ITMI970929A1

ITMI970929A1 - Procedimento per la coniugazione di chelanti con molecole contenenti gruppi amminici

Info

Publication number: ITMI970929A1
Application number: IT97MI000929A
Authority: IT
Inventors: Federico Maisano; Luigia Gozzini
Original assignee: Bracco Spa
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1997-04-18
Publication date: 1998-10-18
Also published as: EP0882454A2; EP0882454A3; IT1291623B1; JPH1129593A; US6022524A

Description

Descrizione dell ' invenzione industriale avente per titolo : "PROCEDIMENTO PER LA CONIUGAZIONE DI CHELANTI CON MOLECOLE CONTENENTI GRUPPI AMMINICI"

La presente invenzione riguarda un metodo per la preparazione di chelanti macromolecolari caratterizzati da un elevato contenuto di gruppi chelanti per macromolecola. Dopo complessazione con opportuni ioni metallici, tali prodotti possono essere utilizzati, come tali o in associazione o formulazione con altri componenti, nell ' imaging diagnostico come agenti di contrasto generali o specifici per un certo tessuto, organo o compartimento corporeo.

Nell 'imaging diagnostico con risonanza magnetica nucleare (MRI ) la necessità di raggiungere e mantenere per un certo tempo un elevato segnale in determinati compartimenti corporei, ad es. nella circolazione sanguigna, richiede la somministrazione di elevate quantità di ioni di metalli paramagnetici, ad es. gadolinio. L'elevata tossicità di questi ioni metallici può essere drasticamente ridotta tramite complessazione con chelanti opportuni, ad es. acido dietilentriamminopentaacetico (DTPA); inoltre, l'obiettivo di mantenere il segnale sufficientemente a lungo viene normalmente ottenuto tramite legame di questi complessi ad una macromolecola, quale ad es. una proteina come la sieroalbumina (Ogan M.D. et al. , Invest. Radiol. 22,665-671, 1987) . La preparazione di questi coniugati tra DTPA e macromolecole viene normalmente effettuata tramite reazione della dianidride del DTPA, un prodotto commercialmente disponibile, con opportuni gruppi funzionali reattivi della macromolecola di elezione quali ad es. gli ammino gruppi. Tuttavia questo metodo soffre di numerose controindicazioni, come la aspecificità della reazione e l'introduzione sulla macromolecola di ponti (crosslinking) sia inter- che intra-molecolari, a causa della doppia funzionalità del reattivo utilizzato {Maisano F. et al., Bioconj. Chem.

3, 212-217, 1992). Tali inconvenienti risultano tanto più gravi quanto più elevato è il rapporto molare fra DTPA dianidride e i gruppi reattivi della macromolecola, adottato nella reazione di coniugazione. D'altra parte, data l'instabilità dell'anidride in ambiente acquoso, elevati rapporti molari sono indispensabili per ottenere livelli di coniugazione apprezzabili .

Per risolvere questi problemi sono stati proposti metodi che richiedono una laboriosa e costosa sintesi di chelanti monofunzionalizzati con gruppi specificamente reattivi con i gruppi amminici della macromolecola, quali ad es. il gruppo isotiocianato (per es. Brechbiel M.W. et al. Inorg. Chem. 25, 2772-2781, 1986; Westerberg D.A. et al., J./Med. Chem. 32, 236-243, 1989). In alternativa, sono stati anche descritti metodi che prevedono una preattivazione del chelante come estere N-succinimmidico e successiva reazione con i gruppi amminici della macromolecola (Buckley R.G. and Searle F. FEBS Lett. 166, 202-204, 1984; Paxton R.J. et al. Cancer Res. 45, 5694-5699, 1985). Quest'ultima alternativa, apparentemente promettente, non ha tuttavia avuto un adeguato sviluppa per introdurre un elevato numero di gruppi chelanti, come invece è necessario nel campo della diagnostica MRI. Detto metodo infatti è stato descritto e messo a punto solo per coniugare chelati di metalli radioattivi ad anticorpi in vista di un loro uso in scintigrafia.Ovviamente questa tecnica diagnostica richiede bassissimi dosaggi e conseguentemente un elevato numero di chelanti coniugati con la macromolecola non è di interesse per il ricercatore del campo.

La presente invenzione consente di risolvere questi problemi, perché permette di legare ad una macromolecola un elevato numero di chelanti,contemporaneamente evitando reazioni non specifiche, come pure ogni forma di cross-linking inter e intramolecolare. Il metodo oggetto della presente invenzione, si basa inizialmente su una preattivazione del chelante da coniugare alla macromolecola, trasformandolo in un opportuno derivato attivo,quale ad esempio preferibilmente un estere N-succinimidico [analogamente a quanto già noto dallo stato dell'arte]. Tuttavia,a differenza dei metodi già descritti,è risultato in grado di dare elevatissimi livelli di coniugazione, grazie alla successiva originale procedura multistep che, oltre ad ovviare a tutte le difficoltà sintetiche note, ne rende possibile l'applicazione su scala industriale. Infatti la preattivazione del chelante come estere N-succinimidico non è in grado,da sola, di dare i necessari alti livelli di coniugazione, pur in presenza di un forte eccesso molare fra estere attivo e gruppi amminici disponibili,principalmente per due motivi: a) i gruppi chelanti coniugati alla macromolecola esercitano una repulsione elettrostatica verso nuove molecole di chelante diminuendo quindi la reattività dei gruppi amminici ancora liberi spazialmente vicini, inoltre

b) nelle condizioni di coniugazione l'estere attivo subisce una concomitante reazione di idrolisi che ne blocca la reattività.

Conseguentemente anche l'impiego di un forte eccesso di estere attivato o l'adozione di tempi di reazione più lunghi come pure condizioni di reazione più drastiche non sono in grado di migliorare la resa totale del processo. Anzi la formazione di ponti salini interni tra gruppi amminici liberi e molecole di chelante già coniugato, non fa altro che peggiorare la situazione complessiva. E’ stato ora inaspettatamente scoperto che, se dopo un primo step di coniugazione, condotto con un eccesso molare di estere attivo e con condizioni di reazione blande (temperatura e tempo di reazione non elevati), i gruppi chelanti introdotti vengono complessati con opportuni cationi metallici, compresi i metalli radioisotopici, il loro potere inibente sulla reattività dei gruppi amminici spazialmente vicini risulta fortemente ridotto. A questo punto, una seconda reazione di coniugazione permette di attaccare altre molecole di chelante anche a quei gruppi amminici che prima non potevano reagire.

E'quindi oggetto della presente invenzione un procedimento per la preparazione di coniugati tra agenti chelanti poliamminopolicarbossilici e molecole contenenti gruppi amminici, sostanzialmente comprendente i seguenti passaggi:

formazione di un estere attivo, quale preferibilmente un estere N-succinimmidico del chelante desiderato, tramite condensazione del chelante con N-idrossisuccinimmide (NHS), in presenza di un opportuno agente disidratante quale ad es. carbodiimmide, reazione di questo estere con la molecola recante i gruppi amminici, essendo l'estere in eccesso molare rispetto ai gruppi amminici della stessa,

purificazione del coniugato così ottenuto dal chelante in eccesso e successiva complessazione del coniugato con uno ione metallico, seconda reazione di coniugazione tra il coniugato complessato e l'estere N-succinimmidico del chelante, essendo l'estere in eccesso molare rispetto ai residui gruppi amminici,

purificazione del coniugato finale dal chelante in eccesso e successiva seconda complessazione con uno ione metallico dei residui chelanti introdotti.

Una realizzazione particolarmente preferita del procedimento secondo la presente invenzione prevede:

la preparazione dell'estere N-succinimmidico del chelante poliamminopolicarbossilico, preferibilmente DTPA o DOTA, mediante reazione con NHS, in presenza di dicicloesilcarbodiimmide in un solvente aprotico scelto tra acetonitrile , dimetilsolfossido, dimetilformammide e in presenza o meno di una base organica, la successiva concentrazione di detto estere mediante evaporazione sotto vuoto di gran parte, circa il 90%, del solvente; l'addizione graduale della soluzione concentrata di estere ad una soluzione acquosa della molecola contenente gruppi amminici mantènendo il pH tra 6 e 10 con l'aggiunta contemporanea di una base, preferibilmente di NaOH; ove il quantitativo teorico di estere calcolato sulla base del chelante di partenza sia in eccesso molare da 5 a 250 volte, preferibilmente tra 6 e 100, rispetto ai gruppi amminici presenti nella molecola e il tempo di reazione sia compreso tra 1 e 48 ore dal termine delle aggiunte di estere, ad una temperatura mantenuta tra 15 e 40*C,

la purificazione del coniugato ottenuto dai sottoprodotti, impurezze e reagenti in eccesso della reazione mediante processi a membrana (dialisi o ultrafiltrazione), o cromatografici (cromatografia a scambio ionico o ad esclusione sterica), o una combinazione di entrambi ,

la complessazione del coniugato con uno ione metallico o un suo sale ed eventuale successivo allontanamento del metallo in eccesso, una seconda reazione di coniugazione tra i gruppi amminici ancora liberi del coniugato complessato con eccesso molare dell'estere N-succinimmidico del chelante nelle condizioni sopra descritte, una seconda purificazione del coniugato dai sottoprodotti della reazione mediante processi a membrana o cromatografici,

la complessazione del coniugato finale con uno ione metallico ed eventuali successivi trattamenti di purificazione per allontanare il metallo in eccesso e/o migliorare l'omogeneità del prodotto.

Tra le macromolecole poliamminiche suscettibili di coniugazione secondo il metodo appena descritto, si possono citare ad esempio sieroalbumina bovina, insulina, citocromo C, mioglobina ed altre. Tra gli ioni metallici più adatti sono compresi Fe(2+), Fe(3+), Cu(2+), Cr(3+), Gd(3+), Eu(3+), Dy(3+), La(3+), Yb(3+) o Mn(2+), mentre gli ioni radioisotopici possono essere 51Cr, 67a , 68Ga, 111In, 99mTc, 140La, 175Yb, 153Sm, 166Ho, 90Y, 149pm, 177Lu, 47Sc, 142Pr, 159Gd, 212Bi.

Con il metodo dell'invenzione vengono ottenute percentuali di coniugazione chelato/macromolecola straordinariamente elevate rispetto all'insegnamento dello stato dell'arte. E' inoltre possibile ottenere coniugati complessi metallici caratterizzati da un grado di sostituzione complessivo chelante/ammino gruppi di almeno il 50%, e, a seconda del tipo di macromolecola utilizzata, superiore anche al 60/70%. Inoltre vengono evitate reazioni non specifiche e reazioni di cross-linking. Risulta conseguentemente più facile anche la purificazione della miscela finale dalle impurezze indesiderate (in questo caso solo il chelante in eccesso e N-idrossisuccinimide) come esemplificato nella seguente sezione sperimentale.

Esempio 1

Preparazione del coniugato Gd-DTPA-sieroalbumina bovina

Si prepara una soluzione di 40 g DTPA (0.102 mol) in 1.21 di dimetilsolfossido (DMSO) anidro, mediante riscaldamento ed agitazione, quindi si lascia raffreddare a temperatura ambiente e si addiziona una soluzione di 11.73 g NHS (0.102 mol) in 300 mi DMSO seguita, goccia a goccia, da una soluzione di 19.6 g di N,N'-dicicloesilcarbodiimmide (0.097 mol) in 400 mi DMSO. Si lascia sotto agitazione per 16 ore, quindi si filtra ed il filtrato è concentrato per evaporazione a 50"C e 5 Pa fino ad un olio denso del volume di 160 mi circa.

Questo olio è aggiunto in porzioni ad una soluzione di 1 g sieroalbumina bovina (BSA; 15 pnol, 60 gruppi amminici/molecola) in 11 di tampone borato 0.1 MpH 8, 0.1 M NaCl, mentre il pH è mantenuto a 8 con l'aggiunta contemporanea di 2 N NaOH. Al termine delle aggiunte si lascia sotto agitazione per 16 ore, quindi si filtra e si purifica dai sottoprodotti e reagenti in eccesso mediante desalting cromatografico su colonna di Sephadex G-25 (8.9 x 50 cm). La soluzione proteica è quindi concentrata per ultrafiltrazione (cartuccia tipo S1Y30, Amicon) fino ad un volume di 100 mi. A questa soluzione si aggiungono 10 mi di una soluzione 0.6 M del complesso di gadolinio con l'acido nitrilotriacetico a pH 6 e si lascia equilibrare per 1 ora, dopodiché si diluisce a 21 con tampone borato pH 8 e si concentra nuovamente per ultrafiltrazione a 100 mi.

A questo punto si ha un prodotto che contiene circa 25 residui di Gd-DTPA per molecola di albumina.Desiderando incrementare ulteriormente questo rapporto, la soluzione del coniugato complessato è trattata nuovamente con l'estere N-succinimmidico come descritto sopra e nuovamente sottoposta alle descritte operazioni di purificazione e complessazione. Dopo la complessazione, il prodotto è definitivamente purificato tramite cromatografia ad esclusione sferica, effettuata su colonna di Sephacryl S-200 HR (65 cm x 9 cm diam.) eluendo con 0.15 M NaCl. Con questa cromatografia si purifica il prodotto anche dalle percentuali di dimero e aggregati originariamente presenti nella BSA commerciale e si ottiene un coniugato con 45 residui di Gd-DTPA per ogni molecola di proteina (75% dei 60 gruppi amminici della BSA),cromatograficamente omogeneo, esente da cross-linking e da Gd-DTPA libero.

La determinazione del livello di sostituzione è stata fatta rapportando la concentrazione di gadolinio a quella della proteina, determinate rispettivamente mediante fluorescenza a raggi X (XRF) e assorbimento spettrofotometrico a 280 nm (e280 nm = 0-66 L.g-1.cm-1).

Esempio 2

Preparazione dei coniugati di altre proteine con Gd-DTPA

Con la stessa procedura Gd-DTPA è stato coniugato con insulina porcina, citocromo c equino, mioglobina equina, ottenendo coniugati contenenti rispettivamente 3, 13 e 12 residui Gd-DTPA/proteina corrispondenti a livelli di sostituzione dei gruppi amminici di 100%, 68% e 60% (v. Tabella 2).

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Processo per la coniugazione di chelanti poliamminopolicarbossilici agli animino gruppi di- molecole/macrcmolecole, sostanzialmente comprendente i seguenti passaggi: a) attivazione di detti chelanti, tramite formazione di un estere attivo,quale un estere N-succinimmidico degli stessi; b) coniugazione di detti esteri reattivi con i gruppi amminici delle molecole da funzionalizzare; c) eliminazione del chelante non reagito e formazione del complesso metallico del coniugato derivante dal passaggio b); d) reazione di detto complesso metallico con i chelanti attivati del punto a); e) eliminazione del chelante non reagito e seconda complessazione con ioni metallici analogamente al passaggio c).
2. Un processo secondo la rivendicazione 1, in cui il passaggio a) è realizzato tramite condensazione del chelante poliamminopolicarbossilico con N-idrossisuccinimmide in presenza di un agente disidratante, in solvente aprotico e in presenza o meno di una base organica.
3. Un processo .secondo le rivendicazioni 1-2, in cui il passaggio b)è realizzato in presenza di un eccesso molare di chelante attivato, rispetto al numero dei gruppi amminici delle molecole da funzionalizzare,in ambiente acquoso e a pH mantenuto fra 6 e 10.
4. Un processo secondo le rivendicazioni 1-3, in cui il passaggio c)è realizzato eliminando dapprima inpurezze, sottoprodotti e reagenti in eccesso tramite processi a membrana e/o cromatografici e successivamente facendo reagire il coniugato ottenuto con uno ione metallico o un suo sale.
5. Un processo secondo le rivendicazioni 1-4, in cui il passaggio d) è realizzato facendo reagire i gruppi amminici ancora liberi del coniugato complessato con eccesso molare di chelante attivato nelle condizioni precedentemente descritte.
6. Un processo secondo le rivendicazioni. 1-5, in cui il passaggio e) è realizzato in modo analogo a quanto descritto in rivendicai 4.
7. Un processo secondo la rivendicazione 2, in cui l'agente disidratante preferito è dicicloesilcarbodiimmide e il solvente aprotico è scelto dal gruppo comprendente acetoni trile, dimetilsolfossido, dimetilformammide.
8. Un processo secondo la rivendicazione 3, in cui l'estere attivo del chelante è in eccesso molare da 5 a 250 volte rispetto al numero dei gruppi amminici, il pH è mantenuto tra 6 e 10 tramite aggiunta di NaOH, il tempo della reazione varia tra 1 h e 48 h dal termine dell'aggiunta dell'estere e la temperatura è mantenuta fra 15* e 40*C.
9. Un processo secondo la rivendicaizone 4, in cui l'eliminazione di impurezze, sottoprodotti e reagenti in eccesso è realizzata tramite dialisi o ultrafiltrazione, o tramite cromatografia a scambio ionico o / ad esclusione sterica, o tramite una combinazione dei metodi precedenti.
10. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti in cui il chelante poliamminopolicarbossilico è scelto dal gruppo comprendente DTPA e DOTA.
11. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti in cui la macromolecola poliamminica è selezionata fra sieroalbumina bovina, insulina,citocromo e,mioglobina, ete.
12. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti in cui lo ione metallico è selezionato fra Fe(2+), Fe(3+), Cu(2+), Cr(3+), Gd(3+), Eu(3+), Dy(3+), La(3+), Yb(3+) o Mn(2+) o fra gli ioni dei seguenti radioisotopi 51Cr, 67Ga, 68Ga, 111In, 99mTc, 140La, 175Yb, 153Sm, 166Ho, 90Y, 149Pm, 177L u, 142Pr, 159Gd 212Bi
13. Coniugati complessi metallici ad elevato rapporto residuo chelante/animino gruppi ottenuti secondo il processo di rivendicazione 1. e seguenti.
14. Coniugati complessi metallici secondo la rivendicazione 13 caratterizzati da un grado di sostituzione complessivo resìduo chelante/ammino gruppi di almeno il 50%.
15. Composizioni farmaceutiche diagnostiche contenenti come agenti di contrasto almeno uno dei coniugati complessi secondo le rivendicazioni precedenti.