JP2014528245A - 構造化ポリペプチドの特異性のモジュレーション - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト血漿カリクレインに特異的なペプチドリガンドについて記載する。

Description

本発明は、分子足場に共有結合したポリペプチドであって、２個以上のペプチドループが足場への取付ポイントの間に内在するように共有結合したポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、ヒトプロテアーゼ血漿カリクレインに特異的なペプチドについて記載する。

環状ペプチドは、タンパク質標的に高い親和性および標的特異性で結合することができ、したがって治療法の開発のために魅力的な分子クラスである。実際に、例えば、抗菌性ペプチドのバンコマイシン、免疫抑制薬のシクロスポリンまたは抗癌薬のオクトレオチド（ocreotide）のように、数種の環状ペプチドが、既に診療所において用いられ成功している（Ｄｒｉｇｇｅｒｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００８、７（７）、６０８〜２４）。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成された相対的に大きな相互作用表面と共に、環状構造のコンホメーション上の柔軟性の低下に起因する。通常、大環状分子は、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å^２；Ｗｕ、Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０（６００７）、１０６６〜７１）、インテグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３５５Å^２）（Ｘｉｏｎｇ、Ｊ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２、２９６（５５６５）、１５１〜５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウパイン（upain）−１（６０３Å^２；Ｚｈａｏ、Ｇ．ら、Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ２００７、１６０（１）、１〜１０）のように、数百平方オングストロームの表面に結合する。

その環状立体配置のため、ペプチド大環状分子は、直鎖状ペプチドよりも柔軟性が低く、標的への結合によるエントロピー損失がより小さくなり、より高い結合親和性をもたらす。柔軟性の低下は、標的特異的コンホメーションをロックし、直鎖状ペプチドと比較して結合特異性を増加させる。このような効果は、その環が開環されると他のＭＭＰに及ぶその選択性を失う、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力かつ選択的な阻害剤により例証されてきた（Ｃｈｅｒｎｅｙ、Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９８、４１（１１）、１７４９〜５１）。大環状化により達成される有利な結合特性は、例えばバンコマイシン、ナイシンまたはアクチノマイシン等、２個以上のペプチド環を有する多環性ペプチドにおいてさらにより明らかである。

様々な研究チームが、以前に、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋いでいる（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．およびＭｃＮａｍａｒａ，Ｐ．Ｅ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、１９８５、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造を模倣するために、合成足場上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用している（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５）。システイン含有ポリペプチドを分子足場、例えばトリス（ブロモメチル）ベンゼンに連結させることによって作製される候補薬物化合物を作製する方法は、ＷＯ２００４／０７７０６２号およびＷＯ２００６／０７８１６１号に開示されている。

ＷＯ２００４／０７７０６２号は、候補薬物化合物の選択方法を開示している。より詳細には、この文書は、第１および第２の反応基を含む様々な足場分子、ならびに、前記足場をさらなる分子と接触させて、カップリング反応において足場とさらなる分子との間に少なくとも２つの連結を形成させることを開示している。

ＷＯ２００６／０７８１６１号は、結合化合物、免疫原性化合物およびペプチド模倣体を開示している。この文書は、既存のタンパク質からとった様々なペプチドのコレクションの人工合成を開示している。その後、これらのペプチドを一部のアミノ酸変化が導入された一定の合成ペプチドと組み合わせて、コンビナトリアルライブラリを生じさせる。様々なアミノ酸変化を特長とする別々のペプチドに、化学結合を介してこの多様性を導入することによって、所望の結合活性を見つける機会の増大がもたらされる。この文書の図１は、様々なループペプチド構築体の合成の模式図を示している。この文書中に開示されている構築体は、典型的にはシステイン残基を含む−ＳＨ官能化したペプチド、および典型的にはビス−またはトリス−ブロモフェニルベンゼンなどのベンジルハロゲン置換基を含む足場上の芳香族複素環基に依存する。そのような基は、反応してペプチドと足場との間にチオエーテル結合を形成する。

本出願人らは近年、二環式ペプチドの大型ライブラリを作製し、対象とする標的に対しスクリーニングするためのファージディスプレイに基づくコンビナトリアルアプローチを開発した（Ｈｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５（７）、５０２〜７；国際特許出願である国際公開第２００９／０９８４５０号パンフレットも参照）。要約すると、３個のシステイン残基と、２個のランダムな６アミノ酸領域とを含有する（Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_６−Ｃｙｓ）直鎖状ペプチドのコンビナトリアルライブラリをファージ上に提示させ、システイン側鎖を小分子（トリス−（ブロモメチル）ベンゼン）へと共有結合させることにより環化させた。ヒトプロテアーゼカテプシンＧおよび血漿カリクレイン（ＰＫ）に対する親和性選択において単離された二環式ペプチドは、ナノモル濃度の阻害定数を有していた。最良の阻害剤、ＰＫ１５は、３ｎＭのＫ_ｉでヒトＰＫ（ｈＰＫ）を阻害する。数種の単離された二環式ペプチドのアミノ酸配列における類似性は、両方のペプチドループが結合に寄与することを示唆した。ＰＫ１５は、検査した最高濃度（１０μＭ）において、ラットＰＫ（８１％配列同一性）も、相同的なヒトセリンプロテアーゼ第ＸＩａ因子（ｈｆＸＩａ；６９％配列同一性）もトロンビン（３６％配列同一性）も阻害しなかった（Ｈｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５（７）、５０２〜７）。この知見は、二環式阻害剤が高度に特異的であり、他のヒトトリプシン様セリンプロテアーゼが阻害されないであろうことを示唆した。上述の効力および標的選択性を有するＰＫ１５等、合成小分子ペプチド性阻害剤は、浮腫の反復的発症により特徴づけられる生命に関わる疾患である遺伝性血管浮腫におけるＰＫ活性を制御する、あるいは心肺バイパス手術における接触活性化を防ぐための治療法としての応用可能性を有する。

ペプチドＰＫ１５は、ペプチドＰＫ２、Ｈ−ＡＣＳＤＲＦＲＮＣＰＬＷＳＧＴＣＧ−ＮＨ_２（式中、第２の６アミノ酸ループがランダム化されている）に基づくライブラリから単離された。ＰＫ１５の配列は、Ｈ−ＡＣＳＤＲＦＲＮＣＰＡＤＥＡＬＣＧ−ＮＨ_２であり、ヒトカリクレインに対するＩＣ５０結合定数は、１．７ｎＭであった。

本出願人らは、異なるループ長を有する多数のライブラリからヒトカリクレインに対して選択された、構造化ポリペプチドの特異性を解析した。その結果、本出願人らは、改善された結合特異性によりカリクレインに結合することができる構造化ペプチドの単離に成功した。

第１の態様において、少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記ペプチドリガンドの前記ループが、３、４または５個の、但し６個未満のアミノ酸を含む、ヒトカリクレインに特異的なペプチドリガンドが提供される。

驚くべきことに、本出願人らは、各ループに６個未満のアミノ酸を含むペプチドが、カリクレインに対しさらにより高い結合親和性を有し得ることを見出した。例えば、本明細書に記載されている５×５ペプチドは、０．０８ｎＭ以下の結合定数を達成する。

一実施形態において、ペプチドリガンドのループは、３個のアミノ酸を含み、ポリペプチドは、コンセンサス配列Ｇ_ｒＦｘｘＧ_ｒＲＶｘＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を有する。

例えば、ポリペプチドは、表３に表記されているポリペプチドのうち１種となり得る。

別の一実施形態において、ペプチドリガンドのループは、５個のアミノ酸を含み、第１のループは、コンセンサス配列Ｇ_ｒＧＧｘｘＮＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を含む。

例えば、ポリペプチドの２個の隣接するループは、コンセンサス配列Ｇ_ｒＧＧｘｘＮＧ_ｒＲｘｘｘｘＧ_ｒを含み得る。

例えば、ポリペプチドは、表４に表記されているペプチドのうち１種となり得る。

一実施形態において、ペプチドリガンドのループは、５個のアミノ酸を含み、第１のループは、モチーフＧ_ｒｘ^Ｗ／_ＦＰｘ^Ｋ／_ＲＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を含む。この文脈において、「第１の」ループの言及は、必ずしも配列におけるループの特定の位置を表示しない。しかし、一部の実施形態において、第１のループは、アミノ末端からカルボキシ末端に及ぶペプチド配列における近位ループとなり得る。例えば、ポリペプチドは、モチーフＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴｘＬＧ_ｒを含む第２の遠位ループをさらに含む。第１のループの配列の例として、Ｇ_ｒｘＷＰＡＲＧ_ｒ、Ｇ_ｒｘＷＰＳＲＧ_ｒ、Ｇ_ｒｘＦＰＦＲＧ_ｒおよびＧ_ｒｘＦＰＹＲＧ_ｒが挙げられる。これらの例において、ｘは、いかなるアミノ酸であってもよいが、例えば、ＳまたはＲである。

一実施形態において、ペプチドリガンドのループは、５個のアミノ酸を含み、第１のループは、モチーフＧ_ｒｘＨｘＤＬＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を含む。

一実施形態において、ペプチドリガンドのループは、５個のアミノ酸を含み、第１のループは、モチーフＧ_ｒＴＨｘｘＬＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を含む。

一実施形態において、ポリペプチドは、モチーフＧ_ｒｘ^Ｗ／_ＦＰｘ^Ｋ／_ＲＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴＤＬＧ_ｒを含む２個の隣接するループを含む。

本出願人らは、特定の位置の性質が、配列における他の位置に影響を与え得ることを示した。特に、ペプチド０６−３４および０６−３４−０３を用いて行った実験は、位置１および６が、位置４に影響を与えることを実証する。好ましくは、位置１および６が、それぞれＳおよびＴである場合に限り、位置４はＡである。

本明細書における例において、ナンバリングは、ループにおける位置を指し、反応基を無視する。よって、Ｇ_ｒｘ^Ｗ／_ＦＰｘ^Ｋ／_ＲＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴＤＬＧ_ｒにおいて、ｘは位置１にあり、^Ｔ／_Ｌは位置６にある。

例えば、ポリペプチドは、表４、表５または表６に表記されているポリペプチドのうち１種となり得る。

例えば、ポリペプチドリガンドは、表４〜６のうち一つの表に表記されているポリペプチドのうち１種を含み得る。

前述の実施形態において、反応基は、好ましくは、反応性アミノ酸である。好ましくは、反応性アミノ酸は、システインである。

本発明の本態様にかかるポリペプチドの変異体は、変異に利用できる残基を同定し、かかる位置に変異を包含するライブラリを調製することにより、上述の通り調製することができる。例えば、表４におけるポリペプチド０６−５６は、活性を失うことなく位置Ｑ４およびＴ１０に変異導入することができる（後述の実施例を参照）。０６−５６と比較して改善された結合活性を有する、これらの位置に変異を含むポリペプチドリガンドを選択することができる。

さらに別の一態様において、１個または複数個の非天然のアミノ酸置換基を含み、プロテアーゼ分解に対し抵抗性である、本発明の先行する態様にかかるポリペプチドリガンドが提供される。

本出願人らは、特定の非天然のアミノ酸が、血漿における滞留時間を有意に増加させつつ、ｎＭのＫｉによる血漿カリクレインとの結合を可能にすることを見出した。

一実施形態において、非天然のアミノ酸は、Ｎ−メチルアルギニン、ホモ−アルギニンおよびヒドロキシプロリンから選択される。好ましくは、アルギニンのＮ−メチルおよびホモ誘導体は、アルギニンの置き換えに用いられ、プロリン３は、好ましくは、ヒドロキシプロリン、アゼチジンカルボン酸またはアミノイソ酪酸等のアルファ置換アミノ酸に置き換えられてよい。別の一実施形態において、アルギニンは、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えることができる。

一実施形態において、ポリペプチドは、モチーフＧ_ｒｘＷＰＡＲＧ_ｒを含む第１のループを含み、Ｐは、アゼチジンカルボン酸に置き換えられ、および／またはＲは、Ｎ−メチルアルギニンに置き換えられ、および／またはＲは、ホモアルギニンに置き換えられ、および／またはＲは、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えられる。

一実施形態において、ポリペプチドは、モチーフＧ_ｒｘＦＰＹＲＧ_ｒを含む第１のループを含み、Ｒは、Ｎ−メチルアルギニンに置き換えられ、および／またはＲは、ホモアルギニンに置き換えられ、プロリンは、アゼチジンカルボン酸により置き換えられ、および／またはＲは、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えられる。

第２の態様において、標的に対して、親ポリペプチドリガンドの結合活性を超える、改善されたレベルの結合活性を生じる変異体ポリペプチドリガンドを作製するための方法であって、前記親ポリペプチドリガンドが、少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記方法が、（ａ）ループ配列のそれぞれにおける２個以上のアミノ酸位置のそれぞれに対し、ｎ種の異なる変異体ライブラリを作製するステップであって、各ライブラリが、前記ループ配列における前記アミノ酸位置の１個が、ｎ種の異なる非親アミノ酸のうち１種による置き換えにより変異導入された親ポリペプチドからなるステップと、（ｂ）親標的との結合に関して各ライブラリをスクリーニングし、各変異を点数化するステップと、（ｃ）変異が耐容されるアミノ酸位置を同定するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）において同定されたアミノ酸位置に位置する１個または複数個の変異を含む１種または複数種の変異体ポリペプチドを作製するステップとを含む方法が提供される。

一実施形態において、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）において同定されたアミノ酸位置の２個以上に変異を組み入れているポリペプチドを含むライブラリを調製するサブステップと、前記標的に対する結合活性のレベルが改善されたポリペプチドに関してライブラリをスクリーニングするサブステップとを含む。

ｎの値は、各ライブラリにおいて作製されるよう企図された、異なる変異体の数に従って選択することができる。例えば、あらゆる可能な天然のアミノ酸を含む変異体が望ましい場合、ｎは、２０となり得る。Ｎ−メチル化アミノ酸等、非天然のアミノ酸が包含される場合、ｎは、２２または２３等、２０より大きくなり得る。例えば、ｎは、２以上、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０となり得る。

第３の態様において、ポリペプチドリガンドのライブラリであって、前記ポリペプチドリガンドが、少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記ライブラリが、ポリペプチドリガンドのｍ種の異なる変異体からなり、前記変異体において、前記ループ配列における特定のアミノ酸位置が、ｍ種の異なるアミノ酸のうち１種による置き換えにより変異導入されており、ｍが少なくとも２である、ライブラリが提供される。

第４の態様において、ポリペプチドリガンドのライブラリのセットであって、前記ポリペプチドリガンドが、少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記セットが、２種以上のポリペプチドリガンドライブラリを含み、前記ポリペプチドリガンドライブラリのそれぞれが、ポリペプチドリガンドのｍ種の異なる変異体からなり、前記変異体において、前記ループ配列における特定のアミノ酸位置が、ｍ種の異なるアミノ酸のうち１種による置き換えにより変異導入されているライブラリのセット、が提供される。

好ましくは、ｍは、２〜２０の間であり、実施形態において、ｎに関して上に提示されている通り、ｍは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０以上である。

さらに別の一態様において、本発明は、少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含むペプチドリガンドであって、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記ペプチドが、少なくとも１種の非天然のアミノ酸の組み入れにより修飾されている、ペプチドリガンドを提供する。

好ましくは、本発明のこの態様にかかるペプチドリガンドは、プロテアーゼ抵抗性である。非天然アミノ酸置換（複数可）は、ポリペプチドのプロテアーゼ抵抗性のレベルを増加させる。

一実施形態において、非天然のアミノ酸は、Ｎ−メチルアルギニン、ホモ−アルギニンおよびアゼチジンカルボン酸およびグアニジルフェニルアラニンから選択される。好ましくは、アルギニンのＮ−メチルおよびホモ誘導体が、アルギニンの置き換えに用いられ、アゼチジンカルボン酸は、プロリンに置き換わる。別の一実施形態において、アルギニンは、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えることができる。

二環式ペプチドのファージ選択を示す図である。（ａ）二環式ペプチドファージライブラリ。ランダムなアミノ酸を「Ｘ」と示し、アラニンを「Ａ」と示し、定常の３システイン残基を「Ｃ」と示す。（ｂ）３、５または６アミノ酸のループを有する化学的に合成された二環式ペプチド構造の型式。３個のシステイン側鎖を介して直鎖状ペプチドをトリス−（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）へと連結することにより、この構造が生成される。二環式ペプチドにおいて変動するアミノ酸は、「Ｘａａ」で示す。（ｃ〜ｅ）ライブラリ５×５（ｃ）、ライブラリ３×３Ａ（ｄ）およびライブラリ３×３Ｂ（ｅ）から単離された二環式ペプチドの配列。アミノ酸における類似性を陰影により強調する。 ｈＰＫの表面アミノ酸および相同セリンプロテアーゼの比較を示す図である。（ａ）表面表示によるｈＰＫの構造（ＰＤＢエントリー２ＡＮＷ）。表面に露出している、Ｓ１ポケットに結合したベンズアミジンに４、８および１２Å（灰色で示す）よりも近いアミノ酸の原子をより暗く染色する。（ｂ）ｈＰＫの構造。ｈｆＸＩａにおいて異なるアミノ酸の側鎖を強調する。（ｃ）ｈＰＫの構造。ｒＰＫにおいて異なるアミノ酸の側鎖を強調する。 ポリペプチドリガンドにおける変異に好ましい残基の決定に用いられる方法をイラストで表示する図である。 ２ｎＭの血漿カリクレインとペプチドの結合における、ペプチド０６−３４（表４）におけるアミノ酸置換の解析を示す図である。位置毎に、親配列と比較した該位置における様々な変異の効果を示す。 ２ｎＭの血漿カリクレインとペプチドの結合における、ペプチド０６−５６（表４）におけるアミノ酸置換の解析を示す図である。位置毎に、親配列と比較した該位置における様々な変異の効果を示す。 １０ｎＭの血漿カリクレインとペプチドの結合における、ペプチド０６−５６（表４）におけるアミノ酸置換の解析を示す図である。位置毎に、親配列と比較した、該位置における様々な変異の効果を示す。 ｔ＝０、１日目、２日目および３日目における、３５％ラット血漿へと曝露した後のＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の質量スペクトルを示す質量分析アウトプットを示す図である（方法１）。質量精度は、干渉するイオンおよび低濃度の断片により若干変動する。しかし、別々のタンパク質分解性断片の同定は可能である。 ラット血漿に曝露した後に同定された、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の代謝産物Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３の化学構造を示す図である。 Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２リード（lead）の化学構造を示す図である。 Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２リードおよびその第１のループがスクランブルされた誘導体によるカリクレインの酵素阻害アッセイを示す図である。親和性の劇的な低下が観察され、ＷＰＡＲファルマコフォアの完全性の重要性を強調する。 アルギニンおよびその類似体の化学構造を示す図である。 Ｔｒｐおよび潜在的な疎水性類似体の化学構造を示す図である。 Ｐｒｏおよび潜在的な制約された類似体の化学構造を示す図である。 Ａｚｅ３、ＮＭｅＡｒｇ５および二重に修飾されたＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２による比較カリクレイン阻害を示す図である。 アラニンおよびその誘導体の化学構造を示す図である。 Ｆ２Ｙ４、Ｆ２Ｙ２ ＨＲ５および二重に修飾されたＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２による比較カリクレイン阻害を示す図である。

別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学ならびに生化学の分野などの当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。分子生物学、遺伝子学および生化学的の方法には、本明細書中に参考として組み込まれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第３版、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の手短なプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）標準の技法が使用される。

本明細書中で言及するペプチドリガンドとは、分子足場と共有結合したペプチドをいう。典型的には、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成することができる２つ以上の反応基、および、ペプチドが足場と結合した際にループを形成するためことからループ配列と呼ばれる、前記反応基間に内在する配列を含む。本事例において、ペプチドは、少なくとも３個の反応基を含み、足場上に少なくとも２個のループを形成する。

反応基とは、分子足場と共有結合を形成することができる基である。典型的には、反応基は、ペプチド上のアミノ酸側鎖上に存在する。例は、システイン、リジンおよびセレノシステインなどのアミノ含有基である。

本明細書の文脈における特異性は、標的と類似の実体を除外したその同族標的と結合する、さもなければこれと相互作用するリガンドの能力を指す。例えば、特異性は、ヒト酵素の相互作用を阻害するが、異なる種由来の相同酵素の相互作用を阻害しないリガンドの能力を指すことができる。本明細書に記載されているアプローチを用いて、企図される標的のホモログまたはパラログとリガンドがより相互作用できるようにまたはできなくなるように、特異性が増加または減少するようモジュレートすることができる。特異性は、活性、親和性またはアビディティーと同義であるとは企図されておらず、その標的におけるリガンドの作用の効力（例えば、結合親和性または阻害のレベル等）は、必ずしもその特異性に関係しない。

本明細書における結合活性は、例えば、本明細書に記載されている結合アッセイから得られる定量的結合測定値を指す。従って、結合活性は、所定の標的濃度で結合しているペプチドリガンドの量を指す。

多重特異性は、２種以上の標的に結合する能力である。通常、結合ペプチドは、そのコンホメーション特性により、抗体の場合はエピトープ等、単一の標的と結合することができる。しかし、２種以上の標的に結合することができるペプチド、例えば上述の通り、本技術分野において公知の二重特異的抗体を開発することができる。本発明において、ペプチドリガンドは、２種以上の標的に結合することができ、従って多重特異的となり得る。好ましくは、これは、２種の標的に結合し、二重特異的である。結合は、独立的となることができ、これは、ペプチドにおける標的に対する結合部位が、標的の一方または他方の結合により構造的に妨げられないことを意味する。この場合、両方の標的が独立的に結合していてよい。より一般的には、一方の標的の結合が、他方の結合を少なくとも部分的に妨害するであろうと予想される。

二重特異的リガンドと、２種の関連する標的を網羅する特異性を有するリガンドとの間には、根本的な差異が存在する。第１の事例において、リガンドは、両方の標的に個々に特異的であり、特異的な様式でそれぞれと相互作用する。例えば、リガンドにおける第１のループが第１の標的に結合し、第２のループが第２の標的に結合することができる。第２の事例において、リガンドは、例えば、両者に共通する標的のエピトープと相互作用することにより、２種の標的の間を区別しないため、非特異的である。

本発明の文脈において、例えば、標的およびオルソログに関して活性を有するリガンドは、二特異的リガンドとなることが可能である。しかし、一実施形態において、リガンドは、二特異的ではないが、標的および１種または複数種のオルソログの両方と結合するような、より低い正確さの特異性を有する。一般に、標的およびそのオルソログの両方に対して選択されていないリガンドは、ループ長のモジュレーションの結果、二特異的となる可能性が低い。

リガンドが、真に二特異的である場合、一実施形態において、リガンドの標的特異性のうち少なくとも一方が、選択されたリガンドの間で共通となり、特異性のレベルは、本明細書において開示される方法によりモジュレートすることができる。第２のまたはさらに別の特異性は、共有される必要はなく、本明細書に表記されている手順の対象である必要はない。

標的は、ペプチドリガンドが結合する、さもなければ相互作用する分子またはその一部である。結合は、多くの種類の活性に必須のものと理解され、それ自体が活性となり得るが、他の活性が想定される。よって、本発明は、直接的または間接的な結合の測定を必要としない。

分子足場とは、複数の点でペプチドと接続して、ペプチドに１つまたは複数の構造的特長を与えることができる、任意の分子である。これは、ジスルフィド結合を単に置き換えるのではなく、その代わりに、ペプチドの２つ以上の付着点をもたらすという点で、架橋結合剤ではない。好ましくは、分子足場は、足場反応基と呼ばれる、ペプチドの付着点を少なくとも３つ含む。これらの基は、ペプチド上の反応基と反応して共有結合を形成することができる。分子足場の好ましい構造を以下に記載する。

結合活性（または任意の他の所望の活性）のスクリーニングは、当分野で周知の方法に従って、例えばファージディスプレイ技術から実施する。例えば、固相に固定した標的を用いて、レパートリーの結合メンバーを同定および単離することができる。スクリーニングにより、所望の特徴に応じたレパートリーのメンバーの選択が可能となる。

用語、ライブラリは、不均質なポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリは、同一ではないメンバーで構成される。この点で、ライブラリはレパートリーと同義である。ライブラリメンバー間の配列の相違が、ライブラリ中に存在する多様性を司っている。ライブラリは、ポリペプチドもしくは核酸の単純な混合物の形態をとり得るか、または、核酸のライブラリで形質転換させた生物もしくは細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物もしくは植物細胞などの形態であり得る。好ましくは、それぞれの個々の生物または細胞は、１つのみまたは限定された数のライブラリメンバーを含有する。

一実施形態では、核酸によってコードされているポリペプチドの発現を可能にするために、核酸を発現ベクター内に組み込む。したがって、好ましい態様では、ライブラリは宿主生物の集団の形態をとってよく、それぞれの生物は、発現させてその対応するポリペプチドメンバーを産生させることができる、ライブラリの単一のメンバーを核酸の形態で含有する発現ベクターの１つまたは複数のコピーを含有する。したがって、宿主生物の集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードしている潜在性を有する。

一実施形態では、核酸のライブラリはポリペプチドのレパートリーをコードしている。ライブラリのそれぞれの核酸メンバーは、好ましくは、ライブラリの１つまたは複数の他のメンバーに関連する配列を有する。関連する配列とは、ライブラリの少なくとも１つの他のメンバーに対して少なくとも５０％の同一性、例えば少なくとも６０％の同一性、例えば少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。同一性は、少なくとも３個のアミノ酸、例えば少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸、例えば少なくとも１２個のアミノ酸、例えば少なくとも１４個のアミノ酸、例えば少なくとも１６個のアミノ酸、例えば少なくとも１７個のアミノ酸の連続的なセグメントまたは参照配列の完全長にわたって判断し得る。

レパートリーは、変異体、この場合はその配列が異なるポリペプチド変異体のコレクションである。通常、反応基の位置および性質は変動しないが、その間にループを形成する配列がランダム化されてよい。レパートリーは、サイズが異なるが、少なくとも１０^２種のメンバーを含むと考慮されるべきである。１０^１１種以上のメンバーのレパートリーを構築することができる。

ポリペプチドリガンドのセットは、本明細書において、記載されている方法における選択に付すことができる複数のポリペプチドリガンドを指す。潜在的には、セットは、レパートリーとなり得るが、少なくとも２、最大１０、２０、５０、１００種以上のポリペプチドの小規模のコレクションであってもよい。

ポリペプチドリガンドの群は、本明細書において、２種以上のリガンドを指す。一実施形態において、リガンドの群は、少なくとも１種の標的特異性を共有するリガンドのみを含む。通常、群は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０、２０、５０、１００種以上のリガンドからなるであろう。一実施形態において、群は、２種のリガンドからなる。

（Ａ）ペプチドリガンドの構築
（ｉ）分子足場
分子足場は、例えば、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットならびにそこに引用されている参考文献、特に、国際公開第２００４０７７０６２号パンフレットおよび国際公開第２００６０７８１６１号パンフレットにおいて記載されている。

前述の文書に記されている通り、分子足場は、有機小分子等、小分子でもよい。

一実施形態では、分子足場は、ヌクレオシド、糖、またはステロイドなどの天然の単量体であり得る、またはそれに基づき得る。例えば、分子足場は、二量体または三量体などの、そのような実体の短いポリマーを含み得る。

一実施形態では、分子足場は、既知の毒性、例えば低い毒性の化合物である。適切な化合物の例には、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、またはタマゼパム（ｔａｍａｚｅｐａｍ）などの既存の薬物が含まれる。

一実施形態では、分子足場は巨大分子であり得る。一実施形態では、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。

一実施形態では、分子足場は、ポリペプチドの官能基（複数可）と反応して共有結合を形成することができる反応基を含む。

分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、酸無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの化学基を含有し得る。

一実施形態では、分子足場は、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、またはその誘導体を含み得る、またはそれからなり得る。

一実施形態では、分子足場は２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。これは、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンに類似であるが、ベンゼン環に付着したさらに３つのメチル基を含有する。これは、追加的なメチル基が、ポリペプチドとのさらに別の接触を形成し、したがって追加的な構造的制約を加え得るという利点を有する。

本発明の分子足場は、本発明のコードされたライブラリのポリペプチドの官能基が分子足場と共有結合を形成することのできる化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、サクシニミド、マレイミド、アジ化物、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを包含する広範な官能基から選択される。

（ｉｉ）ポリペプチド
ポリペプチドの反応基は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖によって提供され得る。ポリペプチドの反応基は、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、グアニジニウム基、フェノール基またはヒドロキシル基から選択され得る。ポリペプチドの反応基は、アジド、ケト−カルボニル、アルキン、ビニル、またはハロゲン化アリール基から選択され得る。分子足場と連結させるためのポリペプチドの反応基は、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端であり得る。

一部の実施形態では、分子足場と連結させるためのポリペプチドの反応基のそれぞれは、同じ種類のものである。例えば、それぞれの反応基はシステイン残基であり得る。さらなる詳細は、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットに提供されている。

一部の実施形態では、分子足場と連結させるための反応基は、２つ以上の異なる種類を含み得るか、または３つ以上の異なる種類を含み得る。例えば、反応基は、２つのシステイン残基および１つのリジン残基を含み得るか、あるいは、１つのシステイン残基、１つのリジン残基および１つのＮ末端アミンを含み得る。

システインは、その反応性がすべての他のアミノ酸と最も異なっているという利点を有するため、使用しうる。システインのチオール基と反応させるために分子足場上で使用することができる足場反応基は、アルキルハロゲン化物、（またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも命名される）。具体例は、ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢにより例証される足場反応基）またはヨードアセトアミドである。化合物をタンパク質中のシステインと選択的にカップリングさせるために使用される他の足場反応基はマレイミドである。本発明において分子足場として使用し得るマレイミドの例には、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド）ベンゼンが含まれる。セレノシステインは、また、システインと類似の反応性を有しており、同じ反応に使用することができる天然アミノ酸である。したがって、システインに言及する場合はいつでも、文脈によりそうでないと示唆される場合以外は、セレノシステインを置換することが典型的には許容される。

また、リジン（およびペプチドのＮ末端の第一級アミン）も、分子足場との連結によってファージ上のペプチドを修飾するための反応基として適している。しかし、ファージを選択に使用する場合は、リジンはファージタンパク質中でシステインよりも豊富に存在し、ファージ粒子が架橋結合し得る、またはこれらがその感染力を失い得る危険性が高くなる。それにもかかわらず、リジンは、分子内反応（例えば、分子足場が既にファージペプチドと連結している場合）において、分子足場と第２のまたは連続した連結を形成するために特に有用であることが見出されている。この場合、分子足場は、ディスプレイされたペプチドのリジン（特に、非常に近位にあるリジン）と優先的に反応する。第一級アミンと選択的に反応する足場反応基は、スクシンイミド、アルデヒドまたはハロゲン化アルキルである。添付の実施例のうちのいくつかにおいて使用されているブロモメチル基では、ベンゼン環の電子が陽イオン性の遷移状態を安定化することができる。したがって、この特定のハロゲン化アリルは、ハロゲン化アルキルよりも反応性が１００〜１０００倍高い。分子足場として使用するためのスクシンイミドの例には、トリス−（スクシンイミジルアミノトリアセテート）、１，３，５−ベンゼン三酢酸が含まれる。分子足場として使用するためのアルデヒドの例には、トリホルミルメタンが含まれる。分子足場として使用するためのハロゲン化アルキルの例には、１，３，５−トリス（ブロモメチル）−２，４，６−トリメチルベンゼン、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン、１，３，５−トリス（ブロモメチル）−２，４，６−トリエチルベンゼンが含まれる。

分子足場と連結させるための反応基を有するアミノ酸は、ポリペプチド内の任意の適切な位置に位置していてよい。作製された特定の構造またはループに影響を与えるために、反応基を有するアミノ酸の位置は、例えば、産生されるポリペプチドを突然変異させるためにポリペプチドをコードしている核酸を操作することによって、技術者によって変動させ得る。かかる手段により、ループ長は、本教示に従って操作することができる。

例えば、ポリペプチドは、配列ＡＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｍＣＧ（式中、Ｘはランダムな天然のアミノ酸を表し、Ａはアラニンを表し、Ｃはシステインを表し、Ｇはグリシンを表し、同一であっても異なっていてもよいｎおよびｍは、３〜６の間の数である）を含むことができる。

（ｉｉｉ）ポリペプチドの反応基
本発明の分子足場は、ポリペプチドにおける官能基または反応基を介してポリペプチドと結合していてよい。これらは通常、ポリペプチドポリマーに存在する特定のアミノ酸の側鎖から形成される。かかる反応基は、システイン側鎖、リジン側鎖またはＮ末端アミン基もしくはその他の適した反応基となり得る。重ねて記すが、詳細は、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットに見出すことができる。

天然のアミノ酸の反応基の例は、システインのチオール基、リジンのアミノ基、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボキシル基、アルギニンのグアニジウム基、チロシンのフェノール基またはセリンのヒドロキシル基である。非天然のアミノ酸は、アジ化物、ケト−カルボニル、アルキン、ビニルまたはハロゲン化アリール基を包含する広範な反応基をもたらすことができる。ポリペプチド末端のアミノおよびカルボキシル基もまた、分子足場／分子コアと共有結合を形成する反応基としての役割を果たすことができる。

本発明のポリペプチドは、少なくとも３個の反応基を含有する。前記ポリペプチドは、４個以上の反応基を含有することもできる。より多くの反応基が用いられるほど、より多くのループを分子足場に形成することができる。

好ましい実施形態において、３個の反応基を有するポリペプチドが生成される。３回（fold）回転対称を有する分子足場／分子コアと前記ポリペプチドの反応は、単一の産物異性体（product isomer）を生成する。単一の産物異性体の生成は、いくつかの理由から有利である。化合物ライブラリの核酸は、ポリペプチドの一次配列のみをコードし、分子コアとポリペプチドの反応により形成される分子の異性体状態をコードしない。１種の産物異性体のみが形成され得るのであれば、産物異性体への核酸の割当は、明確に定義される。複数の産物異性体が形成される場合、核酸は、スクリーニングまたは選択プロセスにおいて単離された産物異性体の性質に関する情報を与えることができない。単一の産物異性体の形成は、本発明のライブラリの特異的なメンバーが合成される場合も有利である。この場合、分子足場とポリペプチドの化学反応は、異性体の混合物ではなく単一の産物異性体を生じる。

本発明の別の一実施形態において、４個の反応基を有するポリペプチドが生成される。４面体対称を有する分子足場／分子コアと前記ポリペプチドの反応は、２種の産物異性体を生成する。２種の異なる産物異性体が、全く同一の核酸にコードされるとしても、単離された異性体の異性体的な性質は、両方の異性体を化学的に合成し、２種の異性体を分離し、標的リガンドへの結合に関して両方の異性体を検査することにより決定することができる。

本発明の一実施形態では、ポリペプチドの反応基のうちの少なくとも１つは、残りの反応基と直交性である。直交性の反応基の使用は、前記直交性の反応基を分子コアの特異的部位に向けることを可能にする。直交性の反応基を含む連結戦略は、形成された生成物異性体の数を制限するために使用し得る。言い換えれば、少なくとも３つの結合のうちの１つまたは複数について、少なくとも３つの結合のうちの残りについて選択したものと区別されるまたは異なる反応基を選択することによって、特定の順序の結合、またはポリペプチドの特定の反応基を分子足場上の特定の位置に指示することが、有用に達成され得る。

別の実施形態では、本発明のポリペプチドの反応基を分子リンカーと反応させ、前記リンカーは、リンカーが最終的な結合状態において分子足場とポリペプチドとの間に介在するように、分子足場と反応することができる。

一部の実施形態において、ポリペプチドのライブラリまたはセットのメンバーのアミノ酸は、いずれかの天然または非天然のアミノ酸に置き換えることができる。これらの交換可能なアミノ酸から除外されるのは、ループ配列単独が交換可能となるような、分子コアにポリペプチドを架橋するための官能基を持つアミノ酸である。交換可能なポリペプチド配列は、ランダムな配列、定常な配列またはランダムおよび定常なアミノ酸を有する配列のいずれかを有する。反応基を有するアミノ酸は、これらのアミノ酸の位置はループサイズを決定するため、ポリペプチド内の定義された位置のいずれかに位置する。

一実施形態では、３つの反応基を有するコードされているポリペプチドは、配列（Ｘ）_ｌＹ（Ｘ）_ｍＹ（Ｘ）_ｎＹ（Ｘ）_ｏ［式中、Ｙは反応基を有するアミノ酸を表し、Ｘはランダムなアミノ酸を表し、ｍおよびｎは、同一でも異なっていてもよい介在ポリペプチドセグメントの長さを定義する３〜６の数字であり、ｌおよびｏは、フランキングポリペプチドセグメントの長さを定義する、０〜２０の数字である］を有する。

チオール媒介性のコンジュゲーションの代替方法を使用して、共有的相互作用を介して分子足場をペプチドに付着させることができる。あるいは、これらの技法は、本発明に従ってこれらを選択された単離した後の、修飾またはさらなる部分（分子足場から区別される対象の小分子など）とポリペプチドとの付着に使用し得る。したがって、本実施形態では、明らかに、付着は共有的である必要はなく、非共有的な付着を包含し得る。これらの方法は、非天然アミノ酸を保有し、必須の化学反応基を、相補的反応基を保有する小分子と組み合わせて有するタンパク質およびペプチドをディスプレイするファージを産生させることによって、または、分子が選択／単離段階の後に作製される場合は、非天然アミノ酸を化学的にもしくは組換えによって合成したポリペプチド内に組み込ませることによって、チオール媒介性方法の代わりに（またはそれと組み合わせて）使用し得る。さらなる詳細は、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットまたはＨｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５（７）、５０２〜７に見出すことができる。

（ｉｖ）多重特異的分子を形成するためのループの組合せ
ペプチドリガンドまたはペプチドリガンドのレパートリー由来のループは、組み合わせたループを組み入れているポリペプチドの配列決定およびｄｅ ｎｏｖｏ合成により有利に組み合わされる。あるいは、かかるポリペプチドをコードする核酸を合成することができる。

レパートリー、特に単一ループのレパートリーが組み合わされる場合、レパートリーをコードする核酸は、有利に消化され、再ライゲーションされて、構成物レパートリー由来のループの異なる組合せを有する新規レパートリーを形成する。ファージベクターは、ポリリンカーおよび制限酵素のための他の部位（ベクターの切断および再ライゲーションのための固有のポイントを提供する）を包含して、所望の多重特異的ペプチドリガンドを作製することができる。ファージライブラリを操作するための方法は、抗体に関してよく知られており、本事例においても適用することができる。

（ｖ）エフェクター基および官能基の取り付け
エフェクターおよび／または官能基を、例えば、ポリペプチドのＮもしくはＣ末端にまたは分子足場に付けることができる。

適切なエフェクター基は、抗体およびその部分または断片を包含する。例えば、エフェクター基は、１種または複数種の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメインまたはこれらのいずれかの組合せを包含することができる。エフェクター基は、抗体のヒンジ領域（ＩｇＧ分子のＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間に通常存在する領域等）を含むこともできる。

本発明の本態様のさらに好ましい実施形態において、本発明にかかるエフェクター基は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明にかかるペプチドリガンドエフェクター基は、１日間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上または７日間以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含む、あるいはこれからなる。最も有利には、本発明にかかるペプチドリガンドは、１日間以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含む、あるいはこれからなる。

官能基は、一般に、結合基、薬物、他の実体を付けるための反応基、細胞への大環状ペプチドの取り込みを助ける官能基その他を包含する。

細胞へと浸透するペプチドの能力は、細胞内標的に対するペプチドを有効なものとすることができる。細胞へと浸透する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的は、転写因子、チロシンキナーゼ等の細胞内シグナル伝達分子およびアポトーシス経路に関与する分子を包含する。細胞の浸透を可能にする官能基は、ペプチドまたは分子足場のいずれかに付加されたペプチドまたは化学基を包含する。ＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエ（Drosophila）のホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）等に由来するペプチド等、ペプチドは、例えば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００７）３５巻、パート４、８２１頁「Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｅｎａｂｌｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ」およびＧｕｐｔａらによる「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００４）５７巻９６３７に記載されている。細胞膜を通した転位置において効率的であることが示された短いペプチドの例として、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の１６アミノ酸ペネトラチン（penetratin）ペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻、１０４４４頁「Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｈｅｌｉｘ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」）、１８アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」（Ｏｅｈｌｋｅら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔｓ １４１４巻１２７頁「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ａｎ ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｍｏｄｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｄｅｌｉｖｅｒ ｐｏｌａｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｎｏｎ−ｅｎｄｏｃｙｔｉｃａｌｌｙ」）およびＨＩＶ ＴＡＴタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチは、生体分子に容易に付けることができる小分子模倣物またはＳＭＯＣの使用を包含する（Ｏｋｕｙａｍａら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４巻１５３頁「Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｍｉｍｉｃｓ ｏｆ ａｎ ａ−ｈｅｌｉｘ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ」。分子にグアニジウム基を付加する他の化学的戦略も、細胞浸透を増強させる（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂら（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２巻１３５８５頁「Ｇｕａｎｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ Ｎｅｏｍｃｙｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｓ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃａｒｇｏ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｕｌｐｈａｔｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ」）。ステロイド等、低分子量の分子を分子足場に付加して、細胞への取り込みを増強させることができる。

ペプチドリガンドに付けることのできる官能基の一クラスは、抗体、およびＦａｂ、Ｆｖまたはシングルドメイン断片等、その結合断片を包含する。特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体を用いることができる。

多くの細胞上に存在するインテグリンに結合するＲＧＤペプチドを組み入れていることもできる。

一実施形態において、本発明にかかるペプチドリガンドエフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上、７日間以上、８日間以上、９日間以上、１０日間以上、１１日間以上、１２日間以上、１３日間以上、１４日間以上、１５日間以上または２０日間以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明にかかるペプチドリガンドエフェクター基または組成物は、１２〜６０時間の範囲内のｔβ半減期を有するであろう。さらに別の実施形態において、これは、１日間以上のｔ半減期を有するであろう。さらにまた別の実施形態において、これは、１２〜２６時間の範囲内であろう。

官能基は、癌治療のための細胞傷害性薬剤等、薬物を包含する。これは、シスプラチンおよびカルボプラチン等のアルキル化剤ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド；プリン類似体、アザチオプリンおよびメルカプトプリンを包含する抗代謝剤））またはピリミジン類似体；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシン等、ビンカアルカロイドを包含する植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシド；本来タキソールとして知られた、パクリタキセルを包含するタキサン；カンプトテシンを包含するトポイソメラーゼ阻害剤：イリノテカンおよびトポテカン、ならびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩およびテニポシドを包含するＩＩ型阻害剤を包含する。さらに別の薬剤は、免疫抑制薬ダクチノマイシン（腎臓移植において用いられる）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンその他を包含する抗腫瘍抗生物質を包含することができる。

可能なエフェクター基は、例えば、ペプチドリガンドが、ＡＤＥＰＴにおいて抗体を置き換える、酵素／プロドラッグ治療法において用いるためのカルボキシペプチダーゼＧ２等、酵素も包含する。

（ｖｉ）合成
対象のポリペプチドを本発明に従って単離または同定した後、その後の続く合成は、可能な場合はいつでも単純化し得ることに留意されたい。よって、ポリペプチドの群またはセットは、組換えＤＮＡ技法により産生される必要はない。例えば、対象のポリペプチドの配列を決定してよく、これを標準の技法によって合成によって製造し、次いで分子足場とｉｎ ｖｉｔｒｏで反応させ得る。これを行う場合、ファージなどの遺伝的にコードされている担体粒子の機能性または完全性を保存する必要はもはやないため、標準の化学を使用し得る。これにより、さらなる下流の実験または妥当性確認のための、可溶性物質の迅速な大スケールの調製が可能となる。この点において、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎらに開示されているものなどの慣用の化学を用いて、本発明の方法によって同定された候補またはリードの大スケール調製を達成することができる。

したがって、本発明はまた、以下に記載する、任意選択のさらなるステップを含む、本明細書中に記載のように選択されたポリペプチドまたはコンジュゲートの製造にも関する。一実施形態では、これらのステップは、ファージ上ではなく、化学合成によって作製された最終産物ポリペプチド／コンジュゲート上で実施する。

任意選択で、コンジュゲートまたは複合体を製造する際に、例えば最初の単離／同定ステップの後に、対象のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換し得る。

また、ペプチドを、例えば別のループを組み込むように延長して、したがって複数の特異性を導入することもできる。

ペプチドを伸長させるため、これは、標準固相または溶液相化学を用いて直交的に保護されたリジン（および類似体）を用いて、そのＮ末端もしくはＣ末端においてまたはループ内で単純に化学的に伸長させることができる。標準のタンパク質の化学を使用して、活性化可能なＮまたはＣ末端を導入し得る。あるいは、付加を、断片の縮合、もしくは、例えば（Ｄａｗｓｏｎ ＰＥ、Ｍｕｉｒ ＴＷ、Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ、Ｋｅｎｔ，ＳＢＨ．、１９９４．、ネイティブ化学的ライゲーションによるタンパク質の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６〜７７９）に記載のネイティブ化学的ライゲーションによって、または、酵素によって、例えば（サブチリガーゼ：タンパク質の半合成のツール（Ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ：ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｃｈａｎｇ ＴＫ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＤＹ、Ｂｕｒｎｉｅｒ ＪＰ、Ｗｅｌｌｓ ＪＡ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、１９９４年１２月２０日、９１（２６）：１２５４４〜８、もしくはプロテオミクスのためにタンパク質のＮ末端をサブチリガーゼで標識するための、生物有機および医薬化学的文字のタグ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｔａｇｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｉ ｗｉｔｈ ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、第１８巻、第２２号、２００８年１１月１５日、ページ６０００〜６００３、プロテオミクスのためにタンパク質のＮ末端をサブチリガーゼで標識するためのタグ（Ｔａｇｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｉ ｗｉｔｈ ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、Ｈｉｋａｒｉ Ａ．Ｉ．Ｙｏｓｈｉｈａｒａ、Ｓａｍｉ ＭａｈｒｕｓおよびＪａｍｅｓ Ａ．Ｗｅｌｌｓ）に記載のサブチリガーゼを用いて行い得る。

あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を介したさらなるコンジュゲーションによって延長または修飾し得る。これは、第１および第２のペプチドが、細胞の還元環境内に入った後に互いに解離することを可能にするという追加の利点を有する。この場合、分子足場（例えばＴＢＭＢ）は、３つのシステイン基と反応するように、第１のペプチドの化学合成中に付加することができ、その後、さらなるシステインを、このシステインが第２のペプチドの遊離システインのみと反応するように、第１のペプチドのＮ末端に付随させることができる。

同様の技法が、２種の二環式および二特異的大環状分子の合成／カップリングに等しく適用され、潜在的に四特異的分子を作製する。

さらに、他の官能基またはエフェクター基の付加を、同じ様式で、適切な化学を用いて、側鎖を介してＮまたはＣ末端でカップリングさせて、達成し得る。一実施形態では、カップリングは、どちらの実体の活性も遮断しないような様式で実施する。

（ｖｉｉ）ペプチド修飾
二環式ペプチド（バイシクル；分子足場にコンジュゲートしたペプチド）を適した薬物様分子へと開発するため、注射、吸入、経鼻、点眼、経口または局所的投与のいずれのためであれ、多数の特性を考慮する必要がある。次の記載は、少なくとも所定のリードバイシクルに設計される必要がある。
・ プロテアーゼ安定性、これが、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー型」）プロテアーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼその他に対するバイシクル安定性に関係するか否か。プロテアーゼ安定性は、バイシクルリード候補が、動物モデルにおいて開発できると共に、自信を持ってヒトに投与できるように、異なる種の間で維持されるべきである。
・ 分子の医薬品安定性プロファイルを改善するための、トリプトファンおよびメチオニン等、酸化感受性残基の酸化抵抗性類似体への置き換え。
・ 製剤および吸収目的に重要な、荷電かつ親水性対疎水性残基の比例の関数である、望ましい溶解性プロファイル。
・ 荷電対疎水性残基の正確な均衡。その理由として、疎水性残基は、血漿タンパク質結合の程度、よって、血漿における遊離した利用できる画分の濃度に影響を与え、一方、荷電残基（特にアルギニン）は、細胞表面におけるリン脂質膜とペプチドとの相互作用に影響を与え得るからである。組み合わせた両者は、半減期、分布の体積およびペプチド薬物への曝露に影響を与えることができ、臨床エンドポイントに応じて目的に合わせて作製することができる。加えて、荷電対疎水性残基の正確な組合せおよび数は、注射部位における刺激作用を低下させることができる（ペプチド薬物を皮下投与した場合）。
・ 臨床適応および治療レジメンに応じた、目的に合わせた半減期。急性疾病管理設定における短時間の曝露のための無修飾分子を開発する、あるいは血漿半減期を増強させる化学修飾を有する、したがってより慢性病状の管理に最適な二環式ペプチドを開発することは、堅実な行為となろう。

タンパク質分解に対して治療ペプチド候補を安定化させるためのアプローチは数多くあり、ペプチド模倣薬の分野と重複する（総説のため、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉら、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ、（２０１０）、１６、３１８５〜２０３およびＮｅｓｔｏｒら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ（２００９）、１６、４３９９〜４１８を参照）。

かかるアプローチの例として、次のものが挙げられる。
・ ペプチドの環化
・ ＮおよびＣ末端キャッピング、通常、Ｎ末端アセチル化およびＣ末端アミド化
・ タンパク質分解による攻撃部位（複数可）を明らかにし、潜在的に除去するためのアラニン走査
・ 立体障害により、また、β−ターンコンホメーションを安定化させるＤ−アミノ酸の傾向によりタンパク質分解安定性を増加させるための、アミノ酸側鎖の立体要件を探るためのＤ−アミノ酸置き換え（Ｔｕｇｙｉら（２００５）ＰＮＡＳ、１０２（２）、４１３〜４１８）
・ 解離しやすいアミド結合の直接的な修飾によりタンパク質分解からの保護を与えるためのＮ−メチル／Ｎ−アルキルアミノ酸置き換え（Ｆｉａｃｃｏら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．（２００８）、９（１４）、２２００〜３）。Ｎ−メチル化は、ペプチド結合のねじれ角における強い効果も有し、細胞浸透＆経口利用能を助けると考えられる（Ｂｉｒｏｎら（２００８）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４７、２５９５〜９９）
・ 非天然のアミノ酸の組み入れ、即ち、次を用いることによる。
− プロテアーゼにより認識されないが、標的効力に効果を持たない、等比体積／等電子側鎖
− 近くのペプチド結合のタンパク質分解による加水分解が、コンホメーション的および立体的に妨害されるような、制約されたアミノ酸側鎖。特に、これらは、プロリン類似体、巨大な（bulky）側鎖、Ｃα−二置換誘導体（最も単純な誘導体が、Ａｉｂ、Ｈ_２Ｎ−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＯＯＨである場合）およびシクロアミノ酸（単純な誘導体がアミノ−シクロプロピルカルボン酸である）に関係する。
・ ペプチド結合代用物、その例として次のものが挙げられる。
− Ｎ−アルキル化（上述、即ち、ＣＯ−ＮＲを参照）
− 還元されたペプチド結合（ＣＨ_２−ＮＨ−）
− ペプトイド（Ｎ−アルキルアミノ酸、ＮＲ−ＣＨ_２−ＣＯ）
− チオ−アミド（ＣＳ−ＮＨ）
− アザペプチド（ＣＯ−ＮＨ−ＮＲ）
− トランス−アルケン（ＲＨＣ＝Ｃ−）
− レトロインベルソ（Retro-inverso）（ＮＨ−ＣＯ）
− 尿素代用物（ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＲ）
・ ペプチド主鎖長のモジュレーション
− 即ち、β^２／３−アミノ酸（ＮＨ−ＣＲ−ＣＨ_２−ＣＯ、ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨＲ−ＣＯ）
・ 主鎖コンホメーションを制約する、アミノ酸のアルファ−炭素における置換、最も単純な誘導体はアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）である。

これら修飾のいくつかが、標的に対するペプチドの効力の計画的な改善に、あるいは例えば、酸化感受性アミノ酸（ＴｒｐおよびＭｅｔ）の強力な置換の同定にも有用となり得ることを明確に留意されたい。バイシクルリードＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２が、タンパク質分解に対する抵抗性を与える２種の修飾、Ｎ／Ｃ末端キャッピングおよび（二）環化を既に持つことにも留意されたい。

（Ｂ）ポリペプチドリガンドのレパートリー、セットおよび群
（ｉ）ライブラリの構築
選択を意図するライブラリは、例えばＷＯ２００４／０７７０６２号に記載の当分野で知られている技法、または本明細書中に記載のファージベクター系を含めた生物系を用いて構築し得る。他のベクター系が当分野で知られており、他のファージ（例えばファージラムダ）、細菌プラスミド発現ベクター、酵母ベクターを含めた真核細胞に基づく発現ベクターなどが含まれる。例えば、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットまたはＨｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５（７）、５０２〜７を参照されたい。

ＷＯ２００４／０７７０６２号に記載のものなどの非生物系は、慣用の化学的スクリーニング手法に基づく。これらは単純であるが、ペプチドリガンドの大きなライブラリをスクリーニングすることは不可能、または少なくとも非実用的に煩雑であるため、生物系の威力を欠く。しかし、これらは、例えば、少数のペプチドリガンドのみをスクリーニングする必要がある場合に有用である。しかし、そのような個々のアッセイによるスクリーニングは時間がかかる場合があり、特定の標的との結合について試験することができるユニークな分子の数は、一般に１０^６個の化学的実体を超えない。

対照的に、生物学的スクリーニングまたは選択方法は、一般に、はるかにより多数の様々な分子のサンプリングを可能にする。したがって、生物学的方法が本発明の応用においてより適切に使用され得る。生物学的手順では、分子を単一の反応器中でアッセイし、好都合な特性（即ち結合）を有するものを、不活性の分子から物理的に分離する。１０^１３個を超える個々の化合物を同時に作製およびアッセイすることを可能にする選択戦略が利用可能である。強力な親和性選択技法の例は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはＲＮＡ／ＤＮＡアプタマー方法である。これらの生物学的なｉｎ ｖｉｔｒｏ選択方法は、リガンドレパートリーがＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされていることが共通している。これらは、配列決定によって選択されたリガンドの繁殖および同定を可能にする。ファージディスプレイ技術は、例えば、事実上任意の標的に対して非常に高い結合親和性を有する抗体の単離に使用されている。

生物系を使用する場合は、ベクター系を選択し、対象のポリペプチドをコードしている１つまたは複数の核酸配列をライブラリベクター内にクローニングした後、発現前に突然変異誘発を行うことによってクローニングした分子内に多様性を発生させ得るか、あるいは、突然変異誘発の前にコードされているタンパク質を発現および選択し、さらなる選択の回を行い得る。

構造的に最適化されたポリペプチドをコードしている核酸配列の突然変異誘発は、標準の分子学的方法によって実施する。特に有用なものは、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲである（本明細書中に参考として組み込まれているＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５：３３５）。対象の標的配列を増幅するために熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される、複数のサイクルのＤＮＡ複製を使用するＰＣＲは、当分野で周知である。様々な抗体ライブラリの構築は、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２、４３３〜５５、およびそれ中に引用される参考文献中に記述されている。

あるいは、本発明によるポリペプチドの短い鎖長を考慮すると、変異体を好ましくは新規合成し、適切な発現ベクター内に挿入する。ペプチド合成は、上述のように当分野で知られている標準の技法によって実施することができる。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ４３３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）などの自動ペプチド合成機が広く利用可能である。

（ｉｉ）遺伝的にコードされている多様性
一実施形態では、対象のポリペプチドは、遺伝的にコードされている。これは、増強された多様性と共に取扱いの容易性の利点を提供する。遺伝的なポリペプチドライブラリの一例はｍＲＮＡディスプレイライブラリである。別の例は、ファージディスプレイライブラリなどの複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（ｒｇｄｐ）ライブラリである。一実施形態では、対象のポリペプチドは、ファージディスプレイライブラリとして遺伝的にコードされている。

したがって、一実施形態では、本発明の複合体は、ファージ粒子などの複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（ｒｇｄｐ）を含む。これらの実施形態では、核酸はファージゲノムによって含まれ得る。これらの実施形態では、ポリペプチドはファージのコートによって含まれ得る。

一部の実施形態では、本発明を使用して、いくつかの核酸を対応するポリペプチドへと翻訳し、前記分子足場の分子を前記ポリペプチドと連結させることによって作製される、遺伝的にコードされているポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを生成し得る。

遺伝的にコードされているポリペプチドのコンビナトリアルライブラリは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイによって作製し得る。

ファージディスプレイを行うための技法および方法論は、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットに見出すことができる。

一実施形態において、スクリーニングは、ポリペプチドリガンドのライブラリ、セットまたは群を標的と接触させ、前記標的と結合する１種または複数種のメンバー（複数可）を単離することにより行うことができる。

別の実施形態では、前記ライブラリ、セットまたは群の個々のメンバーをスクリーニングにおいて標的と接触させ、前記標的と結合する前記ライブラリのメンバーを同定する。

別の実施形態では、前記ライブラリ、セットまたは群のメンバーを標的と同時に接触させ、前記標的と結合するメンバーを選択する。

標的は、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。

標的は、受容体、受容体リガンド、酵素、ホルモンまたはサイトカインであり得る。

標的は、原核タンパク質、真核タンパク質、または古細菌タンパク質であり得る。より詳細には、標的リガンドは、哺乳動物タンパク質もしくは昆虫タンパク質または細菌タンパク質もしくは真菌タンパク質もしくはウイルスタンパク質であり得る。

標的リガンドは、プロテアーゼなどの酵素であり得る。

また、本発明には本発明によるスクリーニングから単離したポリペプチドリガンドも包含されることに留意されたい。一実施形態では、本発明のスクリーニング方法（複数可）は、前記標的と結合することができるものとして単離された、一定量の本発明のポリペプチドを製造するステップをさらに含む。

本発明は、また、３個以上のループを有するペプチドリガンドに関する。例えば、本発明による分子足場に結合した二環ポリペプチドのＮおよびＣ末端を結合させることによって、分子足場に結合した三環ポリペプチドを作製することができる。この様式で、結合したＮおよびＣ末端が第３のループを作り、三環ポリペプチドが作製される。本実施形態は、ファージ上では実施する必要がなく、ここで述べた本発明のポリペプチド−分子足場のコンジュゲート上で実施し得る。ＮおよびＣ末端の結合は、ルーチン的なペプチド化学の事項である。指導が必要な場合は、Ｃ末端を活性化し得る、および／または例えばそれぞれの末端にシステインを付加するためにＮおよびＣ末端を延長させ、その後、ジスルフィド結合によってそれらを結合させ得る。あるいは、結合は、Ｎ／Ｃ末端内に組み込ませたリンカー領域の使用によって達成し得る。あるいは、ＮおよびＣ末端は、慣用のペプチド結合によって結合させ得る。あるいは、ＮおよびＣ末端を結合させる任意の他の適切な手段を用いてもよく、例えば、Ｎ−Ｃ環化は、例えばＬｉｎｄｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、９０、６７１〜６８２（２００８）「主鎖の環化およびメラノコルチンペプチドのＮ−メチル化の、構造−活性の関係性および代謝安定性の研究（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、またはＨｅｓｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５１、１０２６〜１０３４（２００８）「新規の経口投与薬としての主鎖環状ペプチド模倣体メラノコルチン−４受容体作用剤は、肥満の処置をもたらした（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｒａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｄｒｕｇ ｌｅａｄ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｂｅｓｉｔｙ）」に開示されているように、標準の技法によって行うことができる。そのような三環分子の一利点は、特にエクソプロテアーゼ作用による、遊離末端のタンパク質劣化の回避である。この性質の三環ポリペプチドの別の利点は、ＢＳＡ結合、細胞進入もしくは輸送効果、タグ付けまたは任意の他のそのような使用などの、一般に適用可能な機能のために第３のループを利用し得ることである。この第３のループは典型的には選択に利用可能でなく（ファージ上ではなく、ポリペプチド−分子足場のコンジュゲート上でのみ生成されるため）、したがって、他のそのような生物学的機能におけるその使用は、特異性を選択／作製するためにループ１および２をどちらも有利に残すことに留意されたい。

（ｉｉｉ）ファージの精製
ファージを精製するための任意の適切な手段を使用し得る。標準の技法を本発明において適用し得る。例えば、ファージは、濾過またはＰＥＧ沈殿などの沈殿によって精製し得る。ファージ粒子は、以前に記載のようにポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ）沈殿によって生成および精製し得る。詳細は国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットにある。

さらなる指導が必要な場合は、Ｊｅｓｐｅｒｓら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２００４、１７（１０）：７０９〜７１３．、化学合成抗体ライブラリからの光バイオセンサーの選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｒｏｍ ｃｈｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ））を参照されたい。一実施形態では、その中に教示されているようにファージを精製し得る。この出版物の本文は引用することにより、ファージ精製の方法について本明細書中の一部をなすものとする。詳細には、Ｊｅｓｐｅｒｓらのページ７０９の右段の途中から開始される材料および方法のセクションを参照されたい。

さらに、ファージは、ファージの精製をどのように実施するかの具体的な説明について引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、第２２２巻、ページ５８１〜５９７によって公開されているように精製し得る。

（ｉｖ）反応化学
本発明は、生成物の遺伝的にコードされている要素の機能および完全性を有利に保持する、ポリペプチドの修飾の化学条件を活用する。具体的には、遺伝的にコードされている要素が、それをコードしているファージの表面上にディスプレイされるポリペプチドである場合、化学は、有利には、ファージの生物学的完全性を損なわせない。一般に、条件は、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットに記載されている。

（Ｃ）本発明にかかるポリペプチドリガンドの使用
本発明の方法に従って選択されたポリペプチドリガンドは、ｉｎ ｖｉｖｏ治療および予防適用、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ診断適用、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび試薬適用その他において用いることができる。選択されたレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が望ましい非ヒト動物における検査に関与する適用において、あるいはホモログまたはパラログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断適用において有用である。ワクチン適用等、一部の適用において、所定の範囲の抗原に対する免疫応答を誘発する能力を活用して、ワクチンを特異的疾患および病原体の目的に合わせることができる。

少なくとも９０〜９５％の均一性の実質的に純粋なペプチドリガンドが哺乳動物への投与に好ましく、９８〜９９％またはそれより高い均一性が、特に哺乳動物がヒトである場合に製薬的な使用に最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均一性まで精製した後、選択されたポリペプチドを、診断もしくは治療（体外が含まれる）において、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの展開および実行において使用し得る（ＬｅｆｋｏｖｉｔｅおよびＰｅｒｎｉｓ、（１９７９および１９８１）免疫学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第ＩおよびＩＩ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）。

本発明のペプチドリガンドは、典型的には、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染症、および自己免疫障害（それだけには限定されないが、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症が含まれる）の予防、抑制または処置において使用が見つかる。

本出願では、用語「予防」は、疾患の誘導前に保護的組成物を投与することを含む。「抑制」とは、誘導現象の後であるが、疾患の臨床的所見の前に組成物を投与することをいう。「処置」とは、疾患の症状が顕性となった後に保護的組成物を投与することを含む。

疾患に対する保護、またはその処置におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用できる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、本発明により促進されて、ヒトおよび動物標的と交差反応し得るポリペプチドリガンドの開発を可能にし、動物モデルの使用を可能にする。

感受性マウスにおいて全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を試験する方法は当分野で知られている（Ｋｎｉｇｈｔら（１９７８）Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４７：１６５３、Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎら（１９７８）Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ：Ｍｅｄ．、２９９：５１５）。重症筋無力症（ＭＧ）は、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおいて、別の種からの可溶性ＡｃｈＲ タンパク質を用いて疾患を誘導することによって試験する（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｎｚｎ７ｕｎｏｌ．、４２：２３３）。関節炎は、マウスの感受性株においてＩＩ型コラーゲンを注射することによって誘導する（Ｓｔｕａｒｔら（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４２：２３３）。感受性ラットにおいてマイコバクテリア熱ショックタンパク質を注射することによってアジュバント関節炎を誘導するモデルが記載されている（Ｖａｎ Ｅｄｅｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、３３１：１７１）。甲状腺炎は、マウスにおいて記載のようにサイログロブリンを投与することによって誘導する（Ｍａｒｏｎら（１９８０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５２：１１１５）。インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、Ｋａｎａｓａｗａら（１９８４）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、２７：１１３によって記載されているものなどの特定のマウス株において自然に発生するか、または誘導することができる。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳのモデルとして役割を果たす。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質を投与することによって脱髄性疾患が誘導される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９８６）免疫病理学の教科書（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、Ｍｉｓｃｈｅｒら編、ＧｒｕｎｅおよびＳｔｒａｔｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ページ１７９〜２１３、ＭｃＦａｒｌｉｎら（１９７３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７９：４７８、ならびにＳａｔｏｈら（１９８７）Ｊ；Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８：１７９を参照）。

一般に、本発明のペプチドリガンドは、精製された形態で、薬理学的に適切な担体と共に利用される。典型的には、これらの担体には、生理食塩水および／または緩衝媒体を含めた、任意の水性またはアルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルが含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液に保つために必要な場合は、適切な生理的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどのシックナーから選択し得る。

静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、体液および栄養素補充液ならびに電解質補充液が含まれる。また、抗微生物、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る（Ｍａｃｋ（１９８２）レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１６版）。

本発明のペプチドリガンドは、別々に投与する組成物として、または他の薬剤と併せて使用し得る。これらには、シルコスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、および免疫毒素などの、抗体、抗体断片および様々な免疫治療薬が含まれる場合がある。医薬組成物には、様々な細胞毒性がある薬剤または他の薬剤と、本発明の選択された抗体、その受容体もしくは結合タンパク質、またはさらには様々な標的リガンドを用いて選択されたポリペプチドなどの様々な特異性を有する本発明による選択されたポリペプチドの組合せとを併せた「カクテル」が含まれる場合があり、これらを投与前にプールするかどうかに拘らない。

本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののうちの任意のものであり得る。それだけには限定されないが免疫療法を含めた治療には、本発明の選択された抗体、その受容体または結合タンパク質は、標準の技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路、また、適切には、カテーテルを用いた直接輸液によるものを含めた、任意の適切な様式であることができる。用量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、対抗適応症ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータに依存する。

本発明のペプチドリガンドは、貯蔵用に凍結乾燥し、使用前に適切な担体で再構成することができる。この技法は有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾燥および再構成の技法を用いることができる。当業者には、凍結乾燥および再構成は様々な度合の活性の損失をもたらす場合があり、補償するために使用レベルを上方調節する必要があり得ることが理解されよう。

本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的な処置のために投与することができる。特定の治療的の応用では、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、変調、死滅、または何らかの他の測定可能なパラメータを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。この用量を達成するために必要な量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般に体重１キログラムあたり０．００５〜５．０ｍｇの選択されたペプチドリガンドの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用される。予防的な応用では、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、同様または僅かに低い用量で投与してもよい。

本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去を支援するために、予防的および治療的な設定で利用し得る。さらに、本明細書中に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーは、不均一な細胞のコレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇または他の様式で有効に除去するために、体外またはｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に使用し得る。哺乳動物からの血液を体外で選択されたペプチドリガンドと合わせ、これにより所望しない細胞を死滅させるまたは他の様式で血液から除去して、標準の技法に従って哺乳動物に戻し得る。

（Ｄ）ポリペプチドの変異
所望の多様性は通常、１個または複数個の位置における選択された分子の変動により生じる。変化する位置は、ライブラリが、ループ配列における個々の位置毎に構築されるように選択される。例えば、このような位置が、活性を失うことなく変異に利用できないことが明らかになる場合、適宜、選択手順から１個または複数個の位置を省略することができる。

次に、常在アミノ酸が、天然または合成のいずれかのアミノ酸またはその類似体により置き換えられ、非常に大多数の変異体を産生するランダム化により、あるいは常在アミノ酸を定義されたサブセットのアミノ酸の１個または複数個と置き換え、より限定的な数の変異体を産生することにより、変種を達成することができる。

かかる多様性を導入するための様々な方法が報告されている。選択された位置に変異導入するための方法も、本技術分野でよく知られており、ＰＣＲを使用した、あるいは使用しない、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドの使用を包含する。例えば、抗原結合ループへの変異を標的化することにより、数種の合成抗体ライブラリが作製された。本発明の文脈において、同一の技法を用いることができる。例えば、ヒト破傷風トキソイド結合ＦａｂのＨ３領域がランダム化されて、様々な範囲の新しい結合特異性を生じた（Ｂａｒｂａｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７）。ランダムまたはセミランダム（semi-random）Ｈ３およびＬ３領域が、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントに付属されて、変異導入されたフレームワーク領域を有する大型のライブラリを生じた（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ−＆Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｒ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｂａｒｂａｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７；Ｎｉｓｓｉｍら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ、１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ、１３：３２４５；Ｄｅ Ｋｒｕｉｆら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４８：９７）。かかる多様化は、他の抗原結合ループの一部または全部を包含するよう伸長された（Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、２：１００；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９９５）ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：４７５；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、国際公開第９７／０８３２０号パンフレット、上記参照）。

しかし、本発明において用いられるポリペプチドは、抗体よりもさらに小さいため、好ましい方法は、変異体ポリペプチドをｄｅ ｎｏｖｏ合成するものである。構造化ポリペプチドの突然変異誘発は、ライブラリ構築に関連して上述されている。

次の実施例を参照することにより、次に、本発明をさらに説明する。

材料と方法
ファージライブラリのクローニング
Ｈｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５（７）、５０２〜７）に従ってファージライブラリを作製した。Ｈｅｉｎｉｓらにおいて、配列Ｘａａ−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_３−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_３−、リンカーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙならびに２個のジスルフィドフリードメインＤ１およびＤ２を有するセミランダムペプチドをコードする遺伝子（Ｋａｔｈｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００５、３５４（３）、６６６〜７８）を、正確な配向性でファージベクターｆｄ０Ｄ１２にクローニングして、「ライブラリ３×３」を得た。ペプチドレパートリーおよび２種の遺伝子３ドメインをコードする遺伝子を、２回の連続的ＰＣＲ反応において段階的に作製した。最初に、Ｄ１およびＤ２の遺伝子を、ベクターｆｄｇ３ｐ０ｓｓ２１（Ｋａｔｈｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００５、３５４（３）、６６６〜７８）を鋳型として用いて２種のプライマーｐｒｅｐｃｒ（５’−ＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＡＧ−３’）およびｓｆｉ２ｆｏ（５’−ＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧ−３’；制限部位を下線で示す）によりＰＣＲ増幅した。第二に、プライマーｓｆｉｃｘ３ｂａ：５’−ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＴＮＮＫＧＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’（制限部位を下線で示す）およびｓｆｉ２ｆｏを用いたＰＣＲ反応において、ランダムペプチドをコードするＤＮＡを加えた。５５および１１μｇのＳｆｉＩ消化されたｆｄ０Ｄ１２プラスミドおよびＰＣＲ産物のライゲーションは、１０個の２０×２０ｃｍクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）２ＹＴプレートに５．６×１０^８個のコロニーを生じた。２ＹＴ培地のプレートからコロニーを掻き取り、１５％グリセロールを補充し、−８０℃で貯蔵した。本明細書に記載されているライブラリの構築は、例えば３×３ライブラリのためにセミランダムペプチドＰｒｏ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_３−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_３−Ｃｙｓを作製するための同一技法を用い、従って、ｓｆｉｃｘ３ｂａプライマー配列を５’−ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’に置き換えた。同一方法論に従って他のループ長を有するライブラリを作製した。

ファージ選択
ファージライブラリのグリセロールストックを、５００ｍｌの２ＹＴ／クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）培養においてＯＤ_６００＝０．１となるよう希釈し、ファージを３０℃で一晩（１５〜１６時間）産生させた。ファージを精製し、Ｈｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５（７）、５０２〜７に記載されている通りに化学修飾した。ビオチン化ｈＰＫ（３μｇ）（ＩＨＰＫＡ、ヒト血漿由来、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国ミシガン州ノバイ）を、５０μｌの予め洗浄した磁気ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｍ−２８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、英国ペーズリー）と共に１０分間ＲＴでインキュベートした。ビーズを３回洗浄し、その後、１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．５ｍｌの洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２）により回転しつつ３０分間ＲＴでブロッキングした。３％ＢＳＡおよび０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１ｍｌの洗浄バッファーを添加することにより、化学修飾したファージ（通常、２ｍｌの洗浄バッファーに溶解した１０^１０〜１０^１１ｔ．ｕ．）を同時にブロッキングした。次に、ブロッキングしたビーズを、ブロッキングした化学修飾ファージと混合し、３０分間回転ホイールにおいてＲＴでインキュベートした。ビーズを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する洗浄バッファーで８回洗浄し、洗浄バッファーで２回洗浄し、その後、１００μｌの５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．２と共に５分間インキュベーションした。溶出されたファージを、中和のために５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８に移し、ＯＤ_６００＝０．４のＴＧ１細胞３０ｍｌと共に９０分間３７℃でインキュベートし、大型の２ＹＴ／クロラムフェニコールプレート上に細胞を播種した。同一手順を用いて１または２回の追加的なラウンドのパニングを行った。２回目の選択ラウンドにおいて、ニュートラアビジンでコーティングした磁気ビーズを用いて、ストレプトアビジン特異的ペプチドの濃縮を防いだ。サプライヤーの説明書に従って０．８ｍｇのニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、米国イリノイ州ロックフォード）を０．５ｍｌのトシル活性化磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｍ−２８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、英国ペーズリー）と反応させることにより、ニュートラアビジンビーズを調製した。

ヒト、サルおよびラットＰＫのクローニングおよび発現
ｐｒｏＴＥＶ開裂部位を介してＮ末端において触媒ドメインと連結したプロペプチドを有する不活性前駆体として、ヒト、サルおよびラットＰＫの触媒ドメインを哺乳類細胞において発現させた。発現ベクターをクローニングし、次の通りにタンパク質を発現させ、活性化し、精製した。ＰＫシグナル配列、ポリヒスチジンタグ、ｐｒｏＴＥＶ開裂部位、ＰＫの成熟触媒ドメインおよび終止コドンをコードする合成遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）から購入した（補足材料）。ヒト、サル（アカゲザル（Macaca mulatta））およびラットＰＫの合成遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ペアＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ラトビア、ヴィルニウス）ならびにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて、この遺伝子をｐＥＸＰＲ−ＩＢＡ４２哺乳類発現ベクター（ＩＢＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ドイツ、ゲッティンゲン）に移した。ライゲーションしたプラスミドをＸＬ−１ ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国サンタ・クララ）に形質転換し、アンピシリン（１０μｇ／ｍｌ）を含有する２ＹＴ寒天プレート上に蒔いた。３種の発現ベクター（ｍＰＫ、ｒＰＫおよびｈＰＫと命名）から得られたＤＮＡを作製し、ＤＮＡ配列決定（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、韓国ソウル）により正確な配列を確認した。

次の通り、哺乳類細胞において３種のオルソロガス血漿カリクレインを発現させた。５０ｍｌの懸濁液に順応したＨＥＫ−２９３細胞を、４ｍＭグルタミンおよびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（３．７５ｍＭ）の存在下の無血清ＥｘＣｅｌｌ ２９３培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ミズーリ州セントルイス）において、ＩＳＦ−４−Ｗインキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ ＡＧ、スイス、バースフェルデン（Birsfelden））内の軌道回転により１８０ｒｐｍで振盪した１００ｍｌフラスコにおいて３７℃、５％ＣＯ_２存在下で増殖させた。高い細胞密度（２０×１０^６細胞／ｍｌ）の胚性腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞（Ｂａｃｋｌｉｗａｌら／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００８、９９（３）、７２１〜７）に、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ、エッペンハイム（Eppenheim））を用いて３種のプラスミド（３００μｇ／ｍｌ）を遺伝子導入した。７日間の生産段階の終わりに、２’５００ｒｐｍ、１５分間４℃の遠心分離により細胞を収集した。０．４５μｍのＰＥＳ膜（Ｆｉｌｔｅｒ−ｔｏｐ ２５０ｍｌ低タンパク質結合ＴＰＰ）を通した濾過により、いかなる追加的な細胞デブリも培地から除去した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂、洗浄バッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７，４）および溶出バッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７，４、５００ｍＭイミダゾール）を用いたＮｉアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリヒスチジンのタグ付きタンパク質を精製した。（５０ユニット）ｐｒｏＴＥＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）によりタンパク質を部分的に活性化させ、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過（ＰＤ１０カラム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０，５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）によりさらに精製した。

結合活性が改善されたポリペプチドの開発
個々の位置のランダム化
ライブラリ構築：カリクレイン結合二環式ペプチドにおけるアミノ酸をマッピングするため、小型のライブラリのセットを構築した。５残基のループ２個で構成されるバイシクルのため、ペプチド配列における特定のコドンにランダム化を有する１０種の別々のライブラリを作製した。部位特異的突然変異誘発によりファージゲノムＤＮＡに変異導入するため、ライブラリ毎にオリゴヌクレオチドを設計した。突然変異誘発は、対象とするコドンのランダム化（ＮＮＳへと変化）および鋳型ゲノム配列からのユニークなＡｐａＬ１制限部位の除去を組み入れた。ＱＩＡｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて突然変異誘発産物を精製し、超純水へと溶出した。各ライブラリを用いて、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ機械（Ｅｃ１プログラム）および１ｍｍ ＢｉｏＲａｄキュベットを用いたエレクトロポレーションにより、ＴＧ１大腸菌（E coli）を別々に形質転換した。１ｍｌのＳＯＣ培地において３７℃で１時間回復させた後、ライブラリ形質転換体のみを選択的に増殖させるための抗生物質を含有する２５ｍｌの２ＴＹブロスにおいて、ライブラリ形質転換体を一晩増殖させた。遠心分離により細菌を収集し、ＱＩＡｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉキットを用いて大腸菌からライブラリファージＤＮＡを精製し、蒸留水に溶出させた。精製されたＤＮＡを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓバッファー４においてＡｐａＬ１で２時間消化して、親材料を除去した。消化後、ＱＩＡｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（上述）を用いてＤＮＡを再精製し、ＴＧ１の形質転換に用いた（エレクトロポレーション；上に記載）。ＳＯＣにおいて１時間回復させた後、選択的抗生物質を含有するＬＢ寒天プレート上に形質転換体を蒔き、一晩３７Ｃでコロニーを形成するよう増殖させた。

個々のクローンの結合アッセイ：ライブラリ形質転換体コロニーをランダムに採取し、選択的抗生物質を含有する２ＴＹブロスにおいて個々の培養物として増殖させた。採取されたコロニーを、ＱＩＡｇｅｎ ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６ ＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡ配列決定して、各クローンに存在するアミノ酸置換を明らかにした。単離されたら、ユニークな置換それぞれのクローンを、ヒト血漿カリクレイン結合に関して次の通りにアッセイした。培養物からファージを含有する上清を収集し、Ｈｅｉｎｉｓらの方法（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５巻、５０２〜５０７頁（２００９））に基づき、トリスブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢ）によりファージを環化した。このプロセスにより精製されたファージを、均質なプレートに基づく結合アッセイを用いてビオチン化ヒト血漿カリクレインとの結合に関してアッセイした。アッセイ読み取り値は、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳプレートリーダーにおいて測定した。３回複製したアッセイ試料の定量的結合データを平均し（平均値）、シグナル：バックグラウンド（バックグラウンドは、標的材料なしでアッセイした試料である）として表した。シグナル：バックグラウンドは、対応する親試料の％として表した。エラーバーは、平均値の標準偏差を表示する。示されているアッセイは、少なくとも２回の独立的実験の代表である。アッセイデータは、ペプチド配列と相関した。灰色でマークした置換は検査しなかった（クローンは、ランダムライブラリサンプリングから単離されなかった）。アッセイベースラインの図示と並行して、非結合（任意）バイシクルの試料をアッセイした。

ペプチドドメインのランダム化
ライブラリ構築：上述の「ファージライブラリのクローニング」に記載されているＨｅｉｎｉｓらの方法に従って、小型のファージライブラリを作製した。バイシクルコード部分が、ＮＮＳにランダム化された４〜６個のコドンのみを有する親５×５バイシクル（５×５：２個の５残基ループ）ＤＮＡ配列に基づくように、ｓｆｉｃｘ３ｂａプライマーを修飾した。ランダム化されたコドンは、対象とするペプチドドメイン／モチーフをコードするコドンであった。

個々のクローンの結合のアッセイ：ライブラリ形質転換体コロニーまたは選択アウトプットコロニーを採取し、選択的抗生物質を含有する２ＴＹブロスにおいて個々の培養物として増殖させた。採取されたコロニーを、ＱＩＡｇｅｎ ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６ ＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡ配列決定して、各クローンに存在するアミノ酸置換を明らかにし、また、次の通りヒト血漿カリクレイン結合に関してアッセイした。培養物からファージを含有する上清を収集し、Ｈｅｉｎｉｓらの方法（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５巻、５０２〜５０７頁（２００９））に基づきトリスブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢ）によりファージを環化させた。このプロセスにより精製されたファージを、均質なプレートに基づく結合アッセイを用いてビオチン化ヒト血漿カリクレインとの結合に関してアッセイした。アッセイ読み取り値は、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳプレートリーダーにおいて測定した。２回複製したアッセイ試料の定量的結合データを平均し（平均値）、シグナル：バックグラウンドとして表した。示されているアッセイデータは、少なくとも２回の独立的な実験の代表である。アッセイデータは、ペプチド配列と相関した。

二環式ペプチドの合成および精製
表１および表２にペプチド配列を示す。ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓにより製造されたＳｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成機を用いたＦｍｏｃ化学に基づいた。次の側鎖保護基と共に標準Ｆｍｏｃ−アミノ酸を用いた（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）：Ａｒｇ（Ｐｂｆ）；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）；Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）；Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）；ＧＩｕ（ＯｔＢｕ）；Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）；Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ｓｅｒ（ｔＢｕ）；Ｔｈｒ（ｔＢｕ）；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（Ｓｉｇｍａ）。カップリング試薬は、ＨＣＴＵ（Ｐｅｐｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であり、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ）を塩基として用い、ＤＭＦにおける２０％ピペリジン（ＡＧＴＣ）により脱保護を達成した。０．３７ｍモル／ｇｒ Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂（ＡＧＴＣ）を用いて１００ｕモルスケールで合成を行い、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を４倍過剰で利用し、塩基は、アミノ酸に対して４倍過剰であった。アミノ酸をＤＭＦにおいて０．２Ｍとなるよう溶解し、ＨＣＴＵを０．４ＭとなるようＤＭＦに溶解し、ＤＩＰＥＡを１．６ＭとなるようＮ−メチルピロリドン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）に溶解した。カップリング時間は一般に、３０分間であり、脱保護時間は、２×２．５分間であった。Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチルグリシン（Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｍｅｒｃｋ）は１時間カップリングし、続く残基の脱保護およびカップリング時間は、それぞれ２０分間および１時間であった。合成後、樹脂をジクロロメタンで洗浄し、乾燥させた。１０ｍＬの９５：２．５：２．５：２．５ｖ／ｖ／ｖ／ｗのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／ジチオスレイトールを３時間用いて、支持体からの側鎖保護基の開裂を引き起こした。開裂後に、使用済み樹脂を濾過により除去し、−８０セ氏温度で冷却しておいた３５ｍＬのジエチルエーテルに濾液を添加した。ペプチドペレットを遠心分離し、エーテル系（etheric）上清を廃棄し、ペプチドペレットを冷エーテルでさらに２回洗浄した。次に、ペプチドを５〜１０ｍＬのアセトニトリル−水に再溶解し、凍結乾燥させた。質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）による粗生成物の純度解析のため、少量の試料を取り分けた。凍結乾燥後に、ペプチド粉末を取り出して、０．５ｍＬの１Ｍジチオスレイトール（dithiothreitrol）を補充したＨ２Ｏにおける１０ｍＬの６Ｍグアニジン塩酸塩に入れ、Ｃ８ Ｌｕｎａ調製用ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に充填した。溶媒（Ｈ２Ｏ、アセトニトリル）を０．１％ヘプタフルオロ酪酸で酸性化した。３０〜７０％アセトニトリルに及ぶ勾配、１５分間、流速１５／２０ｍＬ／分、Ｇｉｌｓｏｎ調製用ＨＰＬＣシステム使用。純粋な直鎖状ペプチド材料を含有する画分（ＭＡＬＤＩにより同定）を組み合わせ、トリスブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）により修飾した。このため、最大ほぼ３５ｍＬのＨ２Ｏで直鎖状ペプチドを希釈し、アセトニトリルにおけるほぼ５００ｕＬの１００ｍＭ ＴＢＭＢを添加し、Ｈ２Ｏにおける５ｍＬの１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）により反応を開始した。ほぼ３０〜６０分間ＲＴで反応を進行させ、反応が完了したら（ＭＡＬＤＩにより判断）凍結乾燥した。凍結乾燥後、Ｌｕｎａ Ｃ８をＧｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に置き換え、酸を０．１％トリフルオロ酢酸に変える以外は上述の通りに、修飾されたペプチドを精製した。正確なＴＭＢ修飾材料を含有する純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、貯蔵のため−２０セ氏温度に維持した。

非天然のアミノ酸は、表７に表記されている供給源から取得した。

巨大なまたは妨害されるアミノ酸（ＮＭｅ−Ｓｅｒ、ＮＭｅ−Ｔｒｐ、ＮｏｒＨａｒ、４ＰｈｅｎｙｌＰｒｏ、Ａｇｂ、Ａｇｐ、ＮＭｅ−Ａｒｇ、Ｐｅｎ、Ｔｉｃ、Ａｉｂ、Ｈｙｐ、ＮＭｅ−Ａｌａ、ＮＭｅ−Ｃｙｓ、４，４−ＢＰＡｌ、３，３−ＤＰＡ、Ｄｐｇ、１ＮＡｌ、２ＮＡｌ、Ａｚｅ、４ＢｅｎｚｙｌＰｒｏ、Ｉｎｄ）は通常、１時間（２０分間の脱保護）カップリングされ、続く残基は６時間であった（２０分間の脱保護）。ＨＣＴＵは、前述同様にカップリング試薬として用いた。スケールは通常、５０ｕモルであった。

酵素アッセイ
黒一色の（solid black）９６ウェルプレートにおいて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（全てＳｉｇｍａ ＵＫ）ｐＨ７．４において２５℃で機能的酵素アッセイを行った。要約すると、２６．５ｐＭヒト血漿カリクレイン（Ｓｔｒａｔｅｃｈ、英国から購入）または５００ｐＭラット血漿カリクレイン（研究室内で発現および精製）を、増加濃度の被験ペプチドの非存在または存在下で１５分間インキュベートし、その後、最終アッセイ濃度が４％ＤＭＳＯにおける１００μＭとなるよう、蛍光発生基質Ｚ−ＰｈｅＡｒｇ−ＡＭＣ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ英国）を添加した。Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて、励起３６０ｎｍ、発光４６０ｎｍでＡＭＣの遊離を測定した。通常５〜４５分間である反応の線形位相の速度を、ＭＡＲＳデータ解析ソフトウェア（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ）において計算した。次に、この速度を用いて、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）においてＩＣ５０およびＫｉを計算した。４種のパラメータ阻害非線形回帰方程式を用いて、ＩＣ５０を計算した。１部位適合Ｋｉ方程式を用いてＫｉを計算し、Ｋｉを１５０μＭの基質のＫｍに制約した。全Ｋｉ／ＩＣ５０値は、少なくとも２回の独立的な実験の平均値であり、１ｎＭより低いＫｉ値を有するペプチドに関しては少なくとも３回である。

ペプチドを粉末形態でＴＦＡ−塩として溶解し、ストック溶液は通常、水において調製した。２８０ｎｍにおける吸収測定の前に、全溶液を遠心分離し、濾過（２０μｍシリンジフィルター）した。ペプチドのＴｒｐ／Ｔｙｒ含量およびＴＭＢの該含量（ＴＭＢコアは、ペプチドに含有される場合は、ほぼ３００Ｍ^−１ｃｍ^−１のεを有する）に基づき消衰係数を計算した。疑われる発色団特性を有する非天然のアミノ酸を含有するペプチド（即ち、ＮｏｒＨａｒ、４ＰｈｅｎｙｌＰｒｏ、３Ｐａｌ、４Ｐａｌ、Ｔｉｃ、４ＧｕａｎＰｈｅ、４，４−ＢＰＡｌ、３，３−ＤＰＡ、１ＮＡｌ、２ＮＡｌ、４ＢｅｎｚｙｌＰｒｏ、Ｉｎｄ）のため、粉末を秤量し、ペプチドを規定の量の水に溶解することにより濃度を決定した。１ｎＭ以下のカリクレインに対するＫｉを有するペプチドのため、これらを独立的に２回調製した。

血漿安定性プロファイリング
血漿におけるバイシクル（分子足場にコンジュゲートしたペプチド）の安定性を評価するため、３通りの方法を用いた。

方法１：
親ペプチド質量が観察不能となる時点まで親質量の質量分析による検出（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた、迅速な血漿安定性プロファイリングアッセイを開発した。特に、１×ＰＢＳ（１０×ＰＢＳストック、Ｓｉｇｍａに由来）を補充した、３５％ラットまたはヒト血漿（Ｓｅｒａ ｌａｂｓ、抗凝血薬としてクエン酸塩を使用）の存在下で３７セ氏温度にて２００ｕＭのペプチドをインキュベートした。様々な時点において（即ち、ｔ＝０、３、２４時間、その後は毎日、最大１０日間）、アセトニトリル：Ｈ２Ｏの１：１混合物における１８ｕＬの３０ｍＭ重炭酸アンモニウムに、２ｕＬの試料を添加した。解析時まで−８０セ氏温度で試料を凍結した。ペプチドの近似検出ウィンドウを決定する質量分析による解析のため、所定の時点のアセトニトリル：Ｈ_２Ｏで希釈した試料をＭＡＬＤＩプレート上に直接的にスポットした（０．７ｕＬ）。マトリックス（アルファ−シアノ桂皮酸、Ｓｉｇｍａ、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する１：１アセトニトリル：水における飽和溶液として調製）を試料の上に重層した（１ｕＬ）。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦにおける同様のレーザー強度設定で、時間は、親ペプチドが検出不能となるまでに決定することができる。この方法は、血漿安定性における相対的変化の検出に役立つ定性的アッセイであることに留意されたい。

方法２：
安定性データをより迅速に得るため、９５％血漿におけるペプチドも評価した。そこでは、ＰＢＳを省略し、１ｍＭペプチドストック（ＤＭＳＯに溶解）を血漿において直接的に希釈し（即ち、４７．５ｕＬの血漿における２．５ｕＬストック）、最終濃度５０ｕＭを得た。適切な時点で５ｕＬの試料を採取し、−８０セ氏温度で凍結した。解析のため、試料を解凍し、１５ｕＬの１：１アセトニトリル：メタノールと混合し、１３ｋで５分間遠心分離した。５ｕＬのペプチドを含有する上清を吸引し、アセトニトリル：Ｈ_２Ｏの１：１混合物における３０ｍＭ重炭酸アンモニウムと混合した。次に、このうち１ｕＬをＭＡＬＤＩプレート上にスポットし、上に記載されている通りに解析した。上述の通り、この方法は、血漿安定性における相対的変化の検出に役立つ定性的アッセイであることに留意されたい。

方法３：
血漿安定性を定量的に得るため、ペプチドストック溶液（１ｍＭ、ＤＭＳＯに溶解）をＢｉｏｆｏｃｕｓ、英国に輸送し、そこで解析を行った。ペプチドを１００ｕＭとなるよう水で希釈し、血漿において１：２０希釈し（５ｕＭ最終濃度、９５％の血漿による）、適宜サンプリングし、上述の通り沈殿させ、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ＴＱ−ＭＳを用いて定量化した。

［実施例１ 結合活性に好ましい残基の同定］
表４に示す５×５ペプチドの例から、結合活性を有するペプチド間に保存されたアミノ酸を同定することが可能である。いずれの残基が結合活性に好ましいか決定するため、ペプチドの同定されたファミリーの２種からの代表をさらに試験した。これらは、バイシクルの第１のループにおいてＣＸＷＰＡＲＣモチーフを含むペプチド０６−３４と、バイシクルの両方のループにわたりＣＧＧｘｘＮＣＲモチーフを含むペプチド０６−５６であった。ペプチド配列毎に１０種のファージライブラリのセットを作製し、このセットにおいて、ループ残基の９個が一定に維持され、ライブラリにおいて該位置に任意のアミノ酸が発現できるよう、他の残基がランダム化された（上述の方法における「個々の位置のランダム化−ライブラリ構築」を参照）。ライブラリ毎に、２０種のランダムに選択されたファージクローンのセットを、ファージ結合アッセイにおいてヒトカリクレインへの結合に関してスクリーニングして、標的結合に決定的な残基を同定した（上述の方法における「個々の位置のランダム化−個々のクローンの結合のアッセイ」を参照）。本実験から得られたデータを図４〜図６に示す。

ペプチド０６−３４（図４）に関し、バイシクルのＡｒｇ１を種々の異なるアミノ酸に置き換えることができ、ヒト血漿カリクレインへの結合が保持または増強されることが明らかである。それに反して、大部分のアミノ酸による残基２、３、４、５（Ｔｒｐ２、Ｐｒｏ３、Ａｌａ４、Ａｒｇ５）の置き換えは、高親和性結合剤のストリンジェントなカットオフにより設定されたアッセイにおいて観察されるシグナルを大幅に低下させた。Ｖａｌ６は、多くの異なるアミノ酸により置き換えることができ、結合活性は、保持または増強される。第２のループにおける他の残基の置き換えは、Ｌｅｕ１０のみが、活性を保持しつつ種々の異なるアミノ酸により置き換えることができることを示した。位置７、８および９は、置換のために限定的な能力を有し、結合を増強した置換は同定されなかった。

ペプチド０６−５６（図５および図６）に関し、位置６、８および９におけるアルギニン、トリプトファンおよびスレオニンと同様に、位置１および２におけるグリシンが、血漿カリクレインへの結合に大いに好ましい残基であることが明らかである。位置４におけるグルタミンおよび位置１０におけるスレオニンは、優れた結合活性を保持しつつ種々の残基により置き換えることができる。３個の残る残基−位置１におけるプロリン、位置５におけるアスパラギンおよび位置７におけるスレオニンは、置換のために限定的な能力を有する。

アミノ酸置き換えの解析
先行する解析から、０６−３４に関し、位置１および位置６を種々のアミノ酸により置き換えることができ、親ペプチド以上の結合活性を依然として保持することが明らかである。これらの観察が、単離された合成ペプチドに合致するか評価するため、Ａｒｇ１がセリンにより置き換えられ、Ｖａｌ６がスレオニン、メチオニンまたはロイシンのいずれかにより置換された図４における知見に従って、ペプチドのセットを設計した。これらの置換の様々な組合せを用いるペプチドも合成した。これらの置換は、アッセイにおいてより強い結合シグナルを生じた（表５）。

変異体合成ペプチドは全て、０６−３４親ペプチドと比較して、酵素阻害アッセイにおいてヒト血漿カリクレインに対しおよそ同等のまたは増強された活性を有し、この種の解析を標的結合親和性の微調整に用いることができることを示し、非常に高い効力のリードペプチド候補を同定するための経路を示唆した。

ペプチドは、単離された酵素アッセイにおけるラット血漿カリクレインに対しても検査した。Ａｒｇ１からＳｅｒ１への置換は、ラットカリクレインに対する活性において微々たる影響を有し、一方、Ｖａｌ６のスレオニン、メチオニンまたはロイシンへの置換は、ラット血漿カリクレインに対する効力が顕著に増加したペプチドを生じた。ヒトカリクレインに対する活性は、完全に保持された。よって、置換を受け入れられる位置を決定することにより、標的オルソログ交差反応性等、望ましい特性を有するペプチドを同定することができる。

親ペプチドには存在しない官能性または特性を導入する能力を有するような、非天然のアミノ酸によるこれら２個の位置の置き換えの可能性を実証するため、０６−３４−０３におけるＡｒｇ１およびＶａｌ６を、アラニンまたはＮ−メチルグリシン（サルコシン）のいずれかに、あるいは位置１におけるＮ−メチルセリンに置き換え、結合に関して評価した。著しいことに、表６に示す通り、Ｒ１Ａ／Ｖ６Ａ（０６−３４−０３ Ａｌａ１，６）ペプチドは、親と比較して完全な効力を保持したため、位置１／６は、共に側鎖の除去を受け入れられる。Ｎ−メチルグリシンによる残基１、６の置き換え（０６−３４−０３ ＮＭｅＧｌｙ１，６）は、効力の低下を引き起こしたが、しかし、結合親和性は、低いナノモル濃度範囲のままであった。位置１におけるＮ−メチルセリンの導入は、効力において１０分の１への減少を引き起こすが、結合は、ピコモル濃度範囲のままである。よって、プロテアーゼ安定性の計画的な増強、溶解性の増強、凝集可能性の低下およびオルソロガス官能基の導入を達成し得る、ペプチド主鎖構造または側鎖に変化を生じるバイシクルにおける特定の位置を同定することができる。

［実施例２ ＷＰＡＲドメインの詳細な解析］
ＷＰＡＲモチーフの代替物または改善を同定するため、実施例１から同定されたＷＰＡＲモチーフを、０６−３４−０３ペプチドの文脈において解析した。０６−３４−０３の位置１、６、７、８、９＆１０が固定され、位置２、３、４＆５がランダム化されたライブラリを構築した（上述の方法における「ペプチドドメインのランダム化−ライブラリ構築」を参照）。種々のストリンジェンシーで、ヒト血漿カリクレインに対する選択を行った（上述の方法における「ファージ選択」を参照）。全アウトプット配列を同定し、標的結合に関して解析した（上述の方法における「ペプチドドメインのランダム化−個々のクローンの結合のアッセイ」を参照）。表１７は、ユニークな配列それぞれ、選択アウトプットにおけるその相対的存在量（頻度）および標的結合強度に従ったランク数を収載する。

表１７は、他のカリクレイン結合配列が、選択から高度な存在量で回収されるが、ＷＰＡＲモチーフが、ヒト血漿カリクレインへの最も優れた結合を与えることを示す。これらの例として、ＷＰＳＲ、ＷＰＡＲ、ＷＳＡＲ、ＷＰＦＲ、ＷＰＹＲ、ＦＰＦＲ＆ＦＰＦＲが挙げられるがこれらに制限されない。位置２、３、４＆５における最も有効かつ豊富なモチーフは、^Ｗ／_ＦＰｘ^Ｋ／_Ｒと要約することができる。

表１８（Ａ）は、ＷＰＡＲ＆ＷＰＳＲが、よりストリンジェントな選択アウトプットにおいて最も豊富であり；ＦＰＦＲ＆ＦＰＹＲが、より低いストリンジェンシーの選択アウトプットにおいて豊富であったことを示す。これは、ＷＰＡＲ様配列が、ＦＰＦＲ様配列よりも強力な結合剤であることを示すであろう。標的結合アッセイにおける各モチーフ（０６−３４−０３文脈内の）の解析（表１８（Ｂ））は、０６−３４−０３配列の位置２、３、４＆５におけるＷＰＡＲが、カリクレイン結合に最適の配列であることを明らかにする。

［実施例３ ＷＰＡＲ外側の配列の最適化］
ＷＰＡＲモチーフおよびその変異体をペプチド０６−３４−０３の文脈内で試験してきた。図１は、ＷＰＡＲモチーフの外側のいくつかの位置が、他の残基に置換した場合にカリクレイン結合を維持し得ることを実証する。カリクレイン結合の非ＷＰＡＲ決定因子を試験するため、上述の方法における「ペプチドドメインのランダム化 − ライブラリ構築」に記載されている通りに、固定されたＷＰＡＲ配列およびランダム化された他のあらゆる位置（ＣｘＷＰＡＲＣｘｘｘｘｘＣ）を有するファージライブラリを作製した。

８０種のランダムなライブラリメンバーをライブラリプールから直接的に単離し（選択なし）、高および低ストリンジェンシーの両方でカリクレインへの結合に関してアッセイした（上述の方法における「ペプチドドメインのランダム化−個々のクローンの結合のアッセイ」を参照）。ＷＰＡＲ外側のランダム配列を含有するこれらのライブラリメンバーは、ヒト血漿カリクレインへの結合を殆どまたは全く示さず（データ図示せず）、ＷＰＡＲモチーフ単独の存在は、測定可能（measureable）なカリクレイン結合の保持に十分ではなく、バイシクル配列の残りも相互作用に寄与または影響する筈であることを示した。

カリクレイン結合の非ＷＰＡＲ決定因子を試験し、最適なＷＰＡＲ含有ペプチド配列を単離するため、このライブラリを用いてヒト血漿カリクレインに対する選択を行った。１５０種を超える選択アウトプット配列を単離し、ヒト血漿カリクレインへの結合に関してスクリーニングした（上述の方法に記載の通り）。カリクレイン結合の順に配列をランク付けし、表１９において上位５０配列を整列した。表１９は、位置１における残基が、カリクレイン結合に影響を与えないが、位置７においてヒスチジンに対する強力な一致が観察された（この結果は、上述の実施例１における知見を支持する）ことを示す。ペプチド０６−３４−０３（実施例１における実験に由来）は、最良の配列の一つである。第２のループの組成は、ＷＰＡＲモチーフと共に存在すると強力なカリクレイン結合を与える明らかな傾向を示す。

ヒト血漿カリクレインに対する最良のＷＰＡＲ含有結合剤は、次の傾向を有する：
Ｈ７、Ｄ９およびＬ１０は、ＷＰＡＲ含有カリクレイン結合配列において極めて保存されている。

第２のバイシクルループ（位置６〜１０）内の２種のモチーフが同定された：

モチーフ「ＴＨｘｘＬ」または「ｘＨｘＤＬ」からのその由来に従って、１２０種を超える同定されたヒト血漿カリクレイン結合剤（選択アウトプット配列）を２通りの異なる仕方で群分けした。全群に関して、アウトプット配列の平均カリクレイン結合アッセイシグナルを、所定の群のカリクレイン結合の測定値として記した（表２０）。

表２０に示すカリクレイン結合アッセイデータは、「ＴＨｘｘＬ」および「ｘＨｘＤＬ」モチーフが、ＷＰＡＲモチーフを有する二環式ペプチドにおいて、最良のカリクレイン結合をもたらすことを実証する。２種のモチーフの組合せ、「ＴＨｘＤＬ」は、ヒト血漿カリクレインに対し最高の結合を与え、０６−３４−０３ペプチドの「ＴＨＱＤＬ」第２のループ配列を包含する。

［実施例４ 血漿安定性の系統的解析］
カリクレイン阻害性バイシクルに関して、これは、血漿または他の関連する環境においてプロテアーゼによる低いクリアランスを有するような、妥当なプロテアーゼ安定性プロファイルを得ることに関係する。ラット血漿における親ペプチドの進行性の消失を観察した迅速な比較血漿安定性アッセイ（方法の節、方法１）において、Ｎ末端アラニン（選択の時点で存在し、本来、リード配列の合成ペプチドにおいて包含されていた）が、ラットおよびヒト血漿の両方により検査した全バイシクル配列にわたり迅速に除去されることが判明した。この分解は、ＮおよびＣ末端アラニンの両方を欠くリード候補を合成することにより回避された。アミノおよびカルボキシペプチダーゼの潜在的な認識ポイントを除去するため、現在リード候補のＣｙｓ１に存する自由なアミノ末端は、ペプチド合成の間、無水酢酸でキャッピングされ、Ｎ末端がアセチル化された分子をもたらす。同等の測定において、Ｃ末端システインは、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認識ポイントを除去するために、アミドとして合成される。よって、二環式リード候補は、次の一般的な（generic）配列を有する：
（式中、「Ａｃ」は、Ｎ末端アセチル化を指し、「−ＮＨ２」は、Ｃ末端アミド化を指し、「Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３」は、配列における第１、第２および第３のシステインを指し、「ＡＡ_１」から「ＡＡ_ｎ」は、アミノ酸の位置を指し（その性質「ＡＡ」は、上述の選択により定義される）、「（ＴＭＢ）」は、ペプチド配列が、ＴＢＭＢまたはその他の適した反応性足場により環化されたことを示す）。

ヒト（Ｋｉ＝０．１７ｎＭ）およびラットカリクレイン（ＩＣ５０＝１．７ｎＭ）の両方に対するＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の高い親和性のため、本出願人らは、リード開発のためにこのバイシクルを選んだ。上述と同じ迅速血漿安定性プロファイリングアッセイを用いると、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２は、約２日間の可観測性ウィンドウを有しており（方法の節、方法１）、これは、ほぼ２時間のラット血漿半減期に等しい（ＬＣ／ＭＳにより定量的に決定、後述を参照、表２３、方法３）。

Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２におけるタンパク質分解認識部位（複数可）を同定する試みにおいて、３５％ラット血漿におけるこのペプチドを経時的にサンプリングし（方法１）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いてペプチド断片の進行性の出現に関して各試料を解析した。Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の親質量は、１６８７Ｄａである。経時的に（図７）、質量１５４８．６（Ｍ１）、１１９４．５（Ｍ２）および１１０７．２（Ｍ３）の断片が出現する。Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２（Ａｃ−Ｃ_１Ｓ_１Ｗ_２Ｐ_３Ａ_４Ｒ_５Ｃ_２Ｌ_６Ｈ_７Ｑ_８Ｄ_９Ｌ_１０Ｃ_３−ＮＨ２）の配列から、Ｍ１のピークが、Ａｒｇ５を欠くＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２（−Ｒ５）に相当することを計算することができる。これは、最初のタンパク質分解性事象であり、続いて、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２における４アミノ酸セグメントＷＰＡＲの除去が行われ（Ｍ２、−ＷＰＡＲ）、最終的にＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の第１のループ全体が切り取られる（Ｍ３、−ＳＷＰＡＲ）と思われる（図８）。このデータから、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２のＡｒｇ５が、バイシクルの分解の原因となる主要なラット血漿プロテアーゼ認識部位であることが明らかである。

アラニン置換および第１のループのスクランブル
ラット血漿プロテアーゼの認識部位の構成においてＡｒｇ５を同定した後、より高い血漿タンパク質分解性安定性を有する候補を同定することを目標として、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２誘導体の化学合成作戦が為された。重要なことに、かかる修飾は、ヒトまたはラットカリクレインに対する効力に影響を与えるべきではない。Ｗ_２Ｐ_３をＡ_２Ａ_３またはＡ_２Ｑ_３に置き換え、バイシクルの第１のループの部分または全体をスクランブルすることにより、ＷＰＡＲ配列／ファルマコフォアの役割に関する初期調査（図９、図１０）を行った。下表８は、配列およびカリクレインに対するそれぞれの親和性を示す。

これらのデータから、Ｗ_２Ｐ_３の同時的除去が、カリクレインへの結合をほぼ１０００００分の１に劇的に低下させ、分子を有効に薬理学的に不活性な状態にすることが明らかである。アミノ酸の正確な配列の重要性は、４個のスクランブルされたペプチド（Ｓｃｒａｍ２〜４）により強調されるが、その理由は、これら全てカリクレインに対する親和性の実質的な低下を提示するためである（図１０）。奇妙なことに、全ペプチドは、殆ど同一のラット血漿安定性プロファイルを有し（１〜２日の間、方法１）、血漿プロテアーゼ認識が、アルギニンの存在に依存し（図７）、配列内におけるその位置には依存しないことを示す。

次に、Ｗ_２、Ｐ_３、Ａ_４、Ｒ_５およびＣ_２をこれらそれぞれのＤ−エナンチオマー対応物に置き換えた、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の５種の誘導体を作製した（表９）。

このデータから、Ａ_４、Ｒ_５およびＣ_２のＤ−アミノ酸置き換えが、血漿プロテアーゼに対するペプチド安定性を増加させることが明らかである。ラット血漿プロテアーゼによるＡｒｇ５切り取りは、ペプチド分解における最初の事象であると思われるため、ペプチド結合の初期加水分解は、Ａｒｇ５のＮおよび／またはＣ末端側において起こるであろう。Ａｒｇ５のいずれかの側のアミノ酸をそのＤ−エナンチオマーに置き換えると、立体障害により隣接ペプチド結合の加水分解を遮断するということは、もっともらしく思える。実際に、これは以前に観察された効果である（Ｔｕｇｙｉら（２００５）ＰＮＡＳ、１０２（２）、４１３〜４１８）。

カリクレインに対する親和性におけるＤ−アミノ酸置換の有害な効果は、あらゆる事例において際立つ。効力の減少は、３００（Ｄ−Ａｒｇ５）から４５０００（Ｄ−Ｔｒｐ２）分の１に及ぶ。このことは、カリクレインバイシクル結合ポケットへのこれら側鎖の正確な三次元提示の重要性を強調する。Ｄ−Ａｌａ４の効果も等しく際立つ。この場合、単一メチル基（Ａｌａ側鎖における）の配向性の変化は、親和性を７０００分の１に低下させる。

Ｎ−メチル化
次に、第１のループにおける残基をそのＮ−メチル対応物に系統的に置き換えた。Ｎ−メチル化は、ペプチド結合自体の明快な保護として作用する。しかし、アミド水素の非存在のため、立体的容積（bulk）（メチル基）の付加および好ましいねじれ角の変化が効力を減少させることが予想される。

表１０は、データをまとめる。

ループ１におけるアミノ酸のＮ−メチル化は、効力における全体に強烈さの低い有害効果を提示する。特に、Ａｒｇ５のＮ−メチル化は、１桁のナノモル濃度結合剤を依然として生じ（野生型ペプチドと比較して親和性における２０分の１の低下）、そのラット血漿安定性はアッセイ時間を超え（ＭＳにおけるペプチドの断片化は観察できなかった）、これを魅力的な改善されたリード候補とした。Ｄ−アミノ酸置換と同様に、Ａｒｇ５に隣接する残基のＮ−メチル化は、おそらくは、Ａｒｇ５のＮおよび／またはＣ末端のペプチド結合のプロテアーゼ触媒性加水分解に影響する立体的干渉により、ペプチドに増強された安定性を与える。注目すべきことに、Ｓｅｒ１は、効力を有意に減少することなくＮ−メチル化することができ、この位置におけるペプチド主鎖の完全性が、結合に必須ではないことを示す。

アルギニン置換
ラット血漿プロテアーゼによる認識におけるＡｒｇ５の重要性を仮定し、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２リードにおけるアルギニン類似体のセットを検査した。化学構造を図１１に示し、効力対安定性データを表１１に示す。

際立つことに、全アルギニン類似体が、アッセイウィンドウ時間を超えてペプチドの安定性を増加させ、血漿プロテアーゼ認識におけるＡｒｇ５の完全性の重要性を確認した。側鎖（Ａｇｂ、Ａｇｐ）の長さの増加（ＨｏｍｏＡｒｇ）または減少は共に、親和性を減少させるが、ＨｏｍｏＡｒｇ類似体は、増強された安定性を有する非常に優れた結合剤（Ｋｉ＝２．１ｎＭ）を依然として生じる。同一側鎖（β−ｈｏｍｏＡｒｇ５）を保持しつつ、Ａｒｇ５における１個のメチレン基（いわゆるベータ−アミノ酸）によりアミノ酸主鎖を延長することもまた、増強された安定性を有する結合剤を生じるが、これは、親和性のより有意な低下（Ｋｉ＝８．２ｎＭ）を代償とする。フェニル環によるＡｒｇ側鎖の脂肪族部分の置き換えは、共鳴安定化された、より巨大（bulkier）で硬直化（rigidified）したグアニジル含有側鎖（４ＧｕａｎＰｈｅ）を生じる。検査した全Ａｒｇ類似体のうち、４ＧｕａｎＰｈｅは、増強された血漿安定性で、最大の親和性（野生型と比較して２分の１の低下）を有した。興味深いことに、グアニジルフェニル基は、公知の小分子カリクレイン阻害剤ベンズアミジンに構造的に近い（Ｓｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒら（１９９４）、Ｎｏｖｅｌ ｐｌａｓｍａ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ ｔｙｐｅ．Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ．２７（８）：１９２９〜３４；Ｔａｎｇら（２００５）、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４１０７７〜８９）。さらに、誘導体化されたフェニルグアニジンは、別のセリンプロテアーゼ、ｕＰＡの選択的阻害剤として用いられている（Ｓｐｅｒｌら、（４−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｒｉｖｅｓ ａｓ ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｉｃ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９７（１０）：５１１３〜８．）。よって、４ＧｕａｎＰｈｅ５を含有するＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２は、その選択性が周囲の二環式ペプチドにより与えられた、小分子阻害剤であると考えられる。これは、低い選択性の公知の小分子阻害剤が、正確な位置においてバイシクルに「移植（graft）」され、より優れた効力および選択性の分子をもたらす、他のバイシクルに基づく阻害剤の原理を含むことができる。

メチル化（ＳＤＭＡ、ＮＤＭＡ）、正電荷の除去（Ｃｉｔ、グアニジル基が、等比体積であるが無電荷の尿素基により置き換えられている）またはＡｒｇの全体的な欠失（ΔＡｒｇ）のいずれかによる、Ａｒｇグアニジル基自体の修飾は、カリクレイン結合効力において強力に有害な効果を有する。よって、グアニジル基の完全性および存在は重大である一方、グアニジル基またはＡｒｇ５における主鎖への側鎖連結の性質は重大ではない。注目すべきことに、Ａｒｇ５は、リジンに置き換えることもできるが、この場合も同様に、親和性が低下する（ＷＰＡＫペプチドを参照）。

要約すると、これまでのデータは、アルギニンの置き換えとしてＨｏｍｏＡｒｇ、ＮＭｅＡｒｇまたは４ＧｕａｎＰｈｅのいずれかを用いたＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２が、高い親和性を有する血漿安定性の増強された候補を構成することができることを示す。

［実施例５ 非天然修飾、および血漿安定性増強修飾との組合せによるリード候補の効力の改善］
所定の二環式候補の効力の改善は、数種の機序により都合よく達成することができる。これらは、実施例４において部分的に取り組まれており、次の通りに書き直すことができる。
１．より高い親和性が達成されるような、疎水性効果を活用しより低いオフ・レート（off rate）をもたらす疎水性部分の組み入れ
２．より速いオン・レート（on rate）およびより高い親和性をもたらす、長距離イオン相互作用を活用する荷電基の組み入れ（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｒａｐｉｄ， ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ ａｓｓｉｓｔｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３、４２７〜３１を参照）。
３．ペプチドへの追加的な制約の組み入れ、即ち、
− エントロピーの損失が標的結合により最小となるように、アミノ酸の側鎖を正確に制約することによる、
− エントロピーの損失が標的結合により最小となるように、主鎖のねじれ角を制約することによる、
− 同一の根拠のために、分子における追加的な環化を導入することによる。
（総説に関して、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉら、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ、（２０１０）、１６、３１８５〜２０３およびＮｅｓｔｏｒら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ（２００９）、１６、４３９９〜４１８を参照されたい。）

トリプトファンおよび疎水性類似体置換
最初に、様々な疎水性アミノ酸をＴｒｐ２部位に置換して、酸化感受性トリプトファンを置き換えることのできる候補を同定し、効力を増加させ得る候補を同定した（上述の第１のポイントに取り組む）。これらのアミノ酸の側鎖を図１２に示し、親和性データを下表１２にまとめる。

予想された通り、いずれの修飾も血漿安定性を増加させなかった。２−ナフチル（Naphtyl）アラニンは、Ｔｒｐ２に最も密接に関係し、野生型よりも僅かに弱い効力を提示するため、これをＴｒｐ２のための優れた酸化抵抗性置き換えとする。興味深いことに、３，３−ＤＰＡ２は、Ｔｒｐに非常に似ていない構造を有するが、対応するペプチドは、高い効力を保持する。このことは、カリクレインにおけるＴｒｐ接触ポケットが、正確に設計された疎水性実体を同定することにより、より高い親和性結合に活用され得ることを示すことができる。

プロリン類似体
次に、本出願人らは、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２におけるＷＰＡＲファルマコフォアにおけるＰｒｏ３の役割の決定に興味を持った。ペプチド主鎖における追加的な硬性および螺旋性の誘導におけるこれらの公知の特性のため、４−ヒドロキシ−または４−フルオロ−トランス（Ｌ）−プロリン（ＨｙＰ３、４ＦｌｕｏＰｒｏ３）を選んだ（図１５、表１３）。さらに、ＨｙＰにおけるヒドロキシルの存在は、プロリン側鎖の溶媒露出度を探る。それぞれの誘導体のＫｉは、野生型とほぼ同一であり、ペプチド主鎖におけるいかなる効果も無視できることを示したが、側鎖が到達できることも実証する。これについてさらに詳述するため、Ｐｒｏ３側鎖のγ−炭素における巨大な伸展を含有した、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の２種の追加的な誘導体を検査した（４Ｐｈｅｎｙｌ−Ｐｒｏ、４Ｂｅｎｚｙｌ−Ｐｒｏ）。前者は、際立つ効力の保存を提示したが、一方、後者は激しく影響されており（impacted）、Ｐｒｏ側鎖が到達できるが、別個の修飾のみに限定されることを実証する。これらの修飾における立体的容積にもかかわらず、血漿安定性は、野生型と同一であった。よって、これらの修飾は、他のプロテアーゼに対する選択性を改善しない。

結合におけるプロリン環サイズの効果を探るため、高度に制約された４員Ｐｒｏ類似体アゼチジンカルボン酸（Ａｚｅ）およびより柔軟な６員環（ピペコリン酸、Ｐｉｐ）でＰｒｏ３を置換した。Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ａｚｅ３は、全誘導体の間で最高の親和性でカリクレインに結合し、野生型より３倍優れていた（図１４）。環サイズおよびＫｉの間には反比例関係があると考えられ、このことは、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の位置３におけるコンホメーション上の制約が、密接に結合する分子にとって鍵となることを示唆するであろう。

大型で巨大な化学基の耐容におけるプロリン側鎖の柔軟性は、二／三環状プロリン類似体Ｔｉｃ、ＮｏｒＨａｒおよびＩｎｄにより強調される（図１３）。特に後者の２事例にとって、親和性は、依然として十分に１桁のナノモル濃度範囲にある。

最後に、本出願人らは、Ｐｒｏ３における環構造の要件を全体に探ろうとした。この目的を達成するために、本出願人らは、アルファ炭素におけるその二重メチル置換により、αまたは３_１０螺旋性の誘導において隣接するアミノ酸に強力な構造的効果を有するアミノイソ酪酸（Ａｉｂ、図１３、表１３）を選んだ（Ｔｏｎｉｏｌｏら（１９９３）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３３、１０６１〜７２；Ｋａｒｌｅら（１９９０）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９、６７４７〜５６）。著しいことに、この非天然非環状アミノ酸は、１．２ｎＭのＫｉにおいて、Ｐｒｏ３の代わりに十分に耐容される。よって、ＷＰＡＲファルマコフォアにおけるＰｒｏ３の役割は、ペプチド主鎖に制約を導入することである。この制約は、環サイズが低下したプロリン類似体を用いることにより増強することができる（Ａｚｅ３を参照）。逆に、プロリン環は、Ａｉｂ等、非環状であるが構造誘導性アミノ酸により相対的に効率的に置き換えることができる。

種々の類似体
表１０において、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２のループ１におけるＳｅｒ１は、効力にごく僅かな影響でＮ−メチル化することができることが示されている（０．５対０．１７ｎＭ Ｋｉ、ＷＴ）。本出願人らは、この位置が、位置１におけるＣαにおける大型の二重置換を耐容するか決定しようとした。この目的を達成するために、Ｓｅｒ１をＤｐｇ（ジプロピルグリシン）に置き換えた（図１５）。カリクレインに対するこのペプチドの親和性は、１．１ｎＭであり、位置１が、実質的にいかなる巨大な残基の収容においても非常に柔軟であることを示す。よって、ループ１におけるこの位置は、アミノ酸の可溶化、放射標識、色素標識、リンカー、コンジュゲート部位その他諸々を包含する、望ましい化学的官能性または化学基の計画的な包含に活用することができる。

位置４における数種のアラニン類似体も検査した。Ｎ−メチルおよびＤ−アラニン（表２、表３）により既に判明している通り、Ａｌａ４は、Ｃαにおける立体的配向性に対し、あるいは主鎖自体における修飾に対し高度に感受性である。Ａｌａ４におけるペプチド主鎖の伸長（β−Ａｌａ４）は、親和性を劇的に低下させるため（ほぼ２０μＭ）、このクラスのさらに２種の誘導体は、このことを強調する。Ｄ−Ａｌａ４から予想された通り、Ａｉｂ４は、ほぼ同じ程度まで親和性を低下させる（２８９ｎＭ、図１５および表１４）。著しいことに、１個のメチレンによるＡｌａ側鎖の伸展（Ａｂａ４）は、カリクレインに対する親和性を増強すると思われる。

最後に、隣接Ａｒｇ５プロテアーゼ認識ポイントへの空間的アクセス低下によるタンパク質分解性安定性の増加を期待して、中央システイン（Ｃｙｓ２）を、より巨大でより制約された類似体、ペニシラミン（Ｐｅｎ、図１５）に置き換えた。実際に、ラット血漿安定性は、僅かに増強されたが、効力は有意に降下し、この構造的足場連結残基の十分な完全性の重要性を強調する。

単一のバイシクルリードへの血漿安定性を増強および効力を増強する非天然のアミノ酸の組合せ
はっきりと認識できる効力および最大ラット血漿安定性を保持した（方法１により決定）Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２における非天然の置換は、Ａｒｇ５変異体のホモアルギニン（ＨｏｍｏＡｒｇ５）、４−グアニジルフェニルアラニン（４ＧｕａｎＰｈｅ５）およびＮ−メチルアルギニン（ＮＭｅＡｒｇ５）であった。野生型ペプチドと比較して効力を増加させたＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２における非天然の置換は、Ｐｒｏ３類似体アゼチジンカルボン酸（Ａｚｅ３）およびＡｌａ４類似体２−アミノ酪酸（Ａｂａ４）であった。よって、Ａｚｅ３、Ａｂａ４を、プロテアーゼ安定性を増強するＨｏｍｏＡｒｇ５、４ＧｕａｎＰｈｅ５およびＮＭｅＡｒｇ５と組み合わせて、これにより、血漿安定性が高く、効力が増加したペプチド候補が得られるか決定した。

表１５および表１６は、血漿安定性と共に、様々な構築物の親和性を提示する。

第一に、アルギニン類似体含有ペプチドのラット血漿半減期の定量的決定（第４のカラム、表１５）は、Ａｒｇ５のＮ−メチル化が、ペプチドの保護において最も強力であり（ｔ_１／２＞２０時間）、続いて、ＨｏｍｏＡｒｇ５およびＧｕａｎＰｈｅ５であったことを明らかにした。ＡｒｇのＮ−メチル化の強力な保護効果は、これがペプチド結合の加水分解を直接的に防ぐため、おそらく驚くべきことではない。これらの化合物におけるＡｚｅ３の包含により、これらのペプチドの親和性は、あらゆる場合において増強することができ、Ａｃ−（０６−３４−１８）Ａｚｅ３ ＨｏｍｏＡｒｇ５およびＡｃ−（０６−３４−１８）Ａｚｅ３ ＮＭｅＡｒｇ５をさらなる開発のための魅力的な候補とする（表１５、図１６）。

Ｋｉ値が、Ａｂａ４なしで観察された値よりも高かったため、Ａｂａ４の親和性増強効果は、Ａｚｅ３およびアルギニン類似体のいずれの文脈においても再現することができなかった。よって、Ａｚｅ３の効力増強効果は、アルギニン置換の種類とは無関係であるが、Ａｂａ４の場合はそうでない可能性がある。

最後に、これらペプチドのラットカリクレインに対する活性は、有意に低下する（表１５）。しかし、ラットカリクレインのタンパク質調製物は、些細なものではなく、不純物を含有したため、これらの値は、この段階では相対的なものであり定量的ではない。

［実施例６ ＴｒｐフリーＦＰＹＲカリクレインバイシクルリードの血漿安定性増強およびＡｚｅ３による親和性増強］
実施例１〜４における選択アウトプットから、本出願人らは、高い存在量を有したが変更されたＷＰＡＲモチーフを含有した、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２に類似した数種の配列を発見した。これらは、ＷＰＳＲおよびＦＰＹＲであった。後者は、酸化感受性トリプトファンを欠くため、特に興味深い。

ＷＰＳＲ、ＦＰＹＲ、ＷＰＹＲおよびＦＰＡＲを含有するバイシクルを合成し、ＷＰＡＲ親ペプチドに対して比較した（表２１）。

予想された通り、ペプチドのいずれも、有意に異なる血漿安定性を提示しなかった。Ｐｈｅ２によるＴｒｐ２の置き換えは、Ｋｉの４０分の１の低下に陥り、より巨大なＴｒｐ２側鎖の必要を強調する。しかし、この低下は、Ｔｙｒ４によりＡｌａ４を置き換えることにより（ＦＰＹＲモチーフを生じる）補償することができ、親和性は、野生型ＷＰＡＲ配列の親和性とほぼ同一まで再び増加することができるようになる（Ｋｉ＝０．４６ｎＭ）。よって、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２バイシクルの位置２および位置４における残基の間に協同的相互関係が存在する。Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４における高い標的結合親和性およびＴｒｐ２の欠如を仮定し、上述の実施例に記載されているアプローチを用いて、ラット血漿半減期の増加に関してこの候補を調べた。さらに、本出願人らは、非天然のアミノ酸類似体によりこれらの残基を置換することにより、Ｐｈｅ２およびＴｙｒ４の間の相互関係を調べた。

Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４におけるＰｈｅ２／Ｔｙｒ４の非天然の置換
本出願人らは、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４リードにおけるＰｈｅ２またはＴｙｒ４における置き換えを組み入れている非包括的セットの合成を行った。図Ｆ６と同じセットから非天然のアミノ酸を選び、親和性データを表２２にまとめた。

すると、側鎖が、芳香族複素（３Ｐａｌ、４Ｐａｌ）、芳香族および巨大（１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、４，４−ＢＰａｌ）またはシクロ脂肪族（Ｃｈａ）実体であるかに関係なく、検査したアミノ酸のいずれかによる置換は、全般に十分に耐容された。３Ｐａｌは、位置２において十分に耐容され（Ｋｉ＝０．９１）、Ｐａｌはイオン性化学基を含有するため（即ち、製剤に活用することができる）、これは興味深い。しかし、本来のＰｈｅ２／Ｔｙｒ４組合せが、依然として最も強力であると思われる。

ラット血漿におけるＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４の安定化およびアゼチジン３置換の効果
ホモ−アルギニン、４−グアニジルフェニルアラニンおよびＮ−メチルアルギニン置換を用いて、Ａｚｅ３の非存在および存在下で、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４を調製した。ＨｏｍｏＡｒｇ／４Ｇｕａｎｐｈｅは、親Ｐｈｅ２Ｔｙｒ２ペプチドとほぼ同一のＫｉ値で十分に耐容され（表２３）、ラット血漿安定性は、１３倍に増強された（ｔ_１／２＝１２．２時間、表２３）。その上、ラットカリクレインに対するＩＣ５０値は、親の値と同様であり、これがｉｎ ｖｉｖｏ試験に魅力的な候補であることを示す。

ＦＰＹＲ文脈におけるＰｒｏ３からＡｚｅ３置換は、親和性が増強されたペプチド候補を再び生じ、実際に、ラット（Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３Ｔｙｒ４ ＮＭｅＡｒｇ５）において２０時間より長い半減期を有する可能性がある、１ｎＭ未満のＫｉを有するペプチドが作製された。

他に断りがなければ、本発明の実施または検査において、本明細書に記載されている方法および材料と同様または均等のいずれかの方法および材料を用いることができる。かかる使用に適した方法、機器および材料は、上に記載されている。本明細書において引用されているあらゆる刊行物は、本発明に関連して用いることのできる、かかる刊行物に報告されている方法論、試薬およびツールを説明および開示する目的のため、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。

Claims (27)

1. 少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記ペプチドリガンドの前記ループが、３個、４個または５個の、但し６個未満のアミノ酸を含む、ヒトカリクレインに特異的なペプチドリガンド。
2. 前記ペプチドリガンドの前記ループが、３個のアミノ酸を含み、前記ポリペプチドが、コンセンサス配列Ｇ_ｒＦｘｘＧ_ｒＲＶｘＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を有する、請求項１に記載のペプチドリガンド。
3. 表３に表記されているポリペプチドのうち１種を含む、請求項２に記載のペプチドリガンド。
4. 前記ペプチドリガンドの前記ループが、５個のアミノ酸を含み、第１のループが、コンセンサス配列Ｇ_ｒＧＧｘｘＮＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
5. ２個の隣接するループが、コンセンサス配列Ｇ_ｒＧＧｘｘＮＧ_ｒＲｘｘｘｘＧ_ｒを含む、請求項４に記載のペプチドリガンド。
6. 表４に表記されているペプチドのうち１種を含む、請求項４または請求項５に記載のペプチド。
7. 前記ペプチドリガンドの前記ループが、５個のアミノ酸を含み、第１のループが、モチーフＧ_ｒｘ^Ｗ／_ＦＰｘ^Ｋ／_ＲＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
8. モチーフＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴｘＬＧ_ｒを含む第２のループをさらに含む、請求項７に記載のペプチドリガンド。
9. 前記ペプチドリガンドの前記ループが、５個のアミノ酸を含み、第１のループが、モチーフＧ_ｒｘＨｘＤＬＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
10. 前記ペプチドリガンドの前記ループが、５個のアミノ酸を含み、第１のループが、モチーフＧ_ｒＴＨｘｘＬＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
11. ２個の隣接するループが、モチーフＧ_ｒｘ^Ｗ／_ＦＰｘ^Ｋ／_ＲＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴＤＬＧ_ｒを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
12. 表４、表５または表６に表記されているポリペプチドのうち１種を含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
13. 前記第１のループが、配列Ｇ_ｒｘＷＰＡＲＧ_ｒを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
14. 前記第１のループが、配列Ｇ_ｒｘＷＰＳＲＧ_ｒを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
15. 前記第１のループが、配列Ｇ_ｒｘＦＰＦＲＧ_ｒを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
16. 前記第１のループが、配列Ｇ_ｒｘＦＰＹＲＧ_ｒを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
17. ｘがＳまたはＲである、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
18. 前記反応基がシステインである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
19. １個または複数個の非天然のアミノ酸置換基を含み、プロテアーゼ分解に対し抵抗性である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドリガンド。
20. 前記修飾されたアミノ酸が、Ｎ−メチルアルギニン、ホモ−アルギニン、ヒドロキシプロリンおよびグアニジル−フェニルアラニンおよびアゼチジンカルボン酸から選択される、請求項１９に記載のポリペプチドリガンド。
21. 前記ポリペプチドが、モチーフＧ_ｒｘＷＰＡＲＧ_ｒを含む第１のループを含み、Ｐｒｏは、アゼチジンカルボン酸に置き換えられ、および／またはＲは、Ｎ−メチルアルギニンに置き換えられ、および／またはＲは、ホモアルギニンに置き換えられ、および／またはＲは、グアニジルフェニルアラニンに置き換えられる、請求項２０に記載のポリペプチドリガンド。
22. 前記ポリペプチドが、モチーフＧ_ｒｘＦＰＹＲＧ_ｒを含む第１のループを含み、Ｒは、Ｎ−メチルアルギニンに置き換えられ、および／またはＲは、ホモアルギニンに置き換えられ、および／またはＲは、グアニジルフェニルアラニンに置き換えられ、Ｐｒｏは、アゼチジンカルボン酸に置き換えられる、請求項２０に記載のポリペプチドリガンド。
23. 標的に対して、親ポリペプチドリガンドの結合活性を超える、改善されたレベルの結合活性を生じる変異体ポリペプチドリガンドを作製するための方法であって、前記親ポリペプチドリガンドが、少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記方法が、
    （ａ）ループ配列のそれぞれにおける２個以上のアミノ酸位置のそれぞれに対し、ｎ種の異なる変異体ライブラリを作製するステップであって、各ライブラリが、前記ループ配列における前記アミノ酸位置の１個がｎ種の異なる非親アミノ酸のうち１種による置き換えにより変異導入された親ポリペプチドからなるステップと、
    （ｂ）親標的との結合に関して各ライブラリをスクリーニングし、各変異を点数化するステップと、
    （ｃ）変異が耐容されるアミノ酸位置を同定するステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）において同定された前記アミノ酸位置に位置する１個または複数個の変異を含む１種または複数種の変異体ポリペプチドを作製するステップと
    を含む、方法。
24. ステップ（ｄ）が、ステップ（ｃ）において同定された前記アミノ酸位置の２個以上に変異を組み入れているポリペプチドを含むライブラリを調製するサブステップと、前記標的に対する改善されたレベルの結合活性を有するポリペプチドに関して前記ライブラリをスクリーニングするサブステップとを含む、請求項２３に記載の方法。
25. ポリペプチドリガンドのライブラリであって、前記ポリペプチドリガンドが、少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記ライブラリが、ポリペプチドリガンドのｍ種の異なる変異体からなり、前記変異体において、前記ループ配列における特定のアミノ酸位置が、ｍ種の異なるアミノ酸のうち１種による置き換えにより変異導入されており、ｍが少なくとも２である、ライブラリ。
26. ポリペプチドリガンドのライブラリのセットであって、前記ポリペプチドリガンドが、少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記セットが、２種以上のポリペプチドリガンドライブラリを含み、前記ポリペプチドリガンドライブラリのそれぞれが、１ポリペプチドリガンドのｍ種の異なる変異体からなり、前記変異体において、前記ループ配列における特定のアミノ酸位置が、ｍ種の異なるアミノ酸のうち１種による置き換えにより変異導入されている、ライブラリのセット。
27. ｍが、２〜２０の間である、請求項２６に記載のライブラリのセット。