DE69112053T2 - Anwendung von Chelaten von Konjugaten mit paramagnetischen Metallen für Targetting. - Google Patents

Anwendung von Chelaten von Konjugaten mit paramagnetischen Metallen für Targetting.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Komponenten, die auf dem Gebiet der applizierbaren, molekularen Träger verwendbar sind, um paramagnetische MRI-Kontrastverstärker zu interessierenden Organen oder Geweben zu bringen.
  • Es sind bereits molekulare Konjugate bekannt, in denen ein mono- oder polyklonaler Antikörper (zellspezifischer Bindungsfaktor) kovalent an eine Gruppe gebunden ist, die Aminopolycarbonsäure-Chelatbildner tragen, welche paramagnetische Metallionen gebunden haben.
  • In W.T. ANDERSON et al., Cancer Res. 45 (1985), 2154 - 2158, wird beispielsweise die Bindung von bis zu 8 Mol DTPA pro Mol Antikörper offenbart, wobei die Aktivität und Spezifität des Antikörpers erhalten bleibt. Die DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) ist ein starker Chelatbildner mit paramagnetischen Metallen, beispielsweise mit Gd, Fe, Cr und Ni, welche daher direkt auf spezifische, zelluläre Kennstellen gerichtet werden können und die MRI-Erkennung unterstützen, indem sie die Protonen-Spin-Relaxation (T&sub1; und/oder T&sub2;) verändern und den Bild-Kontrast verstärken.
  • Auch in WO-A-90/14881 wird die Bindung von Polyaminocarbonsäure-Chelatbildnern an zielgerichtete Proteine offenbart, wobei Brückenbildner mit funktionellen Gruppen wie Isocyanato-, Isothiocyanato-, Bromacetamido-, Diazo-, N-Hydroxysuccinimid-Ester und inter- oder intra-molekulare Anhydride verwendet werden.
  • Das molekulare Verhältnis von Chelatbildner zu Antikörper war jedoch immer noch zu gering für eine effektive Verstärkung des MRI-Kontrastes und es wurden Mittel entwickelt, die die Effizienz der Kontrast-Verstärkung steigerten. George W. und Catherine H. WU (Wo-A-90/01900) haben beispielsweise ein Konjugat offenbart, in dem ein Ligand, wie ein Glykoprotein, das exponierte Galaktose-Endgruppen trägt, die von einzigartigen Rezeptoren auf der Oberfläche von bestimmten Zelltypen erkannt werden, an einen Chelatbildner gebunden wird, z.B. DTPA oder DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N&sub4;-tetraessigsäure), welcher in der Lage ist, paramagnetische Gruppen zu binden und einen stabilen und nicht-toxischen Komplex zu bilden. Ein selektives Protein war Asialoorosomucoid (AsOR), und DTPA wurde mit nicht offenbarten Mitteln daran gebunden, um schließlich ein molares Verhältnis von chelatisiertem Gd zu AsOR in der Größenordnung von 5 : 1 bis 15 : 1 zu erreichen. In einer weiteren Ausführungsform wurde Polylysin (PL) durch Reaktion mit Lactose-Endgruppen des desialylierten Glykoproteins und danach mit DTPA modifiziert, um ein Asia-PL-chelatbildnerkonjugat zu gewinnen. Es konnte gezeigt werden, daß dieses Konjugat eine Bindung von bis zu 90 Mol Gd pro Mol Lysin erreichte. Experimentelle Details fehlen jedoch in dieser Veröffentlichung.
  • Y. MANABE et al., Biochem. & Biophys. Acta 883 (1986), 460- 467, haben die Herstellung von DTPA-gebundenem Poly(L-Lysin) offenbart, indem Poly(L-Lysin), mit DP von etwa 100 oder ähnlich, mit dem cyclischen Anhydrid von DTPA (caDTPA) reagiert, darin 2-Pyridyldisulfid-Gruppen durch Reaktion mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) eingeführt und an thioliertes IgG gebunden werden, um ein kovalentes thiol-gebundenes Konjugat zu bilden. Die an dieser Synthese beteiligten Reaktionen werden iin folgenden zusammengefaßt.
  • Eine vergleichbare Technik wird von P. Shreve et al. in Magnetic Resonance in Medicine 3 (1986), 336-340, offenbart.
  • P.F. Sieving et al., Bioconjugate Chem. 1 (1990), 65-71, offenbarten die Bindung von Polyaminocarbonsäure-Chelatbildnern an endständige NH&sub2;-Nebengruppen von Polylysin mittels eines Verfahrens, das gemischte Anhydride verwendet. Letztere entstehen aus einer Behandlung der Chelate (z.B. DTPA und DOTA) in Form ihrer Salze mit organischen Aminen wie Triethylamin oder Tetramethylguanidin mit Isobutylchlorformiat (IBCF). Das Chelatbildner-gekoppelte Polylysin wurde daraufhin wie folgt an humanes Serumalbumin (HSA) gebunden: Restliche freie Amino-Seitengruppen des Polylysins wurden mit Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) derivatisiert, um maleinimido-aktivierte Reste herzustellen, während einige freie Aminogruppen des HSA mit 2-Iminothiolan aktiviert wurden, um wenigstens eine reaktive Alkylthiolgruppe herzustellen. Die abschließende Bindung entsteht aus der Addition der Thiolgruppe des HSA an die Doppelbindung der endständigen Maleinimido-Gruppen des Polylysin tragenden Chelatbildners. Es wurde geschätzt, daß das so hergestellte Konjugat durchschnittlich etwa 70 chelatisierende Stellen pro zielgerichtetes Protein enthält.
  • Die obigen Techniken haben jedoch den Nachteil, daß jeder Schritt eine sorgfältige chromatographische Reinigung der Zwischenprodukte benötigt, wobei diese Verfahren aufwendige Handhabungen umfassen und geringe Erträge bringen. Die vorliegende Erfindung offenbart ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Konjugat-Gruppe der Formel III, die in der Lage ist paramagnetische Metallionen zu komplexieren und an zielgerichtete Proteinfaktoren gebunden werden kann, die spezifisch gegen interessierende, zelluläre Kennstellen gerichtet sind, womit applizierbare Komponenten ausgestattet werden, die in der Lage sind große Mengen eines paramagnetischen MRI-Kontrastverstärkermittels spezifisch zu binden und zu bestimmten Bereichen, sowohl in vivo als auch in Gewebekulturen, zu transportieren.
  • Das Verfahren, wie in Anspruch 1 zusammengefaßt, basiert auf der Verwendung einer immobilisierten Phase zur Bindung der Ausgangsmaterialien und anschließend der sukzessiven Zwischenprodukte mit Voranschreiten der Synthese. Im letzten Schritt wird das gewünschte Produkt durch eine Spaltungsreaktion von der immobilisierten Phase freigesetzt, wodurch gleichzeitig eine reaktive Endgruppe zur Bindung an den zielgerichteten Faktor entsteht. Der Vorteil der Verwendung einer immobilisierten Phase zeigt sich besonders bei der Abtrennung der Zwischenprodukte, die durch einfache Filtration oder Zentrifugation durchgeführt werden kann. Ein weiterer Vorteil des vorliegenden Verfahrens liegt darin, daß der Spaltungsschritt ausschließlich eine endständig aktivierte Gruppe pro Molekül freisetzt, während in den früheren Verfahren die jeweiligen Zwischenprodukte häufig mehrere reaktive Endgruppen enthielten, was bei Bindung an den zielgerichteten Faktor zur Vernetzung führte. Ein weiterer Vorteil liegt insbesondere in der Ausführung von Schritt (1a), bei deut die ausgewählte acylierende Komponente ein internes Anhydrid mit mehr als einem Iminodiessigsäurering ist, wobei eine solche zweifache Funktionalität zur Vernetzung führen kann. Bei Verwendung von Komponenten der Formel I, die an einer festen Phase immobilisiert wurden, wird die Vernetzung während der Acylierung mit polyfunktionalen Anhydriden aus sterischen Gründen verhindert.
  • Im vorliegenden Verfahren kann die immobilisierte, feste Phase, die durch das Symbol R dargestellt wird, ein polymeres Harz mit noch vorhandenen reaktiven Gruppen auf der Oberfläche sein oder mineralische Partikel (Glas oder Keramik), die gebundene Substituenten enthalten, welche in der Lage sind die Ausgangskomponente I in einem Verfahren zu bilden, das ein oder mehrere Schritte umfassen kann. Harze wie zum Beispiel Polyacrylharze, Polystyrole, Polyamide, Polyester, Polyimide und Polyolefine sind dafür zu gebrauchen. Auf dem Gebiet der mineralischen Partikel sind Pulver oder Granulate aus Keramik wie Aluminiumoxid, Siliciumdioxid, Rutil oder porösem Glas vorzugsweise dafür zu gebrauchen. Die mineralischen Partikel, vorzugsweise poröse Glaskugeln, können durch Silanierung mit Trialkoxysilanen, die reaktive Endgruppen wie Isocyanato-, Amino-, Amido-, substituierte Oxycarbonyl-, Hydroxy- und Thiolgruppen tragen, aktiviert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, sind die Glaskugeln mit Thioalkylsilan silanisiert (siehe H. WEETALL, Covalent Coupling Methods for Inorganic Support Materials, in Meth. Enzym. 44 (1976), 134) und das Produkt wird mit Cysteamin umgesetzt, um ein immobilisiertes Amin-Zwischenprodukt herzustellen, das eine spaltbare Disulfidbindung enthält (-XX-= S&sub2;-), (siehe L. FIELD et al., J.A.C.S. 83 (1961), 4414). Andererseits sind thiolierte Harze, z.B. Thiosepharose , ebenfalls als Ausgangsmaterial zu gebrauchen.
  • In einigen Anwendungen kann das immobilisierte Amin danach als Initiator der telechelen Polymerisation von Aminosäure-N- carbonylanhydriden (NCA's) verwendet werden, um die Ausgangskomponente I herzustellen, in der n ≠ 0; die Details dieser Reaktionen sind im folgenden dargestellt. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß Polyolefine, die mit Alkylhalogeniden derivatisiert wurden, mit Thioharnstoff in Gegenwart von Bis(aminopropyl)amin sulfidiert werden können (siehe WARDELL, The Chemistry of Thiol Groups, Part I, Ed. Patai, Wiley (1974) New-York), um ebenfalls nützliche Ausgangsmaterialien herzustellen. Auch Harze, die schon eine Thiomethyl-Gruppe tragen (Merrifield Resins), können mit Aminoalkyldithiol-Substituenten versehen werden, durch die gleiche Reaktion mit Cysteamin (HS(CH&sub2;)&sub2;-SH), mit oder ohne Einwirkung von Dithiopyridin (H. Yahima etl al., J. Am. Chem. Soc. 63 (1941), 2263.
  • Die Reaktionen, in denen man von einem halogenalkylierten Harz ausgeht, werden im folgenden zusammengefaßt: Thioharnstoff bis(Aminopropyl)amine DithioPyr Cysteamin
  • In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die feste Phase mit Epoxypropyl-Silan silanisiert, um oxyrangebundene Materialien herzustellen, wobei diese Funktion tatsächlich schon auf einigen Sorten von kommerziell-erhältlichem Polyacrylamid-Harzen gegeben ist, z.B. die Eupergit -Harze von SIGMA Chemicals. Oxyran-derivatisierte immobilisierende Träger wurden verwendet, um durch folgende Reaktionen vic Diol-tragende Zwischenprodukte herzustellen, d.h. Komponenten I, bei denen das -XX- ein -CHOH-CHOH- ist:
  • Die endständige Aminogruppe der Komponenten B und A kann nach im Stand der Technik bekannten Verfahren, z.B. den in der Einleitung erwähnten, bevorzugt den aus Liu YUANFANG et al., Pure & Applied Chem. 63 (1991), 427-463, zur direkten Bindung an ein chelatbildendes Molekül verwendet werden, das entweder im unbeladenen Zustand oder schon in der mit paramagnetischen Metallionen komplexierten Form vorliegt. Eine Ausführungsform liegt in der Acylierung des Amins unter Verwendung eines Anhydrids des chelatbildenden Anhydrids (ein intramolekulares Anhydrid, d.h. mit wenigstens einem Iminodiessigsäureanhydrid-Ring ausgestattet, oder einem intermolekularen Anhydrid, bestehend aus zwei Molekülen derselben oder verschiedener Sorten) von den ausgewählten Polyalkylenaminopolycarboxyl-Chelatbildnern. Ein bevorzugtes Reagens für die Herstellung von heterogenen intermolekularen Anhydriden ist i-Butylchlorformiat (vgl. Bioconjugate Chem. 1, (1990), 65-71).
  • Danach wird Schritt (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt, um den Chelatbildner von dem immobilisierenden Träger zu trennen, wobei gleichzeitig eine reaktive Gruppe zur Bindung an einen protein-zielgerichteten Faktor hergestellt wird, wobei letzterer vor der Bindung gegebenenfalls aktiviert werden muß.
  • Im Fall von Komponenten vom obigen Typ A kann die Trennung - der vic-Diol-Bindung durch eine selektive Oxydierung oder Peroxydierung mittels gewöhnlicher Verfahren ausgeführt werden, wobei ein reaktiver Aldehyd der Formel OHC-CH&sub2;SCH&sub2;CH&sub2;NH-MY freigesetzt wird, worin M und Y die in Anspruch 1 definierte Bedeutung haben.
  • Im Fall von Komponenten vom Typ B wird die Trennung der Disulfid-Bindung mittels der üblichen Verfahren ausgeführt, d.h. in Gegenwart von Mercaptanen wie Thioethanol oder Dithiotreitol. In diesem Fall kann das freigesetzte chelatbildende Molekül mit der typischen Formel HS-(CH&sub2;)&sub2;-NH-MY zur Bindung an sulfid-aktivierte, protein-zielgerichtete Faktoren nach den üblichen Verfahren verwendet werden (vgl. Verfahren, die in den Literaturstellen offenbart werden, die in der Einleitung zitiert wurden). Nach der Spaltung kann der immobilisierende Träger wiedergewonnen werden, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation und in einem weiteren Zyklus wiederverwertet werden, was ökonomisch vorteilhaft ist. In dem Fall, in dem der immobilisierende Träger als ein Aldehyd-Sulfid-Substituent freigesetzt wird, kann dieser für weitere Synthesen verwendet werden oder durch übliche Verfahren regeneriert werden, um in einem weiteren Zyklus des vorliegenden Verfahrens verwendbar zu sein.
  • Gemäß einem weiteren, besonders interessanten Aspekt der vorliegenden Erfindung können die immobilisierten Amine der Formel A oder B als Auslöser für die telechele Polymerisation der Aminosäureanhydride (NCA's) (vgl. E. J. GOETHALS, Telechelic Polymers, Synthesis and Applications, CRC Press (1989), New- York) verwendet werden, um Polyaminosäuren herzustellen, d.h. Komponenten mit einem polymeren Rückgrat und einer Vielzahl von Stellen, an die chelat-bildende Moleküle gebunden werden können. Durch dieses Verfahren wird man die Anzahl der chelatisierten, paramagnetischen Ionen pro zielgerichtetem Molekül nach der Bindung vorteilhaft erhöhen. In einigen Ausführungsformen der Erfindung wurde die Komponente B zur Polymerisierung der NCA's von einigen γ-geschützten Derivaten der L-Glutaminsäure oder den korrespondierenden β-Derivaten der Asparaginsäure verwendet, wobei die schützenden Gruppen aus Benzyl, Phenacyl, Piperonyl und p-Methoxyphenacyl ausgewählt wurden.
  • Die Ester selbst wurden nach Van HEESWIJK, Synthesis (1982), 744, hergestellt und die NCA's durch Reaktion mit Phosgen (gasförmigem oder festem Triphosgen) erhalten. Nach der Polymerisierung wurden die Polyaminosäuren mit dem daran gebundenen Amin- Reaktionsstarter durch bekannte Maßnahmen von den Schutzgruppen befreit, z.B. mit HBr oder Trifluoressigsäure (TFA), und die freie Carboxylgruppe mit Ethylendiamin (oder irgendeinem Alkylendiamin) amidiert, um endständige, primäre Amino-Seitengruppen herzustellen. Die chelatbildenden Moleküle wurden an die endständigen Amino-Seitengruppen gebunden, wie oben für den Fall der Komponenten A oder B beschrieben, d.h. entweder durch Acylierung oder direkt unter Verwendung einer reaktiven, verbindenden Brücke von einem der Alken-Kohlenstoffe des Polyalkylenaminopolycarboxyl-Chelatbildners. Daraufhin wurde die XX-Bindung unter ähnlichen Bedingungen, wie bereits beschrieben, getrennt, so daß, das freie, aktivierte, chelatbildende Polymer freigesetzt wurde, um danach an einen zielgerichteten Faktor gebunden zu werden (mit der Carboxyl-Gruppe frei oder komplexiert mit einem paramagnetischen Metall).
  • Ähnliche Reaktionen wurden unter Verwendung von NCA des L- Lysin durchgeführt, wobei die E-NH&sub2;-Gruppe mit einer Fluorenyloxycarbonyl-Gruppe (PFL) oder mit einer Benzyloxycarbonyl-Gruppe (PBL) geschützt wurde. Die Entfernung der Schutzgruppe nach der Polymerisierung wurde unter Verwendung von Piperidin in DMF oder Mischungen aus TFA und Methansulfonsäure in Dioxan durchgeführt (siehe experimenteller Teil).
  • Die telechelen Polyaminosäuren, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, sind deswegen mit einer Vielzahl von endständigen Amino-Seitengruppen ausgestattet, an die nach bereits beschriebenen Verfahren im folgenden Chelatbildner gebunden werden können. Immobilisiertes Polylysin, das aus einer Polymerisation von L-Lysin-NCA erhalten wurde, die durch immobilisierte Bestandteile A initiiert wurde, wurde beispielsweise mit caDTPA umgesetzt, um eine Polyaminosäure von DP etwa 50 bis 110 herzustellen, in der ein wesentlicher Anteil (bis zu 60-80%) der Seitenketten mit Chelatbildnern versehen ist. Nach Freisetzung durch Oxydation, wie im vorangegangenen bereits beschrieben, kann der resultierende Poly-Chelatbildner, der eine CHO-Endgruppe trägt, zur Bindung an einen zielgerichteten Protein-Bindungsfaktor verwendet werden, wobei es unnötig ist, das Protein vor der Bindung zu aktivieren, was offensichtlich ein großer Vorteil der Erfindung im Vergleich zu den Verfahren des Standes der Technik ist. Die Proteine, die als zielgerichtete Faktoren verwendet werden können, sind sehr zahlreich und umfassen beispielsweise monoklonale und polyklonale Antikörper, humanes Serumalbumin (HSA), spezifische und nicht-spezifische Ig's, α-2- Macroglobulin, Interleukin, epidermalen Wachstums-Faktor (EGF), platelet derived growth factors und grundsätzlich Proteine oder Glycoproteine, die spezifische, zelluläre Kennstellen erkennen können.
  • Der folgende beispielhafte Teil soll die Erfindung detaillierter erklären. In diesem Teil definiert das Symbol AcOH Essigsäure-Gruppen.
    • Experimenteller Teil (Beispiele)
  • Benzylglutamat-NCA wurde nach H. Block, "Ring opening Polymerisation" 2 (1969), 23, K. C. Frish & S. L. Reegen Eds., Marcel Dekker, New York, hergestellt.
  • γ-Phenacylglutamat-NCA wurde erhalten, indem Phosgen in eine Suspension aus 8,6 g Glutamat-Ester in 250 ml THF eingeblasen wurde. Nach vollständiger Auflösung wurde die Lösung mit Stickstoff gespült; daraufhin wurde sie abgedampft und der verbleibende Feststoff wurde aus Ethylacetat und Hexan auskristallisiert; farblose Kristalle wurden erhalten.
  • Die NCA von γ-Piperonylglutamat wurden erhalten, indem eine Suspension von 1 g des Esters in 20 ml Dioxan mit 350 mg festem Triphosgen (Janssen) behandelt wurden und danach für 90 Minuten bei 60ºC gerührt wurden. Soweit notwendig wird die vollständige Auflösung durch Zugabe sehr kleiner, weiterer Mengen von Triphosgen bewirkt. Die Lösung wurde in 400 ml Hexan gegeben und das Ganze wurde über Nacht bei -20ºC stehengelassen, wodurch sich Kristalle bildeten. Diese wurden in einer kleinen Menge Methylacetat gelöst, die Lösung wurde mit Kohle bei 40ºC gebleicht und mit Hexan ausgefällt. Nach wiederholter Reinigung wurden weiße Kristalle erhalten.
    • Beispiel 1 A) Herstellung eines Trägers mit gebundenen primären Aminen mittels eines vic-Diol-Spacers (amino-diol-derivatisierter Träger
  • 5 g Eupergit C-Granulat (ein Polacrylamidharz mit darauf gebundenen Glycidyl-Gruppen - ein Produkt von Sigma) wurde in 100 ml 0,1M Phosphat (1mM EDTA)-Puffer, pH 6,0, suspendiert und ein großer Überschuß von 19 (6,5 mmol) Dithioerythritol (DTE) wurde beim Rühren dazugegeben. Die heterogene Mischung wurde für zwei Tage bei Raumtemperatur gerührt, wonach das Granulat getrocknet und mit demselben Phosphatpuffer gewaschen wurde.
  • Die Analyse wurde durchgeführt, indem ein Aliquot von etwa 50 mg genommen und für eine Stunde bei Raumtemperatur in 10 ml einer 10 mM-Lösung von 2,2'-Dithiodipyridin in DMF gerührt wurde. Das Granulat wurde trockengelegt, mit DMF und mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen, in 5 ml DMF resuspendiert und die -SS-Bindung mit einem Tropfen Mercaptoethanol (EtSH) gespalten; nach 30 Minuten Rühren wurde das Granulat durch Filtration getrennt und die Menge des 2-Thiopyridon im Filtrat wurde durch Absorption bei 343 nm bestimmt (ε = 8080), nach M.C. Millot et al., J. Chromatorgraphie 354 (1986) 155.
  • Das Granulat (ein Großteil) wurde in 100 ml 0,5 M Tris-HCl (0,5 mM EDTA)-Puffer, pH 8,5 suspendiert und eine Menge von 2-Bromethylaminhydrobromid wurde dazugegeben (berechnet nach den Ergebnissen der vorhergehenden Analyse), so daß ein molares Verhältnis von Bromamin/Thiol von 50 entstand, nach K. Okazaki et al., Anal. Biochem. 149 (1985) 516. Nachdem das Granulat für zwei Tage bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde es trockengelegt, mit demselben Puffer und danach mit H&sub2;O gewaschen und im Vakkum getrocknet.
  • Die Analyse der freien Aminogruppen wurde nach C.C.Y. Lee und G.M. Loudon, Anal. Biochem. 94 (1979), 60, durchgeführt und ein durchschnittlicher Wert (nach mehreren Durchgängen) betrug etwa 50 umol-NH&sub2;/g trockenes Granulat.
  • Die Reaktionen verlaufen wie folgt (R = Träger): Amino-diol-Träger
    • B) Herstellung von aldehyd-derivatisiertem DTPA
  • 1 g (2,8 mMol) DTPA-Bisanhydrid (caDTPA) (von Pierce Chemicals) wurde in 100 ml trockenem DMF gelöst, dazu wurden 10 mMol Triethylamin (TEA) und danach 2 g (0,1 mMol) von dem Granulat gegeben, das wie oben in Beispiel 1 derivatisiert wurde. Die Suspension wurde für 24 h bei Raumtemperatur gerührt, danach wurde es trockengelegt, mit DMF gewaschen und in 100 ml DMF resuspendiert, das 19 (2,8 mMol) caDTPA und 10 mMol TEA enthielt. Nach 24 Stunden Rühren wurde das Granulat erneut trockengelegt und nacheinander mit DMF, Dimethylsulfoxid (DMSO) und leicht gesäuertem Wasser (HCl) gewaschen.
  • Das Granulat wurde in 10 ml 0,1 M Phosphat (0,01 M NaIO&sub4;)-Puffer, pH 7, suspendiert und für 30 Minuten im Dunkeln gerührt, daraufhin wurde das Granulat trockengelegt und mit demselben Puffer gewaschen. Das Filtrat und die Wasch-Fraktionen wurden vereinigt.
  • Das vereinigte Filtrat und die Wasch-Fraktionen wurden auf pH 2 (mit HCl) angesäuert und auf etwa 2 ml in einem Rotavapor konzentriert. Daraufhin wurde der Rest über ein Ionenaustauschharz (Dowex 1X8, Acetat-Form, trockene Siebnummer 20-50) in eine 20 x 1 cm-Säule geleitet. Die Elutionsrate betrug 2 ml/min unter Verwendung eines konstanten Essigsäuregradienten (pH = 3). Aliquote Mengen von aufeinanderfolgenden Fraktionen (2 ml) wurden nach Aldehyden analysiert, nach dem Verfahren von J. Bartos et al. Pure Appl. Chem., 51 (1979), 1803, bei dem die Fluoreszenz gemessen wird, die durch Behandlung mit Cyclohexanon und Ammoniumcarbonat entsteht. Von insgesamt 10 Fraktionen enthielten die 6te und 7te die Mehrzahl des aldehyd-derivatisierten DTPA. Die Fraktionen mit einem positiven Aldehyd-Signal wurden vereint und lyophilisiert. Das Produkt wurde durch NMR und nach Bartos (ibid) auf Aldehyde hin analysiert.
  • Das Gewicht des getrockneten Produktes schien auf eine Freisetzungsrate von etwa 100% vom Träger hinzudeuten, und es ist wahrscheinlich, daß das erhaltene DTPA aldehyd-monosubstituiert ist, da sterische Hinderung des Matrix-Netzwerks wahrscheinlich eine zweifache Bindung des DTPA an die feste Phase verhindern würde. Die Messung des Aldehyds scheint jedoch darauf hinzudeuten, daß nur die Hälfte der theoretisch möglichen Substitutionen stattgefunden hat. Die Diskrepanz kann provisorisch durch einen Teil an Überoxydation während der Freisetzung bei möglicher, partieller Konversion zu Carboxyl-Gruppen erklärt werden. Die Reaktionen sind im folgenden schematisch dargestellt (A ist der Amino-Diol-Träger, siehe oben Teil A).
    • Beispiel 2 Herstellung von DTPA-gebundenen Poly(L-Lysin), das mit einer Aldehyd-Kopfgruppe ausgestattet ist.
  • a) Die Polymerisierung des N-Carboxyanhydrids (NCA) des alkyloxycarbonyl-geschützten Lysins wurde durch die Aminogruppe des aminodiol-derivatisierten Eupergit-Trägers initiiert, wie in Beispiel 1 (A) offenbart. Die geschützten Lysinmonomere, d.h. ε- Benzyloxycarbonyl-L-Lysin (BL) und ε-Fluorenylmethyl-oxycarbonyl-L-Lysin (FL) wurden von Bachem gekauft (Schweiz).
  • Die korrespondierenden NCA's wurden nach W.H. Daly et al., Tetrahedron Letters, 46 (1988), 5859, durch Reaktion mit festem Triphosgen in THF hergestellt.
  • b) 10 mMol des BL- oder FL-NCA wurden für drei Tage bei Raumtemperatur mit 2 g (0,1 mMol) des amino-Diol-derivatisierten Trägers, der wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, in 40 ml Dioxan (BL-NCA) oder DMF (FL-NCA) unter Verwendung eines Rotavapor- Apparates gerührt. Das Granulat wurde trockengelegt und nacheinander mit Dioxan oder DMF, dann CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen; schließlich wurde es im Vakuum getrocknet und gewogen. Die Menge des gewonnenen Polymers wurde durch die Zunahme des Gewichts des Trägers bestimmt. Ertrag 90% (BL), 40% (FL).
  • Die Methylfluorenylgruppe des Poly-(ε-fluorenylmethyloxycarbonyl-L-Lysin) (PFL)-derivatisierten Substrates (5 g) wurde entfernt, indem für 30 Minuten in 50 ml einer 20%igen Lösung von Piperidin in DMF gerührt wurde. Daraufhin wurde das Granulat mehrfach mit DMF und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und im Vakuum getrocknet. Der Ertrag bei Entfernung der Schutzgruppe war beinahe 100%. Korrespondierende Poly-(ε-Benzyloxycarbonyl-L-Lysin) (PBL)-derivatisiertes Granulat (1 g) wurde von der schützenden Gruppe befreit, indem es für 60 min in 50 ml einer 33:67-Mischung aus HBR/AcOH gerührt, danach mehrmals mit H&sub2;O, EtOH und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde. In diesem Fall zeigte ein Ninhydrin-Test, daß die Entfernung der Schutzgruppe nicht vollständig war, und weitere Schritte wurden durchgeführt, vorzugsweise unter Verwendung des derivatisierten Trägers, was zu beinahe 100%iger Entfernung der Schutzgruppen durch Entfernung von FL führte.
  • c) 1 g des von der Schutzgruppe befreiten Polylysin (PL)-derivatisierten Eupergit wurde in 20 ml DMSO, das 1 g caDTPA enthielt, für 24 h bei Raumtemperatur suspendiert. Daraufhin wurde ein weiteres g caDTPA dazu gegeben und die Mischung erneut für 24 h gerührt. Dies wurde wiederholt, bis keine freien Amino- Gruppen mehr vorhanden waren, wie mit Ninhydrin nachgewiesen wurde (keine Farbe). Daraufhin wurde das Granulat erneut abgetrennt und von DM50 frei gewaschen.
  • d) Die DTPA-gebundenen PL-Träger wurden in 20 ml 0,1 M Phosphat (0,01 M Natrium-periodat)-Puffer, pH 7,0, suspendiert und für 30 min im Dunkeln gerührt. Der Träger wurde trockengelegt und mit demselben Puffer gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung wurden wiedervereint und durch Dialyse gegen Wasser gereinigt (MG-Ausschlußgrenze der Membran 5000). Der Rückstand wurde gefriergetrocknet, um einen Ertrag von etwa 50% des Polymers zu erhalten. Die Analyse der Aldehydgruppen zeigte, daß etwa 15% der Polymerketten mit einer reaktiven -CHO- Gruppe ausgestattet waren. Es wird davon ausgegangen, daß dieser Ertrag durch Verwendung von milderen Oxydations-Bedingungen zur Freisetzung des Trägers verbessert werden kann. Die Reaktionen werden durch die folgende Abbildung verdeutlicht (nur die FL-Ausführung ist dargestellt). Base Oxidation
    • Beispiel 3 Herstellung von DTPA-gebundenen Poly-(L-Lysin), das mit einer Thiol-Kopfgruppe ausgestattet ist. a) Bindung von Propan-thiol
  • Zu einer Suspension von 4,24 g Glassplitter (kontrolliertes Porenglas CPG-10-1000 von Fluka AG), die mit Wasser und heißer Salpetersäure gewaschen wurden, in 50 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7, 1mM EDTA) wurde 4,24 ml einer Lösung aus 3,7 ml 3-Mercaptopropylmethoxysilan in 20 ml aus 1:1-Acetatpuffer/Ethanol (pH 4) gegeben, die (2h) gerührt worden war. Die Glassplitter wurden über Nacht gerührt, mit 1:1 Wasser/Ethanol gewaschen und in Ethanol (20 ml) resuspendiert, das 1,2 g (10 mMol) Dithiopyridin enthielt. Nach zwei Stunden wurden die Glassplitter entfernt, mit Ethanol gewaschen und dann getrocknet. Der Ertrag war 7 umol Thiol-Gruppen pro g Glas. Zur Thiolierung von Siliciumdioxid- Partikeln (Aerosil -300), Aluminiumoxid und Titandioxid (P25) wurde eine ähnliche Technik verwendet.
    • b) Bindung des Reaktionsinitiators
  • Thiolierte Glassplitter (1,75 g) wurden in 20 ml DMF suspendiert und ein großer Überschuß an Cysteamin (250 mg, 3 mMol) wurde zugegeben. Die Suspension wurde über Nacht gerührt, und die Glassplitter wurden abgetrennt und nacheinander mit DMF, Chloroform, Ethanol, stark verdünnter flüssiger Säure, NaHCO&sub3; und schließlich DMF gewaschen.
    • c) Polymerisierung des ε-geschützten Lysins
  • Das Verfahren war ähnlich wie das in Beispiel 2 offenbarte. 10 mMol FL-NCA wurden für 48 h bei Raumtemperatur mit 1 mMol des amin-substituierten Trägers, der wie oben unter a) dargestellt hergestellt wurde, in 50 ml DMF, das frisch destilliert wurde, um Spuren von Amin-Verunreinigungen zu entfernen, gerührt, wonach sie getrennt und mit DMF und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen wurden. Die Entfernung der Schutzgruppe wurde ebenfalls, wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung von Piperidin in DMF durchgeführt.
  • d) Bindung von caDTPA an die von der Schutzgruppe befreiten ε- NH&sub2;-Gruppen.
  • Das Verfahren wurde genau wie in Beispiel 2 offenbart unter Verwendung eines Überschusses an caDTPA durchgeführt, bis der Verbrauch von freien NH&sub2;-Gruppen im wesentlichen erreicht wurde. Die Glassplitter wurden daraufhin abgetrennt und mit Dioxan und CF&sub2;Cl&sub2; von DMSO freigewaschen.
    • e) Freisetzung des DTPA-gebundenen Polymers
  • Die Glassplitter mit dem gebundenen, DTPA-derivatisierten Polylysin wurden in 20 ml Phosphatpuffer (01, M, pH 7, 1mM EDTA) suspendiert, und 100 mg Dithiothreitol wurden dazugegeben. Nachdem über Nacht gerührt worden war, wurden die Glassplitter durch Filtration entfernt und mit demselben Puffer gewaschen; nach Eindampfen im Vakuum stellte das Filtrat das Produkt in Form des thiol-endständigen Polymers dar (Ertrag 76%).
  • Die Reaktionen werden auf der nächsten Seite zusammengefaßt, wobei R den immobilisierenden Glas-Träger darstellt. Die Oberfläche des Trägers ist mit einer Dichte von Hydroxyl-Gruppen ausgestattet (von absorbierter Feuchtigkeit oder Siliciumdioxid- Material), die eine Kondensation mit dem Silanderivat ermöglichen. Entfernung der Schutzgruppen Dithiothreitol
    • Beispiel 4
  • Die Verwendung von DTPA-gebundenen Polymeren mit Aldehydfunktionalität als zielgerichtete Gruppe eines konjugierten Vektors zum Transport von MRI-Kontrastverstärkern zu ausgewählten Gebieten.
  • Eine Menge von 0,9 mg (etwa 6 nMol) nicht-spezifischem, humanem Immunglobulin nIg (Sigma) wurde in 0,9 ml 1% Acetatpuffer, pH 5,5, gelöst; daraufhin wurde eine Menge des aldehyd-endständigen Polymers dazugegeben (siehe Beispiel 2) und eine Menge von Natriumcyantetrahydroborat in 20 j£l Wasser gelöst, wobei die jeweiligen Mengen ausgewählt wurden, um ein Molverhältnis von Antikörper/Aldehyd/Reduktionsmittel von 1/10/5 herzustellen. Nachdem für 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde ein neuer Anteil des Cyantetrahydroborats da zugegeben und das Rühren für 16 h fortgesetzt. Danach wurde die Mischung durch eine 100'000 MG-Ausschlußmembran mit 10 mM (0,15 M NaCl) Phosphatpuffer ph 7,2 (PBS) diafiltriert, um den Überschuß des Reduktionsmittels und des nicht-reagierten Polymers zu entfernen.
  • Daraufhin wurde die Lösung (0,5 ml) über eine Gel-Säule, erhätlich von Beckman und mit PBS equilibriert, chromatographiert. Zwei Peaks wurden erhalten: eine erste Fraktion, die nIg enthielt und eine zweite Fraktion, die das gewünschte nIg an das Polymer gebunden enthielt. Die letztere Fraktion wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer 10'000 MG-Ausschlußmembran konzentriert, um ein Produkt zu erhalten, das direkt zur Komplexierung paramagnetischer Ionen verwendet und danach für in vivo MRI-Experimente injiziert werden kann. Dieses Material war in der Lage, von etwa 50 bis etwa 100 Gd&spplus;³ pro Mol Ig zu komplexieren. In weiteren Experimenten wurde das nIg durch andere zielgerichtete Faktoren ersetzt und ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet.
    • Beispiel 5
  • Die Verwendung von DTPA-gebundenen Polymeren mit Thiol-Funktionalität als zielgerichtete Gruppe eines injizierbaren Konjugats zum selektiven Transport von MRI-Kontrastverstärkern zu ausgewählten Gebieten in vivo.
  • Zu 0,9 mg nlg (oder Anti-Maus CEA 35 vom Institut für Biochemie, Lausanne) in 0,9 ml PBS-Puffer wurden 60 nMol N-Succinimidyl-4- (N-maleinimido)-butyrat (SMBU) von Sigma gegeben, die in 50 ul DMF gelöst waren. Nach 1 h Stehen bei Raumtemperatur wurde die Lösung durch eine 10'000 MW Ausschlußmembran mit PBS diafiltriert, um überschüssiges SMBU zu entfernen.
  • Daraufhin wurden 16 nMol DTPA-Polylysin mit 5H-Funktionalität (siehe Beispiel 3) in 40 ul PBS zugegeben. Nach 2 h Stehen bei Raumtemperatur wurde das Konjugat einer Reinigung unterworfen (wie in Beispiel 4) oben, um eine injizierbare Lösung herzustel- len, die für in vivo MRI-Kontrastverstärker-Tests verwendet werden kann.
    • Beispiel 6
  • Granulat eines makro-vernetztem Polysterin-Harz (von Polysciences) wurde für 48 h in TFA angeätzt, daraufhin wurde es nacheinander mit DMF, Dioxan und MeOH gewaschen. 15,5 g des Granulates wurden in 80 ml CHCl&sub3; suspendiert und eine Mischung aus Stannibromid (1,8 ml, 13,7 mMol) und Brommethylmethylether (18,6 ml, 228 mMol) wurde tröpfchenweise zu der Suspension gegeben, die bei 0ºC unter Stickstoff geschüttelt wurde. Nachdem längerem Stehen wurde das Harz nacheinander mit Dioxan-HCl 3N (3:1), Dioxan, Methanol und Chloroform gewaschen. Das getrocknete Granulat wurde in 90 ml DMF suspendiert und die Suspension wurde unter N&sub2; auf 100ºC erhitzt (Rücklaufkondensator), wonach eine Lösung aus 2,1 g (27,9 mMol) Tioharnstoff in sehr wenig DMF dazugegeben wurde und die Mischung bei 100ºC über Nacht stehengelassen wurde. Nach Waschen mit DMF wurde das Substrat erneut in 90 ml DMF suspendiert, das 3,6 g Bis-3-Aminopropylamin enthielt, und über Nacht bei 100ºC unter Stickstoff erhitzt. Daraufhin wurde das Granulat nacheinander mit DMF, Dioxan und Chloroform gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet.
  • Das Harz (15,5 g, 512 ueq von -SH) wurde in 140 ml 50% flüssigem Ethanol suspendiert, das 0,8 g Cysteamin (10,4 mMol) enthielt, und daraufhin wurde dazu 3% H&sub2;O&sub2; gegeben, bis keine weitere Reduktion der I&sub2;/KI-Lösung in einer Teilmenge der Mischung festgestellt wird. Nachdem über Nacht geschüttelt wurde, wurde das Granulat mit wasserhaltigem Ethanol und dann mit Wasser gewaschen. Weiterhin wurde es über Nacht in einem Soxhlet-Apparat mit 1:1 MeOH/Chloroform extrahiert und daraufhin unter Vakuum getrocknet.
  • Eine Menge von 89 der aminierten, disulfid-gebundenen, festen Phase wurde in 30 ml Dioxan suspendiert, und eine Lösung aus 5,2 g des N-Carboxyanhydrids von γ-Benzylglutamat (BG-NCA) in 20 ml Dioxan wurde dazugegeben. Nachdem für 3 Tage gerührt wurde, wurde das Harz getrocknet und nacheinander mit Dioxan, MeOH und CHCl&sub3; gewaschen. Eine Menge von 4 g des obigen Granulates mit immobilisiertem Polyglutamat, das in 35 ml Benzol suspendiert worden war, wurde zu 40 ml Benzol gegeben, das mit HBr gesättigt worden war, und für 1 h gerührt, wobei die Durchleitung von HBr fortgesetzt wurde. Die Zufuhr von Gas wurde daraufhin gestoppt, und das Rühren über Nacht fortgesetzt, wonach das Granulat wie gewöhnlich gesammelt und gewaschen wurde, wobei das letzte Lösungsmittel Dichlormethan war. Die freien, funktionellen Carboxylgruppen des immobilisierten Polyglutamats wurden daraufhin mit Ethylendiamin nach bekannten Verfahren amidiert, und die Reaktion der freien, endständigen Amin-Seitenketten mit caDTPA wurde durchgeführt, wie in den vorhergehenden Beispielen offenbart. Schließlich wurde das Granulat in DMF suspendiert, und das thiol-aktivierte polychelat-bildende Molekül wurde durch Zugabe von 3% (basierend auf dem Volumen des Lösungsmittels) Thioethanol freigesetzt. Der Ertrag der Freisetzung überstieg 50% nach 72 h bei 120ºC. Das Endprodukt wurde nach Abtrennung der festen Phase durch Filtration und Eindampf en des Filtrats unter reduziertem Druck erhalten. Die abgetrennte, feste Phase war in einem weiteren Durchgang wiederverwertbar.
  • In den Ausführungsformen dieser Erfindung werden vorzugsweise Polyalkylenaminopolycarboxyl-Chelatbildner mit einer im allgemeinen linearen Struktur verwendet, wie durch die Strukturen des EDTA oder DTPA beschrieben. Natürlich können Chelatbildner mit anderen Strukturen ebenfalls verwendet werden, z.B. sternförmige Verbindungen sowie Nitrilotriessigsäure und das Triethylenaminohexaessigsäure-Homolog, makrocyclische Chelat-Bildner wie Cyclotetraazododecan-tetraessigsäure (DOTA) und weitere, ähnliche Strukturen (vgl. beispielsweise DE-A-3 401 052). Derivate der Polyalkylenaminopolycarbonsäuren, bei denen eine oder mehrere der Carboxyl-Gruppen durch Hydroxy-, Alkoxy- oder Amid-Gruppen ersetzt wurden, sind ebenfalls in dem vorliegenden Verfahren verwendbar; ein typisches Beispiel eines Chelatbildners mit einer Alkoxy-Seitengruppe ist das DTPA-Analog, bei dem eine endständige Carboxyl-Gruppe durch eine Benzyloxy-Gruppe (BOPTA) ersetzt wurde.

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung von Konjugat-Gruppen III zur Bindung an zielgerichtete Faktoren, die sich spezifisch an bioaktive zelluläre Kennstellen von lebendem Gewebe an lagern und/oder binden, um applizierbare, zielgerichtete Konjugate bereit zu stellen, die paramagnetische MRI-Kontrastverstärkermittel tragen können, welche selektiv zu interessierenden Organen oder Geweben gebracht werden, wobei die Konjugat- Gruppen III mindestens einen polyalkyl-aminopolycarbonsäure- Chelatbildner tragen und die folgende Formel aufweisen
wobei X¹ eine -CHO- oder -SH-Gruppe ist;
Alk ein C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylenrest ist, gegebenenfalls durch eine -S-Bindung unterbrochen;
Z ein C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylenrest ist, gegebenenfalls durch eine -COO-Bindung unterbrochen;
mindestens ein Y ein Polyalkylenaminopolycarbonsäure-Chelatbildner-Molekül darstellt (das andere Y, soweit vorhanden, H ist) entweder in Form der freien Säure oder mit paramagnetischen Ionen komplexiert, n eine ganze Zahl von 0 bis 100 ist und M eine Brücke zwischen -NH und Y darstellt, wobei diese Brücke entweder eine Amido-Bindung unter Beteiligung des -CO von Y und dem -NH von III ist, oder ein organischer, brücken-bildender Substituent, der mit einem Alkylenkohlenstoffatom von Y verbunden ist;
wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfaßt
1a) Acylierung einer Komponente der Formel I
wobei X -S- oder -CHOH- ist, und Alk, Z und n wie oben definiert sind, mit einem acylierenden Derivat des Chelatbildners Y, wobei mindestens eine der Carboxyl-Funktionen in der acylierenden derivatisierten Form liegt, d.h. intra- oder intermolekulare Anhydride, Halogene, reaktive Amide oder reaktive Ester; oder
1b) Umsetzen der Komponente I mit einem Derivat des Polyalkylenaminopolycarboxyl-Chelatbildners, der am Alkylenkohlenstoff mit einer brückenbildenden Funktion substituiert ist, die aus Benzoldiazonium, Halogenacetamidophenyl, Halogenacetamidobenzyl, Isocyanatophenyl, Isothiocyanatophenyl, und Azoimidat ausgewählt wurde,
wobei die Schritte (1a) oder (1b) zu einer Zwischenverbindung IV mit der Formel
führen, und dann
(2) Spalten der -XX-Bindung von IV um die Komponente III zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, daß R in den Formeln I und IV eine immobilisierte, feste Phase darstellt, an die der Rest des Moleküls in Komponenten I und IV kovalent gebunden wird, entweder direkt oder mittels einer dazwischenliegenden Brückenverbindung, welche vorher an die Oberfläche der festen Phase gebunden wurde, wobei letztere nach der Spaltung in Schritt (2) wiedergewonnen und danach in einem weiteren präparativen Zyklus wiederverwertet werden kann.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Derivat des Polyalkylenaminopolycarbonsäure-Chelatbildners die Struktur eines intramolekularen Anhydrids besitzt, das mindestens zwei gem-Acetoxy-Gruppen in Form eines Iminodiessigsäureanhydridrings trägt, und dieses Derivat die Formel
TEXT FEHLT
aufweist, wobei m die Anzahl von -N(AcOH)-ethylen-Einheiten des Chelatbildners und AcOH Essigsäure ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die mit R beschriebene feste Phase aus porösen oder nicht-porösen, organischen oder mineralischen Partikeln oder Kugeln besteht.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem die organische Phase ein polymeres Harz ist, welches aus Polystyrol, Sepharose Agarose, Thiosepharose , Polyacrylaten, Polyacrylamiden, Polyestern, Polyamiden, Polyimiden ausgewählt ist und die mineralische Phase aus Glas, Metalloxid oder Keramik, die aus porösen und nicht-porösen, filtrierenden Kugeln oder Pulvern von Glas, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, ZrO&sub2;, TiO&sub2; besthehen, ausgewählt ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem in den Formeln I und IV X¹ -SH ist, X -S- ist, Alk Ethylen ist, Z Tetramethylen ist, n zwischen 50 und 110 liegt und m des acylierenden Derivates 2 ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem in den Formeln I und IV X¹ -SH ist, X -S- ist, Alk Ethylen ist, Z -(CH&sub2;)-COO(CH&sub2;)&sub2;ist, n zwischen 50 und 110 liegt und in des acylierenden Derivates 2 ist.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 5 und 6, bei dem die Spaltung in Schritt (2) durch Hydrolyse durchgeführt wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem in den Formeln I und IV X&sub1; -CHO ist, X CHOH ist, Alk -CH&sub2;S(CH&sub2;)&sub2; ist, Z (CH&sub2;)&sub4; ist, n zwischen 50 und 110 liegt und m des acylierenden Derivates 2 ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem in den Formeln I und IV X1 CHO ist, X = CHOH, Alk = -CH&sub2;S(CH&sub2;)&sub2;, Z (CH&sub2;)&sub4; ist, n ist Null und m = 2.
10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 8 und 9, bei dem die Spaltung in Schritt (2) durch Oxidation durchgeführt wird.
11. Polyalkylaminopolycarboxyl-Chelatbildner mit einer reaktiven Endgruppe X¹ zur Bindung an Proteine und mit der Formel III
in welcher
X¹ eine -CHO- oder -SH-Gruppe ist;
Alk ein C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylenrest ist, wahlweise durch eine -S- Bindung unterbrochen;
Z ein C&sub1;- bis C&sub4;-Alkylenrest ist, wahlweise durch eine -COO- Bindung unterbrochen;
mindestens ein Y ein Polyalkylenaminopolycarbonsäure-Chelatbildnermolekül darstellt (das andere Y, soweit vorhanden, H ist) entweder in Form der freien Säure oder mit paramagnetischen Ionen komplexiert, n eine ganze Zahl von 0 bis 100 ist und M eine Brücke zwischen -NH und Y darstellt, welche entweder aus einer Amido-Bindung unter Verwendung des -CO von Y und des -NH von III, oder aus einem organischen, brückenbildenden Substituent verbunden mit einem Alkylenkohlenstoff des Y gemäß mit Anspruch 1 besteht.
12. Chelatbildner gemäß Anspruch 11 der Formel
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