し、同温度にて撹拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。この際、反応溶媒および反応時間を下記の表４に示すように変化させて実験を行なった。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した（ＨＰＬＣ条件：０．１％ＴＦＡ水溶液中で５％ＣＨ３ＣＮから７５％ＣＨ３ＣＮへの線形濃度勾配（３５分間）、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２３０ｎｍで検出、Ｃｏｌｕｍｎ：ＨＩＴＡＣＨＩ ＬａＣｈｒｏｍ ＩＩ Ｃ１８－（５μｍ） Ｐ／Ｎ ８８９－０９１１ ４．６ＩＤ×１５０ｍｍ）。このようにして得られたＮｐｙｓ修飾ペプチドＰ３のＨＰＬＣ収率を下記の表４に示す。また、表４のエントリー１～３の反応の経時的な様子を表すＨＰＬＣチャートを図４に示す。ここで、図４に示す＊は、Ａｃ－ニューロメジンＢの１酸素化体に対応するピークである。
Ａｃ－ニューロメジンＢの溶液（１当量、１ｍＭ）に、室温にてＮｐｙｓ－ＯＰｈ（ｐＦ）の溶液（１当量、１ｍＭ）を添加し、同温度にて撹拌した（ペプチドの最終濃度：０．５ｍＭ）。この際、反応溶媒および反応時間を下記の表４に示すように変化させて実験を行なった。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した（ＨＰＬＣ条件：０．１％ＴＦＡ水溶液中で５％ＣＨ３ＣＮから７５％ＣＨ３ＣＮへの線形濃度勾配（３５分間）、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２３０ｎｍで検出、Ｃｏｌｕｍｎ：ＨＩＴＡＣＨＩ ＬａＣｈｒｏｍ ＩＩ Ｃ１８－（５μｍ） Ｐ／Ｎ ８８９－０９１１ ４．６ＩＤ×１５０ｍｍ）。このようにして得られたＮｐｙｓ修飾ペプチドＰ３のＨＰＬＣ収率を下記の表４に示す。また、表４のエントリー１～３の反応の経時的な様子を表すＨＰＬＣチャートを図４に示す。ここで、図４に示す＊は、Ａｃ－ニューロメジンＢの１酸素化体に対応するピークである。
表４に示すエントリー１～エントリー３のように、７５％ＡｃＯＨ溶液で反応を行なったところ、２４、４８、７２時間でのＮｐｙｓ修飾ペプチドＰ３のＨＰＬＣ収率は、それぞれ７３、８２、８６％であった。また、図４に示すように、本反応においても、まずピロロインドリン型修飾ペプチドＰ１、Ｐ２が生成し、時間経過に伴いＮｐｙｓ修飾ペプチドＰ３に収束したと考えられる。次に、反応溶媒に含まれる酢酸の濃度を７５％から５０％、２０％、５％、１％と低くしたとしても、それぞれ８２％、７５％、７１％、６５％、５５％の収率でＮｐｙｓ修飾ペプチドＰ３を得ることが可能であった。
［８．タンパク質におけるトリプトファン残基の修飾］
（８－１．Ｎｐｙｓ誘導体（化合物３）の合成）
（８－１．Ｎｐｙｓ誘導体（化合物３）の合成）
まず、論文（Ａｓｉａｎ Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ２０１５， ４， １０３０－１０３３．）の記載に基づき、６－（ベンジルチオ）－５－ニトロニコチン酸（化合物１）を合成した。
Ｎ－（３－アジドプロピル）－６－（ベンジルチオ）－５－ニトロニコチンアミド（化合物２）の合成
化合物１（１．４１ｇ，４．９３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１３ｍＬ）に、室温にて３－アジドプロパン－１－アミン（０．９９ｇ，９．８６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２－（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（２．２５ｇ，５．９２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（１．０２ｍＬ，５．９２ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて２時間３０分撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣を酢酸エチルに溶解させ、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製することで、黄色固体（化合物２）を得た（１．６２ｇ，４．３５ｍｍｏｌ，収率８８％）。
化合物１（１．４１ｇ，４．９３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１３ｍＬ）に、室温にて３－アジドプロパン－１－アミン（０．９９ｇ，９．８６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２－（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（２．２５ｇ，５．９２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（１．０２ｍＬ，５．９２ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて２時間３０分撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣を酢酸エチルに溶解させ、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製することで、黄色固体（化合物２）を得た（１．６２ｇ，４．３５ｍｍｏｌ，収率８８％）。
Ｎ－（３－アジドプロピル）－６－（（４－フルオロフェノキシ）チオ）－５－ニトロニコチンアミド（化合物３）の合成
化合物２（１０９ｍｇ，０．２９３ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン：１，２－ジクロロエタンの混合溶液（１：１，ｖ／ｖ，３ｍＬ）に、室温にて塩化スルフリル（５２．０μＬ，０．６４４ｍｍｏｌ）およびピリジン（１１．８μＬ，０．１４７ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、ヘキサンで共沸した。得られた残渣は精製することなく次の反応に用いた。得られた残渣をジクロロメタン：１，２－ジクロロエタン混合溶液（１：１，ｖ／ｖ，３ｍＬ）に溶解させ、氷冷撹拌下、ｐ－フルオロフェノール（３９．４ｍｇ，０．３５２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１０１μＬ，０．５８６ｍｍｏｌ）を添加し、室温にて１５分間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムに溶解させ、１０％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製することで、黄色固体（化合物３）を得た（８２．９ｍｇ，０．２１１ｍｍｏｌ，２段階の収率７２％）。
化合物２（１０９ｍｇ，０．２９３ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン：１，２－ジクロロエタンの混合溶液（１：１，ｖ／ｖ，３ｍＬ）に、室温にて塩化スルフリル（５２．０μＬ，０．６４４ｍｍｏｌ）およびピリジン（１１．８μＬ，０．１４７ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、ヘキサンで共沸した。得られた残渣は精製することなく次の反応に用いた。得られた残渣をジクロロメタン：１，２－ジクロロエタン混合溶液（１：１，ｖ／ｖ，３ｍＬ）に溶解させ、氷冷撹拌下、ｐ－フルオロフェノール（３９．４ｍｇ，０．３５２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１０１μＬ，０．５８６ｍｍｏｌ）を添加し、室温にて１５分間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムに溶解させ、１０％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製することで、黄色固体（化合物３）を得た（８２．９ｍｇ，０．２１１ｍｍｏｌ，２段階の収率７２％）。
（８－２．蛍光分子－Ｎｐｙｓ誘導体の合成）
まず、論文（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２００６， １２８， １４１４－１４１５．およびＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２００８， ３， ５６７－５７６．）の記載に基づき、ｔｅｒｔ－ブチル２０－アジド－３，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキサイコサノエート（化合物４）を合成した。
一方、論文（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２０１６， １３８， １０７９８－１０８０１．)の記載に基づき、蛍光団を有する化合物５を合成した。
ｔｅｒｔ－ブチル２０－（４－（（（９－（２－（メトキシカルボニル）フェニル）－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－６－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－３，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキサイコサノエート（化合物６）の合成
化合物４（２３１ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）のｔ－ＢｕＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＤＭＦの混合溶媒（３：１：１，ｖ／ｖ／ｖ，１６ｍＬ）に、６５℃にて化合物５（２１１ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。次いで、同温度にてＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（６．８７ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（５５．５ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を添加し、２４時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣を酢酸エチルに溶解させ、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２５：１）で精製することで、茶色固体（化合物６）を得た（２９７．２４ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ，収率６７％）。
化合物４（２３１ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）のｔ－ＢｕＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＤＭＦの混合溶媒（３：１：１，ｖ／ｖ／ｖ，１６ｍＬ）に、６５℃にて化合物５（２１１ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）を添加し、同温度にて１時間撹拌した。次いで、同温度にてＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（６．８７ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（５５．５ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を添加し、２４時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣を酢酸エチルに溶解させ、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２５：１）で精製することで、茶色固体（化合物６）を得た（２９７．２４ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ，収率６７％）。
２０－（４－（（（９－（２－（メトキシカルボニル）フェニル）－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－６－イル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－３，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキサイコサン酸（化合物７）の合成
化合物６（２８１．８１ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）に室温にて４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（６ｍＬ）を添加し、同温度にて２４時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製することで、茶色固体（化合物７）を得た（１７６．２２ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ，収率６７％）。
化合物６（２８１．８１ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）に室温にて４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（６ｍＬ）を添加し、同温度にて２４時間撹拌した。反応溶液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製することで、茶色固体（化合物７）を得た（１７６．２２ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ，収率６７％）。
メチル２－（６－（（１－（１－（（５ａＳ，６Ｒ，６ａＲ）－１－（３－（６－（（４－フルオロフェノキシ）チオ）－５－ニトロニコチンアミド）プロピル）－１，４，５，５ａ，６，６ａ，７，８－オクタヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２－ｄ］［１，２，３］トリアゾール－６－イル）－３，１４－ジオキソ－２，７，１０，１６，１９，２２，２５，２８，３１－ノナオキサ－４，１３－ジアザトリトリアコンタン－３３－イル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メトキシ）－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－９－イル）ベンゾエート（化合物１０）の合成
化合物７（５９．９８ｍｇ，０．０８０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）に、室温にてＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物）（１８．３８ｍｇ，０．１２０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩）（１９．９４ｍｇ，０．１０４ｍｍｏｌ）、化合物８（２５．９２ｍｇ，０．０８０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２６．５μＬ，０．１６０ｍｍｏｌ）を順次添加し、同温度にて遮光下、終夜撹拌した。反応溶媒を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムに溶解させ、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、化合物９を得た（８２．６１ｍｇ，０．０７８ｍｍｏｌ）。化合物９は精製することなく次の反応に用いた。
化合物７（５９．９８ｍｇ，０．０８０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）に、室温にてＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物）（１８．３８ｍｇ，０．１２０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩）（１９．９４ｍｇ，０．１０４ｍｍｏｌ）、化合物８（２５．９２ｍｇ，０．０８０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２６．５μＬ，０．１６０ｍｍｏｌ）を順次添加し、同温度にて遮光下、終夜撹拌した。反応溶媒を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムに溶解させ、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、化合物９を得た（８２．６１ｍｇ，０．０７８ｍｍｏｌ）。化合物９は精製することなく次の反応に用いた。
続いて、化合物９（８２．６１ｍｇ，０．０７８ｍｍｏｌ）を含むＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ混合溶液（３：１，ｖ／ｖ，２．６ｍＬ）に、室温にて化合物３（３０．６０ｍｇ，０．０７８ｍｍｏｌ）を添加し、同室温にて暗所で１時間４５分攪拌した。反応溶媒を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムに溶解させ、水、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過後、母液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）およびＨＰＬＣ（ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｍｉｌｌｉＱ（０．１％ＴＦＡ）／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＝６０：４０ ｔｏ ４０：６０ ｏｖｅｒ ２０ｍｉｎ，ｆｌｏｗ ｌａｔｅ ５ ｍＬ／ｍｉｎ，ＵＶ：３６５ｎｍ，ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｎｆｉｒｅＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤＴＭ ５μｍ，１９ｘ１５０ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ）にて精製することで、黄色固体（化合物１０）を得た（２３．６１ｍｇ，１６．３０μｍｏｌ，収率２１％）。
（８－３．リゾチームへの修飾）
リゾチーム（３．９５ｍｇ，０．２μｍｏｌ）の５０％酢酸水溶液に、化合物１０（２ｍｇ，１．３μｍｏｌ）の酢酸溶液を添加することで、反応混合物を７５％酢酸水溶液にした。この反応溶液を室温にて１９時間振とうさせた（リゾチームの最終濃度：０．５ｍＭ；化合物１０の最終濃度：３．２５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した（ＨＰＬＣ条件：０．１％ＴＦＡ水溶液中で５％ＣＨ３ＣＮから９５％ＣＨ３ＣＮへの線形濃度勾配（４０分間）、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２３０ｎｍで検出、Ｃｏｌｕｍｎ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ ４．６ＩＤｘ１５０ｍｍ）。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＡＳＳにて反応開始１９時間後の反応溶液に含まれる化合物の質量分析測定を行い、Ｎｐｙｓが１分子付加した修飾体（Ｎｐｙｓ修飾体）の生成を確認した（ｆｏｕｎｄ：１５６５３．８６）。反応溶液をＨＰＬＣにて精製することで、Ｎｐｙｓ修飾体を獲得した。図５に、リゾチームに対してスルフェニル化反応を実施した際の反応の経時的な様子を表すＨＰＬＣチャート、および反応混合物中に含まれる化合物の質量分析の結果を示す。
リゾチーム（３．９５ｍｇ，０．２μｍｏｌ）の５０％酢酸水溶液に、化合物１０（２ｍｇ，１．３μｍｏｌ）の酢酸溶液を添加することで、反応混合物を７５％酢酸水溶液にした。この反応溶液を室温にて１９時間振とうさせた（リゾチームの最終濃度：０．５ｍＭ；化合物１０の最終濃度：３．２５ｍＭ）。反応追跡は、反応溶液の一部を希釈し、ＨＰＬＣにて解析した（ＨＰＬＣ条件：０．１％ＴＦＡ水溶液中で５％ＣＨ３ＣＮから９５％ＣＨ３ＣＮへの線形濃度勾配（４０分間）、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２３０ｎｍで検出、Ｃｏｌｕｍｎ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ ４．６ＩＤｘ１５０ｍｍ）。また、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＡＳＳにて反応開始１９時間後の反応溶液に含まれる化合物の質量分析測定を行い、Ｎｐｙｓが１分子付加した修飾体（Ｎｐｙｓ修飾体）の生成を確認した（ｆｏｕｎｄ：１５６５３．８６）。反応溶液をＨＰＬＣにて精製することで、Ｎｐｙｓ修飾体を獲得した。図５に、リゾチームに対してスルフェニル化反応を実施した際の反応の経時的な様子を表すＨＰＬＣチャート、および反応混合物中に含まれる化合物の質量分析の結果を示す。
Claims (14)
- 下記化学式１で表される化合物またはその塩からなり、チオエーテル基を有する化合物の存在下で、トリプトファン残基を含有する分子における前記トリプトファン残基を選択的に修飾するための、トリプトファン選択的修飾剤：
化学式１において、
Ｖは、窒素原子または炭素原子であり、
Ｗは、他の環員原子と一緒になって、Ｖが窒素原子のときにはピリジン環、ピラジン環、イミダゾール環、オキサゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、フェナントロリン環、プテリジン環およびアゾシン環からなる群から選択される含窒素複素環を形成し、Ｖが炭素原子のときにはベンゼン環、１Ｈ－ピロール環、フラン環、ナフタレン環、ベンゾ［ｈ］キノリン環、ピリド［２，３－ｂ］ピラジン環、シクロオクタ－１，３，５，７－テトラエン環からなる群から選択される芳香環を形成し、
Ｘは、－Ｏ－、－ＮＨ－または単結合であり、
Ｙは、Ｘが単結合のときには塩素原子であり、Ｘが－Ｏ－または－ＮＨ－のときには、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基および置換もしくは非置換の電子吸引性を有する脂肪族ヘテロ環由来の１価の基からなる群から選択される基であり、
Ｚは、前記含窒素複素環または前記芳香環上に存在するニトロ基を表し、
ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立して、０または１であり、
ｓは、０～１０の整数を表し、
Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、化学的に安定な構造を有するリンカーを表し、
ＡａおよびＡｂは、それぞれ独立して、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、Ｃ１～Ｃ２０のオキシアルキレン基、Ｃ１～Ｃ２０のアルキレンオキシ基、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、ヒドラジン、トリアゾール、スルホン、スルホキシド、スルホン酸エステル、スルホンアミド、スルフィン酸エステル、スルフィンアミド、ピペリジンおよびジオキサンからなる群から選択される基であり、
Ｒは、水素原子、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニル基、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基、任意の化合物が有する特定の官能基と共有結合しうる基を末端に含む基Ｇ、または機能性物質に由来する基ＦＭである。 - Ｖは窒素原子であり、Ｗは、他の環員原子と一緒になって前記ピリジン環を形成する、請求項１に記載のトリプトファン選択的修飾剤。
- Ｘは－Ｏ－であり、Ｙは、置換もしくは非置換のＣ６～Ｃ２０のアリール基である、請求項１または２に記載のトリプトファン選択的修飾剤。
- Ｌ０およびＬ１は、それぞれ独立して、置換または非置換のＣ１～Ｃ２０のアルキレン基、置換または非置換のＣ２～Ｃ２０のアルケニレン基、置換または非置換のＣ２～Ｃ２０のアルキニレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルキレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換のＣ６～Ｃ２０のアリーレン基、置換または非置換のＣ３～Ｃ２０のヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、ポリオキシアルキレン基および下記化学式（ａ）で表される基：
化学式（ａ）において、
Ｒａは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１５のアルキレン基を表す、
からなる群から選択される（ここで、これらのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、アリーレン基およびヘテロアリーレン基は置換基を有していてもよい）、請求項１または２に記載のトリプトファン選択的修飾剤。 - Ａａが、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－および－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択される基である、請求項１または２に記載のトリプトファン選択的修飾剤。
- ｐが０である、請求項１または２に記載のトリプトファン選択的修飾剤。
- Ｒが、任意の化合物が有する特定の官能基と共有結合しうる基を末端に含む基Ｇであり、前記基Ｇが、アゾメチンイリド基、ニトロン基、ニトリルイリド基、ジアゾメチル基、アジド基、ニトリルオキシド基、アルケニル基およびアルキニル基からなる群から選択される１種または２種以上の基を含む、請求項１または２に記載のトリプトファン選択的修飾剤。
- Ｒが、機能性物質に由来する基ＦＭであり、前記機能性物質が、薬物、放射性物質、蛍光化学物質、発光団、蛍光タンパク質、発光タンパク質、磁性体、酵素、補酵素、生理活性物質、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＥＧからなる群から選択される１種または２種以上を含む、請求項１または２に記載のトリプトファン選択的修飾剤。
- 分子内にトリプトファン残基を有する化合物Ａを、チオエーテル基を有する化合物Ｂが存在する反応系で、請求項１または２に記載のトリプトファン選択的修飾剤と接触させて、前記化学式１で表される化合物に含まれる硫黄原子と前記トリプトファン残基との間に共有結合を形成させることを含む、Ｔｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法。
- 前記反応系にさらに酸が存在する、請求項９に記載のＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法。
- 前記化合物Ａがペプチドまたはタンパク質である、請求項９に記載のＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法。
- 前記化合物Ａと前記化合物Ｂとが単一の化合物であり、前記チオエーテル基が、前記ペプチドまたはタンパク質において修飾の対象とされる前記トリプトファン残基の近傍に存在するメチオニン残基に由来する基である、請求項９に記載のＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法。
- 前記化合物Ａがタンパク質であり、前記タンパク質は、遺伝子組み換えにより、
所望の位置にトリプトファン残基が挿入されたものであるか、
所望の位置のアミノ酸残基がトリプトファン残基に改変されたものであるか、
所望の位置のトリプトファン残基が欠失されたものであるか、
所望の位置のトリプトファン残基が他のアミノ酸残基に改変されたものである、
所望の位置にメチオニン残基が挿入されたものであるか、
所望の位置のアミノ酸残基がメチオニン残基に改変されたものであるか、
所望の位置のメチオニン残基が欠失されたものであるか、または、
所望の位置のメチオニン残基が他のアミノ酸残基に改変されたものである、
請求項９に記載のＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法。 - 前記化合物Ａが、還元型チオール基を有するシステイン残基を２以上有するペプチドまたはタンパク質であり、
前記化合物Ａを前記トリプトファン選択的修飾剤と接触させる前に、保護基を用いて前記還元型チオール基を保護し、
次いで、還元型チオール基が保護された前記化合物Ａを前記トリプトファン選択的修飾剤と接触させた後に、前記還元型チオール基を脱保護することをさらに含む、請求項９に記載のＴｒｐ－Ｓ結合含有化合物の製造方法。
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