ES2244609T3 - Composiciones quelantes de metales. - Google Patents
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Abstract
Composición quelante de metales que presenta la fórmula: en la que Q es un portador; S1 es un espaciador; L es -A-T-CH(X)-; A es un enlace tioéter o selenoéter; T es un enlace o alquilo o alquenilo sustituido o no sustituido; X es -(CH2)kCH3, -(CH2)kCOOH, -(CH2)kSO3H, - (CH2)kPO3H2, -(CH2)kN(J)2 o -(CH2)k, P(J)2; k es un número entero comprendido entre 0 y 2; J es hidrocarbilo o hidrocarbilo sustituido; Y es -COOH, -H, -SO3H, -PO3H2, -N(J)2 o -P(J)2; Z es -COOH, -H, -SO3H, -PO3H2, -N(J)2 o -P(J)2; e i es un número entero comprendido entre 0 y 4.
Description
Composiciones quelantes de metales.
La presente invención se refiere de manera
general a las composiciones quelantes de metales y a los
procedimientos para producir y utilizar los mismos para la
purificación, detección o unión de proteínas y, en particular, se
refiere a derivados del ácido nitriloacético que presentan
especificidad y estabilidad de unión mejoradas y a procedimientos
para producir y utilizar estos derivados de ácido nitriloatriacético
para la purificación de proteínas, detección de proteínas o unión de
proteínas.
Durante muchos años se ha utilizado la
cromatografía de afinidad con quelatos metálicos como técnica para
la purificación de proteínas. Las primeras resinas utilizadas en
este procedimiento eran simples quelantes, tales como el ácido
iminodiacético (IDA) unido a soportes de agarosa (Porath et
al., Nature 258:598-599, 1975) y cargado
con diversos metales, tales como Cu^{2+}, Zn^{2+} y Ni^{2+}.
Se descubrió que estas resinas capturaban proteínas y péptidos de
origen natural de manera selectiva (Porath y Olin,
Biochemistry, 22:1621, 1983; Lonnerdal y Keen, J. Appl.
Biochem., 4:203, 1983; Sulkowski, Protein Purification: Micro
to Macro, páginas 149-162, editado por R.
Burgess, publicado por Liss New York, NY, 1987). Con la llegada de
las técnicas de biología molecular, la cromatografía de quelatos
metálicos adquirió un papel más importante en la purificación de
proteínas con la utilización de una etiqueta de
6-histidina. Ver, por ejemplo, Dobeli et al.,
patente U.S. nº 5.284.933. La etiqueta de polihistidina se unía muy
fuertemente al níquel inmovilizado y podía utilizarse para la
identificación y purificación de estas moléculas recombinantes. El
quelante tridentado IDA era bastante selectivo para estas proteínas
marcadas aunque se descubrió que el níquel se escapaba lentamente de
la resina, reduciendo su capacidad y provocando interferencia con
algunos usos posteriores de las proteínas.
Más recientemente, se ha desarrollado un quelante
tetradentado conocido como resina de ácido nitrilotriacético para su
utilización con metales que presentan seis sitios de coordinación.
Esta resina se ha convertido en la resina preferida para la
purificación de proteínas que contienen polihistidina debido a que
presenta muy pocas pérdidas de metales y una buena selectividad. Sin
embargo, se requiere un esfuerzo considerable para obtener esta
selectividad. Por ejemplo, resulta necesaria la adición de diversas
cantidades de imidazol para determinar si la resina se unirá a la
proteína de manera selectiva y debe optimizarse la capacidad de la
resina para la proteína con el fin de conseguir los resultados
deseados (Janknecht et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
88:8972-8976, 1991; Schmitt et al., Molecular
Biology Reports 88:223-230, 1993).
En la patente US nº 4.877.830, Dobeli et
al. describen resinas de ácido nitrilotriacético adecuadas para
la purificación de proteínas, representadas por la fórmula
general:
[matriz
portadora]-espaciador-NH-(CH_{2})_{x}-CH(COOH)-N(CH_{2}COO-)_{2}Ni^{2+},
en la que x es 2, 3 o 4, la matriz
portadora es una matriz utilizada en la cromatografía de afinidad o
en la cromatografía en gel, tal como los dextranos entrecruzados, la
agarosa o las poliacrilamidas y el espaciador preferentemente es
-O-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-
o -O-CO-. Dobeli et al., patente U.S. nº
4.877.830 en la columna 2, líneas 23-27. Estas
resinas se preparan haciendo reaccionar un compuesto protegido en el
extremo N-terminal con la fórmula
siguiente:
R-HN-(CH_{2})_{x}-CH(NH_{2})-COOH
en la que R es un grupo protector
de amino y x es 2, 3 o 4, con ácido bromoacético en un medio
alcalino y posteriormente cortando el grupo protector y haciendo
reaccionar este producto con una resina activada. Ver, por ejemplo,
Hochuli et al., Journal of Chromatography 411 (1987)
177-184.
En la patente U.S. nº 5.625.075, Srinivasan et
al. describen un compuesto quelante de metal radionucleido que
presenta múltiples atómos de azufre y de nitrógeno. Estos compuestos
quelantes incorporan dos átomos de nitrógeno y tres átomos de
azufre, dos átomos de nitrógeno y cuatro átomos de azufre, o tres
átomos de nitrógeno y tres átomos de azufre.
Aunque estos compuestos proporcionan una
especificidad mejorada en comparación con algunas resinas que
contienen derivados de ácido nitrilotriacético, sigue existiendo una
necesidad de compuestos quelantes que presenten una mayor
especificidad de unión para las proteínas que contienen
polihistidina.
Entre los objetivos de la presente invención se
encuentra la provisión de composiciones quelantes de metales y de
quelatos metálicos que son relativamente estables y proporcionan una
especificidad de unión superior para la purificación, detección o
unión de proteínas y de péptidos, y la provisión de procedimientos
para la preparación y utilización de tales composiciones.
En breve, por lo tanto, la presente invención se
refiere a una composición quelante de metales que presenta la
fórmula:
en la
que
Q es un portador;
S^{1} es un espaciador;
L es
-A-T-CH(X);
A es un enlace tioéter o selenoéter;
T es un enlace o alquilo o alquenilo sustituido o
no sustituido;
X es -(CH_{2})_{k}CH_{3},
-(CH_{2})_{k}COOH, -(CH_{2})_{k}SO_{3}H,
-(CH_{2}),PO_{3}H_{2},
-(CH_{2})_{k}N(J)_{2} o
-(CH_{2})_{k}P(J)_{2};
k es un número entero comprendido entre 0 a
2;
J es hidrocarbilo o hidrocarbilo sustituido;
Y es -COOH, -H, -SO_{3}H, -PO_{3}H_{2},
-N(J)_{2} o -P(J)_{2};
Z es -COOH, -H, -SO_{3}H, -PO_{3}H_{2},
-N(J)_{2} o -P(J)_{2}; e
i es un número entero comprendido entre 0 y
4.
La presente invención se refiere además a un
quelato metálico que comprende un metal y la composición quelante de
metales de la presente invención.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para la purificación o detección de un polipéptido o
de otra composición que presenta una afinidad para un quelato
metálico. El procedimiento comprende poner en contacto la
composición con un quelato metálico, comprendiendo el quelato
metálico, un metal y la composición quelante de metales de la
presente invención.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para la preparación de una amina monocarboxilada o
dicarboxilada. El procedimiento comprende combinar una amina y un
oxoácido en presencia de un agente reductor. La amina presenta la
fórmula R^{2}R^{3}NH, en la que R^{2} es hidrocarbilo o
hidrocarbilo sustituido y R^{3} es hidrógeno, hidrocarbilo o
hidrocarbilo sustituido.
Otros objetivos y características resultarán en
parte evidentes y en parte se indican posteriormente en el presente
documento.
Los presentes inventores han descubierto que la
unión entre el quelante y la resina es un parámetro importante para
la selectividad de la resina para las proteínas etiquetadas con
polihistidina.
La resina convencional de ácido nitrilotriacético
presenta un enlace amina cargado positivamente que actúa como sitio
de unión para cualquier molécula cargada negativamente que pueda
interferir con la unión de la proteína a los sitios de coordinación
ofrecidos por el metal inmovilizado. El oxígeno, azufre, selenio y
las amidas presentan alguna afinidad por metales que pueden
proporcionar propiedades quelantes mejoradas, uniendo el metal más
firmemente que los quelantes tetradentados tradicionales, que
presentan enlaces amina cargados positivamente. Además, la
utilización de átomos no cargados entre el nitrógeno del nitrilo y
el portador aparentemente reduce la unión no específica de
proteínas.
Las composiciones quelantes de metales de la
presente invención son capaces de formar quelatos relativamente
estables con iones metálicos y, ventajosamente, la presencia de
enlaces éter (-O-), tioéter (-S-), selenoéter (-Se-) o amida
((-NR^{1}(C=O)-) o (-(C=O)NR^{1}-), en los que
R^{1} es hidrógeno o hidrocarbilo, dentro de la composición
quelante contribuyen a la especificidad del quelato resultante
cuando se utiliza para la separación o purificación de moléculas,
tales como proteínas, fosfoproteínas, péptidos, fosfopéptidos, ADN,
ARN, oligonucléotidos, fármacos y productos sintéticos y naturales
que presentan una afinidad por los quelatos metálicos, tales como
las agrupaciones de histidinas o las polihistidinas.
En general, las composiciones quelantes de la
presente invención corresponden a la composición (1) mostrada en la
estructura siguiente:
en la
que
Q es un portador;
S^{1} es un espaciador;
L es
-A-T-CH(X);
A es un enlace tioéter o selenoéter;
T es un enlace o alquilo o alquenilo sustituido o
no sustituido;
X es -(CH_{2})_{k}CH_{3},
-(CH_{2})_{k}COOH, -(CH_{2})_{k}SO_{3}H,
-(CH_{2})_{k}PO_{3}H_{2},
-(CH_{2})_{k}N(J)_{2} o
-(CH_{2})_{k}P(J)_{2}, preferentemente
-(CH_{2})_{k}COOH o
-(CH_{2})_{k}SO_{3}H;
k es un número entero comprendido entre 0 y
2;
J es hidrocarbilo o hidrocarbilo sustituido;
Y es -COOH, -H, -SO_{3}H, -PO_{3}H_{2},
-N(J)_{2} o -P(J)_{2},
preferentemente -COOH;
Z es -COOH, -H, -SO_{3}H, -PO_{3}H_{2},
-N(J)_{2} o -P(J)_{2},
preferentemente -COOH; e
i es un número entero comprendido entre 0 y 4,
preferentemente 1 o 2.
En general, el portador, Q, puede comprender
cualquier material o compuesto sólido o soluble capaz de ser
derivatizado para su unión. Los portadores sólidos (o insolubles)
pueden seleccionarse entre un grupo que incluye agarosa, celulosa,
copolímeros de metacrilato, poliestireno, polipropileno, papel,
poliamida, poliacrilonitrilo, polivinilideno, polisulfona,
nitrocelulosa, poliéster, polietileno, sílice, vidrio, látex,
plástico, oro, óxido de hierro y poliacrilamida, pero puede ser
cualquier compuesto insoluble o sólido capaz de ser derivatizado
para permitir la unión del resto de la composición con el portador,
Q. Un portador sólido preferente es la agarosa o una placa de
microtitulación exploratoria de alto rendimiento. Los portadores
solubles incluyen proteínas, ácidos nucleicos, incluyendo ADN, ARN y
oligonucleótidos, lípidos, liposomas, polímeros solubles sintéticos,
proteínas, poliaminoácidos, albúmina, anticuerpos, enzimas,
estreptavidina, péptidos, hormonas, pigmentos cromogénicos,
pigmentos fluorescentes, fluorocromos o cualquier otra molécula de
detección, fármacos, compuestos orgánicos pequeños, polisacáridos y
cualquier otro compuesto soluble capaz de ser derivatizado para la
unión del resto de la composición con el portador, Q. Las proteínas
o polisacáridos son los portadores preferentes.
El espaciador, S^{1}, el cual flanquea al
portador, comprende una cadena de átomos que pueden ser saturados o
insaturados, sustituidos o no sustituidos, lineales o cíclicos, o
lineales o ramificados. Típicamente, la cadena de átomos que define
el espaciador, S^{1}, consiste en no más de aproximadamente 25
átomos; en otras palabras, el esqueleto del espaciador consiste en
no más de aproximadamente 25 átomos. Más preferentemente, la cadena
de átomos que define el espaciador, S^{1}, consiste en no más de
aproximadamente 15 átomos y todavía más preferentemente en no más de
aproximadamente 12 átomos. La cadena de átomos que define el
espaciador, S^{1}, típicamente se selecciona de entre el grupo que
consiste en carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre, selenio, silicio y
fósforo y preferentemente de entre el grupo que consiste en carbono,
oxígeno, nitrógeno, azufre y selenio. Además, los átomos de la
cadena pueden estar sustituidos o no sustituidos con átomos
diferentes del hidrógeno, tales como hidroxi, ceto (=O) o acilo, tal
como acetilo. De esta manera, la cadena puede incluir opcionalmente
uno o más enlaces éter, tioéter, selenoéter, amida o amina entre las
regiones hidrocarbilo o hidrocarbilo sustituidas. Entre los
espaciadores ejemplares, S^{1}, se incluyen metileno, alquilenoxi
(-(CH_{2})_{a}O-), alquilenotioéter
(-(CH_{2})_{a}S-), alquilenoselenoéter
(-(CH_{2})_{a}Se-), alquilenoamida
(-(CH_{2})_{a}NR^{1}(C=O)-), alquilenocarbonilo (-(CH_{2})_{a}CO)- y combinaciones de los mismos, en los que a de manera general se encuentra comprendida entre 1 y aproximadamente 20 y R^{1} es hidrógeno o hidrocarbilo, preferentemente alquilo. En una realización, el espaciador, S^{1}, es una estructura neutra hidrofílica y no contiene ningun enlace o sustituyente amina u otros enlaces o sustituyentes que pudiesen adquirir carga eléctrica durante la purificación de un polipéptido.
(-(CH_{2})_{a}NR^{1}(C=O)-), alquilenocarbonilo (-(CH_{2})_{a}CO)- y combinaciones de los mismos, en los que a de manera general se encuentra comprendida entre 1 y aproximadamente 20 y R^{1} es hidrógeno o hidrocarbilo, preferentemente alquilo. En una realización, el espaciador, S^{1}, es una estructura neutra hidrofílica y no contiene ningun enlace o sustituyente amina u otros enlaces o sustituyentes que pudiesen adquirir carga eléctrica durante la purificación de un polipéptido.
La composición quelante corresponde a la
fórmula:
en la que Q, S^{1}, A, T, X, Y y
Z son tal como se ha definido anteriormente. En la presente
realización, el éter (-O-),
tioéter (-S-), selenoéter (-Se-) o amida ((-NR^{1}(C=O)-) o (-(C=O)NR^{1}-), en que R^{1} es hidrógeno o hidrocarbilo), el enlace está separado de la porción quelante de la molécula por una región alquilo o alquenilo sustituida o no sustituida. Si no es un enlace, T es preferentemente alquilo C_{1} a C_{6} sustituido o no sustituido o alquenilo C_{2} a C_{6} sustituido o no sustituido. Más preferentemente, A es -S-, T es -(CH_{2})_{n}- y n es un número entero comprendido entre 0 y 6, típicamente entre 0 y 4, y más típicamente 0, 1 o 2.
tioéter (-S-), selenoéter (-Se-) o amida ((-NR^{1}(C=O)-) o (-(C=O)NR^{1}-), en que R^{1} es hidrógeno o hidrocarbilo), el enlace está separado de la porción quelante de la molécula por una región alquilo o alquenilo sustituida o no sustituida. Si no es un enlace, T es preferentemente alquilo C_{1} a C_{6} sustituido o no sustituido o alquenilo C_{2} a C_{6} sustituido o no sustituido. Más preferentemente, A es -S-, T es -(CH_{2})_{n}- y n es un número entero comprendido entre 0 y 6, típicamente entre 0 y 4, y más típicamente 0, 1 o 2.
En una realización preferida de la presente
invención, la secuencia -S^{1}-L- en combinación
es una cadena de no más de 35 átomos seleccionados de entre el grupo
consistente en carbono, oxígeno, azufre, selenio, nitrógeno, silicio
y fósforo, más preferentemente sólo carbono, oxígeno, azufre y
nitrógeno, y todavía más preferentemente sólo carbono, oxígeno y
azufre. Con el fin de reducir la probabilidad de unión no
específica, el nitrógeno, en caso de estar presente, preferentemente
se encuentra en la forma de un grupo amida. Además, si los átomos de
la cadena de carbonos están sustituidos con cualquier especie
excepto hidrógeno, preferentemente se encuentran sustituidos con
hidroxi o ceto. En una realización preferida, L comprende una
porción (en ocasiones denominada fragmento o residuo) derivada de un
aminoácido, tal como cistina, homicistina, cisteína, homocisteína,
ácido aspártico, ácido cisteico o un éster de los mismos, tal como
el metil o etil éster de los mismos.
Las composiciones quelantes ejemplares de la
presente invención incluyen las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las que Q es un portador y Ac es
acetilo.
Se obtienen ventajas mediante la utilización de
uno o varios enlaces neutros éter, tioéter, selenoéter o amida en el
grupo de unión en lugar de enlaces amina de carga positiva. Los
átomos de oxígeno, azufre y selenio y las amidas presentan alguna
afinidad por los metales, lo que pueden proporcionar propiedades
quelantes mejoradas, uniendo el metal más firmemente que los
quelantes tetradentados tradicionales, que presentan enlaces amina
de carga positiva. Además, la utilización de átomos no cargados
entre el nitrógeno del nitrilo y el portador aparentemente reduce la
unión no específica de proteínas. Por lo tanto, la utilización de S,
O, Se o amida en el grupo de unión, L, en lugar de amina u otros
grupos cargados tiende a incrementar la estabilidad y especificidad
de la composición para la purificación de proteínas.
En una realización, las composiciones quelantes
de metales (1) de la presente invención pueden derivarse a partir de
composiciones que presentan la fórmula general:
en la que A, T, X, Y, Z e i son tal
como se ha definido anteriormente. Preferentemente, la composición
(2) está representada por una de las fórmulas
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- HS-(CH_{2})_{n}-CH(CH_{2}COOH)-N(CH_{2}COOH)_{2}
- \quad
- HS-(CH_{2})_{n}-NHCO-CH(CH_{2}SO_{3}{}^{-})-N(CH_{2}COOH)_{2}\hskip1cm y
- \quad
- H_{2}N-(CH_{2})_{n}-NHCO-CH(CH_{2}SO_{3}{}^{-})-N(CH_{2}COOH)_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
en las que n es 1 o
2.
Las composiciones correspondientes a la
estructura (2) en la que como mínimo uno de entre X, Y y Z comprende
un grupo ácido carboxílico pueden prepararse mediante alquilación
reductora de una amina. En general, las aminas monocarboxiladas y
dicarboxiladas pueden prepararse haciendo reaccionar una amina que
presenta la fórmula R^{2}R^{3}NH, en la que R^{2} es
hidrocarbilo o hidrocarbilo sustituido y R^{3} es hidrógeno,
hidrocarbilo o hidrocarbilo sustituido, con un oxoácido, tal como
ácido glioxílico, en presencia de un agente reductor, tal como un
complejo piridina-borano, dimetilborano,
trimetilborano, cianoborohidruro sódico. Cuando la amina es un
aminoácido, tal como cistina, homocistina, cisteína, homocisteína,
ácido aspártico, ácido cisteico o un éster de los mismos, tal como
el metil o etil éster de los mismos, la reacción produce
ventajosamente un derivado de ácido nitrilotriacético. Por ejemplo,
puede prepararse un derivado de ácido nitrilotriacético de cistina
mediante la combinación de cistina, un oxoácido tal como el ácido
glioxílico y un agente reductor suave; preferentemente, puede
incluirse alcohol con el fin de ayudar en la clarificación de la
solución. Alternativamente, pueden utilizarse otros procedimientos
conocidos en la técnica para la preparación de la composición (2),
incluyendo los haloalquilácidos.
La composición (2) puede inmovilizarse para
formar la composición (1) mediante enlace covalente de un espaciador
químico, S^{1}, a la molécula de enlace, L, mediante cualquier
procedimiento conocido en la técnica y después hacer reaccionar el
portador con el espaciador, S^{1}, con el fin de formar un
complejo quelato portador-espaciador de la
composición (1). En otra realización, el portador Q en primer lugar
se hace reaccionar con el espaciador, S^{1}, con el fin de formar
un complejo portador-espaciador. A continuación, el
complejo portador-espaciador se une al complejo
quelato a través de la molécula de enlace, L, con el fin de formar
la composición (1).
En algunos casos, resulta ventajoso activar el
portador, Q, con S^{1} previamente a la unión de la porción
quelante de la molécula. En estos casos, en los que Q es una resina
de agarosa, puede activarse utilizando epiclorohidrina,
tetrabutildiglicidil éter o cualquier sustancia capaz de activar un
portador.
Puede formarse un quelato metálico mediante la
adición de un metal o de un óxido de metal a la composición quelante
(1) o composición (2) de la presente invención. Por ejemplo, un
quelato metálico de la presente invención (en forma inmovilizada)
está representado por la fórmula siguiente:
Q-S^{1}-A-T-CH[((CH_{2})_{k}-X)-N((CH_{2})_{i}-Y)-(CH_{2})_{i}-Z]M
en la que Q, S^{1}, A, i, J, k,
T, X, Y y Z son tal como se ha definido anteriormente y M comprende
cualquier metal u óxido de metal capaz de formar un quelato. Entre
los metales y óxidos de metal preferidos se incluyen Ni, Hg, Ga, Cu,
Ru, Co, Cd, Mg, Mn, Ti, In, Zn, Tc, Rh, Pd, Re, Fe, Au, Pb y Bi,
siendo preferidos para la mayoría de aplicaciones, Fe, Cu, Co, Au y
Ni. En general, el metal, M, preferido para una aplicación dada
depende de las capacidades de unión específicas de la porción
quelante de la composición (1) o (2) y del compuesto a unir o
purificar. Por ejemplo, cuando X, Y y Z son -COOH, M óptimamente es
Ni para la purificación de proteínas con secuencias de
polihistidina. Cuando el compuesto es una fosfoproteína, un
fosfopéptido o una molécula que contiene fosfato, M óptimamente es
Fe o
Ga.
Los grupos "hidrocarbilo" descritos en el
presente documento son compuestos o radicales orgánicos consistentes
exclusivamente en los elementos carbono e hidrógeno. Estos grupos
incluyen los grupos alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo. Estos
grupos pueden estar sustituidos o no sustituidos y, preferentemente,
son alquilo sustituido o no sustituido. Estos grupos también
incluyen los grupos alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo,
sustituidos con otros grupos hidrocarbilo alifáticos o cíclicos,
tales como alcarilo, alquenarilo y alquinarilo. A menos que se
indique lo contrario, estos grupos comprenden 1 a 20 átomos de
carbono.
A menos que se indique lo contrario, los grupos
alquilo indicados en el presente documento preferentemente son
alquilos inferiores que contienen entre uno y seis átomos de carbono
en la cadena principal y como máximo 20 átomos de carbono. Pueden
ser de cadena lineal, ramificada o cíclicos e incluyen metilo,
etilo, propilo, isopropilo, butilo, hexilo y similares. Pueden estar
sustituidos con radicales hidrocarbilo alifáticos o cíclicos.
A menos que se indique lo contrario, los grupos
alquenilo indicados en el presente documento preferentemente son
alquenilos inferiores que contienen entre dos y seis átomos de
carbono en la cadena prinicpal y como máximo 20 átomos de carbono.
Pueden ser de cadena lineal o ramificada e incluyen etenilo,
propenilo, isopropenilo, butenilo, isobutenilo, hexenilo y
similares. Pueden estar sustituidos con radicales hidrocarbilo
alifáticos o cíclicos.
A menos que se indique lo contrario, los grupos
alquinilo indicados en el presente documento preferentemente son
alquinilos inferiores que contienen entre dos y seis átomos de
carbono en la cadena principal y como máximo 20 átomos de carbono.
Pueden ser de cadena lineal o ramificada e incluyen etinilo,
propinilo, butinilo, isobutinilo, hexinilo y similares. Pueden estar
sustituidos con radicales hidrocarbilo alifáticos o cíclicos.
A menos que se indique lo contrario, los grupos
arilo indicados en el presente documento contienen entre 6 y 20
átomos de carbono e incluyen fenilo. El hidrocarbilo puede estar
sustituido con los diversos sustituyentes definidos en el presente
documento. El fenilo es el arilo más preferido.
Los grupos hidrocarbilo sustituidos indicados en
el presente documento son grupos hidrocarbilo que están sustituidos
como mínimo con un átomo que no es carbono, incluyendo grupos en los
que un átomo de la cadena de carbonos está sustituido con un
heteroátomo, tal como nitrógeno, oxígeno, silicio, fósforo, boro,
azufre o un átomo de halógeno. Estos sustituyentes son diferentes de
hidroxilo e incluyen alcoxi inferior, tal como metoxi, etoxi,
butoxi; halógeno, tal como cloro o fluoro; éteres; acetales;
cetales; ésteres; heteroarilo, tal como furilo o tienilo; alcanoxi;
acilo; aciloxi; nitro; amino; y amido.
Los grupos acilo indicados en el presente
documento contienen hidrocarbilo, hidrocarbilo sustituido o grupos
heteroarilo. Presentan la fórmula general -C(O)X, en
la que X puede incluir hidrocarbilo, hidrocarbiloxi,
hidrocarbilamino o hidrocarbiltio.
Una proteína, tal como se utiliza en el presente
documento, incluye anticuerpos, enzimas, hemoglobina, hormonas,
polipéptidos y péptidos; y puede ser una molécula intacta, un
fragmento de la misma, o un equivalente funcional de la misma; y
puede ser de ingeniería genética.
Un anticuerpo, tal como se utiliza en el presente
documento, incluye anticuerpos tanto policlonales como monoclonales;
y puede ser una molécula intacta, un fragmento de la misma; y puede
ser de ingeniería genética.
Los ejemplos siguientes ilustran la
invención.
La preparación de Sefarosa® activada con
epiclorohidrina: se lavaron 50 ml de Sefarosa® CL 4B (Pharmacia
Biotech) tres veces con 100 ml de agua en un filtro de succión de
vidrio. Se transfirieron a un matraz de 3 cuellos dotado de un
agitador y de un termómetro. Se añadieron 30 ml de agua y 4 ml de
hidróxido sódico 10 N bajo agitación, seguido de 8 ml de
epiclorohidrina. La mezcla se calentó a 46ºC durante 2 horas. La
resina activa se lavó hasta pH neutro utilizando 800 ml de agua
desionizada.
Agarosa: se añadió una solución de 16,3 g de
L-cisteína en 185 ml de hidróxido sódico 1 N a 48
ml de resina activada con epiclorohidrina en un matraz Erlenmeyer y
se mezcló suavemente durante 18 horas a 22ºC. La mezcla se lavó
cinco veces con 200 ml de agua. El análisis de Kaiser de la amina
libre [Kaiser, E. et al., Anal. Biochem. 34:595, (1970)] dio
lugar a un color azul profundo. Se mezclaron suavemente 47,6 ml de
la resina húmeda anteriormente indicada, en un matraz Erlenmeyer con
una solución de 8,0 g de ácido bromoacético en 50 ml de hidróxido
sódico 1 N y 25 ml de bicarbonato sódico 1 M durante 72 horas a
22ºC. A continuación, la resina se lavó tres veces con 100 ml de
agua desionizada. Se mezclaron suavemente 16 g de resina húmeda con
50 ml de acetato sódico 0,2 M y 2,5 ml de anhídrido acético durante
45 minutos a 22ºC. La resina se lavó tres veces con 100 ml de agua.
El análisis de Kaiser dio lugar a un color azul pálido. La resina se
almacenó en un volumen igual de etanol al 30% a 4ºC.
Análisis de capacidad y carga de níquel: la
resina de
N,N-bis(carboximetil)-cisteína
preparada tal como se ha descrito anteriormente se analizó en primer
lugar determinando la capacidad de la resina de quelar el níquel. Se
incubaron aproximadamente 2,5 ml de la resina con 10 ml de sulfato
de níquel 10 mg/ml durante la noche bajo agitación a 50 rpm a 4ºC.
La resina se mezcló bien y se introdujo en una columna de 1 x 10 cm
y la solución de níquel sobrante se dejó fluir fuera de la resina.
El sulfato de níquel no unido se enjuagó de la resina utilizando 20
a 30 volúmenes de columna de agua desionizada. El agua restante se
dejó desaguar de la resina. Se añadió un volumen igual de agua a la
resina, se mezcló bien y después la mezcla se extrajo de la columna
para su almacenamiento a 4ºC. El equivalente a un ml de resina de
lecho empaquetado se sometió a hidrólisis ácida y después se analizó
mediante ICP para determinar su contenido de níquel. A esta resina
se unieron 5,2 \mumoles de níquel por ml de resina.
Pruebas de unión y especificidad de proteína: se
llevó a cabo la prueba de unión específica de proteínas utilizando
proteínas que contenían polihistidina en una columna de 0,5 x 7,6 cm
que contenía 1,5 ml de resina de lecho empaquetado. La resina se
equilibró con fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 0,5 M e imidazol
10 mM, pH 8,0 (tampón de equilibración). Se cargaron en la columna
cinco ml de un extracto crudo de E. coli que contenía una
fosfatasa alcalina bacteriana con una etiqueta de polihistidina.
Este extracto crudo se preparó fresco a partir de pasta celular
congelada de E. coli utilizado CelLytic-B
(Sigma Chemical Company). La columna se lavó con 10 volúmenes de
columna (15 ml) de tampón de equilibración con el fin de retirar las
proteínas no unidas. El material unido se eluyó con 10 volúmenes de
columna (15 ml) de fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 0,5 M e
imidazol 320 mM, pH 8,0. Las fracciones de los picos del material
eluido se agruparon. El material eluido se sometió a ensayo para
determinar su pureza mediante electroforesis en gel de dodecil
sulfato sódico poliacrilamida (SDS-PAGE), la
actividad de fosfatasa alcalina y el contenido de proteínas mediante
ensayo de proteínas de Bradford. Los resultados del ensayo
demostraron que las proteínas eluídas en este procedimiento de
aislamiento de una etapa utilizando esta resina quelato única
proporcionaban fosfatasa alcalina bacteriana esencialmente
homogénea.
Preparación de
N,N,N',N'-tetracis(carboximetil)-L-cistina:
se introdujo L-cistina (24,03 g; 0,1 moles) en un
vaso de precipitados que contenía 2,0 L de tampón borato 0,05 M, pH
9,0 y se mezcló con una barra de agitación magnética. Se añadió
ácido glioxílico (monohidrato) (368,2 g; 4 moles) a la solución bajo
agitación. La solución contenía 20 ml de tampón por mmol de cistina
y 40 moles de ácido glioxílico por mol de cistina. Se introdujo el
vaso en un baño de agua helada con el fin de enfriar la solución
hasta una temperatura comprendida entre 15ºC y 25ºC. El pH de la
mezcla se ajustó a 9,0 con hidróxido sódico 5 N. Se retiró el vaso
del baño de agua helada y se dejó el vaso a temperatura ambiente. Se
añadió complejo de borano-piridina 8 M (250 ml), 20
moles por mol de cistina. Se añadió etanol hasta una concentración
final comprendida entre el 25% y el 50% con el fin de clarificar la
solución. La solución se agitó a temperatura ambiente durante dos
horas para completar la reacción. Se realizó un seguimiento de la
reacción mediante HPLC hasta que se completó la reacción. La mezcla
de reacción se vertió en un recipiente más grande y se diluyó con 3
volúmenes de agua. Se añadió lentamente ácido hidroclórico (10 N)
para ajustar el pH hasta un valor inferior a 1,0. La mezcla de
reacción se agitó durante 30 a 60 minutos. El pH de la mezcla de
reacción se ajustó seguidamente utilizando hidróxido sódico 5 N
hasta un valor aproximado de 6,5.
Purificación de
N,N,N',N'-tetracis(carboximetil)-L-cistina:
la mezcla de reacción de
N,N,N',N'-tetracis(carboximetil)-L-cistina
cruda se diluyó con agua para reducir la conductividad hasta un
valor inferior a 5 mili-mhos. El pH se ajustó a un
valor comprendido entre 7,0 y 8,5 con hidróxido sódico 1 M. A
continuación, la mezcla se aplicó a una columna
DEAE-Sephadex®-HCO3 (Pharmacia Biotech) que había
sido equilibrada con agua desionizada utilizando 10 ml de resina por
mmol de cistina de material de partida. Tras complecompletar la
carga de la columna, se lavó con 4 volúmenes de columna de agua
desionizada. A continuación, la columna se lavó con 4 volúmenes de
columna de bicarbonato de trietilamonio 0,1 M (TEAB). El producto
purificado se eluyó de la columna con TEAB 0,5 M. El material
agrupado se secó en un evaporador giratorio Rotovap hasta formarse
un sólido pegajoso. Seguidamente se disolvió en un volumen mínimo de
agua. El material se había secado completamente. Después, se
repitieron una vez más las etapas de resuspensión y de secado. El
sólido final se disolvió en 400 ml de agua.
Conversión a ácido libre: se añadió resina
Amberlita IR H+ equilibrada con agua desionizada al material crudo
(25 ml de resina por mmol de cistina). Se realizó un seguimiento del
pH con papel indicador de pH. Tras la conversión al ácido libre, la
resina se eliminó mediante filtración. El filtrado se secó en un
Rotovap hasta estar completamente seco.
Reducción de
N,N,N',N'-tetracis(carboximetil)-L-cistina
a
N,N-bis(carboximetil)-L-cisteína
tetracis(carboximetil)cistina: la
tetracis(carboximetil)-L-cistina
cruda (23,65 g, 0,05 moles) se disolvió en agua a 5 ml de agua por
gramo. El pH de la solución se ajustó a un valor comprendido entre
9,0 y 9,2 con hidróxido sódico 1 N. Después, se añadieron 14,34 g
(0,05 moles) de tris(carboxietil)fosfina (TCEP) bajo
agitación hasta que se disolvió todo el TCEP. Después se incubó
durante 10 minutos. Tras la reducción se llevó a cabo la HPLC. Tras
la reducción completa, que de manera general se producía en menos de
20 minutos, se ajustó el pH a un valor comprendido entre 5,0 y 6,0
utilizando ácido hidroclórico 1 N. El producto puede utilizarse en
este punto o puede liofilizarse. El rendimiento estaba comprendido
entre el 50% y el 75%, basado en la cantidad de partida de
cistina.
Activación de resina con epiclorohidrina: se lavó
bien 1 L de Sefarosa® 6B (Pharmacia Biotech) con agua desionizada.
La resina se suspendió en un volumen igual de hidróxido sódico 0,8
M. A continuación, se combinó con 100 ml de epiclorohidrina durante
la agitación. El material se incubó durante 2 horas a temperatura
ambiente bajo agitación. La resina se lavó con 3 volúmenes de
fosfato sódico 0,1 M, pH 7, seguido de 6 volúmenes de agua
desionizada.
Aminación de la resina: se preparó la amino
Sefarosa® 6B suspendiendo la resina activada con epiclorohidrina en
un volumen igual (un volumen de resina) de hidróxido amónico 2 M y
se mezcló suavemente durante la noche a temperatura ambiente. La
resina se lavó con 3 volúmenes de fosfato sódico 0,1 M, pH 7. La
resina se lavó con 6 volúmenes de agua desionizada.
Bromoacetilación de amino Sefarosa® 6B: la resina
amino Sefarosa® 6B lavada se añadió a agua para producir una mezcla
de resina al 50%. El pH se ajustó a un valor comprendido entre
aproximadamente 5,8 y 6,0 con HCl 1 N. La mezcla de resina se
mantuvo a temperatura ambiente y las reacciones siguientes se
llevaron a cabo en condiciones de luz reducida. Se añadieron 0,15
moles de ácido bromoacético en imidazol 0,2 M, pH 5,8, a la mezcla.
A continuación, se añadieron 0,75 moles de
1-etil-3-(3-diametilaminopropil)carbodiimida
(EDAC) sólida mientras se mezclaba suavemente la resina. Esta mezcla
de resina se mezcló suavemente a temperatura ambiente durante 4
horas manteniendo el pH a 6,0. Las aminas no reaccionadas se
bloquearon mediante acetilación. Se añadieron 6,5 ml de anhídrido
acético a la mezcla de resina seguido de la mezcla suave durante 30
minutos. A continuación, la resina se lavó con 5 volúmenes de
fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5.
Unión de bis(carboximetil)cisteína
con resina bromacetilada: se llevaron a cabo las reacciones
siguientes en condiciones de luz reducida. La pasta de resina
bromoacetilada lavada se suspendió en 1 volumen de resina de fosfato
sódico 0,1 M, pH 7,5, produciendo una mezcla de resina al 50%. La
mezcla se burbujeó con nitrógeno durante 10 minutos para
desairearla. Se añadieron 15 mmoles de
bis(carboximetil)cisteína preparados tal como se ha
descrito en el Ejemplo 2 y se ajustó el pH a 7,5 con hidróxido
sódico 1 N. A continuación, se mezcló a temperatura ambiente durante
como mínimo 2 horas. Se añadió
\beta-mercaptoetanol (14,3 M, 1,5 ml por litro de
resina) a la mezcla y se continuó la incubación durante como mínimo
30 minutos a temperatura ambiente para bloquear los grupos
bromoacetilo no reaccionados. Seguidamente la resina se lavó con 3
volúmenes de solución salina tamponada con fosfato seguida de 5
volúmenes de agua desionizada.
Carga de níquel y análisis de capacidad: se
sometió a ensayo la
N,N-bis(carboximetil)-L-cisteína
preparada tal como se ha descrito anteriormente determinando en
primer lugar la capacidad del material de quelar níquel, tal como se
describe en el Ejemplo 1. Esta resina se unió a 12,0 \mumoles de
níquel por ml de resina.
Ensayo de unión y especificidad de las proteínas:
el ensayo de unión específica de proteínas a esta resina utilizando
proteínas que contienen polihistidina se llevó a cabo tal como se
describe en el Ejemplo 1. Los resultados del ensayo demuestran que
las proteínas eluídas en este procedimiento de aislamiento en una
etapa mediante la utilización de esta resina quelada única
proporcionan fosfatasa alcalina bacteriana esencialmente
homogénea.
Preparación de metil éster de ácido
L-cisteico: se introdujo en una botella una mezcla
de 1 g de ácido L-cisteico, 8 ml de ácido
hidroclórico 4 N en dioxano y 30 ml de metanol seco. La botella se
tapó y se almacenó durante aproximadamente 96 horas a temperatura
ambiente. La cromatografía de capa fina de la solución transparente
[placas de gel de sílice Analtech, n-butanol:
acetato de etilo: ácido acético: agua (1:1:1:1), cloro/reactivo de
yoduro potásico-almidón (Stewart, J.M. y Young,
J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, pág.
120, (1984)] indicó una conversión superior al 95% de ácido cisteico
en el éster. Se eliminaron los disolventes bajo vacío, obteniendo
1,05 g de un sólido pegajoso. El análisis de espectrometría de masas
proporcionó un m/z para el ión M^{+1} principal de 184,3. La
fragmentación de este ión proporcionó un ion M^{+1} de 123,9, que
representa la pérdida de uno de los grupos carboximetilo. Se
utilizaron los sólidos en la etapa siguiente sin purificación
adicional.
Preparación del ácido
aminoetilamido-N,N-bis-(carboximetil)-L-cisteico:
se añadió trietilamina (10 ml) a una mezcla de 0,8 g del metil éster
de ácido cisteico anteriormente indicado en 12,5 ml de DMF en una
botella para obtener una solución transparente. A esta mezcla, se
añadieron 4,4 g de ácido bromoacético seguido de aproximadamente 15
ml de trietilamina hasta que el pH era de aproximadamente 10. La
solución se convirtió en una masa sólida. Tras un mes a temperatura
ambiente, se añadieron 1,5 g de ácido bromoacético y 15 ml de DMF.
El pH de la mezcla se ajustó a aproximadamente 10 con trietilamina.
El análisis de espectrometría de masas proporcionó un m/z del ion
M^{-1} principal de 298,2.
Pasadas 24 horas, la mezcla de reacción
anteriormente indicada se filtró y los sólidos se lavaron con 20 ml
de dimetil formamida. Se añadió etilenodiamina (35 ml) al filtrado
pardo y la solución se calentó a 60ºC durante 18 horas. La solución
parda transparente se evaporó bajo vacío hasta formar un aceite. Se
añadieron 50 ml de agua y se evaporaron nuevamente hasta formar un
aceite. La última etapa se repitió nuevamente. A continuación, se
añadieron 6,1 L al aceite pardo y la solución se cargó en una
columna de 100 ml de DEAE Sephadex® (Pharmacia Biotech). La columna
se lavó con 800 ml de agua. El producto se eluyó con un gradiente
lineal de 1 L de agua y 0,1 N de ácido hidroclórico. La tasa de
flujo era de 2 ml por minuto. Se recogieron fracciones de 5 ml. Se
sometieron a ensayo las fracciones que contenían el producto
amarillo. Basándose en la cromatografía de capa fina [placas de gel
de sílice Analtech, n-butanol: acetato de etilo:
ácido acético: agua (1:1:1:1), cloro/yoduro
potásico-almidón], se agruparon las fracciones que
contenían el producto y se evaporaron a sequedad bajo vacío,
obteniendo 295 mg de sólido espumoso de color amarillo pálido. El
análisis de espectrometría de masas proporcionó un m/z del M^{+1}
principal de 328,5.
Preparación de agarosa-ácido
aminoetilamido-N,N-bis-(carboximetil)-L-cisteico:
se disolvió una solución de 221 mg de ácido
aminoetilamido-N-bis-carboximetilcisteico
preparada tal como se ha indicado anteriormente en 3 ml de agua y se
transfirió a una botella de vidrio. Se añadió a la botella 10 ml de
carbonato sódico 0,5 M, seguido de 8 g de Sefarosa® CL 4B húmeda
activada con epiclorohidrina, preparada tal como se ha descrito en
el Ejemplo 3. La mezcla se agitó suavemente a 60ºC durante 24 horas.
La resina se filtró y se lavó cinco veces con 50 ml de agua. La
resina se almacenó en 20 ml de etanol absoluto (200 proof) al 30% a
4ºC.
Análisis de carga y capacidad de níquel: la
resina de ácido
aminoetilamido-N-bis-(carboximetil)-L-cisteico
preparada tal como se ha descrito anteriormente se sometió a ensayo
tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. A esta resina se unieron
15,6 \mumoles de níquel por ml de resina.
Ensayo de unión y especificidad de proteínas: se
llevó a cabo el ensayo de unión específica de proteínas a esta
resina utilizando proteínas que contenían polihistidina, tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados del ensayo demostraron
que la proteína eluída de este procedimiento de aislamiento de una
etapa utilizando esta resina quelada única proporcionaba fosfatasa
alcalina bacteriana esencialmente homogénea.
Preparación del quelato soluble: se disolvió
albúmina de suero bovina (272 mg; BSA) a 10 mg/ml en fosfato sódico
0,1 M, pH 7,2. Se añadió a la solución el éster NHS de ácido
bromoacético (57 mg; 0,24 mmoles) en 0,5 ml de dimetil formamida
(DMF) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente bajo
agitación. La mezcla de reacción se desaló en una columna Sefadex®
G-50 (Pharmacia Biotech) equilibrada y que se hizo
funcionar en fosfato sódico 0,1 M, pH 7,2. Se realizó un seguimiento
de la columna a partir de la absorbancia a 280 nm. Se combinaron las
fracciones en las que se observó absorbancia a 280 nm. Seguidamente
se burbujearon suavemente con argón durante 3 minutos. Se disolvió
N,N-bis(carboximetil)cisteína (39 mg;
0,12 mmoles) en 0,2 ml de fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0 (tal como se
había preparado en el Ejemplo 3) y después se añadió a la solución
de BSA, que después se burbujeó con argón. La mezcla de reacción se
incubó durante la noche a 4ºC. Se realizó un seguimiento de la
eficiencia de unión mediante la reacción del ácido
5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzoico)
(DTNB) y se determinó que era como mínimo del 95%. La mezcla se
desaló en una columna Sefadex® G-50 (Pharmacia
Biotech) eluída con un tampón que contenía ácido
3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 10 mM
y cloruro sódico 0,15 M, pH 7,0. La BSA
soluble-quelato se cargó con sulfato de níquel 0,01
M en un tampón de MOPS 10 mM y cloruro sódico 0,15 M, pH 7,0. La
solución final se desaló en una columna Sefadex®
G-50 (Pharmacia Biotech). El quelato BSA níquel
desalado de color azul presentaba picos de absorbancia a los 280 nm
y 390 nm, indicando que el níquel estaba quelado con el
conjugado.
Ensayo de utilización del portador soluble
albúmina de suero bovina unido covalentemente con la
N,N-bis(carboximetil)cisteína: el
quelato BSA preparado tal como se ha descrito anteriormente se
adsorbió a los pocillos de microtitulación de poliestireno
utilizando 5 \mug/ml en bicarbonato sódico 0,1 M, pH 9,6, durante
la noche. La placa de microtitulación se lavó tres veces con PBS con
Tween 20 al 0,05%. El quelato BSA unido se cargó con níquel mediante
la incubación de la placa con sulfato de níquel 0,01 M en MOPS, pH
7,0, durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó con
agua tres veces. Se incubó una proteína de fusión modelo, la
fosfatasa alcalina bacteriana, que contiene una etiqueta
N-terminal de polihistidina, en los pocillos de
microtitulación de quelato de níquel BSA a diversas concentraciones
en el tampón MOPS. La placa se lavó tres veces con el tampón MOPS
para eliminar la proteína no unida. La proteína de fusión fosfatasa
alcalina se detectó mediante incubación de los pocillos de
microtitulación con un sustrato del enzima fosfatasa alcalina. El
ensayo demostró la existencia de una cantidad significativa de unión
específica de quelato de la proteína de fusión polihistidina al
quelato níquel-albúmina.
Claims (18)
1. Composición quelante de metales que presenta
la fórmula:
en la
que
Q es un portador;
S^{1} es un espaciador;
L es
-A-T-CH(X)-;
A es un enlace tioéter o selenoéter;
T es un enlace o alquilo o alquenilo sustituido o
no sustituido;
X es -(CH_{2})_{k}CH_{3},
-(CH_{2})_{k}COOH, -(CH_{2})_{k}SO_{3}H,
-(CH_{2})_{k}PO_{3}H_{2},
-(CH_{2})_{k}N(J)_{2} o
-(CH_{2})_{k}P(J)_{2};
k es un número entero comprendido entre 0 y
2;
J es hidrocarbilo o hidrocarbilo sustituido;
Y es -COOH, -H, -SO_{3}H, -PO_{3}H_{2},
-N(J)_{2} o -P(J)_{2};
Z es -COOH, -H, -SO_{3}H, -PO_{3}H_{2},
-N(J)_{2} o -P(J)_{2}; e
i es un número entero comprendido entre 0 y
4.
2. Composición quelante de metales según la
reivindicación 1, caracterizada porque A es un enlace
tioéter.
3. Composición quelante de metales según la
reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el portador se
slecciona de entre el grupo que consiste en agarosa, celulosa,
copolímeros de metacrilato, poliestireno, polipropileno, papel,
poliamida, poliacrilonitrilo, polivinilideno, polisulfona,
nitrocelulosa, poliéster, polietileno, sílice, vidrio, látex,
plástico, oro, óxido de hierro, poliacrilamida, ácido nucleico,
lípidos, liposomas, polímeros solubles sintéticos, proteínas,
poliaminoácidos, albúmina, anticuerpos, enzimas, estreptavidina,
péptidos, hormonas, pigmentos cromogénicos, pigmentos fluorescentes,
fluorocromos y polisacáridos.
4. Composición quelante de metales según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada
porque X es -(CH_{2})_{k}COOH, Y es hidrógeno o -COOH, Z
es hidrógeno o -COOH y k es tal como se ha definido en la
reivindicación 1.
5. Composición quelante de metales según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada
porque A es un enlace tioéter, T es -CH_{2}-, X es -COOH, Y es
-COOH, Z es -COOH e i es 1.
6. Composición quelante de metales según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada
porque S^{1} consiste en una cadena de no más de 25 átomos
seleccionados de entre el grupo que consiste en carbono, nitrógeno,
oxígeno y azufre.
7. Composición quelante de metales según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada
porque S^{1} está definida por una cadena de no más de 15 átomos
seleccionados de entre el grupo que consiste en carbono, oxígeno y
azufre y T es -(CH_{2})_{n}, en la que n es 0 a 6.
8. Composición quelante de metales según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada
porque S^{1} no contiene un enlace amina.
9. Composición quelante de metales según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada
porque A y T se derivan de un aminoácido.
10. Composición quelante de metales según la
reivindicación 9, caracterizada porque el aminoácido se
selecciona de entre el grupo consistente en cistina, homocistina,
cisteína, homocisteína, ácido aspártico, ácido cisteico o un éster
de los mismos.
11. Composición quelante de metales según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, seleccionada de entre
el grupo consistente en:
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en la que Q es tal como se ha
definido en la reivindicación 1 y Ac es
acetilo.
12. Quelato de metales que comprende un metal y
la composición quelante de metales según una de las reivindicaciones
1 a 11.
13. Quelato de metales según la reivindicación
12, caracterizado porque el metal se selecciona de entre el
grupo consistente en Ni, Hg, Ga, Cu, Ru, Co, Cd, Mg, Mn, Ti, In, Zn,
Tc, Rh, Pd, Re, Fe, Au, Pb y Bi.
14. Quelato de metales según la reivindicación
13, caracterizado porque el metal es níquel.
15. Procedimiento para la purificación o
detección de una composición, comprendiendo el procedimiento poner
en contacto la composición con un quelato de metales según una de
las reivindicaciones 12 a 14.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque la composición es un polipéptido que
contiene como mínimo dos residuos de histidina.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque la composición es un polipéptido que
contiene como mínimo seis residuos de histidina.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque la composición
es una proteína, fosfoproteína, péptido, fosfopéptido, ácido
nucleico, oligonucleótido, fármaco o producto sintético o natural
que presenta una afinidad por un quelato de metales.
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