DE60111628T2

DE60111628T2 - Metallchelatisierende gemische

Info

Publication number: DE60111628T2
Application number: DE60111628T
Authority: DE
Inventors: William K. Kappel; Venkatappa Viswanatha; Handong Li; Richard J. Mehigh; John G. Dapron
Original assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Current assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Priority date: 2000-04-24
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: WO2001081365A3; US7709612B2; AU2001251479A1; ES2244609T3; DE60111628D1; JP2003531213A; EP1627683A3; JP4298201B2; US20060148090A1; ATE298321T1; EP1276716A2; EP1627683A2; ES2244609T5; WO2001081365A2; US20040092031A1; DE60111628T3; EP1276716B1; EP1276716B2; US7033520B2; US6623655B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf metallchelatbildende Verbindungen und auf Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung derjenigen für die Proteinreinigung, -erkennung oder -bindung und, im besonderen, Nitrilotriessigsäurederivate, die verbesserte Bindungsspezifität und -stabilität aufweisen und auf Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Nitrilotriessigsäurederivate zur Proteinreinigung, Proteinerkennung oder Proteinbindung ausgerichtet.
Metallchelatchromatographie wurde bereits viele Jahre als eine Technik zur Reinigung von Proteinen verwendet. Frühe Harze, die für diesen Prozess verwendet wurden, waren einfache Chelatoren wie Iminodiessigsäure (iminodiacetic acid, IDA), die an Agaroseträger gebunden wurden (Porath et al. Nature, 258 : 598–599, 1975), und die mit verschiedenen Metallen, wie z.B. Cu²⁺, Zn²⁺ und Ni²⁺ beladen wurden. Man stellte fest, dass diese Harze selektiv Proteine und Peptide aus natürlichen Quellen banden (Porath and Olin, Biochemistry, 22 : 1621, 1983; Lonnerdal and Keen, J. Appl. Biochem., 4 : 203, 1983; Sulkowski, Protein Purification: Micro to Macro, Seiten 149-162, herausgegeben von R. Burgess, verlegt von Liss New York, NY, 1987). Mit der Ankunft von molekularbiologischen Techniken nahm Metallchelatchromatographie mit dem Gebrauch eines 6-Histidin-Identifikationszeichens (tag) eine wichtigere Rolle in der Reinigung von Proteinen ein. Siehe zum Beispiel Dobeli et al., U.S. Patent-Nr. 5,284,933. Das Poly-Histidin-Identifikationszeichen band sehr stark an das immobilisierte Nickel und konnte für die Identifizierung und Reinigung von diesen rekombinanten Molekülen verwendet werden. Der dreizähnige Chelator IDA war recht selektiv für diese mit Identifikationszeichen versehenen Proteine, aber man fand, dass das Nickel langsam von dem Harz ausgewaschen wurde, wodurch die Kapazität reduziert und eine Beeinträchtigung mit einigen nachgelagerten Verwendungen der Proteine verursacht wurde.
Vor noch kürzerer Zeit wurde ein vierzähniger Chelator, der als Nitrilotriessigsäureharz bekannt ist, zum Gebrauch mit Metallen, die sechs Koordinationsstellen besitzen, entwickelt. Dieses Harz wurde das bevorzugte Harz für die Reinigung von Polyhistidin-enthaltenden Proteinen, da es sehr wenig Auslaugung von Metallen und eine gute Selektivität aufweist. Jedoch wird ein beträchtlicher Aufwand benötigt, um diese Selektivität zu erreichen. Zum Beispiel ist die Zugabe von verschiedenen Mengen an Imidazol nötig, um zu bestimmen, ob das Harz das Protein selektiv binden wird, und die Kapazität des Harzes für das Protein muss optimiert werden, um die erwünschten Resultate zu erreichen (Janknecht et all, Proc. Natl. Acad. Sci., 88 : 8972-8976, 1991, Schmitt et all., Molecular Biology Reports, 88:223-230, 1993).
In U.S. Pat.-Nr. 4,877,830, Dobeli et al. beschreiben Nitrilotriessigsäureharze, die für die Proteinreinigung geeignet sind, dargestellt durch die allgemeine Formel:
[Trägermatrix]-Abstandshalter-NH-(CH₂)_x-CH(COOH)-N(CH₂COO-)₂Ni²⁺, wobei x 2, 3 oder 4 ist, die Trägermatrix eine ist, die in Affinitäts- oder Gel-Chromatographie verwendet wird, wie kreuzvernetzte Dextrane, Agarose oder Polyacrylamide; und der Abstandhalter ist vorzugsweise -O-CH₂-CH(OH)-CH₂- oder -O-CO-. Dobeli et al., U.S. Patent-Nr. 4,877,830 in Spalte 2, Zeilen 23-37. Diese Harze werden durch zur Reaktion-Bringen einer N-terminalen geschützten Verbindung der Formel: R-HN-(CH₂)_x-CH(NH₂)-COOH, wobei R eine Amino-Schutzgruppe und x 2, 3 oder 4 ist, mit Bromessigsäure in einem alkalischen Medium und durch folgendes Abspalten der Schutzgruppe und zur Reaktion-Bringen dieses Produkts mit einem aktivierten Harz hergestellt. Siehe, z.B., Hochuli et al., Journal of Chromatography, 411 (1987) 177-184.
In U.S. Pat.- Nr. 5,625,075, Srinivasan et al. beschreiben eine Metallradionuclidchelatisierende Verbindung, die mehrere Schwefel- und Stickstoffatome aufweist. Diese chelatisierenden Verbindungen schließen zwei Stickstoffatome und drei Schwefelatome, zwei Stickstoffatome und vier Schwefelatome, oder drei Stickstoffatome und drei Schwefelatome ein.
Während diese Verbindungen verbesserte Spezifität im Vergleich zu manchen Harzen, die Nitrilotriessigsäurederivate enthalten, bieten, bleibt ein Bedarf an chelatisierenden Verbindungen, die eine größere Bindungsspezifität für Polyhistidin-enthaltende Proteine aufweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Unter den Zielen der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von metallchelatisierenden Verbindungen, und von Metallchelaten, die relativ stabil sind, und die erhöhte Bindungsspezifität für Protein- oder Polypeptidreinigung, Protein- oder Polypeptiderkennung, oder Protein- oder Polypeptidbindung bieten, und die Bereitstellung von Verfahren für die Herstellung und die Verwendung von solchen Verbindungen.
Daher ist die vorliegende Erfindung kurz gesagt auf eine metallchelatisierende Verbindung, die die folgende Formel besitzt, ausgerichtet:
wobei
Q ein Träger ist;
S¹ ein Abstandhalter ist;
L -A-T-CH(X)- ist;
A ein Thioether- oder Selenether-Bindungselement ist;
T eine Bindung oder ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkenyl ist;
X -(CH₂)_kCH_3,-(CH₂)_kCOOH, -(CH₂)_kSO₃H, -(CH₂)_kPO₃H₂, -(CH₂)_kN(J)₂, oder -(CH₂)_kP(J)₂ ist;
k eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist;
J Kohlenwasserstoff oder substituierter Kohlenwasserstoff ist;
Y -COOH, -H, -SO₃H, -PO₃H₂, -N(J)₂, oder -P(J)₂ ist;
Z -COOH, -H, -SO₃H, -PO₃H₂, -N(J)₂, oder -P(J)₂ ist; und
i eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf ein Metallchelat, das ein Metall und die metallchelatisierende Verbindung der vorliegenden Erfindung enthält, ausgerichtet.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin ausgerichtet auf ein Verfahren für die Reinigung oder Erkennung eines Polypeptids oder einer anderen Verbindung, die eine Affinität für ein Metallchelat aufweist. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren der Verbindung mit einem Metallchelat, wobei das Metallchelat ein Metall und die metallchelatisierende Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung eines mono- oder dicarboxylierten Amins ausgerichtet. Das Verfahren umfasst das Kombinieren eines Amins und einer Oxosäure in der Gegenwart eines reduzierenden Mittels. Das Amin hat die Formel R²R³NH, wobei R² Kohlenwasserstoff oder substituierter Kohlenwasserstoff und R³ Wasserstoff, Kohlenwasserstoff oder substituierter Kohlenwasserstoff ist.
Andere Ziele und Merkmale werden teilweise im Folgenden offenbar und teilweise erklärt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Wir fanden heraus, dass die Bindung zwischen dem Chelator und dem Harz ein wichtiger Parameter für die Selektivität des Harzes für mit Identifikationszeichen für Polyhistidin versehene Proteine ist.
Konventionelles Nitrilotriessigsäureharz weist eine positiv geladene Amin-Bindung auf, die als Bindungsstelle für jegliches negativ geladene Molekül, welche die Bindung des Proteins an die Koordinationsstellen, die von dem immobilisierten Metall geboten werden, stört. Sauerstoff, Schwefel, Selen und Amide weisen eine gewisse Affinität für Metalle auf, welche verbesserte Chealtbildungs-Eigenschaften bieten können, wobei sie das Metall fester als traditionelle vierzähnige Chelatbildner binden, die positive Aminbindungen aufweisen.
Zusätzlich scheint der Gebrauch eines nicht geladenen Atoms zwischen dem Nitril-Stickstoff und dem Träger die nicht spezifische Bindung von Proteinen zu reduzieren.
Die metallchelatbildenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, relativ stabile Chelate mit Metallionen zu bilden und, vorteilhafterweise, die Gegenwart von Ether-(-O-), Thioether-(-S-), Selenoether-(-Se-) oder Amid-((-NR¹(C=O)-) oder (-(C=O)NR¹-), wobei R¹ Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff ist)-Bindungen innerhalb der chelatbildenden Verbindung trägt zu der Spezifität des resultierenden Chelats bei, wenn es für die Trennung oder Reinigung von Molekülen wie Proteinen, Phosphoproteinen, Peptiden, Phosphopeptiden, DNA, RNA, Oligonucleotiden, Medikamenten, und synthetischen und natürlichen Produkten, die eine Affinität für Metallchelate, wie in Clustern angeordnete Histidine oder Polyhistidine aufweisen, verwendet wird.
Im allgemeinen entsprechen die chelatbildenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung der Verbindung (1), die in der Struktur unten abgebildet ist:

Q ein Träger ist;
S ¹ ein Abstandhalter ist;
L -A-T-CH(X)- ist;
A ein Thioether- oder Selenether-Bindungselement ist;
T eine Bindung oder ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkenyl ist;
X -(CH₂)_kCH_3, -(CH₂)_kCOOH, -(CH₂)_kSO₃H, -(CH₂)_kPO₃H₂, -(CH₂)_kN(J)₂, oder -(CH₂)_kP(J)₂ ist; vorzugsweise -(CH₂)_kCOOH oder -(CH₂)_kSO₃H;
k eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist;
J Kohlenwasserstoff oder substituierter Kohlenwasserstoff ist;
Y-COOH, -H, -SO₃H, -PO₃H₂, -N(J)₂, oder -P(J)₂ ist; vorzugsweise, -COOH;
Z-COOH, -H, -SO₃H, -PO₃H₂, -N(J)₂, oder -P(J)₂ ist; vorzugsweise -COOH; und
i eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist, vorzugsweise 1 oder 2.
Im allgemeinen kann der Träger, Q, jegliches feste oder lösliche Material oder Verbindung, das in der Lage ist, für eine Kupplung derivatisierts zu werden, umfassen. Feste (oder unlösliche) Träger können aus einer Gruppe, die Agarose, Cellulose, Methacrylatcopolymere, Polystyrol, Polypropylen, Papier, Polyamid, Polyacrylnitril, Polyvinyliden, Polysulfon, Nitrocellulose, Polyester, Polyethylen, Silica, Glas, Latex, Plastik, Gold, Eisenoxid und Polyacrylamid ausgewählt werden, aber kann jegliche unlösliche oder feste Verbindung sein, die in der Lage ist, derivatisiert zu werden, um eine Kupplung des Restes der Verbindung an den Träger, Q, zuzulassen. Ein bevorzugter fester Träger ist Agarose oder eine Hochdurchsatz-Selektions- Mikrotiterplatte (high-throughput screening microtiterplate). Lösliche Träger schließen Proteine, Nukleinsäuren einschließlich DNA, RNA und Oligonukleotide, Lipide, Liposomen, synthetische lösliche Polymere, Proteine, Polyaminosäuren, Albumin, Antikörper, Enzyme, Streptavidin, Peptide, Hormone, chromogene Farbstoffe, fluoreszente Farbstoffe, Flurochrome oder jegliches anderes Detektionsmolekül, Medikamente, kleine organische Verbindungen, Polysaccharide und jegliche andere lösliche Verbindung, die in der Lage ist, derivatisiert zu werden, um den Rest der Verbindung an den Träger, Q, zu kuppeln, ein. Proteine oder Polysaccharide sind der bevorzugte Träger.
Der Abstandshalter, S¹, der an den Träger grenzt, umfasst eine Kette von Atomen, die gesättigt oder ungesättigt sein kann, substituiert oder unsubstituiert, linear oder zyklisch, gerade oder verzweigt. Typischerweise wird die Kette von Atomen, die den Abstandshalter, S¹, definiert, aus nicht mehr als ungefähr 25 Atomen bestehen; anders ausgedrückt, das Rückgrat des Abstandshalters wird aus nicht mehr als ungefähr 25 Atomen bestehen. Bevorzugter wird die Kette von Atomen, die den Abstandshalter, S¹, definiert, aus nicht mehr als ungefähr 15 Atomen bestehen, und am bevorzugtesten aus nicht mehr als ungefähr 12 Atomen. Die Kette von Atomen, die den Abstandshalter, S¹, definieren, wird typischerweise aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Selen, Silizium und Phosphor und vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Selen bestehen. Zusätzlich können die Kettenatome substituiert oder unsubstituiert sein mit Atomen mit Ausnahme von Wasserstoff, wie Hydroxy, Keto (=O), oder Acyl wie Acetyl. So kann die Kette wahlweise eine oder mehrere Ether-, Thioether-, Selenoether-, Amid- oder Aminbindungen zwischen Kohlenwasserstoff- oder substituierten Kohlenwasserstoffregionen einschließen. Beispielhafte Abstandshalter, S¹, schließen Methylen, Alkylenoxy-(-(CH₂)_aO-), Alkylenthioether(-(CH₂)_aS-), Alkylenselenoether((CH₂)_aSe-), Alkylenamid(-(CH₂)_aNR¹(C=O)-), Alkylencarbonyl(-(CH₂)_aCO)-, und Kombinationen daraus ein, wobei a im allgemeinen von 1 bis ungefähr 20 ist und R¹ Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff ist, vorzugsweise Alkyl. In einer Ausführungsform ist der Abstandshaller, S¹, eine hydrophile, neutrale Struktur und enthält keine Aminbindungen oder Substituenten oder andere Bindungen oder Substituenten, die während der Reinigung eines Polypeptids elektrisch geladen werden könnten.
Die chelatbildende Verbindung entspricht der Formel:
wobei Q, S¹, A, T, X, Y und Z wie vorher definiert sind. In dieser Ausführungsform ist, die Ether-(-O-), Thioether-(-S-), Selenoether-(-Se-) oder Amid-((-NR¹(C=O)-) oder ((C=O)NR¹-), wobei R¹ Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff ist)-Bindung von dem chelatbildenden Teil des Moleküls durch eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder Alkenylregion getrennt. Falls es keine Bindung ist, ist T bevorzugt ein substituiertes oder unsubstituiertes C₁- bis C₆-Alkyl oder substituiertes oder unsubstituiertes C₂- bis C₆-Alkenyl. Noch bevorzugter, A ist -S-, T ist -(CH₂)_n-, und n ist eine ganze Zahl von 0 bis 6, typischerweise 0 bis 4, und noch typischer 0, 1 oder 2.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Sequenz -S¹ -L-, in Kombination, eine Kette von nicht mehr als 35 Atomen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Selen, Stickstoff, Silizium und Phosphor, noch bevorzugter nur Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, und ferner noch bevorzugter nur Kohlenstoff, Sauerstoff und Schwefel. Um die Aussichten für nicht-spezifische Bindung zu senken, ist Stickstoff, wenn gegenwärtig, bevorzugt in der Form eines Amidrestes. Falls die Kohlenstoffkettenatome mit irgendetwas anderem als Wasserstoff substituiert sind, sind sie außerdem bevorzugterweise substituiert mit Hydroxy oder Keto. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst L einen Teil (manchmal bezeichnet als ein Fragment oder Rest), der abgeleitet von einer Aminosäure wie Cystin, Homocystin, Cystein, Homocystein, Aspartamsäure, Cysteinsäure oder einem Ester davon, wie der Methyl- oder Ethylester davon, ist.
Beispielhafte chelatbildende Verbindungen der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden ein:

wobei Q ein Träger und Ac Acetyl ist.
Es werden Vorteile erlangt durch den Gebrauch von neutralen Ether-, Thioether-, Selenoether- oder Amidbindung(en) in dem bindenden Rest anstelle von positiv geladenen Aminbindungen. Sauerstoff, Schwefel und Selenatome und Amide weisen eine gewisse Affinität für Metalle auf, welche verbesserte Chelat-Eigenschaften bieten können, wobei sie das Metall fester als traditionelle vierzähnige Chelatoren binden, welche positive Aminbindungen aufweisen. Zusätzlich scheint der Gebrauch eines nicht-geladenen Atoms zwischen dem Nitrilstickstoff und dem Träger die nicht-spezifische Bindung von Proteinen zu reduzieren. Der Gebrauch von S, O, Se oder Amid in dem bindenden Rest, L, anstelle von Amin oder anderen geladenen Resten tendiert daher, die Stabilität und Spezifität der Verbindung für Proteinreinigung zu erhöhen.
In einer Ausführungsform können Metall-chelatbildende Verbindungen (1) der vorliegenden Erfindung von Verbindungen abgeleitet werden, die die allgemeine Formel aufweisen:
wobei A, T, X, Y, Z und i wie vorher definiert sind. Vorzugsweise, Verbindung (2) wird durch eine der folgenden Formeln wiedergegeben: HS-(CH₂)_n-CH(CH₂COOH)-N(CH₂COOH)₂ HS-(CH₂)_n-NHCO-CH(CH₂SO₃ ^–)-N(CH₂COOH)₂ und H₂N-(CH₂)_n-NHCO-CH(CH₂SO₃ ^–)-N(CH₂COOH)₂ wobei n 1 oder 2 ist.
Verbindungen, die der Struktur (2) entsprechen, in der mindestens eines von X, Y und Z einen Carbonsäurerest umfasst, kann durch reduktive Alkylierung eines Amins dargestellt werden. Im allgemeinen können mono- und dicarboxylierte Amine durch das zur Reaktion-Bringen eines Amins, das die Formel R²R³NH hat, wobei R² Kohlenwasserstoff oder substituierter Kohlenwasserstoff und R³ Wasserstoff, Kohlenwasserstoff oder substituierter Kohlenwasserstoff ist, mit einer Oxosäure, wie Glyoxylsäure, in der Gegenwart eines reduzierenden Mittels wie eines Pyridin-Boran-Komplexes, Dimethylboran, Trimethylboran, Natriumcyanoborhydrid, hergestellt werden. Wenn das Amin eine Aminosäure wie Cystin, Homocystin, Cystein, Homocystein, Aspartamsäure, Cysteinsäure ist oder ein Ester davon wie der Methyl- oder Ethylester, ergibt die Reaktion vorteilhafter Weise ein Derivat einer Nitrilotriessigsäure. Zum Beispiel kann ein Nitrilotriessigsäurederivat von Cystin durch Kombinieren von Cystin, einer Oxosäure wie Glyoxylsäure und einem milden reduzierenden Mittel hergestellt werden; Alkohol kann vorzugsweise zugefügt werden, um bei der Klärung der Lösung zu helfen. Alternativ können andere, dem Fachmann geläufige Verfahren zur Herstellung von Verbindung (2) verwendet werden, umfassend Haloalkylsäuren.
Verbindung (2) kann immobilisiert werden, um Verbindung (1) zu bilden, indem ein chemischer Abstandshalter, S¹, durch dem Fachmann geläufige Verfahren an den Binder, L, kovalent verknüpft wird, und dann der Träger mit dem Abstandshalter, S¹, zur Reaktion gebracht wird, um einen Träger-Abstandshalter-Chelat-Komplex von Verbindung (1) zu formen. In einer Ausführungsform wird Träger Q zunächst mit dem Abstandshalter, S¹, zur Reaktion gebracht, um einen Träger-Abstandshalter-Komplex zu bilden. Danach wird der Träger-Abstandshalter-Komplex durch den Binder, L, an den Chelat-Komplex verknüpft, um Verbindung (1) zu bilden.
In manchen Fällen ist es vorteilhaft, den Träger, Q, mit S¹ vor der Verknüpfung mit dem chelatbildenden Teil des Moleküls zu aktivieren. In diesen Fällen, wenn Q ein Agarose-Harz ist, kann es aktiviert werden, indem Epichlorhydrin, Tetrabutyldiglycidylether oder irgendeine Substanz, die in der Lage ist, einen Träger zu aktivieren, verwendet wird.
Ein Metallchelat kann durch Addition eines Metalls oder Metalloxids an die chelatbildende Verbindung (1) oder Verbindung (2) der vorliegenden Erfindung gebildet werden. Zum Beispiel wird ein Metallchelat der vorliegenden Erfindung (in immobilisierter Form) durch die folgende Formel dargestellt: Q-S¹-A-T-CH[((CH₂)_k-X)-N((CH₂)_i-Y)-(CH₂)_i-Z]M wobei Q, S¹, A, i, J, k, T, X, Y und Z wie oben definiert sind und M irgendein Metall oder Metalloxid umfasst, das in der Lage ist, ein Chelat zu bilden. Bevorzugte Metalle und Metalloxide schließen Ni, Hg, Ga, Cu, Ru, Co, Cd, Mg, Mn, Ti, In, Zn, Tc, Rh, Pd, Re, Fe, Au, Pb und Bi ein, wobei Fe, Cu, Co, Au und Ni für die meisten Anwendungen bevorzugt sind. Im allgemeinen ist das Metall, M, das für eine gegebene Anwendung bevorzugt wird, abhängig von den spezifischen Bindungsfähigkeiten des chelatbildenden Teils von Verbindung (1) oder (2) und von der Verbindung, die gebunden oder gereinigt werden soll. Zum Beispiel, wenn X, Y und Z -COOH sind, ist M optimalerweise Ni zur Reinigung von Proteinen mit Polyhistidinsequenzen. Wenn die Verbindung ein Phosphoprotein, ein Phosphopeptid oder ein Phosphat-enthaltendes Molekül ist, ist M optimalerweise Fe oder Ga.
Definitionen
Die hierin beschriebenen "Kohlenwasserstoff"-Reste sind organische Verbindungen oder Radikale, die ausschließlich aus den Elementen Kohlenstoff und Wasserstoff bestehen. Diese Reste umfassen Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, und Aryl-Reste. Diese Reste können substituiert oder unsubstituiert sein und sind vorzugsweise substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl. Diese Reste umfassen auch Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, und Aryl-Reste, die mit anderen aliphatischen oder zyklischen Kohlenwasserstoffgruppen substituiert sind, wie Alkaryl, Alkenaryl und Alkynaryl. Wenn nicht anders angegeben, umfassen diese Reste 1 bis 20 Kohlenstoffatome.
Wenn nicht anders angegeben, sind die hierin beschriebenen Alkylgruppen vorzugsweise niedrigere Alkyle, die von 1 bis 6 Kohlenstoffatome in der Hauptkette enthalten und bis zu 20 Kohlenstoffatome enthalten. Sie können gerade sein, eine verzweigte Kette oder zyklisch und schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Hexyl und ähnliche ein. Sie können mit aliphatischen oder zyklischen Kohlenwasserstoffradikalen substituiert sein.
Wenn nicht anders angegeben, sind die hierin beschriebenen Alkenylgruppen vorzugsweise niedrigere Alkenyle, die von zwei bis sechs Kohlenstoffatomen in der Hauptkette und bis zu 20 Kohlenstoffatome enthalten. Sie können gerade oder eine verzweigte Kette sein und schließen Ethenyl, Propenyl, Isopropenyl, Butenyl, Isobutenyl, Hexenyl und ähnliche ein. Sie können substituiert mit aliphatischen oder zyklischen Kohlenwasserstoffradikalen sein.
Wenn nicht anders angegeben, sind die hierin beschriebenen Alkynylgruppen vorzugsweise niedrigere Alkynyle, die von zwei bis sechs Kohlenstoffatome in der Hauptkette und bis zu 20 Kohlenstoffatome enthalten. Sie können gerade oder eine verzweigte Kette sein und schließen Ethynyl, Propynyl, Butynyl, Isobutynyl, Hexynyl und ähnliche ein. Sie können substituiert mit aliphatischen oder zyklischen Kohlenwasserstoffradikalen sein.
Wenn nicht anders angegeben, enthalten die hierin beschriebenen Arylreste von 6 bis 20 Kohlenstoffatome und schließen Phenyl ein. Sie können mit den verschiedenen Substituenten, die hierin beschrieben sind, Kohlenwasserstoff-substituiert sein. Phenyl ist das bevorzugtere Aryl.
Die hierin beschriebenen substituierten Kohlenwasserstoffreste sind Kohlenwasserstoffreste, die mit wenigstens einem Atom außer Kohlenstoff substituiert sind, einschließlich Reste, in denen ein Kohlenstoffkettenatom mit einem Heteroatom wie Stickstoff, Sauerstoff, Silizium, Phosphor, Bor, Schwefel oder einem Halogenatom substituiert ist. Diese Substituenten sind mit Ausnahme von Hydroxyl und umfassen niedrigere Alkoxy wie Methoxy, Ethoxy, Butoxy; Halogen wie Chlor oder Fluor; Ether; Acetale; Ketale; Ester; Heteroaryle wie Furyl oder Thienyl; Alkanoxy; Acyl; Acyloxy; Nitro; Amino; und Amido.
Die hierin beschriebenen Acylreste enthalten Kohlenwasserstoff, substituierten Kohlenwasserstoff oder Heteroarylreste. Sie haben die allgemeine Formel -C(O)X, wobei X Kohlenwasserstoff, Kohlenwasserstoff-Oxy, Kohlenwasserstoff-Amino oder Kohlenwasserstoff-Thio umfassen kann.
Ein Protein, wie hierin benutzt, schließt Antikörper, Enzyme, Hämoglobin, Hormone, Polypeptide und Peptide ein; und kann ein intaktes Molekül, ein Fragment davon, oder ein funktionales Äquivalent davon sein; und kann genetisch manipuliert sein.
Ein Antikörper, wie hierin benutzt, umfasst sowohl polyclonale und monoclonale Antikörper; und kann ein intaktes Molekül, ein Fragment davon sein; und kann genetisch manipuliert sein.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung von N,N-bis(carboxymethyl)-L-Cystein gekoppelt an einen unlöslichen Träger durch Festphasen-Carboxymethylierung.
Herstellung von Epichlorhydrin-aktivierter Sepharose^®: 50 ml Sepharose^® CL 4B (Pharmcia Biotech) wurde dreimal mit 100 ml Wasser in einem Glas-Saugfilter gewaschen. Sie wurde in einen mit einem Rührer und einem Thermometer ausgestatteten Dreihalskolben transferiert. Unter Rühren wurden 30 ml Wasser und 4 ml 10 N Natriumhydroxid zugegeben, gefolgt von 8 ml Epichlorhydrin. Die Mischung wurde für 2 Stunden auf 46°C geheizt. Das aktivierte Harz wurde auf einen neutralen pH gewaschen, indem 800 ml deionisiertes Wasser benutzt wurde.
Herstellung von N,N-bis-Carboxymethyl-L-Cystein
Agarose: Eine Lösung von 16,3 g L-Cystein in 185 ml 1 N Natriumhydroxid wurde zu 48 ml Epichlorhydrin-aktiviertem Harz in einem Erlenmeyer-Kolben zugegeben und wurde für 18 Stunden bei 22°C leicht gerührt. Die Mischung wurde fünfmal mit 200 ml Wasser gewaschen. Der Kaiser-Test auf freies Amin [Kaiser, E., et al, Anal. Biochem., 34:595 (1970)] ergab eine tiefblaue Farbe. 47,6 ml des obigen feuchten Harzes in einem Erlenmeyer-Kolben wurde mit einer Lösung von
8,0 g Bromessigsäure in 50 ml von 1 N Natriumhydroxid und 25 ml 1 M Natriumbicarbonat für 72 Stunden bei 22°C gerührt. Das Harz wurde dann dreimal mit 100 ml deionisiertem Wasser gewaschen. 16 g feuchtes Harz wurde leicht mit 50 ml 0.2 M Natriumacetat und 2,5 ml Essigsäureanhydrid für 45 Minuten bei 22°C leicht gerührt. Das Harz wurde dreimal mit 100 ml Wasser gewaschen. Der Kaiser-Test ergab eine schwache blaue Farbe. Das Harz wurde in einem gleichen Volumen an 30 %igem Ethanol bei 4°C aufbewahrt.
Nickel-Beladung und Kapazitätsanalyse: Das wie oben beschrieben hergestellte N,N-bis(carboxymethyl)-Cysteinharz wurde zunächst getestet, indem das Vermögen des Harzes, Nickel zu chelatisieren, bestimmt wurde. Ungefähr 2,5 ml des Harzes wurde mit 10 ml an 10 mg/ml Nickelsulfat über Nacht mit Schütteln bei 50 rpm bei 4°C inkubiert. Das Harz wurde gut gemischt und in eine 1 × 10 cm Säule platziert, und man ließ die zusätzliche Nickellösung aus dem Harz hinauslaufen. Das ungebundene Nickelsulfat wurde aus dem Harz gespült, indem 20 bis 30 Säulenvolumen an deionisiertem Wasser benutzt wurden. Das übriggebliebene Wasser ließ man aus dem Harz abfließen. Ein gleiches Volumen an Wasser wurde zum Harz zugegeben, gut gemischt und dann wurde die Aufschlämmung zur Lagerung bei 4°C aus der Säule entfernt. Das Äquivalent von einem ml an Packung aus Harz wurde mit Säure hydrolysiert und dann durch ICP auf Nickelgehalt analysiert. Dieses Harz band 5,2 μmol Nickel pro ml Harz.
Proteinbindung und Spezifitätstestung: Der Gebrauchstest für spezifische Proteinbindung für Polyhistidin-enthaltende Proteine wurde an einer 0,5 × 7,6 cm-Säule, die 1,5 ml an Packung aus Harz enthielt, durchgeführt. Das Harz wurde mit 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid und 10 mM Imidazol pH 8,0 (Gleichgewichtspuffer) ins Gleichgewicht gebracht. Fünf ml eines rohen E. Coli-Extraktes, enthaltend eine bakterielle alkalische Phosphatase mit einem Poly-Histidin-Indentifikationszeichen (tag), wurde auf die Säule geladen. Dieses rohe Extrakt wurde frisch aus eingefrorener E. Coli-Zellen-Paste, indem CelLytic-B (Sigma Chemical Company) benutzt wurde, hergestellt. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumen (15 ml) an Gleichgewichtspuffer gewaschen, um ungebundene Proteine zu entfernen. Das gebundene Material wurde mit 10 Säulenvolumen (15 ml) 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid und 320 mM Imidazol pH 8,0 eluiert. Die Spitzenfraktionen (peak fractions) des eluierten Materials wurden gesammelt. Das eluierte Material wurde durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf Reinheit untersucht, nach alkalischer Phosphataseaktivität und Proteingehalt durch Bradford Proteinuntersuchung. Die Untersuchungsergebnisse zeigten, dass das eluierte Protein aus dieser Ein-Schritt-Isolationsprozedur unter Benutzung dieses einzigartigen Chelatharzes im wesentlichen homogene bakterielle alkalische Phosphatase ergab.
Beispiel 2
Herstellung von N,N-bis(carboxymethyl)-L-Cystin
Herstellung von N, N, N', N' -Tetrakis(carboxymethyl)-L-Cystin: L-Cystin (24,03 g; 0,1 mol) wurde in ein Becherglas gegeben, das 2,0 L 0,05 M Boratpuffer, pH 9,0 enthielt und mit einem Magnetrührfisch gemischt. Glyoxylsäure (Monohydrate) (368,2 g; 4 mol) wurde unter Rühren zu der Lösung zugegeben. Die Lösung enthielt 20 ml Puffer pro mmol Cystin und 40 mol Glyoxylsäure pro mol Cystin. Ein Eis-Wasserbad wurde um das Becherglas platziert, um die Lösung auf zwischen 15 bis 25°C abzukühlen. Der pH der Mischung wurde mit 5 N Natriumhydroxid auf 9,0 eingestellt. Das Eisbad wurde entfernt und das Becherglas wurde bei Raumtemperatur gelassen. 8 M Boran-Pyridin-Komplex (250 mL) wurde zugegeben, 20 mol pro mol Cystin. Ethanol bis auf eine endgültige Konzentration von zwischen 25 bis 50 % wurde zugegeben, um die Lösung aufzuklaren. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt, um die Reaktion zu vollenden. Die Reaktion wurde durch HPLC überwacht, bis die Reaktion komplett war. Das Reaktionsgemisch wurde in ein größeres Gefäß gegossen und mit 3 Inhalten an Wasser verdünnt. Salzsäure (10 N) wurde langsam zugegeben, um den pH auf unter 1,0 einzustellen. Das Reaktionsgemisch wurde 30 bis 60 Minuten gerührt. Der pH des Reaktionsgemischs wurde dann unter Benutzung von 5 N Natriumhydroxid auf ungefähr 6,5 eingestellt.
Reinigung von N,N,N', N'–Tetrakis(carboxymethyl)-L-Cystin: Das rohe N,N,N', N'–Tetrakis(carboxymethyl)-L-Cystin-Reaktionsgemisch wurde mit Wasser verdünnt, um die Leitfähigkeit auf weniger als 5 milli mhos zu verringern. Der pH wurde auf zwischen 7,0 und 8,5 mit 1 M Natriumhydroxid eingestellt. Die Mischung wurde dann auf eine DEAE-Sephadex^®-HCO3 (Pharmacia Biotech)-Säule aufgetragen, die in deonisiertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht wurde, indem 10 ml Harz pro mmol Cystin Startmaterial benutzt wurden. Sobald die Säulenladung komplett war, wurde sie mit 4 Säuleninhalten an deionisiertem Wasser gewaschen. Dann wurde die Säule mit 4 Säulenvolumen 0,1 M Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) gewaschen. Das gereinigte Produkt wurde mit 0,5 M TEAB aus der Säule eluiert. Das gesammelte Material wurde in einem Rotationsverdampfer (Rotovap) getrocknet, bis ein klebriger Feststoff gebildet wurde. Dann wurde es in einem minimalen Volumen an Wasser aufgelöst. Das Material wurde nun komplett getrocknet. Die Wasser-Re-Suspensions- und Trocknungs-Schritte wurden dann noch einmal wiederholt. Der endgültige Feststoff wurde in 400 mL Wasser aufgelöst.
Umwandlung in die freie Säure: Amberlite IR H⁺-Harz, das mit deionisiertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht wurde, wurde zu dem rohen Material (25 ml Harz pro mmol Cystin) zugegeben. Der pH wurde mit pH-Papier überwacht. Nach Umwandlung in die freie Säure wurde das Harz durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde in einem Rotationsverdampfer getrocknet, bis es komplett trocken war.
Reduktion von N,N,N', N' –Tetrakis(carboxymethyl)-L-Cystin zu N,N-bis(carboxymethyl)-L-Cystein-Tetrakis(carboxymethyl)-Cystin: Das rohe Tetrakis(carboxymethyl)-L-Cystin (23,65 g, 0,05 mol) wurde in Wasser bei 5 ml Wasser pro Gramm aufgelöst. Der pH der Lösung wurde mit 1 N Natriumhydroxid auf 9,0 bis 9,2 eingestellt. Dann wurde unter Rühren 14,34 g (0,05 mol) an Tris(carboxyethyl)phosphin (TCEP) zugegeben, bis das ganze TCEP aufgelöst war. Es wurde dann für 10 Min. inkubiert. Die Reduktion wurde dann bei HPLC gefolgt. Nach kompletter Reduktion, im allgemeinen in weniger als 20 Minuten, wurde der pH mit 1 N Salzsäure auf 5,0 bis 6,0 eingestellt. Das Produkt kann an dieser Stelle verwendet werden oder es kann lyophilisiert werden. Die Ausbeute war zwischen 50-75 %, basierend auf der Startmenge an Cystin.
Beispiel 3
Herstellung und Analyse von N,N-bis(carboxymethyl)-L-Cystein, covalent angebunden an Agarose.
Epichlorhydrinaktivierung des Harzes: 1 L an Sepharose 6B (Pharmica Biotech) wurde gut mit deionisiertem Wasser gewaschen. Das Harz wurde in einem gleichen Volumen an 0,8 M Natriumhydroxid suspendiert. Es wurde unter Rühren mit 100 ml Epichlorhydrin kombiniert. Es wurde unter Rühren für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Harz wurde mit 3 Volumen an 0,1 M Natriumphosphat, pH 7, gewaschen, gefolgt von 6 Volumen an deionisiertem Wasser.
Harzaminierung: Die Amino-Sepharose^® 6B wurde hergestellt, indem das Epichchlorhydrinaktivierte Harz in einem gleichen Volumen (ein Harzvolumen) von 2 M Ammoniumhydroxid suspendiert und bei Raumtemperatur über Nacht leicht gerührt wurde. Das Harz wurde mit 3 Volumen an 0,1 M Natriumphosphat, pH 7, gewaschen. Das Harz wurde mit 6 Volumen an deionisiertem Wasser gewaschen.
Bromacetylierung von Amino-Sepharose^® 6B: Das gewaschene Amino-Sepharose^® 6B-Harz wurde zu Wasser zugegeben, um eine 50 %ige-Harzaufschlämmung herzustellen. Der pH wurde auf ungefähr 5,8 bis 6,0 mit 1 N HCl eingestellt. Die Harzaufschlämmung wurde bei Raumtemperatur beibehalten und die folgenden Reaktionen wurde bei reduzierten Lichtverhältnissen durchgeführt. 0,15 mol an Bromessigsäure in 0,2 M Imidazol, pH 5,8 wurden zu der Aufschlämmung zugegeben. Dann wurden 0,75 mol festes 1-Ethyl-3-(3-diamethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) zugegeben, während das Harz leicht gerührt wurde. Diese Harzaufschlämmung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden unter Beibehaltung eines pHs von 6,0 leicht gerührt. Die nicht-abreagierten Amine wurden durch Acetylierung blockiert. 6,5 ml Essigsäureanhydrid wurden zu der Harzaufschlämmung zugegeben, gefolgt von leichtem Rühren für 30 Minuten. Dann wurde das Harz mit 5 Volumen an 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, gewaschen
Bis(carboxymethyl)cysteinkopplung an bromacetyliertes Harz: Die folgenden Reaktionen wurden unter reduzierten Lichtbedingungen durchgeführt. Die gewaschene bromacetylierte Harzplatte wurde in 1 Harzvolumen an 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, suspendiert, um eine 50 %ige Harzaufschlämmung herzustellen. Durch die Aufschlämmung wurde 10 Minuten lang Stickstoff durchgesprudelt, um zu entlüften. 15 mmol an wie in Beispiel 2 hergestelltem Bis (carboxymethyl)cystein wurden zugegeben und der pH wurde mit 1 N Natriumhydroxid auf 7,5 eingestellt. Es wurde dann bei Raumtemperatur für mindestens zwei Stunden gerührt. β-Mercaptoethanol (14,3 M, 1,5 mL pro Liter Harz) wurde zu der Aufschlämmung zugegeben und die Inkubation wurde für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt, um nicht abreagierte Bromacetylgruppen zu blockieren. Das Harz wurde dann mit 3 Volumen Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen, gefolgt von 5 Volumen an deionisiertem Wasser.
Nickel-Beladung und Kapazitätsanalyse: Das wie oben beschrieben hergestellte N,N-bis(carboxymethyl)-L-Cystein wurde getestet, indem zunächst das Vermögen des Materials, Nickel zu chelatieren, bestimmt wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben. Dieses Harz band 12,0 μmol an Nickel pro ml an Harz.
Proteinbindung und Spezifitätstestung: Der Gebrauchstest für spezifische Proteinbindung für Polyhistidin-enthaltende Proteine durch dieses Harz wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Untersuchungsergebnisse demonstrierten, dass das eluierte Protein aus dieser Ein-Schritt-Isolationsprozedur unter Benutzung dieses einzigartigen Chelat-Harzes im wesentlichen homogene bakterielle alkalische Phosphatase lieferte.
Beispiel 4
Herstellung und Analyse von Aminoethylamido-N, N-bis(carboxymethyl)-L-Cysteinsäure, gekoppelt an den unlöslichen Träger Agarose.
Herstellung von L-Cysteinsäuremethylester: Eine Mischung von 1 g von L-Cysteinsäure, 8 ml an 4 N Salzsäure in Dioxan und 30 ml trockenes Methanol wurde in eine Flasche gegeben. Die Flasche wurde verschlossen und für ungefähr 96 Stunden bei Raumtemperatur gelagert. Dünnschichtchromatographie der klaren Lösung [Analtech Silica-Gelplatten, n-Butanol: Ethylacetat: Essigsäure: Wasser (1:1: 1:1), Chlor/Kaliumiodid-Stärkereagenz (Stewart. J.M. and Young. J.D in Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, PP. 120 (1984)) zeigte mehr als 95 % Umsetzung von Cysteinsäure in den Ester. Die Lösemittel wurden unter Vakuum entfernt, um 1,05 g eines klebrigen Feststoffs zu erhalten. Massenspektrometrie-Analyse lieferte den m/z für das M⁺¹-Ion als 184.3. Fragmentierung dieses Ions lieferte das M⁺¹-Ion von 123.9, das den Verlust einer der Carboxymethylgruppen dargestellt. Die Feststoffe wurden ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe benutzt.
Aminoethylamido-N, N-bis(carboxymethyl)-L-Cysteinsäure-Herstellung: Triethylamin (10 ml) wurde zu einer Mischung der 0,8 g des obigen Cysteinsäuremethylesters in 12,5 ml an DMF in einer Flasche zugegeben, um eine klare Lösung zu erhalten. Zu dieser Lösung wurden 4,4 g an Bromessigsäure zugegeben, gefolgt von ungefähr 15 ml Triethylamin, bis der pH ungefähr 10 war. Die Lösung wurde eine feste Masse. Nach einem Monat bei Raumtemperatur wurden zusätzliche 1,5 g Bromessigsäure und 15 ml an DMF zu der Mischung zugegeben. Der pH der Mischung wurde mit Triethylamin auf ungefähr 10 eingestellt. Massenspektrometrieanalyse lieferte den m/z des Haupt-M^–1-Ions als 298,2.
Das obige Reaktionsgemisch wurde nach 24 Stunden gefiltert und die Feststoffe wurden mit 20 ml an Dimethylformamid gewaschen. Ethylendiamin (35 ml) wurden zu dem braunen Filtrat zugegeben und die Lösung wurde bei 60°C für 18 Stunden geheizt. Die klare braune Lösung wurde unter Vakuum zu einem Öl verdampft. 50 ml an Wasser wurden zugegeben und wieder zu einem Öl verdampft. Der letzte Schritt wurde noch einmal wiederholt. Dann wurden 6,1 L an Wasser zu dem braunen Öl zugegeben und die Lösung wurde auf eine 100 ml Säule von DEAE Sephadex^® (Pharmica Biotech) geladen. Die Säule wurde mit 800 ml an Wasser gewaschen. Das Produkt wurde mit einem linearen Gradienten mit jeweils 1 L an Wasser und 0,1 N Salzsäure eluiert. Die Flussrate war 2 ml pro Minute. Fraktionen von 5 ml wurden gesammelt. Fraktionen, die ein gelbes Produkt enthielten, wurden untersucht. Basierend auf Dünnschichtchromatographie [Analtech Silica-Gelplatten, n-Butanol: Ethylacetat: Essigsäure: Wasser (1:1:1:1), Chlor/Kaliumiodid-Stärke] wurden die Fraktionen, die das Produkt enthielten, vereinigt und unter Vakuum bis zur Trockne verdampft, um 295 mg an hellgelbem schaumigem Feststoff zu erhalten. Massenspektrometrieanalyse lieferte den m/z des Haupt-M⁺¹ von 328.5.
Herstellung von Aminoethylamido-N, N-bis(carboxymethyl)-L-Cysteinsäureagarose: Eine Lösung von 221 mg von wie oben beschrieben hergestellter Aminoethylamido-N-bis-carboxymethylcysteinsäure wurde in 3 ml an Wasser aufgelöst und in eine Glasflasche überführt. Zu der Flasche wurden 10 ml 0,5 M Natriumcarbonat zugegeben, gefolgt von 8 g feuchter Epichlorhydrin-aktivierter Sepharose^® CL 4B, die wie in Beispiel 3 hergestellt wurde. Die Mischung wurde bei 60°C für 24 Stunden leicht geschüttelt. Das Harz wurde gefiltert und fünfmal mit 50 ml an Wasser gewaschen. Das Harz wurde in 20 ml 30 %igem 200-Proof-Ethanol bei 4°C gelagert.
Nickel-Beladung und Kapazitätsanalyse: Das wie oben beschrieben hergestellte Aminoethylamido-N-bis-(carboxymethyl)-L-Cysteinsäureharz wurde wie in Beispiel 1 getestet. Dieses Harz band 15,6 μmol an Nickel pro ml an Harz.
Proteinbindung und Spezifitätstestung: Der Gebrauchstest für spezifische Proteinbindung für Polyhistidin-enthaltende Proteine durch dieses Harz wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Untersuchungsresultate demonstrierten, dass das eluierte Protein aus dieser Ein-Schritt-Isolations-Prozedur unter Benutzung dieses einigartigen Chelatharzes im wesentlichen homogene bakterielle alkalische Phosphatase lieferte.
Beispiel 5
Herstellung und Testung von N,N-bis(carboxymethyl)-Cystein, gekuppelt an die lösliche Verbindung, Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin, BSA).
Herstellung des löslichen Chelats: Rinderserum-Albumin (272 mg; BSA) wurde bei 10 mg/ml in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,2, aufgelöst. Bromessigsäure-NHS-ester (57 mg; 0,24 mmol) in 0,5 ml Dimethylformamid (DMF) wurde zu der Lösung zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf einer Sephadex^® G-50 (Pharmacia Biotech)-Säule, die in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,2 equilibriert und betrieben wurde, entsalzt. Die Säule wurde durch Absorbanz bei 280 nm überwacht. Die Fraktionen, die Absorbanz bei 280 nm enthielten, wurden kombiniert. Sie wurden dann mit Argon für 3 Minuten leicht durchströmt. N,N-bis(carboxymethyl)Cystein (39 mg; 0,12 mmol) wurde in 0,2 ml an 0,1 M Natriumphosphat, pH 8,0 aufgelöst (wie in Beispiel 3 hergestellt) und dann zu der BSA-Lösung zugegeben, welche dann mit Argon durchströmt wurde. Die Reaktionsmischung wurde bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Kupplungseffizienz wurde durch die 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure)(DTNB)-Reaktion überwacht und wurde als mindestens 95 % bestimmt. Die Mischung wurde auf einer Sephadex^® G-50 (Pharmacia Biotech)-Säule entsalzt, welche mit einem Puffer enthaltend 10 mM 3-(N-morpholin)propansulfonsäure (MOPS) und 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,0, eluiert wurde. Das lösliche BSA-Chelat wurde mit 0,01 M Nickelsulfat in einem Puffer von 10 mM MOPS und 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,0 beladen. Die endgültige Lösung wurde auf einer Sephadex^® G-50 (Pharmacia Biotech)-Säule entsalzt. Das entsalzte, blaugefärbte BSA-Nickel-Chelat wies Absorbanz-Peaks bei 280 nm und 390 nm auf, was anzeigte, dass Nickel durch Chelat an das Konjugat gebunden war.
Gebrauchstestung des löslichen Rinderserum-Albumin-Trägers, der kovalent an das N,N-bis(carboxymethyl)-L-Cystein gebunden war: Das wie oben hergestellte BSA-Chelat wurde an Polystyrolmicrotiterlöcher absorbiert, indem 5 μg/ml in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 9,6 über Nacht benutzt wurden. Die Microtiterplatte wurde dreimal mit PBS mit 0.05 % Tween 20 gewaschen. Das gebundene BSA-Chelat wurde durch Inkubieren der Platte mit 0,01 M Nickelsulfat in MOPS pH 7,0 für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Nickel beladen. Die Platte wurde dreimal mit Wasser gewaschen. Ein Modell-Verbindungsprotein, bakterielle alkalische Phosphatase, enthaltend ein N-terminales Polyhistidin-Identifikationszeichen, wurde in den BSA-Nickelchelat-Microtiterlöchern bei verschiedenen Konzentrationen in dem MOPS-Puffer inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit dem MOPS-Puffer gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen. Das alkalische Phosphatase-Verbindungsprotein wurde durch Inkubation der Microtiterlöcher mit einem alkalischen Phosphataseenzymsubstrat detektiert. Die Untersuchung zeigte eine signifikante Menge an chelatspezifischer Bindung des Polyhistidin-Verbindungsproteins an das Albuminnickel-Chelat.

Claims

Metallchelatisierende Verbindung mit der Formel:
wobei Q ein Träger ist; S¹ ein Abstandhalter ist; L -A-T-CH(X)- ist; A eine Thioether- oder Selenether-Bindungselement ist; T eine Bindung oder ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkenyl ist; X -(CH₂)_kCH₃, -(CH₂)_kCOOH, -(CH₂)_kSO₃H, -(CH₂)_kPO₃H₂, -(CH₂)_kN(J)₂, oder -(CH₂)_kP(J)₂ ist; k eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist; J Kohlenwasserstoff oder substituierter Kohlenwasserstoff ist; Y -COOH, -H, -SO₃H, -PO₃H₂, -N(J)₂, oder -P(J)₂ ist; Z -COOH, -H, -SO₃H, -PO₃H₂, -N(J)₂, oder -P(J)₂ ist; und i eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei A ein Thioetherbindungselement ist.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Träger aus der Gruppe, bestehend aus Agarose, Zellulose, Methacrylat-Copolymeren, Polystyrol, Polypropylen, Papier, Polyamid, Polyacrylnitril, Polyvinyliden, Polysulphon, Nitrozellulose, Polyester, Polyethylen, Siliziumoxid, Glas, Latex, Plastik, Gold, Eisenoxid, Polyacrylamid, Nukleinsäure, Lipide, Liposome, synthetische lösliche Polymere, Proteine, Polyaminosäuren, Albumin, Antikörper, Enzyme, Streptavidin, Piptide, Hormone, chromogene Färbemittel, fluoreszierende Färbemittel, Flurochrome und Polysaccharide, ausgewählt ist.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei X -(CH₂)_kCOOH ist, Y Wasserstoff oder -COOH ist, Z Wasserstoff oder -COOH ist und K so wie in Anspruch 1 definiert ist.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei A ein Thioether-Verbindungselement ist, T -CH₂- ist, X -COOH ist, Y -COOH ist, Z -COOH ist und i gleich 1 ist.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei S¹ aus einer Kette von nicht mehr als 25 Atomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, besteht.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei S¹ als Kette von nicht mehr als 15 Atomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff und Schwefel, definiert ist und T -(CH₂)_n ist, wobei n gleich 0 bis 6 ist.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei S¹ kein Aminverbindungselement enthält.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei A und T von einer Aminosäure abgeleitet sind.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß Anspruch 9, wobei die Aminosäure aus der Gruppe, bestehend aus Zystin, Homozystin, Zystein, Homozystein, Asparaginsäure, Zysteinsäure oder Ester davon, ausgewählt ist.
Metallchelatisierende Verbindung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

wobei Q wie in Anspruch 1 definiert ist und Ac Acetyl ist.
Metallchelat, umfassend ein Metall und die metallchelatisierende Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
Metallchelat gemäß Anspruch 12, wobei das Metall ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ni, Hg, Ga, Cu, Ru, Co, Cd, Mg, Mn, Ti, In, Zn, Tc, Rh, Pd, Re, Fe, Au, Pb und Bi.
Metallchelat gemäß Anspruch 13, wobei das Metall Nickel ist.
Verfahren zur Reinigung oder Detektion einer Verbindung, wobei das Verfahren das in-Kontakt-bringen der Verbindung mit einem Metallchelat gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Verbindung ein Polypeptid ist, welches mindestens zwei Histidinreste enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Verbindung ein Polypeptid ist, welches mindestens sechs Histidinreste enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Zusammensetzung ein Protein, Phosphoprotein, Peptid, Phosphopeptid, Nukleinsäure, Oligonucleotid, Arzneimittel oder ein synthetisches oder natürliches Produkt, welches eine Affinität für Metallchelate aufweist, ist.