JP2019218358A - 構造化ポリペプチドの特異性のモジュレーション - Google Patents
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Abstract
Description
が足場への取付ポイントの間に内在するように共有結合したポリペプチドに関する。具体
的には、本発明は、ヒトプロテアーゼ血漿カリクレインに特異的なペプチドについて記載
する。
、したがって治療法の開発のために魅力的な分子クラスである。実際に、例えば、抗菌性
ペプチドのバンコマイシン、免疫抑制薬のシクロスポリンまたは抗癌薬のオクトレオチド
(ocreotide)のように、数種の環状ペプチドが、既に診療所において用いられ成功して
いる(Driggersら、Nat Rev Drug Discov 2008、7(
7)、608〜24)。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成された相対的に
大きな相互作用表面と共に、環状構造のコンホメーション上の柔軟性の低下に起因する。
通常、大環状分子は、例えば、環状ペプチドCXCR4アンタゴニストCVX15(40
0Å2;Wu、B.ら、Science 330(6007)、1066〜71)、イン
テグリンαVb3に結合するArg−Gly−Aspモチーフを有する環状ペプチド(3
55Å2)(Xiong、J.P.ら、Science 2002、296(5565)
、151〜5)またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチ
ド阻害剤ウパイン(upain)−1(603Å2;Zhao、G.ら、J Struct
Biol 2007、160(1)、1〜10)のように、数百平方オングストロームの
表面に結合する。
、標的への結合によるエントロピー損失がより小さくなり、より高い結合親和性をもたら
す。柔軟性の低下は、標的特異的コンホメーションをロックし、直鎖状ペプチドと比較し
て結合特異性を増加させる。このような効果は、その環が開環されると他のMMPに及ぶ
その選択性を失う、マトリックスメタロプロテイナーゼ8(MMP−8)の強力かつ選択
的な阻害剤により例証されてきた(Cherney、R.J.ら、J Med Chem
1998、41(11)、1749〜51)。大環状化により達成される有利な結合特
性は、例えばバンコマイシン、ナイシンまたはアクチノマイシン等、2個以上のペプチド
環を有する多環性ペプチドにおいてさらにより明らかである。
繋いでいる(Kemp,D.S.およびMcNamara,P.E.、J.Org.Ch
em、1985、Timmerman,P.ら、ChemBioChem、2005)。
Meloenおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造を模倣するために、合成足場
上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス(ブロモメチル)ベ
ンゼンおよび関連分子を使用している(Timmerman,P.ら、ChemBioC
hem、2005)。システイン含有ポリペプチドを分子足場、例えばトリス(ブロモメ
チル)ベンゼンに連結させることによって作製される候補薬物化合物を作製する方法は、
WO2004/077062号およびWO2006/078161号に開示されている。
細には、この文書は、第1および第2の反応基を含む様々な足場分子、ならびに、前記足
場をさらなる分子と接触させて、カップリング反応において足場とさらなる分子との間に
少なくとも2つの連結を形成させることを開示している。
を開示している。この文書は、既存のタンパク質からとった様々なペプチドのコレクショ
ンの人工合成を開示している。その後、これらのペプチドを一部のアミノ酸変化が導入さ
れた一定の合成ペプチドと組み合わせて、コンビナトリアルライブラリを生じさせる。様
々なアミノ酸変化を特長とする別々のペプチドに、化学結合を介してこの多様性を導入す
ることによって、所望の結合活性を見つける機会の増大がもたらされる。この文書の図1
は、様々なループペプチド構築体の合成の模式図を示している。この文書中に開示されて
いる構築体は、典型的にはシステイン残基を含む−SH官能化したペプチド、および典型
的にはビス−またはトリス−ブロモフェニルベンゼンなどのベンジルハロゲン置換基を含
む足場上の芳香族複素環基に依存する。そのような基は、反応してペプチドと足場との間
にチオエーテル結合を形成する。
スクリーニングするためのファージディスプレイに基づくコンビナトリアルアプローチを
開発した(Heinisら、Nat Chem Biol 2009、5(7)、502
〜7;国際特許出願である国際公開第2009/098450号パンフレットも参照)。
要約すると、3個のシステイン残基と、2個のランダムな6アミノ酸領域とを含有する(
Cys−(Xaa)6−Cys−(Xaa)6−Cys)直鎖状ペプチドのコンビナトリ
アルライブラリをファージ上に提示させ、システイン側鎖を小分子(トリス−(ブロモメ
チル)ベンゼン)へと共有結合させることにより環化させた。ヒトプロテアーゼカテプシ
ンGおよび血漿カリクレイン(PK)に対する親和性選択において単離された二環式ペプ
チドは、ナノモル濃度の阻害定数を有していた。最良の阻害剤、PK15は、3nMのK
iでヒトPK(hPK)を阻害する。数種の単離された二環式ペプチドのアミノ酸配列に
おける類似性は、両方のペプチドループが結合に寄与することを示唆した。PK15は、
検査した最高濃度(10μM)において、ラットPK(81%配列同一性)も、相同的な
ヒトセリンプロテアーゼ第XIa因子(hfXIa;69%配列同一性)もトロンビン(
36%配列同一性)も阻害しなかった(Heinisら、Nat Chem Biol
2009、5(7)、502〜7)。この知見は、二環式阻害剤が高度に特異的であり、
他のヒトトリプシン様セリンプロテアーゼが阻害されないであろうことを示唆した。上述
の効力および標的選択性を有するPK15等、合成小分子ペプチド性阻害剤は、浮腫の反
復的発症により特徴づけられる生命に関わる疾患である遺伝性血管浮腫におけるPK活性
を制御する、あるいは心肺バイパス手術における接触活性化を防ぐための治療法としての
応用可能性を有する。
H2(式中、第2の6アミノ酸ループがランダム化されている)に基づくライブラリから
単離された。PK15の配列は、H−ACSDRFRNCPADEALCG−NH2であ
り、ヒトカリクレインに対するIC50結合定数は、1.7nMであった。
て選択された、構造化ポリペプチドの特異性を解析した。その結果、本出願人らは、改善
された結合特異性によりカリクレインに結合することができる構造化ペプチドの単離に成
功した。
の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも2個のポリペプチドルー
プが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基
と共有結合を形成し、前記ペプチドリガンドの前記ループが、3、4または5個の、但し
6個未満のアミノ酸を含む、ヒトカリクレインに特異的なペプチドリガンドが提供される
。
リクレインに対しさらにより高い結合親和性を有し得ることを見出した。例えば、本明細
書に記載されている5×5ペプチドは、0.08nM以下の結合定数を達成する。
チドは、コンセンサス配列GrFxxGrRVxGr(式中、Grは反応基である)を有
する。
のループは、コンセンサス配列GrGGxxNGr(式中、Grは反応基である)を含む
。
rRxxxxGrを含み得る。
ープは、モチーフGrxW/FPxK/RGr(式中、Grは反応基である)を含む。こ
の文脈において、「第1の」ループの言及は、必ずしも配列におけるループの特定の位置
を表示しない。しかし、一部の実施形態において、第1のループは、アミノ末端からカル
ボキシ末端に及ぶペプチド配列における近位ループとなり得る。例えば、ポリペプチドは
、モチーフGr T/LHQ/TxLGrを含む第2の遠位ループをさらに含む。第1のル
ープの配列の例として、GrxWPARGr、GrxWPSRGr、GrxFPFRGr
およびGrxFPYRGrが挙げられる。これらの例において、xは、いかなるアミノ酸
であってもよいが、例えば、SまたはRである。
ープは、モチーフGrxHxDLGr(式中、Grは反応基である)を含む。
ープは、モチーフGrTHxxLGr(式中、Grは反応基である)を含む。
Q/TDLGrを含む2個の隣接するループを含む。
した。特に、ペプチド06−34および06−34−03を用いて行った実験は、位置1
および6が、位置4に影響を与えることを実証する。好ましくは、位置1および6が、そ
れぞれSおよびTである場合に限り、位置4はAである。
無視する。よって、GrxW/FPxK/RGr T/LHQ/TDLGrにおいて、xは
位置1にあり、T/Lは位置6にある。
1種となり得る。
チドのうち1種を含み得る。
、反応性アミノ酸は、システインである。
かる位置に変異を包含するライブラリを調製することにより、上述の通り調製することが
できる。例えば、表4におけるポリペプチド06−56は、活性を失うことなく位置Q4
およびT10に変異導入することができる(後述の実施例を参照)。06−56と比較し
て改善された結合活性を有する、これらの位置に変異を含むポリペプチドリガンドを選択
することができる。
テアーゼ分解に対し抵抗性である、本発明の先行する態様にかかるポリペプチドリガンド
が提供される。
つ、nMのKiによる血漿カリクレインとの結合を可能にすることを見出した。
およびヒドロキシプロリンから選択される。好ましくは、アルギニンのN−メチルおよび
ホモ誘導体は、アルギニンの置き換えに用いられ、プロリン3は、好ましくは、ヒドロキ
シプロリン、アゼチジンカルボン酸またはアミノイソ酪酸等のアルファ置換アミノ酸に置
き換えられてよい。別の一実施形態において、アルギニンは、グアニジル−フェニルアラ
ニンに置き換えることができる。
プを含み、Pは、アゼチジンカルボン酸に置き換えられ、および/またはRは、N−メチ
ルアルギニンに置き換えられ、および/またはRは、ホモアルギニンに置き換えられ、お
よび/またはRは、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えられる。
プを含み、Rは、N−メチルアルギニンに置き換えられ、および/またはRは、ホモアル
ギニンに置き換えられ、プロリンは、アゼチジンカルボン酸により置き換えられ、および
/またはRは、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えられる。
善されたレベルの結合活性を生じる変異体ポリペプチドリガンドを作製するための方法で
あって、前記親ポリペプチドリガンドが、少なくとも2個のループ配列によって隔てられ
た少なくとも3個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも2個の
ポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプ
チドの前記反応基と共有結合を形成し、前記方法が、(a)ループ配列のそれぞれにおけ
る2個以上のアミノ酸位置のそれぞれに対し、n種の異なる変異体ライブラリを作製する
ステップであって、各ライブラリが、前記ループ配列における前記アミノ酸位置の1個が
、n種の異なる非親アミノ酸のうち1種による置き換えにより変異導入された親ポリペプ
チドからなるステップと、(b)親標的との結合に関して各ライブラリをスクリーニング
し、各変異を点数化するステップと、(c)変異が耐容されるアミノ酸位置を同定するス
テップと、(d)ステップ(c)において同定されたアミノ酸位置に位置する1個または
複数個の変異を含む1種または複数種の変異体ポリペプチドを作製するステップとを含む
方法が提供される。
位置の2個以上に変異を組み入れているポリペプチドを含むライブラリを調製するサブス
テップと、前記標的に対する結合活性のレベルが改善されたポリペプチドに関してライブ
ラリをスクリーニングするサブステップとを含む。
て選択することができる。例えば、あらゆる可能な天然のアミノ酸を含む変異体が望まし
い場合、nは、20となり得る。N−メチル化アミノ酸等、非天然のアミノ酸が包含され
る場合、nは、22または23等、20より大きくなり得る。例えば、nは、2以上、3
、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19または20となり得る。
リガンドが、少なくとも2個のループ配列によって隔てられた少なくとも3個の反応基を
含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも2個のポリペプチドループが前記分
子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合
を形成し、前記ライブラリが、ポリペプチドリガンドのm種の異なる変異体からなり、前
記変異体において、前記ループ配列における特定のアミノ酸位置が、m種の異なるアミノ
酸のうち1種による置き換えにより変異導入されており、mが少なくとも2である、ライ
ブラリが提供される。
ペプチドリガンドが、少なくとも2個のループ配列によって隔てられた少なくとも3個の
反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも2個のポリペプチドループ
が前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と
共有結合を形成し、前記セットが、2種以上のポリペプチドリガンドライブラリを含み、
前記ポリペプチドリガンドライブラリのそれぞれが、ポリペプチドリガンドのm種の異な
る変異体からなり、前記変異体において、前記ループ配列における特定のアミノ酸位置が
、m種の異なるアミノ酸のうち1種による置き換えにより変異導入されているライブラリ
のセット、が提供される。
ている通り、mは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19または20以上である。
た少なくとも3個の反応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含むペプチドリガンドで
あって、少なくとも2個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように、前
記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記ペプチドが、少な
くとも1種の非天然のアミノ酸の組み入れにより修飾されている、ペプチドリガンドを提
供する。
る。非天然アミノ酸置換(複数可)は、ポリペプチドのプロテアーゼ抵抗性のレベルを増
加させる。
およびアゼチジンカルボン酸およびグアニジルフェニルアラニンから選択される。好まし
くは、アルギニンのN−メチルおよびホモ誘導体が、アルギニンの置き換えに用いられ、
アゼチジンカルボン酸は、プロリンに置き換わる。別の一実施形態において、アルギニン
は、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えることができる。
ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学ならびに生化学の分野な
どの当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。分子生物学、遺伝子学および生
化学的の方法には、本明細書中に参考として組み込まれている(Sambrookら、分
子クローニング:実験室の手引き(Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual)、第3版、2001、Cold Spring Harb
or Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N
Y、Ausubelら、分子生物学の手短なプロトコル(Short Protocol
s in Molecular Biology)(1999)第4版、John Wi
ley&Sons,Inc.を参照)標準の技法が使用される。
。典型的には、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成することができる2つ以上
の反応基、および、ペプチドが足場と結合した際にループを形成するためことからループ
配列と呼ばれる、前記反応基間に内在する配列を含む。本事例において、ペプチドは、少
なくとも3個の反応基を含み、足場上に少なくとも2個のループを形成する。
基は、ペプチド上のアミノ酸側鎖上に存在する。例は、システイン、リジンおよびセレノ
システインなどのアミノ含有基である。
る、さもなければこれと相互作用するリガンドの能力を指す。例えば、特異性は、ヒト酵
素の相互作用を阻害するが、異なる種由来の相同酵素の相互作用を阻害しないリガンドの
能力を指すことができる。本明細書に記載されているアプローチを用いて、企図される標
的のホモログまたはパラログとリガンドがより相互作用できるようにまたはできなくなる
ように、特異性が増加または減少するようモジュレートすることができる。特異性は、活
性、親和性またはアビディティーと同義であるとは企図されておらず、その標的における
リガンドの作用の効力(例えば、結合親和性または阻害のレベル等)は、必ずしもその特
異性に関係しない。
られる定量的結合測定値を指す。従って、結合活性は、所定の標的濃度で結合しているペ
プチドリガンドの量を指す。
ンホメーション特性により、抗体の場合はエピトープ等、単一の標的と結合することがで
きる。しかし、2種以上の標的に結合することができるペプチド、例えば上述の通り、本
技術分野において公知の二重特異的抗体を開発することができる。本発明において、ペプ
チドリガンドは、2種以上の標的に結合することができ、従って多重特異的となり得る。
好ましくは、これは、2種の標的に結合し、二重特異的である。結合は、独立的となるこ
とができ、これは、ペプチドにおける標的に対する結合部位が、標的の一方または他方の
結合により構造的に妨げられないことを意味する。この場合、両方の標的が独立的に結合
していてよい。より一般的には、一方の標的の結合が、他方の結合を少なくとも部分的に
妨害するであろうと予想される。
には、根本的な差異が存在する。第1の事例において、リガンドは、両方の標的に個々に
特異的であり、特異的な様式でそれぞれと相互作用する。例えば、リガンドにおける第1
のループが第1の標的に結合し、第2のループが第2の標的に結合することができる。第
2の事例において、リガンドは、例えば、両者に共通する標的のエピトープと相互作用す
ることにより、2種の標的の間を区別しないため、非特異的である。
は、二特異的リガンドとなることが可能である。しかし、一実施形態において、リガンド
は、二特異的ではないが、標的および1種または複数種のオルソログの両方と結合するよ
うな、より低い正確さの特異性を有する。一般に、標的およびそのオルソログの両方に対
して選択されていないリガンドは、ループ長のモジュレーションの結果、二特異的となる
可能性が低い。
うち少なくとも一方が、選択されたリガンドの間で共通となり、特異性のレベルは、本明
細書において開示される方法によりモジュレートすることができる。第2のまたはさらに
別の特異性は、共有される必要はなく、本明細書に表記されている手順の対象である必要
はない。
である。結合は、多くの種類の活性に必須のものと理解され、それ自体が活性となり得る
が、他の活性が想定される。よって、本発明は、直接的または間接的な結合の測定を必要
としない。
長を与えることができる、任意の分子である。これは、ジスルフィド結合を単に置き換え
るのではなく、その代わりに、ペプチドの2つ以上の付着点をもたらすという点で、架橋
結合剤ではない。好ましくは、分子足場は、足場反応基と呼ばれる、ペプチドの付着点を
少なくとも3つ含む。これらの基は、ペプチド上の反応基と反応して共有結合を形成する
ことができる。分子足場の好ましい構造を以下に記載する。
従って、例えばファージディスプレイ技術から実施する。例えば、固相に固定した標的を
用いて、レパートリーの結合メンバーを同定および単離することができる。スクリーニン
グにより、所望の特徴に応じたレパートリーのメンバーの選択が可能となる。
、同一ではないメンバーで構成される。この点で、ライブラリはレパートリーと同義であ
る。ライブラリメンバー間の配列の相違が、ライブラリ中に存在する多様性を司っている
。ライブラリは、ポリペプチドもしくは核酸の単純な混合物の形態をとり得るか、または
、核酸のライブラリで形質転換させた生物もしくは細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物
もしくは植物細胞などの形態であり得る。好ましくは、それぞれの個々の生物または細胞
は、1つのみまたは限定された数のライブラリメンバーを含有する。
に、核酸を発現ベクター内に組み込む。したがって、好ましい態様では、ライブラリは宿
主生物の集団の形態をとってよく、それぞれの生物は、発現させてその対応するポリペプ
チドメンバーを産生させることができる、ライブラリの単一のメンバーを核酸の形態で含
有する発現ベクターの1つまたは複数のコピーを含有する。したがって、宿主生物の集団
は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードしている潜在性を
有する。
ライブラリのそれぞれの核酸メンバーは、好ましくは、ライブラリの1つまたは複数の他
のメンバーに関連する配列を有する。関連する配列とは、ライブラリの少なくとも1つの
他のメンバーに対して少なくとも50%の同一性、例えば少なくとも60%の同一性、例
えば少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも80%の同一性、例えば少なくとも9
0%の同一性、例えば少なくとも95%の同一性、例えば少なくとも98%の同一性、例
えば少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。同一性は、少なくとも
3個のアミノ酸、例えば少なくとも4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸、例
えば少なくとも12個のアミノ酸、例えば少なくとも14個のアミノ酸、例えば少なくと
も16個のアミノ酸、例えば少なくとも17個のアミノ酸の連続的なセグメントまたは参
照配列の完全長にわたって判断し得る。
ョンである。通常、反応基の位置および性質は変動しないが、その間にループを形成する
配列がランダム化されてよい。レパートリーは、サイズが異なるが、少なくとも102種
のメンバーを含むと考慮されるべきである。1011種以上のメンバーのレパートリーを
構築することができる。
択に付すことができる複数のポリペプチドリガンドを指す。潜在的には、セットは、レパ
ートリーとなり得るが、少なくとも2、最大10、20、50、100種以上のポリペプ
チドの小規模のコレクションであってもよい。
形態において、リガンドの群は、少なくとも1種の標的特異性を共有するリガンドのみを
含む。通常、群は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10、20、50
、100種以上のリガンドからなるであろう。一実施形態において、群は、2種のリガン
ドからなる。
(i)分子足場
分子足場は、例えば、国際公開第2009098450号パンフレットならびにそこに
引用されている参考文献、特に、国際公開第2004077062号パンフレットおよび
国際公開第2006078161号パンフレットにおいて記載されている。
体であり得る、またはそれに基づき得る。例えば、分子足場は、二量体または三量体など
の、そのような実体の短いポリマーを含み得る。
合物の例には、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、またはタマゼパム(tam
azepam)などの既存の薬物が含まれる。
ノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。
形成することができる反応基を含む。
ン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、酸無水物、スクシンイミド、マレイミド
、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの化学基を含有し得る。
リス(ブロモメチル)ベンゼン(「TBMB」)、またはその誘導体を含み得る、または
それからなり得る。
これは、1,3,5−トリス(ブロモメチル)ベンゼンに類似であるが、ベンゼン環に付
着したさらに3つのメチル基を含有する。これは、追加的なメチル基が、ポリペプチドと
のさらに別の接触を形成し、したがって追加的な構造的制約を加え得るという利点を有す
る。
足場と共有結合を形成することのできる化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオ
ール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、
アルキン、無水物、サクシニミド、マレイミド、アジ化物、ハロゲン化アルキルおよびハ
ロゲン化アシルを包含する広範な官能基から選択される。
ポリペプチドの反応基は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖によって提供され得る。
ポリペプチドの反応基は、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、グアニジニウム基、
フェノール基またはヒドロキシル基から選択され得る。ポリペプチドの反応基は、アジド
、ケト−カルボニル、アルキン、ビニル、またはハロゲン化アリール基から選択され得る
。分子足場と連結させるためのポリペプチドの反応基は、ポリペプチドのアミノまたはカ
ルボキシ末端であり得る。
、同じ種類のものである。例えば、それぞれの反応基はシステイン残基であり得る。さら
なる詳細は、国際公開第2009098450号パンフレットに提供されている。
含み得るか、または3つ以上の異なる種類を含み得る。例えば、反応基は、2つのシステ
イン残基および1つのリジン残基を含み得るか、あるいは、1つのシステイン残基、1つ
のリジン残基および1つのN末端アミンを含み得る。
するため、使用しうる。システインのチオール基と反応させるために分子足場上で使用す
ることができる足場反応基は、アルキルハロゲン化物、(またはハロゲノアルカンもしく
はハロアルカンとも命名される)。具体例は、ブロモメチルベンゼン(TBMBにより例
証される足場反応基)またはヨードアセトアミドである。化合物をタンパク質中のシステ
インと選択的にカップリングさせるために使用される他の足場反応基はマレイミドである
。本発明において分子足場として使用し得るマレイミドの例には、トリス−(2−マレイ
ミドエチル)アミン、トリス−(2−マレイミドエチル)ベンゼン、トリス−(マレイミ
ド)ベンゼンが含まれる。セレノシステインは、また、システインと類似の反応性を有し
ており、同じ反応に使用することができる天然アミノ酸である。したがって、システイン
に言及する場合はいつでも、文脈によりそうでないと示唆される場合以外は、セレノシス
テインを置換することが典型的には許容される。
てファージ上のペプチドを修飾するための反応基として適している。しかし、ファージを
選択に使用する場合は、リジンはファージタンパク質中でシステインよりも豊富に存在し
、ファージ粒子が架橋結合し得る、またはこれらがその感染力を失い得る危険性が高くな
る。それにもかかわらず、リジンは、分子内反応(例えば、分子足場が既にファージペプ
チドと連結している場合)において、分子足場と第2のまたは連続した連結を形成するた
めに特に有用であることが見出されている。この場合、分子足場は、ディスプレイされた
ペプチドのリジン(特に、非常に近位にあるリジン)と優先的に反応する。第一級アミン
と選択的に反応する足場反応基は、スクシンイミド、アルデヒドまたはハロゲン化アルキ
ルである。添付の実施例のうちのいくつかにおいて使用されているブロモメチル基では、
ベンゼン環の電子が陽イオン性の遷移状態を安定化することができる。したがって、この
特定のハロゲン化アリルは、ハロゲン化アルキルよりも反応性が100〜1000倍高い
。分子足場として使用するためのスクシンイミドの例には、トリス−(スクシンイミジル
アミノトリアセテート)、1,3,5−ベンゼン三酢酸が含まれる。分子足場として使用
するためのアルデヒドの例には、トリホルミルメタンが含まれる。分子足場として使用す
るためのハロゲン化アルキルの例には、1,3,5−トリス(ブロモメチル)−2,4,
6−トリメチルベンゼン、1,3,5−トリス(ブロモメチル)ベンゼン、1,3,5−
トリス(ブロモメチル)−2,4,6−トリエチルベンゼンが含まれる。
な位置に位置していてよい。作製された特定の構造またはループに影響を与えるために、
反応基を有するアミノ酸の位置は、例えば、産生されるポリペプチドを突然変異させるた
めにポリペプチドをコードしている核酸を操作することによって、技術者によって変動さ
せ得る。かかる手段により、ループ長は、本教示に従って操作することができる。
然のアミノ酸を表し、Aはアラニンを表し、Cはシステインを表し、Gはグリシンを表し
、同一であっても異なっていてもよいnおよびmは、3〜6の間の数である)を含むこと
ができる。
本発明の分子足場は、ポリペプチドにおける官能基または反応基を介してポリペプチド
と結合していてよい。これらは通常、ポリペプチドポリマーに存在する特定のアミノ酸の
側鎖から形成される。かかる反応基は、システイン側鎖、リジン側鎖またはN末端アミン
基もしくはその他の適した反応基となり得る。重ねて記すが、詳細は、国際公開第200
9098450号パンフレットに見出すことができる。
ラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボキシル基、アルギニンのグアニジウム基、チロシ
ンのフェノール基またはセリンのヒドロキシル基である。非天然のアミノ酸は、アジ化物
、ケト−カルボニル、アルキン、ビニルまたはハロゲン化アリール基を包含する広範な反
応基をもたらすことができる。ポリペプチド末端のアミノおよびカルボキシル基もまた、
分子足場/分子コアと共有結合を形成する反応基としての役割を果たすことができる。
4個以上の反応基を含有することもできる。より多くの反応基が用いられるほど、より多
くのループを分子足場に形成することができる。
fold)回転対称を有する分子足場/分子コアと前記ポリペプチドの反応は、単一の産物異
性体(product isomer)を生成する。単一の産物異性体の生成は、いくつかの理由から有
利である。化合物ライブラリの核酸は、ポリペプチドの一次配列のみをコードし、分子コ
アとポリペプチドの反応により形成される分子の異性体状態をコードしない。1種の産物
異性体のみが形成され得るのであれば、産物異性体への核酸の割当は、明確に定義される
。複数の産物異性体が形成される場合、核酸は、スクリーニングまたは選択プロセスにお
いて単離された産物異性体の性質に関する情報を与えることができない。単一の産物異性
体の形成は、本発明のライブラリの特異的なメンバーが合成される場合も有利である。こ
の場合、分子足場とポリペプチドの化学反応は、異性体の混合物ではなく単一の産物異性
体を生じる。
4面体対称を有する分子足場/分子コアと前記ポリペプチドの反応は、2種の産物異性体
を生成する。2種の異なる産物異性体が、全く同一の核酸にコードされるとしても、単離
された異性体の異性体的な性質は、両方の異性体を化学的に合成し、2種の異性体を分離
し、標的リガンドへの結合に関して両方の異性体を検査することにより決定することがで
きる。
応基と直交性である。直交性の反応基の使用は、前記直交性の反応基を分子コアの特異的
部位に向けることを可能にする。直交性の反応基を含む連結戦略は、形成された生成物異
性体の数を制限するために使用し得る。言い換えれば、少なくとも3つの結合のうちの1
つまたは複数について、少なくとも3つの結合のうちの残りについて選択したものと区別
されるまたは異なる反応基を選択することによって、特定の順序の結合、またはポリペプ
チドの特定の反応基を分子足場上の特定の位置に指示することが、有用に達成され得る。
ンカーは、リンカーが最終的な結合状態において分子足場とポリペプチドとの間に介在す
るように、分子足場と反応することができる。
酸は、いずれかの天然または非天然のアミノ酸に置き換えることができる。これらの交換
可能なアミノ酸から除外されるのは、ループ配列単独が交換可能となるような、分子コア
にポリペプチドを架橋するための官能基を持つアミノ酸である。交換可能なポリペプチド
配列は、ランダムな配列、定常な配列またはランダムおよび定常なアミノ酸を有する配列
のいずれかを有する。反応基を有するアミノ酸は、これらのアミノ酸の位置はループサイ
ズを決定するため、ポリペプチド内の定義された位置のいずれかに位置する。
lY(X)mY(X)nY(X)o[式中、Yは反応基を有するアミノ酸を表し、Xはラ
ンダムなアミノ酸を表し、mおよびnは、同一でも異なっていてもよい介在ポリペプチド
セグメントの長さを定義する3〜6の数字であり、lおよびoは、フランキングポリペプ
チドセグメントの長さを定義する、0〜20の数字である]を有する。
分子足場をペプチドに付着させることができる。あるいは、これらの技法は、本発明に従
ってこれらを選択された単離した後の、修飾またはさらなる部分(分子足場から区別され
る対象の小分子など)とポリペプチドとの付着に使用し得る。したがって、本実施形態で
は、明らかに、付着は共有的である必要はなく、非共有的な付着を包含し得る。これらの
方法は、非天然アミノ酸を保有し、必須の化学反応基を、相補的反応基を保有する小分子
と組み合わせて有するタンパク質およびペプチドをディスプレイするファージを産生させ
ることによって、または、分子が選択/単離段階の後に作製される場合は、非天然アミノ
酸を化学的にもしくは組換えによって合成したポリペプチド内に組み込ませることによっ
て、チオール媒介性方法の代わりに(またはそれと組み合わせて)使用し得る。さらなる
詳細は、国際公開第2009098450号パンフレットまたはHeinisら、Nat
Chem Biol 2009、5(7)、502〜7に見出すことができる。
ペプチドリガンドまたはペプチドリガンドのレパートリー由来のループは、組み合わせ
たループを組み入れているポリペプチドの配列決定およびde novo合成により有利
に組み合わされる。あるいは、かかるポリペプチドをコードする核酸を合成することがで
きる。
コードする核酸は、有利に消化され、再ライゲーションされて、構成物レパートリー由来
のループの異なる組合せを有する新規レパートリーを形成する。ファージベクターは、ポ
リリンカーおよび制限酵素のための他の部位(ベクターの切断および再ライゲーションの
ための固有のポイントを提供する)を包含して、所望の多重特異的ペプチドリガンドを作
製することができる。ファージライブラリを操作するための方法は、抗体に関してよく知
られており、本事例においても適用することができる。
エフェクターおよび/または官能基を、例えば、ポリペプチドのNもしくはC末端にま
たは分子足場に付けることができる。
クター基は、1種または複数種の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域(CL)
、抗体CH1重鎖ドメイン、抗体CH2重鎖ドメイン、抗体CH3重鎖ドメインまたはこ
れらのいずれかの組合せを包含することができる。エフェクター基は、抗体のヒンジ領域
(IgG分子のCH1およびCH2ドメインの間に通常存在する領域等)を含むこともで
きる。
、IgG分子のFc領域である。有利には、本発明にかかるペプチドリガンドエフェクタ
ー基は、1日間以上、2日間以上、3日間以上、4日間以上、5日間以上、6日間以上ま
たは7日間以上のtβ半減期を有するペプチドリガンドFc融合体を含む、あるいはこれ
からなる。最も有利には、本発明にかかるペプチドリガンドは、1日間以上のtβ半減期
を有するペプチドリガンドFc融合体を含む、あるいはこれからなる。
プチドの取り込みを助ける官能基その他を包含する。
ことができる。細胞へと浸透する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的は、
転写因子、チロシンキナーゼ等の細胞内シグナル伝達分子およびアポトーシス経路に関与
する分子を包含する。細胞の浸透を可能にする官能基は、ペプチドまたは分子足場のいず
れかに付加されたペプチドまたは化学基を包含する。VP22、HIV−Tat、ショウ
ジョウバエ(Drosophila)のホメオボックスタンパク質(アンテナペディア)等に由来す
るペプチド等、ペプチドは、例えば、Chen and Harrison、Bioch
emical Society Transactions(2007)35巻、パート
4、821頁「Cell−penetrating peptides in drug
development:enabling intracellular targ
ets」およびGuptaらによる「Intracellular delivery
of large molecules and small peptides by
cell penetrating peptides」Advanced Drug
Discovery Reviews(2004)57巻9637に記載されている。
細胞膜を通した転位置において効率的であることが示された短いペプチドの例として、シ
ョウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の16アミノ酸ペネトラチン(penetrat
in)ペプチド(Derossiら(1994)J Biol.Chem.269巻、10
444頁「The third helix of the Antennapedia
homeodomain translocates through biolog
ical membranes」)、18アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」(Oeh
lkeら(1998)Biochim Biophys Acts 1414巻127頁
「Cellular uptake of an alpha−helical amp
hipathic model peptide with the potentia
l to deliver polar compounds into the ce
ll interior non−endocytically」)およびHIV TA
Tタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチは、生体分
子に容易に付けることができる小分子模倣物またはSMOCの使用を包含する(Okuy
amaら(2007)Nature Methods 4巻153頁「Small−mo
lecule mimics of an a−helix for efficien
t transport of proteins into cells」。分子にグ
アニジウム基を付加する他の化学的戦略も、細胞浸透を増強させる(Elson−Scw
abら(2007)J Biol Chem 282巻13585頁「Guanidin
ylated Neomcyin Delivers Large Bioactive
Cargo into cells through a heparin Sulp
hate Dependent Pathway」)。ステロイド等、低分子量の分子を
分子足場に付加して、細胞への取り込みを増強させることができる。
vまたはシングルドメイン断片等、その結合断片を包含する。特に、in vivoにお
けるペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体を用
いることができる。
もできる。
上、24時間以上、2日間以上、3日間以上、4日間以上、5日間以上、6日間以上、7
日間以上、8日間以上、9日間以上、10日間以上、11日間以上、12日間以上、13
日間以上、14日間以上、15日間以上または20日間以上からなる群から選択されるt
β半減期を有する。有利には、本発明にかかるペプチドリガンドエフェクター基または組
成物は、12〜60時間の範囲内のtβ半減期を有するであろう。さらに別の実施形態に
おいて、これは、1日間以上のt半減期を有するであろう。さらにまた別の実施形態にお
いて、これは、12〜26時間の範囲内であろう。
およびカルボプラチン等のアルキル化剤ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シ
クロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド;プリン類似体、アザチオプリンお
よびメルカプトプリンを包含する抗代謝剤))またはピリミジン類似体;ビンクリスチン
、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシン等、ビンカアルカロイドを包含する植
物アルカロイドおよびテルペノイド;ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドお
よびテニポシド;本来タキソールとして知られた、パクリタキセルを包含するタキサン;
カンプトテシンを包含するトポイソメラーゼ阻害剤:イリノテカンおよびトポテカン、な
らびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩およびテニポシドを包含するII
型阻害剤を包含する。さらに別の薬剤は、免疫抑制薬ダクチノマイシン(腎臓移植におい
て用いられる)、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンその他を包含する抗腫
瘍抗生物質を包含することができる。
き換える、酵素/プロドラッグ治療法において用いるためのカルボキシペプチダーゼG2
等、酵素も包含する。
対象のポリペプチドを本発明に従って単離または同定した後、その後の続く合成は、可
能な場合はいつでも単純化し得ることに留意されたい。よって、ポリペプチドの群または
セットは、組換えDNA技法により産生される必要はない。例えば、対象のポリペプチド
の配列を決定してよく、これを標準の技法によって合成によって製造し、次いで分子足場
とin vitroで反応させ得る。これを行う場合、ファージなどの遺伝的にコードさ
れている担体粒子の機能性または完全性を保存する必要はもはやないため、標準の化学を
使用し得る。これにより、さらなる下流の実験または妥当性確認のための、可溶性物質の
迅速な大スケールの調製が可能となる。この点において、Timmermanらに開示さ
れているものなどの慣用の化学を用いて、本発明の方法によって同定された候補またはリ
ードの大スケール調製を達成することができる。
明細書中に記載のように選択されたポリペプチドまたはコンジュゲートの製造にも関する
。一実施形態では、これらのステップは、ファージ上ではなく、化学合成によって作製さ
れた最終産物ポリペプチド/コンジュゲート上で実施する。
テップの後に、対象のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換し得る。
異性を導入することもできる。
されたリジン(および類似体)を用いて、そのN末端もしくはC末端においてまたはルー
プ内で単純に化学的に伸長させることができる。標準のタンパク質の化学を使用して、活
性化可能なNまたはC末端を導入し得る。あるいは、付加を、断片の縮合、もしくは、例
えば(Dawson PE、Muir TW、Clark−Lewis I、Kent,
SBH.、1994.、ネイティブ化学的ライゲーションによるタンパク質の合成(Sy
nthesis of Proteins by Native Chemical L
igation.)、Science、266:776〜779)に記載のネイティブ化
学的ライゲーションによって、または、酵素によって、例えば(サブチリガーゼ:タンパ
ク質の半合成のツール(Subtiligase:a tool for semisy
nthesis of proteins)、Chang TK、Jackson DY
、Burnier JP、Wells JA、Proc Natl Acad Sci
U S A.、1994年12月20日、91(26):12544〜8、もしくはプロ
テオミクスのためにタンパク質のN末端をサブチリガーゼで標識するための、生物有機お
よび医薬化学的文字のタグ(Bioorganic&Medicinal Chemis
try Letters Tags for labelling protein N
−termini with subtiligase for proteomics
)、第18巻、第22号、2008年11月15日、ページ6000〜6003、プロテ
オミクスのためにタンパク質のN末端をサブチリガーゼで標識するためのタグ(Tags
for labeling protein N−termini with sub
tiligase for proteomics)、Hikari A.I.Yosh
ihara、Sami MahrusおよびJames A.Wells)に記載のサブ
チリガーゼを用いて行い得る。
て延長または修飾し得る。これは、第1および第2のペプチドが、細胞の還元環境内に入
った後に互いに解離することを可能にするという追加の利点を有する。この場合、分子足
場(例えばTBMB)は、3つのシステイン基と反応するように、第1のペプチドの化学
合成中に付加することができ、その後、さらなるシステインを、このシステインが第2の
ペプチドの遊離システインのみと反応するように、第1のペプチドのN末端に付随させる
ことができる。
適用され、潜在的に四特異的分子を作製する。
、側鎖を介してNまたはC末端でカップリングさせて、達成し得る。一実施形態では、カ
ップリングは、どちらの実体の活性も遮断しないような様式で実施する。
二環式ペプチド(バイシクル;分子足場にコンジュゲートしたペプチド)を適した薬物
様分子へと開発するため、注射、吸入、経鼻、点眼、経口または局所的投与のいずれのた
めであれ、多数の特性を考慮する必要がある。次の記載は、少なくとも所定のリードバイ
シクルに設計される必要がある。
・ プロテアーゼ安定性、これが、血漿プロテアーゼ、上皮(「膜アンカー型」)プロテ
アーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼその他に
対するバイシクル安定性に関係するか否か。プロテアーゼ安定性は、バイシクルリード候
補が、動物モデルにおいて開発できると共に、自信を持ってヒトに投与できるように、異
なる種の間で維持されるべきである。
・ 分子の医薬品安定性プロファイルを改善するための、トリプトファンおよびメチオニ
ン等、酸化感受性残基の酸化抵抗性類似体への置き換え。
・ 製剤および吸収目的に重要な、荷電かつ親水性対疎水性残基の比例の関数である、望
ましい溶解性プロファイル。
・ 荷電対疎水性残基の正確な均衡。その理由として、疎水性残基は、血漿タンパク質結
合の程度、よって、血漿における遊離した利用できる画分の濃度に影響を与え、一方、荷
電残基(特にアルギニン)は、細胞表面におけるリン脂質膜とペプチドとの相互作用に影
響を与え得るからである。組み合わせた両者は、半減期、分布の体積およびペプチド薬物
への曝露に影響を与えることができ、臨床エンドポイントに応じて目的に合わせて作製す
ることができる。加えて、荷電対疎水性残基の正確な組合せおよび数は、注射部位におけ
る刺激作用を低下させることができる(ペプチド薬物を皮下投与した場合)。
・ 臨床適応および治療レジメンに応じた、目的に合わせた半減期。急性疾病管理設定に
おける短時間の曝露のための無修飾分子を開発する、あるいは血漿半減期を増強させる化
学修飾を有する、したがってより慢性病状の管理に最適な二環式ペプチドを開発すること
は、堅実な行為となろう。
り、ペプチド模倣薬の分野と重複する(総説のため、Gentilucciら、Curr
.Pharmaceutical Design、(2010)、16、3185〜20
3およびNestorら、Curr.Medicinal Chem(2009)、16
、4399〜418を参照)。
・ ペプチドの環化
・ NおよびC末端キャッピング、通常、N末端アセチル化およびC末端アミド化
・ タンパク質分解による攻撃部位(複数可)を明らかにし、潜在的に除去するためのア
ラニン走査
・ 立体障害により、また、β−ターンコンホメーションを安定化させるD−アミノ酸の
傾向によりタンパク質分解安定性を増加させるための、アミノ酸側鎖の立体要件を探るた
めのD−アミノ酸置き換え(Tugyiら(2005)PNAS、102(2)、413
〜418)
・ 解離しやすいアミド結合の直接的な修飾によりタンパク質分解からの保護を与えるた
めのN−メチル/N−アルキルアミノ酸置き換え(Fiaccoら、Chembioch
em.(2008)、9(14)、2200〜3)。N−メチル化は、ペプチド結合のね
じれ角における強い効果も有し、細胞浸透&経口利用能を助けると考えられる(Biro
nら(2008)、Angew.Chem.Int.Ed.、47、2595〜99)
・ 非天然のアミノ酸の組み入れ、即ち、次を用いることによる。
− プロテアーゼにより認識されないが、標的効力に効果を持たない、等比体積/等電
子側鎖
− 近くのペプチド結合のタンパク質分解による加水分解が、コンホメーション的およ
び立体的に妨害されるような、制約されたアミノ酸側鎖。特に、これらは、プロリン類似
体、巨大な(bulky)側鎖、Cα−二置換誘導体(最も単純な誘導体が、Aib、H2N
−C(CH3)2−COOHである場合)およびシクロアミノ酸(単純な誘導体がアミノ
−シクロプロピルカルボン酸である)に関係する。
・ ペプチド結合代用物、その例として次のものが挙げられる。
− N−アルキル化(上述、即ち、CO−NRを参照)
− 還元されたペプチド結合(CH2−NH−)
− ペプトイド(N−アルキルアミノ酸、NR−CH2−CO)
− チオ−アミド(CS−NH)
− アザペプチド(CO−NH−NR)
− トランス−アルケン(RHC=C−)
− レトロインベルソ(Retro-inverso)(NH−CO)
− 尿素代用物(NH−CO−NHR)
・ ペプチド主鎖長のモジュレーション
− 即ち、β2/3−アミノ酸(NH−CR−CH2−CO、NH−CH2−CHR−
CO)
・ 主鎖コンホメーションを制約する、アミノ酸のアルファ−炭素における置換、最も単
純な誘導体はアミノイソ酪酸(Aib)である。
えば、酸化感受性アミノ酸(TrpおよびMet)の強力な置換の同定にも有用となり得
ることを明確に留意されたい。バイシクルリードAc−06−34−18(TMB)−N
H2が、タンパク質分解に対する抵抗性を与える2種の修飾、N/C末端キャッピングお
よび(二)環化を既に持つことにも留意されたい。
(i)ライブラリの構築
選択を意図するライブラリは、例えばWO2004/077062号に記載の当分野で
知られている技法、または本明細書中に記載のファージベクター系を含めた生物系を用い
て構築し得る。他のベクター系が当分野で知られており、他のファージ(例えばファージ
ラムダ)、細菌プラスミド発現ベクター、酵母ベクターを含めた真核細胞に基づく発現ベ
クターなどが含まれる。例えば、国際公開第2009098450号パンフレットまたは
Heinisら、Nat Chem Biol 2009、5(7)、502〜7を参照
されたい。
ニング手法に基づく。これらは単純であるが、ペプチドリガンドの大きなライブラリをス
クリーニングすることは不可能、または少なくとも非実用的に煩雑であるため、生物系の
威力を欠く。しかし、これらは、例えば、少数のペプチドリガンドのみをスクリーニング
する必要がある場合に有用である。しかし、そのような個々のアッセイによるスクリーニ
ングは時間がかかる場合があり、特定の標的との結合について試験することができるユニ
ークな分子の数は、一般に106個の化学的実体を超えない。
々な分子のサンプリングを可能にする。したがって、生物学的方法が本発明の応用におい
てより適切に使用され得る。生物学的手順では、分子を単一の反応器中でアッセイし、好
都合な特性(即ち結合)を有するものを、不活性の分子から物理的に分離する。1013
個を超える個々の化合物を同時に作製およびアッセイすることを可能にする選択戦略が利
用可能である。強力な親和性選択技法の例は、ファージディスプレイ、リボソームディス
プレイ、mRNAディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはRNA/D
NAアプタマー方法である。これらの生物学的なin vitro選択方法は、リガンド
レパートリーがDNAまたはRNAによってコードされていることが共通している。これ
らは、配列決定によって選択されたリガンドの繁殖および同定を可能にする。ファージデ
ィスプレイ技術は、例えば、事実上任意の標的に対して非常に高い結合親和性を有する抗
体の単離に使用されている。
1つまたは複数の核酸配列をライブラリベクター内にクローニングした後、発現前に突然
変異誘発を行うことによってクローニングした分子内に多様性を発生させ得るか、あるい
は、突然変異誘発の前にコードされているタンパク質を発現および選択し、さらなる選択
の回を行い得る。
の分子学的方法によって実施する。特に有用なものは、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちPC
Rである(本明細書中に参考として組み込まれているMullisおよびFaloona
(1987)Methods Enzymol.、155:335)。対象の標的配列を
増幅するために熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼによって触媒される、複数の
サイクルのDNA複製を使用するPCRは、当分野で周知である。様々な抗体ライブラリ
の構築は、Winterら(1994)Ann.Rev.Immunology、12、
433〜55、およびそれ中に引用される参考文献中に記述されている。
規合成し、適切な発現ベクター内に挿入する。ペプチド合成は、上述のように当分野で知
られている標準の技法によって実施することができる。Applied Biosyst
ems ABI433(Applied Biosystems、米国カリフォルニア州
Foster City)などの自動ペプチド合成機が広く利用可能である。
一実施形態では、対象のポリペプチドは、遺伝的にコードされている。これは、増強さ
れた多様性と共に取扱いの容易性の利点を提供する。遺伝的なポリペプチドライブラリの
一例はmRNAディスプレイライブラリである。別の例は、ファージディスプレイライブ
ラリなどの複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ(rgdp)ライブラリである。一
実施形態では、対象のポリペプチドは、ファージディスプレイライブラリとして遺伝的に
コードされている。
子ディスプレイパッケージ(rgdp)を含む。これらの実施形態では、核酸はファージ
ゲノムによって含まれ得る。これらの実施形態では、ポリペプチドはファージのコートに
よって含まれ得る。
翻訳し、前記分子足場の分子を前記ポリペプチドと連結させることによって作製される、
遺伝的にコードされているポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを生成し得る。
ィスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイまたはmR
NAディスプレイによって作製し得る。
50号パンフレットに見出すことができる。
または群を標的と接触させ、前記標的と結合する1種または複数種のメンバー(複数可)
を単離することにより行うことができる。
グにおいて標的と接触させ、前記標的と結合する前記ライブラリのメンバーを同定する。
せ、前記標的と結合するメンバーを選択する。
詳細には、標的リガンドは、哺乳動物タンパク質もしくは昆虫タンパク質または細菌タン
パク質もしくは真菌タンパク質もしくはウイルスタンパク質であり得る。
含されることに留意されたい。一実施形態では、本発明のスクリーニング方法(複数可)
は、前記標的と結合することができるものとして単離された、一定量の本発明のポリペプ
チドを製造するステップをさらに含む。
明による分子足場に結合した二環ポリペプチドのNおよびC末端を結合させることによっ
て、分子足場に結合した三環ポリペプチドを作製することができる。この様式で、結合し
たNおよびC末端が第3のループを作り、三環ポリペプチドが作製される。本実施形態は
、ファージ上では実施する必要がなく、ここで述べた本発明のポリペプチド−分子足場の
コンジュゲート上で実施し得る。NおよびC末端の結合は、ルーチン的なペプチド化学の
事項である。指導が必要な場合は、C末端を活性化し得る、および/または例えばそれぞ
れの末端にシステインを付加するためにNおよびC末端を延長させ、その後、ジスルフィ
ド結合によってそれらを結合させ得る。あるいは、結合は、N/C末端内に組み込ませた
リンカー領域の使用によって達成し得る。あるいは、NおよびC末端は、慣用のペプチド
結合によって結合させ得る。あるいは、NおよびC末端を結合させる任意の他の適切な手
段を用いてもよく、例えば、N−C環化は、例えばLindeら、Peptide Sc
ience、90、671〜682(2008)「主鎖の環化およびメラノコルチンペプ
チドのN−メチル化の、構造−活性の関係性および代謝安定性の研究(Structur
e−activity relationship and metabolic st
ability studies of backbone cyclization
and N−methylation of melanocortin peptid
es)」、またはHessら、J.Med.Chem.、51、1026〜1034(2
008)「新規の経口投与薬としての主鎖環状ペプチド模倣体メラノコルチン−4受容体
作用剤は、肥満の処置をもたらした(backbone cyclic peptido
mimetic melanocortin−4 receptor agonist
as a novel orally administered drug lead
for treating obesity)」に開示されているように、標準の技法
によって行うことができる。そのような三環分子の一利点は、特にエクソプロテアーゼ作
用による、遊離末端のタンパク質劣化の回避である。この性質の三環ポリペプチドの別の
利点は、BSA結合、細胞進入もしくは輸送効果、タグ付けまたは任意の他のそのような
使用などの、一般に適用可能な機能のために第3のループを利用し得ることである。この
第3のループは典型的には選択に利用可能でなく(ファージ上ではなく、ポリペプチド−
分子足場のコンジュゲート上でのみ生成されるため)、したがって、他のそのような生物
学的機能におけるその使用は、特異性を選択/作製するためにループ1および2をどちら
も有利に残すことに留意されたい。
ファージを精製するための任意の適切な手段を使用し得る。標準の技法を本発明におい
て適用し得る。例えば、ファージは、濾過またはPEG沈殿などの沈殿によって精製し得
る。ファージ粒子は、以前に記載のようにポリエチレン−グリコール(PEG)沈殿によ
って生成および精製し得る。詳細は国際公開第2009098450号パンフレットにあ
る。
ing Design and Selection、2004、17(10):709
〜713.、化学合成抗体ライブラリからの光バイオセンサーの選択(Selectio
n of optical biosensors from chemisynthe
tic antibody libraries))を参照されたい。一実施形態では、
その中に教示されているようにファージを精製し得る。この出版物の本文は引用すること
により、ファージ精製の方法について本明細書中の一部をなすものとする。詳細には、J
espersらのページ709の右段の途中から開始される材料および方法のセクション
を参照されたい。
引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Marksら、J.Mol.Bi
ol、第222巻、ページ581〜597によって公開されているように精製し得る。
本発明は、生成物の遺伝的にコードされている要素の機能および完全性を有利に保持す
る、ポリペプチドの修飾の化学条件を活用する。具体的には、遺伝的にコードされている
要素が、それをコードしているファージの表面上にディスプレイされるポリペプチドであ
る場合、化学は、有利には、ファージの生物学的完全性を損なわせない。一般に、条件は
、国際公開第2009098450号パンフレットに記載されている。
本発明の方法に従って選択されたポリペプチドリガンドは、in vivo治療および
予防適用、in vitroおよびin vivo診断適用、in vitroアッセイ
および試薬適用その他において用いることができる。選択されたレベルの特異性を有する
リガンドは、交差反応性が望ましい非ヒト動物における検査に関与する適用において、あ
るいはホモログまたはパラログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断適用に
おいて有用である。ワクチン適用等、一部の適用において、所定の範囲の抗原に対する免
疫応答を誘発する能力を活用して、ワクチンを特異的疾患および病原体の目的に合わせる
ことができる。
与に好ましく、98〜99%またはそれより高い均一性が、特に哺乳動物がヒトである場
合に製薬的な使用に最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均一性まで精製した後、
選択されたポリペプチドを、診断もしくは治療(体外が含まれる)において、またはアッ
セイ手順、免疫蛍光染色などの展開および実行において使用し得る(Lefkovite
およびPernis、(1979および1981)免疫学的方法(Immunologi
cal Methods)、第IおよびII巻、Academic Press、NY)
。
菌またはウイルス感染症、および自己免疫障害(それだけには限定されないが、I型糖尿
病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無
力症が含まれる)の予防、抑制または処置において使用が見つかる。
抑制」とは、誘導現象の後であるが、疾患の臨床的所見の前に組成物を投与することをい
う。「処置」とは、疾患の症状が顕性となった後に保護的組成物を投与することを含む。
グするために使用できる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、本発明
により促進されて、ヒトおよび動物標的と交差反応し得るポリペプチドリガンドの開発を
可能にし、動物モデルの使用を可能にする。
られている(Knightら(1978)J Exp.Med.、147:1653、R
einerstenら(1978)New Eng.J:Med.、299:515)。
重症筋無力症(MG)は、SJL/J雌マウスにおいて、別の種からの可溶性AchR
タンパク質を用いて疾患を誘導することによって試験する(Lindstromら(19
88)Adv.Inzn7unol.、42:233)。関節炎は、マウスの感受性株に
おいてII型コラーゲンを注射することによって誘導する(Stuartら(1984)
Ann.Rev.Immunol.、42:233)。感受性ラットにおいてマイコバク
テリア熱ショックタンパク質を注射することによってアジュバント関節炎を誘導するモデ
ルが記載されている(Van Edenら(1988)Nature、331:171)
。甲状腺炎は、マウスにおいて記載のようにサイログロブリンを投与することによって誘
導する(Maronら(1980)J.Exp.Med.、152:1115)。インス
リン依存性真性糖尿病(IDDM)は、Kanasawaら(1984)Diabeto
logia、27:113によって記載されているものなどの特定のマウス株において自
然に発生するか、または誘導することができる。マウスおよびラットにおけるEAEは、
ヒトにおけるMSのモデルとして役割を果たす。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパ
ク質を投与することによって脱髄性疾患が誘導される(Paterson(1986)免
疫病理学の教科書(Textbook of Immunopathology)、Mi
scherら編、GruneおよびStratton、New York、ページ179
〜213、McFarlinら(1973)Science、179:478、ならびに
Satohら(1987)J;Immunol.、138:179を参照)。
に利用される。典型的には、これらの担体には、生理食塩水および/または緩衝媒体を含
めた、任意の水性またはアルコール/水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経
口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび
塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルが含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液に保つ
ために必要な場合は、適切な生理的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセル
ロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどのシックナーから選択
し得る。
補充液ならびに電解質補充液が含まれる。また、抗微生物、抗酸化剤、キレート化剤およ
び不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る(Mack(1982)レミン
トンの製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Scien
ces)、第16版)。
使用し得る。これらには、シルコスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたは
シスプラチン、および免疫毒素などの、抗体、抗体断片および様々な免疫治療薬が含まれ
る場合がある。医薬組成物には、様々な細胞毒性がある薬剤または他の薬剤と、本発明の
選択された抗体、その受容体もしくは結合タンパク質、またはさらには様々な標的リガン
ドを用いて選択されたポリペプチドなどの様々な特異性を有する本発明による選択された
ポリペプチドの組合せとを併せた「カクテル」が含まれる場合があり、これらを投与前に
プールするかどうかに拘らない。
意のものであり得る。それだけには限定されないが免疫療法を含めた治療には、本発明の
選択された抗体、その受容体または結合タンパク質は、標準の技法に従って任意の患者に
投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路、ま
た、適切には、カテーテルを用いた直接輸液によるものを含めた、任意の適切な様式であ
ることができる。用量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時
投与、対抗適応症ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータに依存する。
ことができる。この技法は有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾
燥および再構成の技法を用いることができる。当業者には、凍結乾燥および再構成は様々
な度合の活性の損失をもたらす場合があり、補償するために使用レベルを上方調節する必
要があり得ることが理解されよう。
たは治療的な処置のために投与することができる。特定の治療的の応用では、選択された
細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、変調、死滅、または何らかの他の測定可能
なパラメータを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。こ
の用量を達成するために必要な量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態
に依存するが、一般に体重1キログラムあたり0.005〜5.0mgの選択されたペプ
チドリガンドの範囲であり、0.05〜2.0mg/kg/用量の用量がより一般的に使
用される。予防的な応用では、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する
組成物を、同様または僅かに低い用量で投与してもよい。
細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去を支援するために、予防的および治療的な設
定で利用し得る。さらに、本明細書中に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーは
、不均一な細胞のコレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇または他の様式で有効に除
去するために、体外またはin vitroで選択的に使用し得る。哺乳動物からの血液
を体外で選択されたペプチドリガンドと合わせ、これにより所望しない細胞を死滅させる
または他の様式で血液から除去して、標準の技法に従って哺乳動物に戻し得る。
所望の多様性は通常、1個または複数個の位置における選択された分子の変動により生
じる。変化する位置は、ライブラリが、ループ配列における個々の位置毎に構築されるよ
うに選択される。例えば、このような位置が、活性を失うことなく変異に利用できないこ
とが明らかになる場合、適宜、選択手順から1個または複数個の位置を省略することがで
きる。
置き換えられ、非常に大多数の変異体を産生するランダム化により、あるいは常在アミノ
酸を定義されたサブセットのアミノ酸の1個または複数個と置き換え、より限定的な数の
変異体を産生することにより、変種を達成することができる。
入するための方法も、本技術分野でよく知られており、PCRを使用した、あるいは使用
しない、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドの使用を包含する
。例えば、抗原結合ループへの変異を標的化することにより、数種の合成抗体ライブラリ
が作製された。本発明の文脈において、同一の技法を用いることができる。例えば、ヒト
破傷風トキソイド結合FabのH3領域がランダム化されて、様々な範囲の新しい結合特
異性を生じた(Barbasら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、89:4457)。ランダムまたはセミランダム(semi-random)H3およびL3
領域が、生殖系列V遺伝子セグメントに付属されて、変異導入されたフレームワーク領域
を有する大型のライブラリを生じた(Hoogenboom−&Winter(1992
)R Mol.Biol.、227:381;Barbasら(1992)Proc.N
atl.Acad.Sci.USA、89:4457;Nissimら(1994)EM
BO J、13:692;Griffithsら(1994)EMBO J、13:32
45;De Kruifら(1995)J.Mol.Biol.、248:97)。かか
る多様化は、他の抗原結合ループの一部または全部を包含するよう伸長された(Cram
eriら(1996)Nature Med.、2:100;Riechmannら(1
995)BiolTechnology、13:475;Morphosys、国際公開
第97/08320号パンフレット、上記参照)。
ましい方法は、変異体ポリペプチドをde novo合成するものである。構造化ポリペ
プチドの突然変異誘発は、ライブラリ構築に関連して上述されている。
ファージライブラリのクローニング
Heinisら、Nat Chem Biol 2009、5(7)、502〜7)に
従ってファージライブラリを作製した。Heinisらにおいて、配列Xaa−Cys−
(Xaa)3−Cys−(Xaa)3−、リンカーGly−Gly−Ser−Glyなら
びに2個のジスルフィドフリードメインD1およびD2を有するセミランダムペプチドを
コードする遺伝子(Katherら、J Mol Biol 2005、354(3)、
666〜78)を、正確な配向性でファージベクターfd0D12にクローニングして、
「ライブラリ3×3」を得た。ペプチドレパートリーおよび2種の遺伝子3ドメインをコ
ードする遺伝子を、2回の連続的PCR反応において段階的に作製した。最初に、D1お
よびD2の遺伝子を、ベクターfdg3p0ss21(Katherら、J Mol B
iol 2005、354(3)、666〜78)を鋳型として用いて2種のプライマー
prepcr(5’−GGCGGTTCTGGCGCTGAAACTGTTGAAAGT
AG−3’)およびsfi2fo(5’−GAAGCCATGGCCCCCGAGGCC
CCGGACGGAGCATTGACAGG−3’;制限部位を下線で示す)によりPC
R増幅した。第二に、プライマーsficx3ba:5’−TATGCGGCCCAGC
CGGCCATGGCANNKTGTNNKNNKNNKTGCNNKNNKNNKNN
KTGTNNKGGGCGGTTCTGGCGCTG−3’(制限部位を下線で示す)お
よびsfi2foを用いたPCR反応において、ランダムペプチドをコードするDNAを
加えた。55および11μgのSfiI消化されたfd0D12プラスミドおよびPCR
産物のライゲーションは、10個の20×20cmクロラムフェニコール(30μg/m
l)2YTプレートに5.6×108個のコロニーを生じた。2YT培地のプレートから
コロニーを掻き取り、15%グリセロールを補充し、−80℃で貯蔵した。本明細書に記
載されているライブラリの構築は、例えば3×3ライブラリのためにセミランダムペプチ
ドPro−Ala−Met−Ala−Cys−(Xaa)3−Cys−(Xaa)3−C
ysを作製するための同一技法を用い、従って、sficx3baプライマー配列を5’
−TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCATGTNNKNNKNNKTGC
NNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG−3’に置き換えた。同一
方法論に従って他のループ長を有するライブラリを作製した。
ファージライブラリのグリセロールストックを、500mlの2YT/クロラムフェニ
コール(30μg/ml)培養においてOD600=0.1となるよう希釈し、ファージ
を30℃で一晩(15〜16時間)産生させた。ファージを精製し、Heinisら、N
at Chem Biol 2009、5(7)、502〜7に記載されている通りに化
学修飾した。ビオチン化hPK(3μg)(IHPKA、ヒト血漿由来、Innovat
ive Research、米国ミシガン州ノバイ)を、50μlの予め洗浄した磁気ス
トレプトアビジンビーズ(Dynal、M−280、Invitrogen製、英国ペー
ズリー)と共に10分間RTでインキュベートした。ビーズを3回洗浄し、その後、1%
BSAおよび0.1%Tween20を含有する0.5mlの洗浄バッファー(10mM
Tris−Cl、pH7.4、150mM NaCl、10mM MgCl2、1mM
CaCl2)により回転しつつ30分間RTでブロッキングした。3%BSAおよび0
.3%Tween20を含有する1mlの洗浄バッファーを添加することにより、化学修
飾したファージ(通常、2mlの洗浄バッファーに溶解した1010〜1011t.u.
)を同時にブロッキングした。次に、ブロッキングしたビーズを、ブロッキングした化学
修飾ファージと混合し、30分間回転ホイールにおいてRTでインキュベートした。ビー
ズを、0.1%Tween20を含有する洗浄バッファーで8回洗浄し、洗浄バッファー
で2回洗浄し、その後、100μlの50mMグリシン、pH2.2と共に5分間インキ
ュベーションした。溶出されたファージを、中和のために50μlの1M Tris−C
l、pH8に移し、OD600=0.4のTG1細胞30mlと共に90分間37℃でイ
ンキュベートし、大型の2YT/クロラムフェニコールプレート上に細胞を播種した。同
一手順を用いて1または2回の追加的なラウンドのパニングを行った。2回目の選択ラウ
ンドにおいて、ニュートラアビジンでコーティングした磁気ビーズを用いて、ストレプト
アビジン特異的ペプチドの濃縮を防いだ。サプライヤーの説明書に従って0.8mgのニ
ュートラアビジン(Pierce、米国イリノイ州ロックフォード)を0.5mlのトシ
ル活性化磁気ビーズ(Dynal、M−280、Invitrogen製、英国ペーズリ
ー)と反応させることにより、ニュートラアビジンビーズを調製した。
proTEV開裂部位を介してN末端において触媒ドメインと連結したプロペプチドを
有する不活性前駆体として、ヒト、サルおよびラットPKの触媒ドメインを哺乳類細胞に
おいて発現させた。発現ベクターをクローニングし、次の通りにタンパク質を発現させ、
活性化し、精製した。PKシグナル配列、ポリヒスチジンタグ、proTEV開裂部位、
PKの成熟触媒ドメインおよび終止コドンをコードする合成遺伝子は、Geneart(
ドイツ、レーゲンスブルク)から購入した(補足材料)。ヒト、サル(アカゲザル(Maca
ca mulatta))およびラットPKの合成遺伝子を含有するプラスミドDNAを調製し、制
限酵素ペアXhoIおよびHindIII(Fermentas、ラトビア、ヴィルニウ
ス)ならびにT4 DNAリガーゼ(Fermentas)を用いて、この遺伝子をpE
XPR−IBA42哺乳類発現ベクター(IBA Biotechnology、ドイツ
、ゲッティンゲン)に移した。ライゲーションしたプラスミドをXL−1 blueエレ
クトロコンピテント細胞(Stratagene、米国サンタ・クララ)に形質転換し、
アンピシリン(10μg/ml)を含有する2YT寒天プレート上に蒔いた。3種の発現
ベクター(mPK、rPKおよびhPKと命名)から得られたDNAを作製し、DNA配
列決定(Macrogen、韓国ソウル)により正確な配列を確認した。
0mlの懸濁液に順応したHEK−293細胞を、4mMグルタミンおよびヒストン脱ア
セチル化酵素阻害剤バルプロ酸(3.75mM)の存在下の無血清ExCell 293
培地(SAFC Biosciences、ミズーリ州セントルイス)において、ISF
−4−Wインキュベーター(Kuhner AG、スイス、バースフェルデン(Birsfeld
en))内の軌道回転により180rpmで振盪した100mlフラスコにおいて37℃、
5%CO2存在下で増殖させた。高い細胞密度(20×106細胞/ml)の胚性腎臓(
HEK−293)細胞(Backliwalら/Biotechnol Bioeng
2008、99(3)、721〜7)に、直鎖状ポリエチレンイミン(PEI、Poly
sciences、ドイツ、エッペンハイム(Eppenheim))を用いて3種のプラスミド
(300μg/ml)を遺伝子導入した。7日間の生産段階の終わりに、2’500rp
m、15分間4℃の遠心分離により細胞を収集した。0.45μmのPES膜(Filt
er−top 250ml低タンパク質結合TPP)を通した濾過により、いかなる追加
的な細胞デブリも培地から除去した。Ni−NTA樹脂、洗浄バッファー(500mM
NaCl、25mM Na2HPO4、pH7,4)および溶出バッファー(500mM
NaCl、25mM Na2HPO4、pH7,4、500mMイミダゾール)を用い
たNiアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリヒスチジンのタグ付きタンパク質
を精製した。(50ユニット)proTEV(Promega、米国ウィスコンシン州マ
ディソン)によりタンパク質を部分的に活性化させ、Niアフィニティークロマトグラフ
ィーおよびゲル濾過(PD10カラム、150mM NaCl、0,5mM EDTA、
50mM HEPES、pH7)によりさらに精製した。
個々の位置のランダム化
ライブラリ構築:カリクレイン結合二環式ペプチドにおけるアミノ酸をマッピングする
ため、小型のライブラリのセットを構築した。5残基のループ2個で構成されるバイシク
ルのため、ペプチド配列における特定のコドンにランダム化を有する10種の別々のライ
ブラリを作製した。部位特異的突然変異誘発によりファージゲノムDNAに変異導入する
ため、ライブラリ毎にオリゴヌクレオチドを設計した。突然変異誘発は、対象とするコド
ンのランダム化(NNSへと変化)および鋳型ゲノム配列からのユニークなApaL1制
限部位の除去を組み入れた。QIAgen QIAquick PCR精製キットを用い
て突然変異誘発産物を精製し、超純水へと溶出した。各ライブラリを用いて、BioRa
d Micropulser機械(Ec1プログラム)および1mm BioRadキュ
ベットを用いたエレクトロポレーションにより、TG1大腸菌(E coli)を別々に形質転
換した。1mlのSOC培地において37℃で1時間回復させた後、ライブラリ形質転換
体のみを選択的に増殖させるための抗生物質を含有する25mlの2TYブロスにおいて
、ライブラリ形質転換体を一晩増殖させた。遠心分離により細菌を収集し、QIAgen
Plasmid Plus Midiキットを用いて大腸菌からライブラリファージD
NAを精製し、蒸留水に溶出させた。精製されたDNAを、New England B
iolabsバッファー4においてApaL1で2時間消化して、親材料を除去した。消
化後、QIAgen PCR精製キット(上述)を用いてDNAを再精製し、TG1の形
質転換に用いた(エレクトロポレーション;上に記載)。SOCにおいて1時間回復させ
た後、選択的抗生物質を含有するLB寒天プレート上に形質転換体を蒔き、一晩37Cで
コロニーを形成するよう増殖させた。
選択的抗生物質を含有する2TYブロスにおいて個々の培養物として増殖させた。採取さ
れたコロニーを、QIAgen PyroMark Q96 DNAシーケンサーを用い
てDNA配列決定して、各クローンに存在するアミノ酸置換を明らかにした。単離された
ら、ユニークな置換それぞれのクローンを、ヒト血漿カリクレイン結合に関して次の通り
にアッセイした。培養物からファージを含有する上清を収集し、Heinisらの方法(
Nature Chemical Biology 5巻、502〜507頁(2009
))に基づき、トリスブロモメチルベンゼン(TBMB)によりファージを環化した。こ
のプロセスにより精製されたファージを、均質なプレートに基づく結合アッセイを用いて
ビオチン化ヒト血漿カリクレインとの結合に関してアッセイした。アッセイ読み取り値は
、BMG Labtech Pherastar FSプレートリーダーにおいて測定し
た。3回複製したアッセイ試料の定量的結合データを平均し(平均値)、シグナル:バッ
クグラウンド(バックグラウンドは、標的材料なしでアッセイした試料である)として表
した。シグナル:バックグラウンドは、対応する親試料の%として表した。エラーバーは
、平均値の標準偏差を表示する。示されているアッセイは、少なくとも2回の独立的実験
の代表である。アッセイデータは、ペプチド配列と相関した。灰色でマークした置換は検
査しなかった(クローンは、ランダムライブラリサンプリングから単離されなかった)。
アッセイベースラインの図示と並行して、非結合(任意)バイシクルの試料をアッセイし
た。
ライブラリ構築:上述の「ファージライブラリのクローニング」に記載されているHe
inisらの方法に従って、小型のファージライブラリを作製した。バイシクルコード部
分が、NNSにランダム化された4〜6個のコドンのみを有する親5×5バイシクル(5
×5:2個の5残基ループ)DNA配列に基づくように、sficx3baプライマーを
修飾した。ランダム化されたコドンは、対象とするペプチドドメイン/モチーフをコード
するコドンであった。
ットコロニーを採取し、選択的抗生物質を含有する2TYブロスにおいて個々の培養物と
して増殖させた。採取されたコロニーを、QIAgen PyroMark Q96 D
NAシーケンサーを用いてDNA配列決定して、各クローンに存在するアミノ酸置換を明
らかにし、また、次の通りヒト血漿カリクレイン結合に関してアッセイした。培養物から
ファージを含有する上清を収集し、Heinisらの方法(Nature Chemic
al Biology 5巻、502〜507頁(2009))に基づきトリスブロモメ
チルベンゼン(TBMB)によりファージを環化させた。このプロセスにより精製された
ファージを、均質なプレートに基づく結合アッセイを用いてビオチン化ヒト血漿カリクレ
インとの結合に関してアッセイした。アッセイ読み取り値は、BMG Labtech
Pherastar FSプレートリーダーにおいて測定した。2回複製したアッセイ試
料の定量的結合データを平均し(平均値)、シグナル:バックグラウンドとして表した。
示されているアッセイデータは、少なくとも2回の独立的な実験の代表である。アッセイ
データは、ペプチド配列と相関した。
表1および表2にペプチド配列を示す。ペプチド合成は、Peptide Instr
umentsにより製造されたSymphonyペプチド合成機を用いたFmoc化学に
基づいた。次の側鎖保護基と共に標準Fmoc−アミノ酸を用いた(Sigma、Mer
ck):Arg(Pbf);Asn(Trt);Asp(OtBu);Cys(Trt)
;GIu(OtBu);Gln(Trt);His(Trt);Lys(Boc);Se
r(tBu);Thr(tBu);Trp(Boc)、Tyr(tBu)(Sigma)
。カップリング試薬は、HCTU(Pepceuticals)であり、ジイソプロピル
エチルアミン(DIPEA、Sigma)を塩基として用い、DMFにおける20%ピペ
リジン(AGTC)により脱保護を達成した。0.37mモル/gr Fmoc−Rin
kアミドAM樹脂(AGTC)を用いて100uモルスケールで合成を行い、Fmoc−
アミノ酸を4倍過剰で利用し、塩基は、アミノ酸に対して4倍過剰であった。アミノ酸を
DMFにおいて0.2Mとなるよう溶解し、HCTUを0.4MとなるようDMFに溶解
し、DIPEAを1.6MとなるようN−メチルピロリドン(Alfa Aesar)に
溶解した。カップリング時間は一般に、30分間であり、脱保護時間は、2×2.5分間
であった。Fmoc−N−メチルグリシン(Fmoc−Sar−OH、Merck)は1
時間カップリングし、続く残基の脱保護およびカップリング時間は、それぞれ20分間お
よび1時間であった。合成後、樹脂をジクロロメタンで洗浄し、乾燥させた。10mLの
95:2.5:2.5:2.5v/v/v/wのTFA/H2O/iPr3SiH/ジチ
オスレイトールを3時間用いて、支持体からの側鎖保護基の開裂を引き起こした。開裂後
に、使用済み樹脂を濾過により除去し、−80セ氏温度で冷却しておいた35mLのジエ
チルエーテルに濾液を添加した。ペプチドペレットを遠心分離し、エーテル系(etheric
)上清を廃棄し、ペプチドペレットを冷エーテルでさらに2回洗浄した。次に、ペプチド
を5〜10mLのアセトニトリル−水に再溶解し、凍結乾燥させた。質量分析(MALD
I−TOF、Voyager DE、Applied Biosystems製)による
粗生成物の純度解析のため、少量の試料を取り分けた。凍結乾燥後に、ペプチド粉末を取
り出して、0.5mLの1Mジチオスレイトール(dithiothreitrol)を補充したH2O
における10mLの6Mグアニジン塩酸塩に入れ、C8 Luna調製用HPLCカラム
(Phenomenex)に充填した。溶媒(H2O、アセトニトリル)を0.1%ヘプ
タフルオロ酪酸で酸性化した。30〜70%アセトニトリルに及ぶ勾配、15分間、流速
15/20mL/分、Gilson調製用HPLCシステム使用。純粋な直鎖状ペプチド
材料を含有する画分(MALDIにより同定)を組み合わせ、トリスブロモメチルベンゼ
ン(TBMB、Sigma)により修飾した。このため、最大ほぼ35mLのH2Oで直
鎖状ペプチドを希釈し、アセトニトリルにおけるほぼ500uLの100mM TBMB
を添加し、H2Oにおける5mLの1M NH4HCO3(pH8)により反応を開始し
た。ほぼ30〜60分間RTで反応を進行させ、反応が完了したら(MALDIにより判
断)凍結乾燥した。凍結乾燥後、Luna C8をGemini C18カラム(Phe
nomenex)に置き換え、酸を0.1%トリフルオロ酢酸に変える以外は上述の通り
に、修飾されたペプチドを精製した。正確なTMB修飾材料を含有する純粋な画分をプー
ルし、凍結乾燥し、貯蔵のため−20セ氏温度に維持した。
4PhenylPro、Agb、Agp、NMe−Arg、Pen、Tic、Aib、H
yp、NMe−Ala、NMe−Cys、4,4−BPAl、3,3−DPA、Dpg、
1NAl、2NAl、Aze、4BenzylPro、Ind)は通常、1時間(20分
間の脱保護)カップリングされ、続く残基は6時間であった(20分間の脱保護)。HC
TUは、前述同様にカップリング試薬として用いた。スケールは通常、50uモルであっ
た。
黒一色の(solid black)96ウェルプレートにおいて、10mM Tris HCl
、150mM NaCl、10mM MgCl2、1mM CaCl2および1mg/m
L BSA(全てSigma UK)pH7.4において25℃で機能的酵素アッセイを
行った。要約すると、26.5pMヒト血漿カリクレイン(Stratech、英国から
購入)または500pMラット血漿カリクレイン(研究室内で発現および精製)を、増加
濃度の被験ペプチドの非存在または存在下で15分間インキュベートし、その後、最終ア
ッセイ濃度が4%DMSOにおける100μMとなるよう、蛍光発生基質Z−PheAr
g−AMC(Enzo Lifesciences英国)を添加した。Pherasta
r FS(BMG Labtech)を用いて、励起360nm、発光460nmでAM
Cの遊離を測定した。通常5〜45分間である反応の線形位相の速度を、MARSデータ
解析ソフトウェア(BMG labtech)において計算した。次に、この速度を用い
て、Prism(GraphPad)においてIC50およびKiを計算した。4種のパ
ラメータ阻害非線形回帰方程式を用いて、IC50を計算した。1部位適合Ki方程式を
用いてKiを計算し、Kiを150μMの基質のKmに制約した。全Ki/IC50値は
、少なくとも2回の独立的な実験の平均値であり、1nMより低いKi値を有するペプチ
ドに関しては少なくとも3回である。
した。280nmにおける吸収測定の前に、全溶液を遠心分離し、濾過(20μmシリン
ジフィルター)した。ペプチドのTrp/Tyr含量およびTMBの該含量(TMBコア
は、ペプチドに含有される場合は、ほぼ300M−1cm−1のεを有する)に基づき消
衰係数を計算した。疑われる発色団特性を有する非天然のアミノ酸を含有するペプチド(
即ち、NorHar、4PhenylPro、3Pal、4Pal、Tic、4Guan
Phe、4,4−BPAl、3,3−DPA、1NAl、2NAl、4BenzylPr
o、Ind)のため、粉末を秤量し、ペプチドを規定の量の水に溶解することにより濃度
を決定した。1nM以下のカリクレインに対するKiを有するペプチドのため、これらを
独立的に2回調製した。
血漿におけるバイシクル(分子足場にコンジュゲートしたペプチド)の安定性を評価す
るため、3通りの方法を用いた。
親ペプチド質量が観察不能となる時点まで親質量の質量分析による検出(MALDI−
TOF、Voyager DE、Applied Biosystems)を用いた、迅
速な血漿安定性プロファイリングアッセイを開発した。特に、1×PBS(10×PBS
ストック、Sigmaに由来)を補充した、35%ラットまたはヒト血漿(Sera l
abs、抗凝血薬としてクエン酸塩を使用)の存在下で37セ氏温度にて200uMのペ
プチドをインキュベートした。様々な時点において(即ち、t=0、3、24時間、その
後は毎日、最大10日間)、アセトニトリル:H2Oの1:1混合物における18uLの
30mM重炭酸アンモニウムに、2uLの試料を添加した。解析時まで−80セ氏温度で
試料を凍結した。ペプチドの近似検出ウィンドウを決定する質量分析による解析のため、
所定の時点のアセトニトリル:H2Oで希釈した試料をMALDIプレート上に直接的に
スポットした(0.7uL)。マトリックス(アルファ−シアノ桂皮酸、Sigma、0
.1%トリフルオロ酢酸を含有する1:1アセトニトリル:水における飽和溶液として調
製)を試料の上に重層した(1uL)。MALDI TOFにおける同様のレーザー強度
設定で、時間は、親ペプチドが検出不能となるまでに決定することができる。この方法は
、血漿安定性における相対的変化の検出に役立つ定性的アッセイであることに留意された
い。
安定性データをより迅速に得るため、95%血漿におけるペプチドも評価した。そこで
は、PBSを省略し、1mMペプチドストック(DMSOに溶解)を血漿において直接的
に希釈し(即ち、47.5uLの血漿における2.5uLストック)、最終濃度50uM
を得た。適切な時点で5uLの試料を採取し、−80セ氏温度で凍結した。解析のため、
試料を解凍し、15uLの1:1アセトニトリル:メタノールと混合し、13kで5分間
遠心分離した。5uLのペプチドを含有する上清を吸引し、アセトニトリル:H2Oの1
:1混合物における30mM重炭酸アンモニウムと混合した。次に、このうち1uLをM
ALDIプレート上にスポットし、上に記載されている通りに解析した。上述の通り、こ
の方法は、血漿安定性における相対的変化の検出に役立つ定性的アッセイであることに留
意されたい。
血漿安定性を定量的に得るため、ペプチドストック溶液(1mM、DMSOに溶解)を
Biofocus、英国に輸送し、そこで解析を行った。ペプチドを100uMとなるよ
う水で希釈し、血漿において1:20希釈し(5uM最終濃度、95%の血漿による)、
適宜サンプリングし、上述の通り沈殿させ、Waters Xevo TQ−MSを用い
て定量化した。
表4に示す5×5ペプチドの例から、結合活性を有するペプチド間に保存されたアミノ
酸を同定することが可能である。いずれの残基が結合活性に好ましいか決定するため、ペ
プチドの同定されたファミリーの2種からの代表をさらに試験した。これらは、バイシク
ルの第1のループにおいてCXWPARCモチーフを含むペプチド06−34と、バイシ
クルの両方のループにわたりCGGxxNCRモチーフを含むペプチド06−56であっ
た。ペプチド配列毎に10種のファージライブラリのセットを作製し、このセットにおい
て、ループ残基の9個が一定に維持され、ライブラリにおいて該位置に任意のアミノ酸が
発現できるよう、他の残基がランダム化された(上述の方法における「個々の位置のラン
ダム化−ライブラリ構築」を参照)。ライブラリ毎に、20種のランダムに選択されたフ
ァージクローンのセットを、ファージ結合アッセイにおいてヒトカリクレインへの結合に
関してスクリーニングして、標的結合に決定的な残基を同定した(上述の方法における「
個々の位置のランダム化−個々のクローンの結合のアッセイ」を参照)。本実験から得ら
れたデータを図4〜図6に示す。
置き換えることができ、ヒト血漿カリクレインへの結合が保持または増強されることが明
らかである。それに反して、大部分のアミノ酸による残基2、3、4、5(Trp2、P
ro3、Ala4、Arg5)の置き換えは、高親和性結合剤のストリンジェントなカッ
トオフにより設定されたアッセイにおいて観察されるシグナルを大幅に低下させた。Va
l6は、多くの異なるアミノ酸により置き換えることができ、結合活性は、保持または増
強される。第2のループにおける他の残基の置き換えは、Leu10のみが、活性を保持
しつつ種々の異なるアミノ酸により置き換えることができることを示した。位置7、8お
よび9は、置換のために限定的な能力を有し、結合を増強した置換は同定されなかった。
ン、トリプトファンおよびスレオニンと同様に、位置1および2におけるグリシンが、血
漿カリクレインへの結合に大いに好ましい残基であることが明らかである。位置4におけ
るグルタミンおよび位置10におけるスレオニンは、優れた結合活性を保持しつつ種々の
残基により置き換えることができる。3個の残る残基−位置1におけるプロリン、位置5
におけるアスパラギンおよび位置7におけるスレオニンは、置換のために限定的な能力を
有する。
先行する解析から、06−34に関し、位置1および位置6を種々のアミノ酸により置
き換えることができ、親ペプチド以上の結合活性を依然として保持することが明らかであ
る。これらの観察が、単離された合成ペプチドに合致するか評価するため、Arg1がセ
リンにより置き換えられ、Val6がスレオニン、メチオニンまたはロイシンのいずれか
により置換された図4における知見に従って、ペプチドのセットを設計した。これらの置
換の様々な組合せを用いるペプチドも合成した。これらの置換は、アッセイにおいてより
強い結合シグナルを生じた(表5)。
いてヒト血漿カリクレインに対しおよそ同等のまたは増強された活性を有し、この種の解
析を標的結合親和性の微調整に用いることができることを示し、非常に高い効力のリード
ペプチド候補を同定するための経路を示唆した。
した。Arg1からSer1への置換は、ラットカリクレインに対する活性において微々
たる影響を有し、一方、Val6のスレオニン、メチオニンまたはロイシンへの置換は、
ラット血漿カリクレインに対する効力が顕著に増加したペプチドを生じた。ヒトカリクレ
インに対する活性は、完全に保持された。よって、置換を受け入れられる位置を決定する
ことにより、標的オルソログ交差反応性等、望ましい特性を有するペプチドを同定するこ
とができる。
アミノ酸によるこれら2個の位置の置き換えの可能性を実証するため、06−34−03
におけるArg1およびVal6を、アラニンまたはN−メチルグリシン(サルコシン)
のいずれかに、あるいは位置1におけるN−メチルセリンに置き換え、結合に関して評価
した。著しいことに、表6に示す通り、R1A/V6A(06−34−03 Ala1,
6)ペプチドは、親と比較して完全な効力を保持したため、位置1/6は、共に側鎖の除
去を受け入れられる。N−メチルグリシンによる残基1、6の置き換え(06−34−0
3 NMeGly1,6)は、効力の低下を引き起こしたが、しかし、結合親和性は、低
いナノモル濃度範囲のままであった。位置1におけるN−メチルセリンの導入は、効力に
おいて10分の1への減少を引き起こすが、結合は、ピコモル濃度範囲のままである。よ
って、プロテアーゼ安定性の計画的な増強、溶解性の増強、凝集可能性の低下およびオル
ソロガス官能基の導入を達成し得る、ペプチド主鎖構造または側鎖に変化を生じるバイシ
クルにおける特定の位置を同定することができる。
WPARモチーフの代替物または改善を同定するため、実施例1から同定されたWPA
Rモチーフを、06−34−03ペプチドの文脈において解析した。06−34−03の
位置1、6、7、8、9&10が固定され、位置2、3、4&5がランダム化されたライ
ブラリを構築した(上述の方法における「ペプチドドメインのランダム化−ライブラリ構
築」を参照)。種々のストリンジェンシーで、ヒト血漿カリクレインに対する選択を行っ
た(上述の方法における「ファージ選択」を参照)。全アウトプット配列を同定し、標的
結合に関して解析した(上述の方法における「ペプチドドメインのランダム化−個々のク
ローンの結合のアッセイ」を参照)。表17は、ユニークな配列それぞれ、選択アウトプ
ットにおけるその相対的存在量(頻度)および標的結合強度に従ったランク数を収載する
。
ARモチーフが、ヒト血漿カリクレインへの最も優れた結合を与えることを示す。これら
の例として、WPSR、WPAR、WSAR、WPFR、WPYR、FPFR&FPFR
が挙げられるがこれらに制限されない。位置2、3、4&5における最も有効かつ豊富な
モチーフは、W/FPxK/Rと要約することができる。
おいて最も豊富であり;FPFR&FPYRが、より低いストリンジェンシーの選択アウ
トプットにおいて豊富であったことを示す。これは、WPAR様配列が、FPFR様配列
よりも強力な結合剤であることを示すであろう。標的結合アッセイにおける各モチーフ(
06−34−03文脈内の)の解析(表18(B))は、06−34−03配列の位置2
、3、4&5におけるWPARが、カリクレイン結合に最適の配列であることを明らかに
する。
WPARモチーフおよびその変異体をペプチド06−34−03の文脈内で試験してき
た。図1は、WPARモチーフの外側のいくつかの位置が、他の残基に置換した場合にカ
リクレイン結合を維持し得ることを実証する。カリクレイン結合の非WPAR決定因子を
試験するため、上述の方法における「ペプチドドメインのランダム化 − ライブラリ構
築」に記載されている通りに、固定されたWPAR配列およびランダム化された他のあら
ゆる位置(CxWPARCxxxxxC)を有するファージライブラリを作製した。
なし)、高および低ストリンジェンシーの両方でカリクレインへの結合に関してアッセイ
した(上述の方法における「ペプチドドメインのランダム化−個々のクローンの結合のア
ッセイ」を参照)。WPAR外側のランダム配列を含有するこれらのライブラリメンバー
は、ヒト血漿カリクレインへの結合を殆どまたは全く示さず(データ図示せず)、WPA
Rモチーフ単独の存在は、測定可能(measureable)なカリクレイン結合の保持に十分で
はなく、バイシクル配列の残りも相互作用に寄与または影響する筈であることを示した。
単離するため、このライブラリを用いてヒト血漿カリクレインに対する選択を行った。1
50種を超える選択アウトプット配列を単離し、ヒト血漿カリクレインへの結合に関して
スクリーニングした(上述の方法に記載の通り)。カリクレイン結合の順に配列をランク
付けし、表19において上位50配列を整列した。表19は、位置1における残基が、カ
リクレイン結合に影響を与えないが、位置7においてヒスチジンに対する強力な一致が観
察された(この結果は、上述の実施例1における知見を支持する)ことを示す。ペプチド
06−34−03(実施例1における実験に由来)は、最良の配列の一つである。第2の
ループの組成は、WPARモチーフと共に存在すると強力なカリクレイン結合を与える明
らかな傾向を示す。
れている。
える同定されたヒト血漿カリクレイン結合剤(選択アウトプット配列)を2通りの異なる
仕方で群分けした。全群に関して、アウトプット配列の平均カリクレイン結合アッセイシ
グナルを、所定の群のカリクレイン結合の測定値として記した(表20)。
」モチーフが、WPARモチーフを有する二環式ペプチドにおいて、最良のカリクレイン
結合をもたらすことを実証する。2種のモチーフの組合せ、「THxDL」は、ヒト血漿
カリクレインに対し最高の結合を与え、06−34−03ペプチドの「THQDL」第2
のループ配列を包含する。
カリクレイン阻害性バイシクルに関して、これは、血漿または他の関連する環境におい
てプロテアーゼによる低いクリアランスを有するような、妥当なプロテアーゼ安定性プロ
ファイルを得ることに関係する。ラット血漿における親ペプチドの進行性の消失を観察し
た迅速な比較血漿安定性アッセイ(方法の節、方法1)において、N末端アラニン(選択
の時点で存在し、本来、リード配列の合成ペプチドにおいて包含されていた)が、ラット
およびヒト血漿の両方により検査した全バイシクル配列にわたり迅速に除去されることが
判明した。この分解は、NおよびC末端アラニンの両方を欠くリード候補を合成すること
により回避された。アミノおよびカルボキシペプチダーゼの潜在的な認識ポイントを除去
するため、現在リード候補のCys1に存する自由なアミノ末端は、ペプチド合成の間、
無水酢酸でキャッピングされ、N末端がアセチル化された分子をもたらす。同等の測定に
おいて、C末端システインは、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認識ポイントを除去す
るために、アミドとして合成される。よって、二環式リード候補は、次の一般的な(gene
ric)配列を有する:
、「C1、C2、C3」は、配列における第1、第2および第3のシステインを指し、「
AA1」から「AAn」は、アミノ酸の位置を指し(その性質「AA」は、上述の選択に
より定義される)、「(TMB)」は、ペプチド配列が、TBMBまたはその他の適した
反応性足場により環化されたことを示す)。
方に対するAc−06−34−18(TMB)−NH2の高い親和性のため、本出願人ら
は、リード開発のためにこのバイシクルを選んだ。上述と同じ迅速血漿安定性プロファイ
リングアッセイを用いると、Ac−06−34−18(TMB)−NH2は、約2日間の
可観測性ウィンドウを有しており(方法の節、方法1)、これは、ほぼ2時間のラット血
漿半減期に等しい(LC/MSにより定量的に決定、後述を参照、表23、方法3)。
)を同定する試みにおいて、35%ラット血漿におけるこのペプチドを経時的にサンプリ
ングし(方法1)、MALDI−TOF質量分析を用いてペプチド断片の進行性の出現に
関して各試料を解析した。Ac−06−34−18(TMB)−NH2の親質量は、16
87Daである。経時的に(図7)、質量1548.6(M1)、1194.5(M2)
および1107.2(M3)の断片が出現する。Ac−06−34−18(TMB)−N
H2(Ac−C1S1W2P3A4R5C2L6H7Q8D9L10C3−NH2)の配
列から、M1のピークが、Arg5を欠くAc−06−34−18(TMB)−NH2(
−R5)に相当することを計算することができる。これは、最初のタンパク質分解性事象
であり、続いて、Ac−06−34−18(TMB)−NH2における4アミノ酸セグメ
ントWPARの除去が行われ(M2、−WPAR)、最終的にAc−06−34−18(
TMB)−NH2の第1のループ全体が切り取られる(M3、−SWPAR)と思われる
(図8)。このデータから、Ac−06−34−18(TMB)−NH2のArg5が、
バイシクルの分解の原因となる主要なラット血漿プロテアーゼ認識部位であることが明ら
かである。
ラット血漿プロテアーゼの認識部位の構成においてArg5を同定した後、より高い血
漿タンパク質分解性安定性を有する候補を同定することを目標として、Ac−06−34
−18(TMB)−NH2誘導体の化学合成作戦が為された。重要なことに、かかる修飾
は、ヒトまたはラットカリクレインに対する効力に影響を与えるべきではない。W2P3
をA2A3またはA2Q3に置き換え、バイシクルの第1のループの部分または全体をス
クランブルすることにより、WPAR配列/ファルマコフォアの役割に関する初期調査(
図9、図10)を行った。下表8は、配列およびカリクレインに対するそれぞれの親和性
を示す。
00分の1に劇的に低下させ、分子を有効に薬理学的に不活性な状態にすることが明らか
である。アミノ酸の正確な配列の重要性は、4個のスクランブルされたペプチド(Scr
am2〜4)により強調されるが、その理由は、これら全てカリクレインに対する親和性
の実質的な低下を提示するためである(図10)。奇妙なことに、全ペプチドは、殆ど同
一のラット血漿安定性プロファイルを有し(1〜2日の間、方法1)、血漿プロテアーゼ
認識が、アルギニンの存在に依存し(図7)、配列内におけるその位置には依存しないこ
とを示す。
物に置き換えた、Ac−06−34−18(TMB)−NH2の5種の誘導体を作製した
(表9)。
に対するペプチド安定性を増加させることが明らかである。ラット血漿プロテアーゼによ
るArg5切り取りは、ペプチド分解における最初の事象であると思われるため、ペプチ
ド結合の初期加水分解は、Arg5のNおよび/またはC末端側において起こるであろう
。Arg5のいずれかの側のアミノ酸をそのD−エナンチオマーに置き換えると、立体障
害により隣接ペプチド結合の加水分解を遮断するということは、もっともらしく思える。
実際に、これは以前に観察された効果である(Tugyiら(2005)PNAS、10
2(2)、413〜418)。
において際立つ。効力の減少は、300(D−Arg5)から45000(D−Trp2
)分の1に及ぶ。このことは、カリクレインバイシクル結合ポケットへのこれら側鎖の正
確な三次元提示の重要性を強調する。D−Ala4の効果も等しく際立つ。この場合、単
一メチル基(Ala側鎖における)の配向性の変化は、親和性を7000分の1に低下さ
せる。
次に、第1のループにおける残基をそのN−メチル対応物に系統的に置き換えた。N−
メチル化は、ペプチド結合自体の明快な保護として作用する。しかし、アミド水素の非存
在のため、立体的容積(bulk)(メチル基)の付加および好ましいねじれ角の変化が効力
を減少させることが予想される。
果を提示する。特に、Arg5のN−メチル化は、1桁のナノモル濃度結合剤を依然とし
て生じ(野生型ペプチドと比較して親和性における20分の1の低下)、そのラット血漿
安定性はアッセイ時間を超え(MSにおけるペプチドの断片化は観察できなかった)、こ
れを魅力的な改善されたリード候補とした。D−アミノ酸置換と同様に、Arg5に隣接
する残基のN−メチル化は、おそらくは、Arg5のNおよび/またはC末端のペプチド
結合のプロテアーゼ触媒性加水分解に影響する立体的干渉により、ペプチドに増強された
安定性を与える。注目すべきことに、Ser1は、効力を有意に減少することなくN−メ
チル化することができ、この位置におけるペプチド主鎖の完全性が、結合に必須ではない
ことを示す。
ラット血漿プロテアーゼによる認識におけるArg5の重要性を仮定し、Ac−06−
34−18(TMB)−NH2リードにおけるアルギニン類似体のセットを検査した。化
学構造を図11に示し、効力対安定性データを表11に示す。
定性を増加させ、血漿プロテアーゼ認識におけるArg5の完全性の重要性を確認した。
側鎖(Agb、Agp)の長さの増加(HomoArg)または減少は共に、親和性を減
少させるが、HomoArg類似体は、増強された安定性を有する非常に優れた結合剤(
Ki=2.1nM)を依然として生じる。同一側鎖(β−homoArg5)を保持しつ
つ、Arg5における1個のメチレン基(いわゆるベータ−アミノ酸)によりアミノ酸主
鎖を延長することもまた、増強された安定性を有する結合剤を生じるが、これは、親和性
のより有意な低下(Ki=8.2nM)を代償とする。フェニル環によるArg側鎖の脂
肪族部分の置き換えは、共鳴安定化された、より巨大(bulkier)で硬直化(rigidified
)したグアニジル含有側鎖(4GuanPhe)を生じる。検査した全Arg類似体のう
ち、4GuanPheは、増強された血漿安定性で、最大の親和性(野生型と比較して2
分の1の低下)を有した。興味深いことに、グアニジルフェニル基は、公知の小分子カリ
クレイン阻害剤ベンズアミジンに構造的に近い(Sturzebecherら(1994
)、Novel plasma Kallikrein inhibitors of
the benzamidine type.Braz J Med Biol Res
.27(8):1929〜34;Tangら(2005)、Expression, c
rystallization, and three−dimensional st
ructure of the catalytic domain of human
plasma Kallikrein.J.Biol.Chem.280:41077
〜89)。さらに、誘導体化されたフェニルグアニジンは、別のセリンプロテアーゼ、u
PAの選択的阻害剤として用いられている(Sperlら、(4−aminomethy
l)phenylguanidine derivarives as nonpept
idic highly selective inhibitors of huma
n urokinase(2000)Proc Natl Acad Sci U S
A.97(10):5113〜8.)。よって、4GuanPhe5を含有するAc−0
6−34−18(TMB)−NH2は、その選択性が周囲の二環式ペプチドにより与えら
れた、小分子阻害剤であると考えられる。これは、低い選択性の公知の小分子阻害剤が、
正確な位置においてバイシクルに「移植(graft)」され、より優れた効力および選択性
の分子をもたらす、他のバイシクルに基づく阻害剤の原理を含むことができる。
であるが無電荷の尿素基により置き換えられている)またはArgの全体的な欠失(ΔA
rg)のいずれかによる、Argグアニジル基自体の修飾は、カリクレイン結合効力にお
いて強力に有害な効果を有する。よって、グアニジル基の完全性および存在は重大である
一方、グアニジル基またはArg5における主鎖への側鎖連結の性質は重大ではない。注
目すべきことに、Arg5は、リジンに置き換えることもできるが、この場合も同様に、
親和性が低下する(WPAKペプチドを参照)。
eArgまたは4GuanPheのいずれかを用いたAc−06−34−18(TMB)
−NH2が、高い親和性を有する血漿安定性の増強された候補を構成することができるこ
とを示す。
の改善]
所定の二環式候補の効力の改善は、数種の機序により都合よく達成することができる。
これらは、実施例4において部分的に取り組まれており、次の通りに書き直すことができ
る。
1.より高い親和性が達成されるような、疎水性効果を活用しより低いオフ・レート(of
f rate)をもたらす疎水性部分の組み入れ
2.より速いオン・レート(on rate)およびより高い親和性をもたらす、長距離イオン
相互作用を活用する荷電基の組み入れ(例えば、Schreiberら、Rapid,
electrostatically assisted association o
f proteins(1996)、Nature Struct.Biol.3、42
7〜31を参照)。
3.ペプチドへの追加的な制約の組み入れ、即ち、
− エントロピーの損失が標的結合により最小となるように、アミノ酸の側鎖を正確に
制約することによる、
− エントロピーの損失が標的結合により最小となるように、主鎖のねじれ角を制約す
ることによる、
− 同一の根拠のために、分子における追加的な環化を導入することによる。
(総説に関して、Gentilucciら、Curr.Pharmaceutical
Design、(2010)、16、3185〜203およびNestorら、Cur
r.Medicinal Chem(2009)、16、4399〜418を参照された
い。)
最初に、様々な疎水性アミノ酸をTrp2部位に置換して、酸化感受性トリプトファン
を置き換えることのできる候補を同定し、効力を増加させ得る候補を同定した(上述の第
1のポイントに取り組む)。これらのアミノ酸の側鎖を図12に示し、親和性データを下
表12にまとめる。
tyl)アラニンは、Trp2に最も密接に関係し、野生型よりも僅かに弱い効力を提示す
るため、これをTrp2のための優れた酸化抵抗性置き換えとする。興味深いことに、3
,3−DPA2は、Trpに非常に似ていない構造を有するが、対応するペプチドは、高
い効力を保持する。このことは、カリクレインにおけるTrp接触ポケットが、正確に設
計された疎水性実体を同定することにより、より高い親和性結合に活用され得ることを示
すことができる。
次に、本出願人らは、Ac−06−34−18(TMB)−NH2におけるWPARフ
ァルマコフォアにおけるPro3の役割の決定に興味を持った。ペプチド主鎖における追
加的な硬性および螺旋性の誘導におけるこれらの公知の特性のため、4−ヒドロキシ−ま
たは4−フルオロ−トランス(L)−プロリン(HyP3、4FluoPro3)を選ん
だ(図15、表13)。さらに、HyPにおけるヒドロキシルの存在は、プロリン側鎖の
溶媒露出度を探る。それぞれの誘導体のKiは、野生型とほぼ同一であり、ペプチド主鎖
におけるいかなる効果も無視できることを示したが、側鎖が到達できることも実証する。
これについてさらに詳述するため、Pro3側鎖のγ−炭素における巨大な伸展を含有し
た、Ac−06−34−18(TMB)−NH2の2種の追加的な誘導体を検査した(4
Phenyl−Pro、4Benzyl−Pro)。前者は、際立つ効力の保存を提示し
たが、一方、後者は激しく影響されており(impacted)、Pro側鎖が到達できるが、別
個の修飾のみに限定されることを実証する。これらの修飾における立体的容積にもかかわ
らず、血漿安定性は、野生型と同一であった。よって、これらの修飾は、他のプロテアー
ゼに対する選択性を改善しない。
アゼチジンカルボン酸(Aze)およびより柔軟な6員環(ピペコリン酸、Pip)でP
ro3を置換した。Ac−06−34−18(TMB)−NH2 Aze3は、全誘導体
の間で最高の親和性でカリクレインに結合し、野生型より3倍優れていた(図14)。環
サイズおよびKiの間には反比例関係があると考えられ、このことは、Ac−06−34
−18(TMB)−NH2の位置3におけるコンホメーション上の制約が、密接に結合す
る分子にとって鍵となることを示唆するであろう。
体Tic、NorHarおよびIndにより強調される(図13)。特に後者の2事例に
とって、親和性は、依然として十分に1桁のナノモル濃度範囲にある。
的を達成するために、本出願人らは、アルファ炭素におけるその二重メチル置換により、
αまたは310螺旋性の誘導において隣接するアミノ酸に強力な構造的効果を有するアミ
ノイソ酪酸(Aib、図13、表13)を選んだ(Tonioloら(1993)、Bi
opolymers 33、1061〜72;Karleら(1990)、Bioche
mistry 29、6747〜56)。著しいことに、この非天然非環状アミノ酸は、
1.2nMのKiにおいて、Pro3の代わりに十分に耐容される。よって、WPARフ
ァルマコフォアにおけるPro3の役割は、ペプチド主鎖に制約を導入することである。
この制約は、環サイズが低下したプロリン類似体を用いることにより増強することができ
る(Aze3を参照)。逆に、プロリン環は、Aib等、非環状であるが構造誘導性アミ
ノ酸により相対的に効率的に置き換えることができる。
表10において、Ac−06−34−18(TMB)−NH2のループ1におけるSe
r1は、効力にごく僅かな影響でN−メチル化することができることが示されている(0
.5対0.17nM Ki、WT)。本出願人らは、この位置が、位置1におけるCαに
おける大型の二重置換を耐容するか決定しようとした。この目的を達成するために、Se
r1をDpg(ジプロピルグリシン)に置き換えた(図15)。カリクレインに対するこ
のペプチドの親和性は、1.1nMであり、位置1が、実質的にいかなる巨大な残基の収
容においても非常に柔軟であることを示す。よって、ループ1におけるこの位置は、アミ
ノ酸の可溶化、放射標識、色素標識、リンカー、コンジュゲート部位その他諸々を包含す
る、望ましい化学的官能性または化学基の計画的な包含に活用することができる。
2、表3)により既に判明している通り、Ala4は、Cαにおける立体的配向性に対し
、あるいは主鎖自体における修飾に対し高度に感受性である。Ala4におけるペプチド
主鎖の伸長(β−Ala4)は、親和性を劇的に低下させるため(ほぼ20μM)、この
クラスのさらに2種の誘導体は、このことを強調する。D−Ala4から予想された通り
、Aib4は、ほぼ同じ程度まで親和性を低下させる(289nM、図15および表14
)。著しいことに、1個のメチレンによるAla側鎖の伸展(Aba4)は、カリクレイ
ンに対する親和性を増強すると思われる。
ク質分解性安定性の増加を期待して、中央システイン(Cys2)を、より巨大でより制
約された類似体、ペニシラミン(Pen、図15)に置き換えた。実際に、ラット血漿安
定性は、僅かに増強されたが、効力は有意に降下し、この構造的足場連結残基の十分な完
全性の重要性を強調する。
組合せ
はっきりと認識できる効力および最大ラット血漿安定性を保持した(方法1により決定
)Ac−06−34−18(TMB)−NH2における非天然の置換は、Arg5変異体
のホモアルギニン(HomoArg5)、4−グアニジルフェニルアラニン(4Guan
Phe5)およびN−メチルアルギニン(NMeArg5)であった。野生型ペプチドと
比較して効力を増加させたAc−06−34−18(TMB)−NH2における非天然の
置換は、Pro3類似体アゼチジンカルボン酸(Aze3)およびAla4類似体2−ア
ミノ酪酸(Aba4)であった。よって、Aze3、Aba4を、プロテアーゼ安定性を
増強するHomoArg5、4GuanPhe5およびNMeArg5と組み合わせて、
これにより、血漿安定性が高く、効力が増加したペプチド候補が得られるか決定した。
ム、表15)は、Arg5のN−メチル化が、ペプチドの保護において最も強力であり(
t1/2>20時間)、続いて、HomoArg5およびGuanPhe5であったこと
を明らかにした。ArgのN−メチル化の強力な保護効果は、これがペプチド結合の加水
分解を直接的に防ぐため、おそらく驚くべきことではない。これらの化合物におけるAz
e3の包含により、これらのペプチドの親和性は、あらゆる場合において増強することが
でき、Ac−(06−34−18)Aze3 HomoArg5およびAc−(06−3
4−18)Aze3 NMeArg5をさらなる開発のための魅力的な候補とする(表1
5、図16)。
果は、Aze3およびアルギニン類似体のいずれの文脈においても再現することができな
かった。よって、Aze3の効力増強効果は、アルギニン置換の種類とは無関係であるが
、Aba4の場合はそうでない可能性がある。
5)。しかし、ラットカリクレインのタンパク質調製物は、些細なものではなく、不純物
を含有したため、これらの値は、この段階では相対的なものであり定量的ではない。
びAze3による親和性増強]
実施例1〜4における選択アウトプットから、本出願人らは、高い存在量を有したが変
更されたWPARモチーフを含有した、Ac−06−34−18(TMB)−NH2に類
似した数種の配列を発見した。これらは、WPSRおよびFPYRであった。後者は、酸
化感受性トリプトファンを欠くため、特に興味深い。
R親ペプチドに対して比較した(表21)。
he2によるTrp2の置き換えは、Kiの40分の1の低下に陥り、より巨大なTrp
2側鎖の必要を強調する。しかし、この低下は、Tyr4によりAla4を置き換えるこ
とにより(FPYRモチーフを生じる)補償することができ、親和性は、野生型WPAR
配列の親和性とほぼ同一まで再び増加することができるようになる(Ki=0.46nM
)。よって、Ac−06−34−18(TMB)−NH2バイシクルの位置2および位置
4における残基の間に協同的相互関係が存在する。Ac−06−34−18(TMB)−
NH2 Phe2Tyr4における高い標的結合親和性およびTrp2の欠如を仮定し、
上述の実施例に記載されているアプローチを用いて、ラット血漿半減期の増加に関してこ
の候補を調べた。さらに、本出願人らは、非天然のアミノ酸類似体によりこれらの残基を
置換することにより、Phe2およびTyr4の間の相互関係を調べた。
r4の非天然の置換
本出願人らは、Ac−06−34−18(TMB)−NH2 Phe2Tyr4リード
におけるPhe2またはTyr4における置き換えを組み入れている非包括的セットの合
成を行った。図F6と同じセットから非天然のアミノ酸を選び、親和性データを表22に
まとめた。
2Nal、4,4−BPal)またはシクロ脂肪族(Cha)実体であるかに関係なく、
検査したアミノ酸のいずれかによる置換は、全般に十分に耐容された。3Palは、位置
2において十分に耐容され(Ki=0.91)、Palはイオン性化学基を含有するため
(即ち、製剤に活用することができる)、これは興味深い。しかし、本来のPhe2/T
yr4組合せが、依然として最も強力であると思われる。
定化およびアゼチジン3置換の効果
ホモ−アルギニン、4−グアニジルフェニルアラニンおよびN−メチルアルギニン置換
を用いて、Aze3の非存在および存在下で、Ac−06−34−18(TMB)−NH
2 Phe2Tyr4を調製した。HomoArg/4Guanpheは、親Phe2T
yr2ペプチドとほぼ同一のKi値で十分に耐容され(表23)、ラット血漿安定性は、
13倍に増強された(t1/2=12.2時間、表23)。その上、ラットカリクレイン
に対するIC50値は、親の値と同様であり、これがin vivo試験に魅力的な候補
であることを示す。
を再び生じ、実際に、ラット(Ac−(06−34−18)Phe2 Aze3Tyr4
NMeArg5)において20時間より長い半減期を有する可能性がある、1nM未満
のKiを有するペプチドが作製された。
法および材料と同様または均等のいずれかの方法および材料を用いることができる。かか
る使用に適した方法、機器および材料は、上に記載されている。本明細書において引用さ
れているあらゆる刊行物は、本発明に関連して用いることのできる、かかる刊行物に報告
されている方法論、試薬およびツールを説明および開示する目的のため、ここに本明細書
の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。
Claims (27)
- 少なくとも2個のループ配列によって隔てられた少なくとも3個の反応基を含むポリペ
プチドと、分子足場とを含み、少なくとも2個のポリペプチドループが前記分子足場上に
形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、
前記ペプチドリガンドの前記ループが、3個、4個または5個の、但し6個未満のアミノ
酸を含む、ヒトカリクレインに特異的なペプチドリガンド。 - 前記ペプチドリガンドの前記ループが、3個のアミノ酸を含み、前記ポリペプチドが、
コンセンサス配列GrFxxGrRVxGr(式中、Grは反応基である)を有する、請
求項1に記載のペプチドリガンド。 - 表3に表記されているポリペプチドのうち1種を含む、請求項2に記載のペプチドリガ
ンド。 - 前記ペプチドリガンドの前記ループが、5個のアミノ酸を含み、第1のループが、コン
センサス配列GrGGxxNGr(式中、Grは反応基である)を含む、請求項1に記載
のペプチドリガンド。 - 2個の隣接するループが、コンセンサス配列GrGGxxNGrRxxxxGrを含む
、請求項4に記載のペプチドリガンド。 - 表4に表記されているペプチドのうち1種を含む、請求項4または請求項5に記載のペ
プチド。 - 前記ペプチドリガンドの前記ループが、5個のアミノ酸を含み、第1のループが、モチ
ーフGrxW/FPxK/RGr(式中、Grは反応基である)を含む、請求項1に記載
のペプチドリガンド。 - モチーフGr T/LHQ/TxLGrを含む第2のループをさらに含む、請求項7に記
載のペプチドリガンド。 - 前記ペプチドリガンドの前記ループが、5個のアミノ酸を含み、第1のループが、モチ
ーフGrxHxDLGr(式中、Grは反応基である)を含む、請求項1に記載のペプチ
ドリガンド。 - 前記ペプチドリガンドの前記ループが、5個のアミノ酸を含み、第1のループが、モチ
ーフGrTHxxLGr(式中、Grは反応基である)を含む、請求項1に記載のペプチ
ドリガンド。 - 2個の隣接するループが、モチーフGrxW/FPxK/RGr T/LHQ/TDLG
rを含む、請求項8〜10のいずれか1項に記載のペプチドリガンド。 - 表4、表5または表6に表記されているポリペプチドのうち1種を含む、請求項7〜1
1のいずれか1項に記載のペプチドリガンド。 - 前記第1のループが、配列GrxWPARGrを含む、請求項7〜11のいずれか1項
に記載のペプチドリガンド。 - 前記第1のループが、配列GrxWPSRGrを含む、請求項7〜11のいずれか1項
に記載のペプチドリガンド。 - 前記第1のループが、配列GrxFPFRGrを含む、請求項7〜11のいずれか1項
に記載のペプチドリガンド。 - 前記第1のループが、配列GrxFPYRGrを含む、請求項7〜11のいずれか1項
に記載のペプチドリガンド。 - xがSまたはRである、請求項13〜16のいずれか1項に記載のペプチドリガンド。
- 前記反応基がシステインである、請求項1〜17のいずれか1項に記載のペプチドリガ
ンド。 - 1個または複数個の非天然のアミノ酸置換基を含み、プロテアーゼ分解に対し抵抗性で
ある、請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリペプチドリガンド。 - 前記修飾されたアミノ酸が、N−メチルアルギニン、ホモ−アルギニン、ヒドロキシプ
ロリンおよびグアニジル−フェニルアラニンおよびアゼチジンカルボン酸から選択される
、請求項19に記載のポリペプチドリガンド。 - 前記ポリペプチドが、モチーフGrxWPARGrを含む第1のループを含み、Pro
は、アゼチジンカルボン酸に置き換えられ、および/またはRは、N−メチルアルギニン
に置き換えられ、および/またはRは、ホモアルギニンに置き換えられ、および/または
Rは、グアニジルフェニルアラニンに置き換えられる、請求項20に記載のポリペプチド
リガンド。 - 前記ポリペプチドが、モチーフGrxFPYRGrを含む第1のループを含み、Rは、
N−メチルアルギニンに置き換えられ、および/またはRは、ホモアルギニンに置き換え
られ、および/またはRは、グアニジルフェニルアラニンに置き換えられ、Proは、ア
ゼチジンカルボン酸に置き換えられる、請求項20に記載のポリペプチドリガンド。 - 標的に対して、親ポリペプチドリガンドの結合活性を超える、改善されたレベルの結合
活性を生じる変異体ポリペプチドリガンドを作製するための方法であって、前記親ポリペ
プチドリガンドが、少なくとも2個のループ配列によって隔てられた少なくとも3個の反
応基を含むポリペプチドと、分子足場とを含み、少なくとも2個のポリペプチドループが
前記分子足場上に形成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共
有結合を形成し、前記方法が、
(a)ループ配列のそれぞれにおける2個以上のアミノ酸位置のそれぞれに対し、n種
の異なる変異体ライブラリを作製するステップであって、各ライブラリが、前記ループ配
列における前記アミノ酸位置の1個がn種の異なる非親アミノ酸のうち1種による置き換
えにより変異導入された親ポリペプチドからなるステップと、
(b)親標的との結合に関して各ライブラリをスクリーニングし、各変異を点数化する
ステップと、
(c)変異が耐容されるアミノ酸位置を同定するステップと、
(d)ステップ(c)において同定された前記アミノ酸位置に位置する1個または複数
個の変異を含む1種または複数種の変異体ポリペプチドを作製するステップと
を含む、方法。 - ステップ(d)が、ステップ(c)において同定された前記アミノ酸位置の2個以上に
変異を組み入れているポリペプチドを含むライブラリを調製するサブステップと、前記標
的に対する改善されたレベルの結合活性を有するポリペプチドに関して前記ライブラリを
スクリーニングするサブステップとを含む、請求項23に記載の方法。 - ポリペプチドリガンドのライブラリであって、前記ポリペプチドリガンドが、少なくと
も2個のループ配列によって隔てられた少なくとも3個の反応基を含むポリペプチドと、
分子足場とを含み、少なくとも2個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成される
ように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前記ライブ
ラリが、ポリペプチドリガンドのm種の異なる変異体からなり、前記変異体において、前
記ループ配列における特定のアミノ酸位置が、m種の異なるアミノ酸のうち1種による置
き換えにより変異導入されており、mが少なくとも2である、ライブラリ。 - ポリペプチドリガンドのライブラリのセットであって、前記ポリペプチドリガンドが、
少なくとも2個のループ配列によって隔てられた少なくとも3個の反応基を含むポリペプ
チドと、分子足場とを含み、少なくとも2個のポリペプチドループが前記分子足場上に形
成されるように、前記分子足場が前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成し、前
記セットが、2種以上のポリペプチドリガンドライブラリを含み、前記ポリペプチドリガ
ンドライブラリのそれぞれが、1ポリペプチドリガンドのm種の異なる変異体からなり、
前記変異体において、前記ループ配列における特定のアミノ酸位置が、m種の異なるアミ
ノ酸のうち1種による置き換えにより変異導入されている、ライブラリのセット。 - mが、2〜20の間である、請求項26に記載のライブラリのセット。
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