CN114349822A

CN114349822A - 一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法

Info

Publication number: CN114349822A
Application number: CN202111661772.6A
Authority: CN
Inventors: 李子刚; 尹丰; 徐红坤; 孔凌微
Original assignee: Shenzhen Bay Laboratory Pingshan Biomedical R & D And Transformation Center; Peking University Shenzhen Graduate School; Shenzhen Bay Laboratory
Current assignee: Shenzhen Bay Laboratory Pingshan Biomedical R & D And Transformation Center; Peking University Shenzhen Graduate School; Shenzhen Bay Laboratory
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114349822B

Abstract

本发明提出一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法，具体为：用固相合成法将多肽接在树脂上，生成乙烯基锍盐多肽树脂后，从树脂上剪切下来；与生物大分子反应，反应温度为25℃‑37℃，pH值为7‑9，反应溶剂为水、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、二甲基亚砜、N,N‑二甲基甲酰胺、或PBS溶液中的任意一种或两种，反应2‑6小时；其中，多肽含有甲硫氨酸基团，生物大分子带有巯基。本发明产率高，使用的反应底物容易获得，并且毒性较小，可以在弱碱性环境中反应，适合实验室和工业化多肽、蛋白质和核酸药物的化学修饰和改造。

Description

一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法

技术领域

本发明属于化学生物学领域，涉及一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法，具体涉及一种通过乙烯基锍盐化合物，在水相和37℃条件下，修饰生物大分子的化学方法。

背景技术

生物大分子的化学修饰在化学生物学、分子生物学和药物研发等研究领域中有重要作用。其中，多肽、蛋白质和核酸与有机小分子药物和探针的偶联反应是蛋白质组学、药物化学和生物技术研究的强大实验工具。例如，抗体-药物偶联物的成功开发有赖于可靠的生物正交反应的研究。传统的蛋白质化学修饰方法主要集中于针对半胱氨酸和赖氨酸残基的化学反应。近年来，新型的蛋白质修饰化学聚焦于传统条件无法实现的氨基酸残基的修饰，或极高效的修饰化学反应。例如，可见光诱导的温和条件下的蛋白质修饰化学反应。这种光氧化还原催化的历程通过产生自由基来构建独特的化学键，提供了非传统的生物大分子功能化的策略。

大部分生物大分子都包含巯基，现在技术中对生物大分子中巯基的修饰主要是使用碘乙酰胺(IAA)，具体以水作溶剂，将带荧光标签的IAA配置成溶液后与蛋白孵育后，通过检测蛋白上荧光强度，以荧光强度作为IAA标记蛋白的标志。该技术的缺点在于IAA毒性较大，并且不能修饰甲硫氨酸。因此，探索新的生物大分子修饰方法具有很高的科学与社会价值。

发明内容

针对生物大分子的化学选择性修饰技术和应用的需求，本发明提出一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法，反应如下：

具体包括如下步骤：

(1)将多肽衍生为乙烯基锍盐多肽：用固相合成法将多肽接在树脂上，生成乙烯基锍盐多肽树脂后，将乙烯基锍盐多肽从树脂上剪切下来；

(2)将步骤(1)所得的乙烯基锍盐多肽与生物大分子反应，反应温度为25℃-37℃，pH值范围为7-9，反应溶剂为水、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或PBS溶液中的一种或几种，反应时间为2-6小时；

其中，所述多肽含有甲硫氨酸基团，所述生物大分子为带有巯基的多肽、蛋白质或核酸中的一种或几种。

本发明中，所述步骤(2)中，反应温度为37℃，pH值为7.4，反应溶剂为PBS溶液，反应时间为4小时。

本发明中，所述步骤(1)中生成乙烯基锍盐多肽树脂的具体步骤为：在甲酸存在下，用二氯甲烷与乙腈的混合体系做溶剂，将接有多肽的树脂浸在溶剂中，加入三氟甲磺酸2-溴-乙酯，反应6小时，洗干净树脂，用N,N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷的混合体系作溶剂，树脂浸在溶剂中反应即得乙烯基锍盐多肽树脂。

本发明中，所述步骤(1)中的乙烯基锍盐多肽为PDM1、PDM2或PDM3中的一种或几种。PDM1氨基酸序列为:QSPANIMYKV(SEQ ID NO.1所示)、PDM2氨基酸序列为:QSPANMYYKV(SEQ ID NO.2所示)、PDM3氨基酸序列为:QSPAMIYYKV(SEQ ID NO.3所示)。

本发明中，所述步骤(2)中乙烯基锍盐多肽为PDM2，生物大分子为蛋白，其中，PDM2与蛋白的摩尔比为5。

本发明的有益效果在于：

本发明提出的基于乙烯基锍盐的生物大分子化学修饰的方法，可以以乙烯基锍盐基团为活性官能团进行生物大分子巯基的高效选择性化学修饰。相比现有技术中使用碘乙酰胺(IAA)修饰生物大分子巯基的方法，本发明产率高，使用的反应底物容易获得，并且毒性较小，并且可以在弱碱性环境中进行巯基修饰，还能修饰甲硫氨酸。本发明适用于生物大分子的化学修饰，条件温和适合实验室和工业化多肽、蛋白质和核酸药物的化学修饰和改造。

附图说明

图1是实施例1中乙烯基锍盐多肽PDM1、PDM2和PDM3与离体蛋白质反应的蛋白胶图。

图2是实施例1中乙烯基锍盐多肽PDM2与离体蛋白反应条件优化的蛋白胶图。

图3是实施例2中乙烯基锍盐多肽PDM1、碘乙酰胺分别与细胞反应的细胞毒性实验图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

本发明方法的反应如下：

1、将多肽接在树脂上

在接肽仪中放入500毫克Rink-Amide-MBHA树脂，用Fmoc固相合成法策略合成多肽PDM1:QSPANIMYKV-Resin、PDM2:QSPANMYYKV-Resin和PDM3:QSPAMIYYKV-Resin，本发明所使用的多肽固相合成树脂为市售的Rink amide MBHAResin。所使用的原料为Fmoc保护的20中天然氨基酸或其他非天然氨基酸。这些氨基酸原料的C端为羧基或硫代羧基。所使用的氨基酸原料当量为树脂负载量的5倍摩尔数。

2、生成乙烯基锍盐多肽

在甲酸存在下，用二氯甲烷(DCM)与乙腈的混合体系做溶剂，含有多肽的树脂浸在溶剂中，加入三氟甲磺酸2-溴-乙酯(5eq.)，甲硫氨酸的侧链硫原子与乙烯基前体小分子三氟甲磺酸2-溴-乙酯发生亲核进攻反应，反应6小时，生成锍盐基团，洗干净树脂，用N,N-二甲基甲酰胺(DIPEA)与二氯甲烷(DCM)的混合体系作溶剂，树脂浸在混合溶剂中反应五分钟形成乙烯基锍盐多肽树脂。

3、将乙烯基锍盐多肽从树脂上切下来

形成乙烯基锍盐之后，用三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、H₂O的混合体系(质量百分比为95：2.5：2.5)为剪切液将形成锍盐的多肽从树脂上切下来，用氮气将剪切液吹干。乙醚沉淀剩余的多肽，离心，除去上清液，重复此步骤三次。将得到的雪花状的多肽用HPLC纯化。

其中形成乙烯基锍盐的过程，产率都在82％以上。

基于此方法合成的PDM1:QSPANIMYKV、PDM2:QSPANMYYKV、PDM3:QSPAMIYYKV，所述氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3所示。

上述反应的技术路线如下：

4、乙烯基锍盐多肽与离体蛋白质的反应

首先，制备PDZ^ΔRGS3蛋白稀释液：利用分子克隆技术得到的携带有PDZ^ΔRGS3基因的pET28A质粒，该质粒由香港中文大学夏江教授课题组赠送(ACS Chem.Biol.2016,11,149-158)转化至大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)中，在LB固体培养基中37℃培养过夜。随后将单克隆菌落转至5ml的LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄霉素)转入37℃继续培养12小时。待菌液浑浊，继续转入500ml的液体培养基中37℃培养至OD600～0.6。菌液转至16℃并加入1mMIPTG诱导蛋白表达8小时。离心收集菌体用裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，500mMNaCl，3mM DTT，0.1mM PMSF)斡旋，利用超声破碎仪在冰上进行破碎。超声后14000g/min离心1小时后弃细胞碎片，取上清0.45μm滤膜过滤。镍柱用10mM咪唑的PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)平衡5个柱体积(25ml)后对蛋白进行纯化，蛋白最终在250mM咪唑下洗脱下来，跑胶鉴定蛋白表达量。将洗脱下来的蛋白溶液装入3k超滤管，在高速离心机中浓缩，分光光度计检测蛋白浓度，使其为30μM。

将以上制得de30μM的PDZ^ΔRGS3蛋白稀释液与乙烯基锍盐多肽(100μM，分别取PDM1、PDM2、PDM3)在0.6ml EP管中混匀，在37℃水浴中反应4小时，pH值为7.4，反应溶剂为PBS溶液，反应如下：

反应结束后加入适量的loading buffer(配方：250mM Tris-HCl,(pH 6.8).10％SDS(W/V),0.5％(W/V)BPB,50％(V/V)甘油，5％(V/V)β-巯基乙醇)混匀，沸水煮10分钟，用15％的胶分离，为了使蛋白与共价体分开，下层胶的跑胶时间尽量长，最后用考马斯亮蓝染色鉴定。对于不同蛋白选择性的共价反应条件，共价反应的时间梯度、当量梯度等实验根据实验目的进行条件调整，如图1和图2所示。

图1可以看出多肽对目标蛋白具有良好靶向性，证明该方法有很好的的蛋白修饰效果，同时乙烯基锍盐可以作为一个探针，开发更多的生物大分子修饰方法，可以作为一种经典方法的替代进行蛋白修饰。

同时PDZ^ΔRGS3作为模板筛选多肽的浓度与反应时间，优化蛋白修饰过程，其中Maker是指一种用于标记蛋白分子量的标准蛋白。结果如图2所示。结果显示当乙烯基锍盐多肽PDM2的摩尔浓度是蛋白的5倍时就能达到很好的修饰效果，并且乙烯基锍盐多肽浓度越高反应效果会更好。结果显示24小时可以实现最佳修饰效果。

实施例2乙烯基锍盐多肽PDM1与碘乙酰胺与细胞反应的毒性比较实验

具体操作如下：用96孔板培养293T细胞，培养基为含10％血清的DMED，密度为每孔5000个细胞，培养12小时，加入CCK-8培养1小时，酶标仪检测。可以发现PDM1的浓度在200微摩时，细胞的存活率在75％以上，IAA的浓度在50微摩时，细胞存活率不足25％。因此该乙烯基锍盐多肽具有低细胞毒性。

序列表

<110> 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心

北京大学深圳研究生院

深圳湾实验室

<120> 一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法

<130> YZP21004

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Ser Pro Ala Asn Ile Met Tyr Lys Val

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Ser Pro Ala Asn Met Tyr Tyr Lys Val

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Ser Pro Ala Met Ile Tyr Tyr Lys Val

1 5 10

Claims

1.一种基于乙烯基锍盐的生物大分子修饰方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应温度为37℃，pH值为7.4，反应溶剂为PBS溶液，反应时间为4小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中生成乙烯基锍盐多肽树脂的具体步骤为：在甲酸存在下，用二氯甲烷与乙腈的混合体系做溶剂，将接有多肽的树脂浸在溶剂中，加入三氟甲磺酸2-溴-乙酯，反应6小时，洗干净树脂，用N,N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷的混合体系作溶剂，树脂浸在溶剂中反应即得乙烯基锍盐多肽树脂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的乙烯基锍盐多肽为PDM1、PDM2或PDM3中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中乙烯基锍盐多肽为PDM2，生物大分子为蛋白，所述PDM2与蛋白的摩尔比为5。