JP3463810B2 - 常磁性金属をキレート化でき、そして特異的細胞マーカー部位に応答する因子とカップリングするように企画された共役体成分を製造するための方法 - Google Patents
常磁性金属をキレート化でき、そして特異的細胞マーカー部位に応答する因子とカップリングするように企画された共役体成分を製造するための方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、選択された器官又は組織に常磁性MRIコン
トラストエンハンサーを運ぶように標的化された投与可
能な分子キャリヤーの分野に使用されるべき化合物を製
造するための新規方法に関する。
トラストエンハンサーを運ぶように標的化された投与可
能な分子キャリヤーの分野に使用されるべき化合物を製
造するための新規方法に関する。
モノクローナル又はポリクローナル抗体（細胞選択性
ホーミング因子）が常磁性金属イオンを保持するアミノ
ポリカルボン酸キレート化剤を担持する成分に共有結合
される分子共役体は知られている。
ホーミング因子）が常磁性金属イオンを保持するアミノ
ポリカルボン酸キレート化剤を担持する成分に共有結合
される分子共役体は知られている。
たとえば、W.T.ANDERSONなど.,Cancer Res.45（198
5）,2154〜2158においては、抗体活性及び特異性を保持
しながら、抗体１モル当たりDTPA8モルまでの結合が開
示されている。DTPA（ジエチレントリアミン−ペンタ酢
酸）は、たとえばGd,Fe,Cr及びNiを含む常磁性金属性の
ための強力なキレート化剤であり、従ってそれらは特異
的細胞部位に直接的に標的化され、そしてプロトンスピ
ン緩和（T1及び／又はT2）を変性し、そして像コントラ
ストを増強することによってMRI可視化を助けることが
できる。
5）,2154〜2158においては、抗体活性及び特異性を保持
しながら、抗体１モル当たりDTPA8モルまでの結合が開
示されている。DTPA（ジエチレントリアミン−ペンタ酢
酸）は、たとえばGd,Fe,Cr及びNiを含む常磁性金属性の
ための強力なキレート化剤であり、従ってそれらは特異
的細胞部位に直接的に標的化され、そしてプロトンスピ
ン緩和（T1及び／又はT2）を変性し、そして像コントラ
ストを増強することによってMRI可視化を助けることが
できる。
また、WO−Ａ−90/14881においては、架橋官能基、た
とえばイソシアネート−、イソチオシアネート−、ブロ
モアセトアミド−、ジアゾ−、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル及び分子間又は分子内無水物を用いるこ
とによってのホーミングタンパク質へのポリアミノカル
ボキシルキレート剤の結合が開示されている。
とえばイソシアネート−、イソチオシアネート−、ブロ
モアセトアミド−、ジアゾ−、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル及び分子間又は分子内無水物を用いるこ
とによってのホーミングタンパク質へのポリアミノカル
ボキシルキレート剤の結合が開示されている。
しかしながら、キレート化剤：抗体の分子比は、効果
的なMRIコントラスト増強のためには低く過ぎ、そして
コントラスト増強効率を改良する手段が開発された。た
とえば、George W.and Catherine H.WU（WO−Ａ−90/01
900）は、一定タイプの細胞の表面で特定レセプターに
より認識されるべく暴露された末端ガラクトース残基を
有する糖タンパク質を包含するリガンドがキレート化
剤、たとえば常磁性種を結合できるDTPA又はDOTA（1,4,
7,10−テトラザンクロドデカン−N4−テトラ酢酸）に結
合され、そして安定した非毒性錯体を形成する共役体を
開示した。選択的タンパク質はアシアロオロソムコイド
（AsOR）であり、そしてDTPAは、5:1〜15:1の範囲での
モル比のキレート化されたGd:AsORを結果的に達成する
ために、開示されていない手段によりそれらに結合され
た。もう１つの態様において、ポリリシン（PL）は、ア
シアログリコプロテインのラクトース末端との及びその
後、DTPAとの反応により変性され、アシア−PL−キレー
ト剤共役体が生成される。この共役体は、リシン１モル
当たりGd 90モルまでの結合を達成することが見出され
た。しかしながら、実験的な詳細はこの文献には欠乏し
ている。
的なMRIコントラスト増強のためには低く過ぎ、そして
コントラスト増強効率を改良する手段が開発された。た
とえば、George W.and Catherine H.WU（WO−Ａ−90/01
900）は、一定タイプの細胞の表面で特定レセプターに
より認識されるべく暴露された末端ガラクトース残基を
有する糖タンパク質を包含するリガンドがキレート化
剤、たとえば常磁性種を結合できるDTPA又はDOTA（1,4,
7,10−テトラザンクロドデカン−N4−テトラ酢酸）に結
合され、そして安定した非毒性錯体を形成する共役体を
開示した。選択的タンパク質はアシアロオロソムコイド
（AsOR）であり、そしてDTPAは、5:1〜15:1の範囲での
モル比のキレート化されたGd:AsORを結果的に達成する
ために、開示されていない手段によりそれらに結合され
た。もう１つの態様において、ポリリシン（PL）は、ア
シアログリコプロテインのラクトース末端との及びその
後、DTPAとの反応により変性され、アシア−PL−キレー
ト剤共役体が生成される。この共役体は、リシン１モル
当たりGd 90モルまでの結合を達成することが見出され
た。しかしながら、実験的な詳細はこの文献には欠乏し
ている。
Y.NANABEなど.,Biochim.＆ Biophys.Acta 883（198
6）,460〜467は、約100かそこらのDPのポリ（Ｌ−シリ
ン）とDTPA環状無水物（caDTPA）との反応せしめ、Ｎ−
スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロ
ピオネート（SPDP）との反応による２−ピリジルジスル
フィド基の導入及び共有チア結合共役体を形成するため
にチオール化されたIgGとのカップリングによりDTPA結
合ポリ（Ｌ−リシン）の製造を開示している。この合成
に関与する反応は下記に要約される。
6）,460〜467は、約100かそこらのDPのポリ（Ｌ−シリ
ン）とDTPA環状無水物（caDTPA）との反応せしめ、Ｎ−
スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロ
ピオネート（SPDP）との反応による２−ピリジルジスル
フィド基の導入及び共有チア結合共役体を形成するため
にチオール化されたIgGとのカップリングによりDTPA結
合ポリ（Ｌ−リシン）の製造を開示している。この合成
に関与する反応は下記に要約される。
類似する技法が、P.Shreveなど、Magnetic Resonance
in Medicine 3（1986）,336〜340により開示されてい
る。
in Medicine 3（1986）,336〜340により開示されてい
る。
P.F.Sievingなど.,Bioconjngate Chem.1（1990）,65
〜71は、混合された無水物を包含する技法によりポリリ
シンの側鎖末端−NH2へのポリアミノカルボキシルキレ
ート化剤の結合を開示している。後者は、有機アミン、
たとえばトリエチルアミン又はテトラメチルグアニジン
及びイソブチルクロロホルメート（IBCF）によりそれら
の塩の形でのキレート（たとえばDTPA及びDOTA）を処理
することに起因した。その塩、ポリリシンを担持するキ
レート化剤は次のようにしてヒト血清アルブミン（HS
A）に結合される：ポリリシンの未反応残基アミン側基
は、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレインイミドメチ
ル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）
により誘導体化され、マレインイミド活性化残基が供給
され、そしてHSAのいくつかの遊離アミノ基が２−イミ
ノチオランにより活性化され、少なくとも１つの反応性
アルキルチオール基が供給される。最終カップリング
は、ポリシシンを担持するキレート化剤のマレインイミ
ド末端の二重結合へのHSAの前記チオールの付加に起因
した。得られた共役体は、標的タンパク質当たり平均約
70のキレート部位を含んだ。
〜71は、混合された無水物を包含する技法によりポリリ
シンの側鎖末端−NH2へのポリアミノカルボキシルキレ
ート化剤の結合を開示している。後者は、有機アミン、
たとえばトリエチルアミン又はテトラメチルグアニジン
及びイソブチルクロロホルメート（IBCF）によりそれら
の塩の形でのキレート（たとえばDTPA及びDOTA）を処理
することに起因した。その塩、ポリリシンを担持するキ
レート化剤は次のようにしてヒト血清アルブミン（HS
A）に結合される：ポリリシンの未反応残基アミン側基
は、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレインイミドメチ
ル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）
により誘導体化され、マレインイミド活性化残基が供給
され、そしてHSAのいくつかの遊離アミノ基が２−イミ
ノチオランにより活性化され、少なくとも１つの反応性
アルキルチオール基が供給される。最終カップリング
は、ポリシシンを担持するキレート化剤のマレインイミ
ド末端の二重結合へのHSAの前記チオールの付加に起因
した。得られた共役体は、標的タンパク質当たり平均約
70のキレート部位を含んだ。
しかしながら、前記技法は、個々の段階が、退屈な操
作を必要とし、そして低収率を与える、中間生成物の注
意したクロマトグラフィー精製を包含する欠点を有す
る。本発明においては、選択された細胞マーカー部位に
対して特異的に応答するタンパク質ホーミング因子に結
合される常磁性金属イオンを錯化できる式IIの共役成分
を調製するための改良された方法が提供され、従ってイ
ンビボ及び組織培養の両者において、予定された領域に
高い割合の常磁性MRIコントラスト増強種を選択的に担
持することができ、そして運ぶことができる投与可能化
合物を供給する。
作を必要とし、そして低収率を与える、中間生成物の注
意したクロマトグラフィー精製を包含する欠点を有す
る。本発明においては、選択された細胞マーカー部位に
対して特異的に応答するタンパク質ホーミング因子に結
合される常磁性金属イオンを錯化できる式IIの共役成分
を調製するための改良された方法が提供され、従ってイ
ンビボ及び組織培養の両者において、予定された領域に
高い割合の常磁性MRIコントラスト増強種を選択的に担
持することができ、そして運ぶことができる投与可能化
合物を供給する。
請求の範囲第１項に要約されるように、この方法は、
合成の進行につれて出発材料及び続いて、連続的な中間
体を結合するために固体相の使用に基づかれている。最
後の段階においては、所望する生成物が、標的因子とカ
ップリングするために反応性最終機能を同時に生成する
分裂段階により固定化相から開放される。固定化相を用
いることの利点は、それが単純な濾過又は遠心分離によ
りもたらされ得るので、特に中間体の分離において判明
する。本発明のもう１つの利点は、分離段階が分子当た
りたった１つの末端活性化基を開放することであり、と
ころが過去の方法においては、その対応する中間体が、
ホーミング因子とのカップリングに基づいて架橋を導び
くいくつかの反応性末端をしばしば担持した。１つの他
の利点は、選択されたアシル化化合物が１つ以上のイミ
ノジ酢酸環を有する中間無水物である場合、特に段階
（1a）の実施に影響を及ぼすことであり、それによって
そのような二重官能性は架橋を導びくことができる。固
相上に固定された式Ｉの化合物を用いる場合、多官能無
水物によるアシル化の間、架橋が、立体反応により妨害
される。
合成の進行につれて出発材料及び続いて、連続的な中間
体を結合するために固体相の使用に基づかれている。最
後の段階においては、所望する生成物が、標的因子とカ
ップリングするために反応性最終機能を同時に生成する
分裂段階により固定化相から開放される。固定化相を用
いることの利点は、それが単純な濾過又は遠心分離によ
りもたらされ得るので、特に中間体の分離において判明
する。本発明のもう１つの利点は、分離段階が分子当た
りたった１つの末端活性化基を開放することであり、と
ころが過去の方法においては、その対応する中間体が、
ホーミング因子とのカップリングに基づいて架橋を導び
くいくつかの反応性末端をしばしば担持した。１つの他
の利点は、選択されたアシル化化合物が１つ以上のイミ
ノジ酢酸環を有する中間無水物である場合、特に段階
（1a）の実施に影響を及ぼすことであり、それによって
そのような二重官能性は架橋を導びくことができる。固
相上に固定された式Ｉの化合物を用いる場合、多官能無
水物によるアシル化の間、架橋が、立体反応により妨害
される。
本発明の方法においては、信号Ｒにより示された固定
された固相は、１又はそれ以上の段階を必要とする方法
において出発成分Ｉを形成することができるグラフトさ
れた置換基を供給された表面又は無機粒子（ガラス又は
セラミックス）上に残留反応性基を有するポリマー樹脂
であり得る。たとえば、ポリアクリル酸樹脂、ポリスチ
レン、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ポリオ
レフィン等の樹脂が便利である。無機粒子においては、
アルミナ、シリカ、ルチル又は多孔性ガラスのようなセ
ラミックスの粉末又はビーズが便利である。無機粒子、
好ましくは多孔性ガラスビーズは、反応性末端基、たと
えばイソシアネート、アミノ、アミド、置換オキシカル
ボニル、ヒドロキシ、チオール及び同様のものを供給さ
れたトリアルコキシシランによるシラン化により反応性
にされ得る。好ましい態様においては、ビーズはチオア
ルキル−シランによりシラン化され（H.WEETALL,Covale
nt Coupling Methods for Inorganic Support Material
s,Meth.Enzym.44（1976）,134を参照のこと），そして
その生成物が、分裂可能なジスルフィド結合（−XX−＝
S2）を含む固定された中間体アミンを供給するためにシ
ステアミンと反応せしめられる（L.FIELDなど.,J.A.C.
S.83（1961）,4414を参照のこと）。他方、チオール化
された樹脂、たとえばチオセファロース（Thiosepharos
e）はまた、便利な出発材料である。
された固相は、１又はそれ以上の段階を必要とする方法
において出発成分Ｉを形成することができるグラフトさ
れた置換基を供給された表面又は無機粒子（ガラス又は
セラミックス）上に残留反応性基を有するポリマー樹脂
であり得る。たとえば、ポリアクリル酸樹脂、ポリスチ
レン、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ポリオ
レフィン等の樹脂が便利である。無機粒子においては、
アルミナ、シリカ、ルチル又は多孔性ガラスのようなセ
ラミックスの粉末又はビーズが便利である。無機粒子、
好ましくは多孔性ガラスビーズは、反応性末端基、たと
えばイソシアネート、アミノ、アミド、置換オキシカル
ボニル、ヒドロキシ、チオール及び同様のものを供給さ
れたトリアルコキシシランによるシラン化により反応性
にされ得る。好ましい態様においては、ビーズはチオア
ルキル−シランによりシラン化され（H.WEETALL,Covale
nt Coupling Methods for Inorganic Support Material
s,Meth.Enzym.44（1976）,134を参照のこと），そして
その生成物が、分裂可能なジスルフィド結合（−XX−＝
S2）を含む固定された中間体アミンを供給するためにシ
ステアミンと反応せしめられる（L.FIELDなど.,J.A.C.
S.83（1961）,4414を参照のこと）。他方、チオール化
された樹脂、たとえばチオセファロース（Thiosepharos
e）はまた、便利な出発材料である。
ある態様において、その後、固定されたアミンは、ｎ
がゼロでない出発化合物Ｉを供給するために、アミノ酸
Ｎ−カルボニル無水物（NCA）のテレキレート重合にお
いて開始剤として使用され得；そのような反応について
の詳細はこの後に与えられる。ハロアルキルにより誘導
体化されたポリオレフィンは、適切な出発材料をまた供
給するために、ビス（アミノプロピル）アミンの存在下
でチオ尿素により硫化され得ることが注目されるべきで
ある（WARDELL,The Chemistry of Thiol Groups,Part
I,Ed.Patai,Wiley（1974）New−Yorkを参照のこと）。
また、チオメチル基により利用できる樹脂（Merrifield
樹脂）が、ジチオピリジンの中間作用を伴って又は伴わ
ないで、システアミン（HSCCH2）２−SH）との同じ反応
によるアミノ−アルキルジチア置換基により供給され得
る（H.YAHIMAなど.,J.Am.Chem.Soc.63（1941）,226
3）。
がゼロでない出発化合物Ｉを供給するために、アミノ酸
Ｎ−カルボニル無水物（NCA）のテレキレート重合にお
いて開始剤として使用され得；そのような反応について
の詳細はこの後に与えられる。ハロアルキルにより誘導
体化されたポリオレフィンは、適切な出発材料をまた供
給するために、ビス（アミノプロピル）アミンの存在下
でチオ尿素により硫化され得ることが注目されるべきで
ある（WARDELL,The Chemistry of Thiol Groups,Part
I,Ed.Patai,Wiley（1974）New−Yorkを参照のこと）。
また、チオメチル基により利用できる樹脂（Merrifield
樹脂）が、ジチオピリジンの中間作用を伴って又は伴わ
ないで、システアミン（HSCCH2）２−SH）との同じ反応
によるアミノ−アルキルジチア置換基により供給され得
る（H.YAHIMAなど.,J.Am.Chem.Soc.63（1941）,226
3）。
ハロアルキル化された樹脂により開始する反応がこの
後に要約される： 本発明の他の態様においては、固相がオキシラングラ
フト化された材料を供給するためにエポキシプロピル−
シランによりシラン化され、この機能はいくつかの品種
の市販のポリアクリルアミド樹脂、すなわちSIGMA Chem
icalsからのEupergit樹脂上に実際、すでに存在する。
オキシシラン誘導体化された固定化相が、隣位（vic）
−ジオール担持中間体、すなわち−XX−が−CHOH−CHOH
−である化合物Ｉを次の反応により製造するために使用
された： 次に、化合物Ｂ及びＡの末端アミノ基が、たとえば特
にLiu YUANFANGなど.,Pure ＆ Applied Chem.63（199
1）,427〜463の序論に言及される当業界において既知の
手段に従って、遊離状態又はすでに常磁性金属イオンを
有する錯体形下のいづれかで、キレート化剤分子との直
接的な結合のために使用され得る。１つの手段は、選択
されたポリアルキレンアミノ−ポリカルボキシルキレー
ト化剤のキレート化剤無水物（すなわち少なくとも１つ
のイミノジ酢酸無水物環を供給された分子内無水物又は
同じか又は異なった種類の２つの分子を含む分子間無水
物）の無水物を用いることによってアミンをアシル化す
ることである。不均質分子間無水物を形成するための好
ましい試薬は、イソブチルクロンホルメートである（Bi
oconjugate Chem.1.（1990）,65〜71を参照のこと）。
後に要約される： 本発明の他の態様においては、固相がオキシラングラ
フト化された材料を供給するためにエポキシプロピル−
シランによりシラン化され、この機能はいくつかの品種
の市販のポリアクリルアミド樹脂、すなわちSIGMA Chem
icalsからのEupergit樹脂上に実際、すでに存在する。
オキシシラン誘導体化された固定化相が、隣位（vic）
−ジオール担持中間体、すなわち−XX−が−CHOH−CHOH
−である化合物Ｉを次の反応により製造するために使用
された： 次に、化合物Ｂ及びＡの末端アミノ基が、たとえば特
にLiu YUANFANGなど.,Pure ＆ Applied Chem.63（199
1）,427〜463の序論に言及される当業界において既知の
手段に従って、遊離状態又はすでに常磁性金属イオンを
有する錯体形下のいづれかで、キレート化剤分子との直
接的な結合のために使用され得る。１つの手段は、選択
されたポリアルキレンアミノ−ポリカルボキシルキレー
ト化剤のキレート化剤無水物（すなわち少なくとも１つ
のイミノジ酢酸無水物環を供給された分子内無水物又は
同じか又は異なった種類の２つの分子を含む分子間無水
物）の無水物を用いることによってアミンをアシル化す
ることである。不均質分子間無水物を形成するための好
ましい試薬は、イソブチルクロンホルメートである（Bi
oconjugate Chem.1.（1990）,65〜71を参照のこと）。
次に本発明の方法の段階（２）は、固定化相からキレ
ート化剤を分離することを含んで成り、そして同時に、
タンパク質標的因子に結合するための反応性基を生成せ
しめ、ここで後者は、結合の前、活性化される必要があ
り、又は必要がない。
ート化剤を分離することを含んで成り、そして同時に、
タンパク質標的因子に結合するための反応性基を生成せ
しめ、ここで後者は、結合の前、活性化される必要があ
り、又は必要がない。
上記タイプＡの化合物の場合、分離は、隣位−ジオー
ル結合の通常の手段による選択的酸化又は過酸化により
もたらされ得、それによって式OHC−CH2SCH2−CH2NH−M
Yの反応性アルデヒド（ここでＭ及びＹは請求の範囲に
定義された意味を有する）が開放されるであろう。
ル結合の通常の手段による選択的酸化又は過酸化により
もたらされ得、それによって式OHC−CH2SCH2−CH2NH−M
Yの反応性アルデヒド（ここでＭ及びＹは請求の範囲に
定義された意味を有する）が開放されるであろう。
タイプＢの化合物の場合、分離は、通常の手段によ
り、すなわちチオエタノール又はジチオトレイトールの
存在下でジスルフィド結合でもたらされる。この場合、
典型的な式HS−（CH2）２−NH−MYの開放されるキレー
ト化剤分子が、通常の手段（たとえば前記引用された文
献に開示される技法）に従って、スルフィド活性化タン
パク質ホーミング因子とのカップリングのために使用さ
れ得る。分離の後、固定化相が、たとえば濾過又は遠心
分離にり回収され、そして経済的に興味あるもう１つの
サイクルに再使用され得る。アルデヒド−スルフィド置
換基により開放される固定化相の場合、これは、他の合
成に使用され得、又は本発明の方法のもう１つのサイク
ルへの再使用のために従来の手段により再生成され得
る。
り、すなわちチオエタノール又はジチオトレイトールの
存在下でジスルフィド結合でもたらされる。この場合、
典型的な式HS−（CH2）２−NH−MYの開放されるキレー
ト化剤分子が、通常の手段（たとえば前記引用された文
献に開示される技法）に従って、スルフィド活性化タン
パク質ホーミング因子とのカップリングのために使用さ
れ得る。分離の後、固定化相が、たとえば濾過又は遠心
分離にり回収され、そして経済的に興味あるもう１つの
サイクルに再使用され得る。アルデヒド−スルフィド置
換基により開放される固定化相の場合、これは、他の合
成に使用され得、又は本発明の方法のもう１つのサイク
ルへの再使用のために従来の手段により再生成され得
る。
本発明のさらに１つの特に興味ある観点によれば、式
Ａ又はＢの固定化されたアミンが、ポリアミノ酸、すな
わちキレート化剤分子を結合するための多くの部位を有
するポリマー主鎖を有する化合物を供給するために、ア
ミノ酸無水物（NCA）のテレキレート重合のための開始
剤として使用され得る（E.J.GOETHALS,Telechelic Poly
mers,Synthesis and Applications,CRC Press（1989）,
New−Yorkを参照のこと）。この技法によれば、カップ
リングの後、標的分子当たりのキレート化された常磁性
イオンの数を都合良く高めるであろう。本発明のある態
様において、化合物Ｂは、Ｌ−グルタミン酸のいくつか
のｒ−保護された誘導体又はアスパラギン酸のその対応
するβ−誘導体のNCAの重合のために使用され、ここで
前記保護基はベンジル、フェナシル、ピペロニル及びｐ
−メトキシフェナシルから選択される。
Ａ又はＢの固定化されたアミンが、ポリアミノ酸、すな
わちキレート化剤分子を結合するための多くの部位を有
するポリマー主鎖を有する化合物を供給するために、ア
ミノ酸無水物（NCA）のテレキレート重合のための開始
剤として使用され得る（E.J.GOETHALS,Telechelic Poly
mers,Synthesis and Applications,CRC Press（1989）,
New−Yorkを参照のこと）。この技法によれば、カップ
リングの後、標的分子当たりのキレート化された常磁性
イオンの数を都合良く高めるであろう。本発明のある態
様において、化合物Ｂは、Ｌ−グルタミン酸のいくつか
のｒ−保護された誘導体又はアスパラギン酸のその対応
するβ−誘導体のNCAの重合のために使用され、ここで
前記保護基はベンジル、フェナシル、ピペロニル及びｐ
−メトキシフェナシルから選択される。
エステル自体は、Van HEESWIJK,Synthesis（1982）,7
44に従って調製され、そしてNCAはホスゲン（気体又は
固体トリホスゲン）との反応により得られた。重合の
後、それらに結合されるアミン開始剤ヘッドを有するポ
リアミノ酸は、通常の手段、たとえばHBr又はトリフル
オロ酢酸（TFA）により保護解除され、そして第一アミ
ンを末端に有する側基を供給するために、遊離カルボキ
シル官能基がエチレンジアミン（又はいづれかのアルキ
レンジアミン）によりアミド化された。キレート化剤分
子は、化合物Ａ又はＢの場合において上記で説明された
ようにして、すなわちアシル化により又はポリアルキレ
ンアミン−ポリカルボキシルキレート化剤分子のアルキ
レン炭素の１つからの反応性結合橋を直接的に使用する
ことによって、前記アミン末端側基に結合された。次
に、XX結合が、その後、標的ホーミング因子に（常磁性
金属を有さない又はそれにより錯化されたカルボキシル
基により）結合されるべき活性化された遊離キレート化
剤ポリマーを開始するために、前記ですでに言及された
条件に類似する条件下で分離された。
44に従って調製され、そしてNCAはホスゲン（気体又は
固体トリホスゲン）との反応により得られた。重合の
後、それらに結合されるアミン開始剤ヘッドを有するポ
リアミノ酸は、通常の手段、たとえばHBr又はトリフル
オロ酢酸（TFA）により保護解除され、そして第一アミ
ンを末端に有する側基を供給するために、遊離カルボキ
シル官能基がエチレンジアミン（又はいづれかのアルキ
レンジアミン）によりアミド化された。キレート化剤分
子は、化合物Ａ又はＢの場合において上記で説明された
ようにして、すなわちアシル化により又はポリアルキレ
ンアミン−ポリカルボキシルキレート化剤分子のアルキ
レン炭素の１つからの反応性結合橋を直接的に使用する
ことによって、前記アミン末端側基に結合された。次
に、XX結合が、その後、標的ホーミング因子に（常磁性
金属を有さない又はそれにより錯化されたカルボキシル
基により）結合されるべき活性化された遊離キレート化
剤ポリマーを開始するために、前記ですでに言及された
条件に類似する条件下で分離された。
類似する反応が、Ｌ−リシンのNCAを用いて行なわ
れ、ここでε−NH2基は、フルオレニルオキシカルボニ
ル（PFL）基又はベンジルオキシカルボニル（PBL）基の
いづれかにより保護されている。重合の後の保護解除
は、DMF中、ピペリジン又はジオキサン中、TFA及びメシ
ル酸の混合物を用いることによってもたらされた（実験
部分を参照のこと）。
れ、ここでε−NH2基は、フルオレニルオキシカルボニ
ル（PFL）基又はベンジルオキシカルボニル（PBL）基の
いづれかにより保護されている。重合の後の保護解除
は、DMF中、ピペリジン又はジオキサン中、TFA及びメシ
ル酸の混合物を用いることによってもたらされた（実験
部分を参照のこと）。
従って、上記のようにして得られたテレキレートポリ
アミノ酸は、その後、前ですでに記載された同じ方法に
より、キレート化剤分子が結合され得る多くのアミノ末
端側基を供給される。たとえば、固定された化合物Ａに
より開始されたＬ−リシン−NCAの重合後に得られた固
定されたポリリシンが、側基（side arms）の有意な割
合（60〜80％まで）がキレート化剤分子により装備され
ているDP約50〜110のポリアミノ酸を供給するためにcaD
TPAと反応せしめられた。次に、前ですでに説明された
ように、酸化による開放の後、−CHOヘッド基を含む得
られたポリキレート化剤がタンパク質ホーミング因子と
のカップリングのために使用され、ここでカップリング
が必要とされる前、タンパク質を活性化する必要はな
く；これは明らかに従来技術の技法に比較して本発明の
強い利点である。ホーミング因子として使用され得るタ
ンパク質はひじょうに多く、そしてたとえばモノクロー
ナル及びポリクローナル抗体、ヒト血清アルブミン（HS
A）、特異的及び非特異的Ig,α−２−マクログロブリ
ン、インターロイキン、上皮増幅因子（EGF）、血小板
由来増殖因子及び一般的に、特異的細胞マーカー部位を
認識するタンパク質又は糖タンパク質を包含する。
アミノ酸は、その後、前ですでに記載された同じ方法に
より、キレート化剤分子が結合され得る多くのアミノ末
端側基を供給される。たとえば、固定された化合物Ａに
より開始されたＬ−リシン−NCAの重合後に得られた固
定されたポリリシンが、側基（side arms）の有意な割
合（60〜80％まで）がキレート化剤分子により装備され
ているDP約50〜110のポリアミノ酸を供給するためにcaD
TPAと反応せしめられた。次に、前ですでに説明された
ように、酸化による開放の後、−CHOヘッド基を含む得
られたポリキレート化剤がタンパク質ホーミング因子と
のカップリングのために使用され、ここでカップリング
が必要とされる前、タンパク質を活性化する必要はな
く；これは明らかに従来技術の技法に比較して本発明の
強い利点である。ホーミング因子として使用され得るタ
ンパク質はひじょうに多く、そしてたとえばモノクロー
ナル及びポリクローナル抗体、ヒト血清アルブミン（HS
A）、特異的及び非特異的Ig,α−２−マクログロブリ
ン、インターロイキン、上皮増幅因子（EGF）、血小板
由来増殖因子及び一般的に、特異的細胞マーカー部位を
認識するタンパク質又は糖タンパク質を包含する。
次の実験部分は、本発明をより詳細に説明する。この
セクションにおいて、記号AcOHは、酢酸基を表わす。
セクションにおいて、記号AcOHは、酢酸基を表わす。
実験（例）
ベンジルグルタメート−NCAを、H.BLOCK,“Ring Open
ing Polymerization"2（1969）,23,K.C.FRISH ＆ S.L.R
EEGEN Eds.,MARCEL DEKKER,New−Yorkに従って調製し
た。
ing Polymerization"2（1969）,23,K.C.FRISH ＆ S.L.R
EEGEN Eds.,MARCEL DEKKER,New−Yorkに従って調製し
た。
γ−フェナシルグルタメート−NCAを、THF250m中、
グルタミン酸エステル8.6gの懸濁液中でホスゲンを泡立
てることによって得た。溶解が完結した後、その溶液を
窒素によりフラッシュし；次にそれを蒸発し、そして残
留固体を酢酸エチル及びヘキサンから結晶化し；無色の
結晶を得た。
グルタミン酸エステル8.6gの懸濁液中でホスゲンを泡立
てることによって得た。溶解が完結した後、その溶液を
窒素によりフラッシュし；次にそれを蒸発し、そして残
留固体を酢酸エチル及びヘキサンから結晶化し；無色の
結晶を得た。
γ−ピペロニルグルタメートのNCAを、ジオキサン20m
中、前記エステル1gの懸濁液を固定トリホスゲン（Ja
nssen）350mにより処理し、そしてその後、60℃で90
分間、さらに撹拌することによって得た。必要なら、十
分な溶解を、ひじょうに少量の追加のトリホスゲンの添
加により行なう。その溶液をヘキサン400mに注ぎ、そ
して−20℃で一晩、放置し、それによって結晶を形成せ
しめた。それらを少量の酢酸エチルに溶解し、その溶液
を40℃で炭素により漂白し、そしてヘキサンにより沈澱
せしめた。白色結晶を、くり返しこの精製の後に得た。
中、前記エステル1gの懸濁液を固定トリホスゲン（Ja
nssen）350mにより処理し、そしてその後、60℃で90
分間、さらに撹拌することによって得た。必要なら、十
分な溶解を、ひじょうに少量の追加のトリホスゲンの添
加により行なう。その溶液をヘキサン400mに注ぎ、そ
して−20℃で一晩、放置し、それによって結晶を形成せ
しめた。それらを少量の酢酸エチルに溶解し、その溶液
を40℃で炭素により漂白し、そしてヘキサンにより沈澱
せしめた。白色結晶を、くり返しこの精製の後に得た。
例１
Ａ）隣位ジオールスペーサーを通してのグラフトされた
第一アミンによるキャリヤーの調製（アミノ−ジオール
−誘導体化キャリヤー）。
第一アミンによるキャリヤーの調製（アミノ−ジオール
−誘導体化キャリヤー）。
Eugerfic−Ｃビーズ（その上でグラフトされたグリシ
ジル基を有するポリアクリルアミド樹脂−SIGMAの製
品）5gを、0.1Mのリン酸（1mMのEDTA）緩衝液（pH6.0）
100mに懸濁し、そしてジチオエリトリトール（DTE）1
g（6.5mモル）を撹拌下で添加した。その不均質混合物
を室温で２日間、撹拌し、その後、ビーズを排水し、そ
して同じリン酸緩衝液により洗浄した。約50mgのアリコ
ートを取り、そしてDMF中、2,2′−ジチオジピリジンの
10mM溶液10mと共に室温で１時間、撹拌することによ
って洗浄した。ビーズを排水し、DMFにより、次にCH2Cl
2により洗浄し、DMF5mに再懸濁し、そして−SS−結合
を１滴のメルカプトエタノール（EtSH）により分離し;3
0分間の撹拌の後、ビーズを濾過により分離し、そして
濾液における２−チオピリドンの量をM.C.Millotなど.,
J.Chromatography 354（1986）155に従って343nm（ε＝
8080）での吸光度により決定した。
ジル基を有するポリアクリルアミド樹脂−SIGMAの製
品）5gを、0.1Mのリン酸（1mMのEDTA）緩衝液（pH6.0）
100mに懸濁し、そしてジチオエリトリトール（DTE）1
g（6.5mモル）を撹拌下で添加した。その不均質混合物
を室温で２日間、撹拌し、その後、ビーズを排水し、そ
して同じリン酸緩衝液により洗浄した。約50mgのアリコ
ートを取り、そしてDMF中、2,2′−ジチオジピリジンの
10mM溶液10mと共に室温で１時間、撹拌することによ
って洗浄した。ビーズを排水し、DMFにより、次にCH2Cl
2により洗浄し、DMF5mに再懸濁し、そして−SS−結合
を１滴のメルカプトエタノール（EtSH）により分離し;3
0分間の撹拌の後、ビーズを濾過により分離し、そして
濾液における２−チオピリドンの量をM.C.Millotなど.,
J.Chromatography 354（1986）155に従って343nm（ε＝
8080）での吸光度により決定した。
ビーズ（主要部分）を0.5Mのトリス−HCL（0.5mMのED
TA）緩衝液（pH8.5）100mに懸濁し、そして２−ブロ
モエチルアミン臭酸塩の量（前記分析の結果から計算さ
れる）のブロモアミン／チオールのモル割合を50にし、
これは、K.Okazakiなど.,Anal.Biochem.149（1985）516
に従って行なわれた。室温で２日間の撹拌の後、ビーズ
を排水し、同じ緩衝液、次にH2Oにより洗浄し、そして
真空下で乾燥せしめた。
TA）緩衝液（pH8.5）100mに懸濁し、そして２−ブロ
モエチルアミン臭酸塩の量（前記分析の結果から計算さ
れる）のブロモアミン／チオールのモル割合を50にし、
これは、K.Okazakiなど.,Anal.Biochem.149（1985）516
に従って行なわれた。室温で２日間の撹拌の後、ビーズ
を排水し、同じ緩衝液、次にH2Oにより洗浄し、そして
真空下で乾燥せしめた。
遊離アミノ基の分析をC.C.Y.Lee and G.M.Loudon,Ana
l.Biochem.94（1979）60に従って行ない、そして平均値
（いくつかの実施の後）は、乾燥ビーズ1g当たり約50μ
モルの−NH2であった。
l.Biochem.94（1979）60に従って行ない、そして平均値
（いくつかの実施の後）は、乾燥ビーズ1g当たり約50μ
モルの−NH2であった。
その反応は次の通りである（Ｒ＝キャリヤー）：
Ｂ）アルデヒド−誘導体化DTPAの調製
DTPAビス無水物（caDTPA）（Pierce Chemicalsから
の）1g（2.8mモル）を無水DMF 100mに溶解し、トリエ
チルアミン（TEA）10mモルを添加し、そしてその後、ビ
ーズ2g（0.1mモル）を上記例１下におけるようにして誘
導体化した。懸濁液を室温で24時間、撹拌し、その後、
それらを排水し、DMFにより洗浄し、そしてcaDTPA 1g
（2.8mモル）及びTEA 10mモルを含むDMF 100mに再懸
濁した。24時間の撹拌の後、ビーズを再び排水し、そし
てDMF、ジメチルスルホキシド（DMSO）及びわずかに酸
性化された水（HCl）により連続的に洗浄した。ビーズ
を0.1Mのリン酸（0.01MのNaIO4）緩衝液（ph7）10mに
懸濁し、そして暗室で30分間撹拌し、次にビーズを排水
し、そして同じ緩衝液により洗浄した。濾液及び洗浄画
分をプールした。
の）1g（2.8mモル）を無水DMF 100mに溶解し、トリエ
チルアミン（TEA）10mモルを添加し、そしてその後、ビ
ーズ2g（0.1mモル）を上記例１下におけるようにして誘
導体化した。懸濁液を室温で24時間、撹拌し、その後、
それらを排水し、DMFにより洗浄し、そしてcaDTPA 1g
（2.8mモル）及びTEA 10mモルを含むDMF 100mに再懸
濁した。24時間の撹拌の後、ビーズを再び排水し、そし
てDMF、ジメチルスルホキシド（DMSO）及びわずかに酸
性化された水（HCl）により連続的に洗浄した。ビーズ
を0.1Mのリン酸（0.01MのNaIO4）緩衝液（ph7）10mに
懸濁し、そして暗室で30分間撹拌し、次にビーズを排水
し、そして同じ緩衝液により洗浄した。濾液及び洗浄画
分をプールした。
プールされた濾液及び洗浄画分をpH2に酸性化し（HCl
により）、そしてRotaraporにより約2mに濃縮した。
次に残留物を、20×1cmのカラムにおけるイオン交換樹
脂上に通した（Dowex 1×８、アセテート形、20〜50の
ドライメッシュ）。溶出速度は一定の酢酸グラジェント
（pH＝３）を用いて2m／分であった。連続的画分から
のアリコート（2m）を、シクロヘキサノン及び炭酸ア
ンモニウムによる処理の後に生成される蛍光を測定す
る、J.Bartosなど、Pure Apple.Chem.51（1979）,1803
の方法によりアルデヒドについて分析した。合計10の画
分に基づけば、６及び７番目の画分がアルデヒド−誘導
体化DTPAの主要部を含んだ。陽性のアルデヒドシグナル
を付与する画分をプールし、そして凍結乾燥せしめた。
生成物をNMRにより及びBartos（前記）に従ってアルデ
ヒドについて分析した。
により）、そしてRotaraporにより約2mに濃縮した。
次に残留物を、20×1cmのカラムにおけるイオン交換樹
脂上に通した（Dowex 1×８、アセテート形、20〜50の
ドライメッシュ）。溶出速度は一定の酢酸グラジェント
（pH＝３）を用いて2m／分であった。連続的画分から
のアリコート（2m）を、シクロヘキサノン及び炭酸ア
ンモニウムによる処理の後に生成される蛍光を測定す
る、J.Bartosなど、Pure Apple.Chem.51（1979）,1803
の方法によりアルデヒドについて分析した。合計10の画
分に基づけば、６及び７番目の画分がアルデヒド−誘導
体化DTPAの主要部を含んだ。陽性のアルデヒドシグナル
を付与する画分をプールし、そして凍結乾燥せしめた。
生成物をNMRにより及びBartos（前記）に従ってアルデ
ヒドについて分析した。
乾燥された生成物の重量は約100％の結果物からの開
放の収率を示すと思われ、そしてその得られたDTPAがア
ルデヒド−置換されているように思える。なぜならば、
マトリックス網状構造による立体的妨害がたぶん、同相
への二重のDTPA結合を阻害するからである。しかしなが
ら、アルデヒドの測定は、理論的に置換のたった半分が
生じたことを示しているように思える。その矛盾は、カ
ルボキシル基への可能な部分的転換を伴っての開放の
間、ある程度の過酸化によりたぶん説明され得る。
放の収率を示すと思われ、そしてその得られたDTPAがア
ルデヒド−置換されているように思える。なぜならば、
マトリックス網状構造による立体的妨害がたぶん、同相
への二重のDTPA結合を阻害するからである。しかしなが
ら、アルデヒドの測定は、理論的に置換のたった半分が
生じたことを示しているように思える。その矛盾は、カ
ルボキシル基への可能な部分的転換を伴っての開放の
間、ある程度の過酸化によりたぶん説明され得る。
その反応は下記に図示される（Ａはアミノ−ジオール
−キャリヤーである；上記パートＡを参照のこと）： 例2:アルデヒド末端基（heading group）を供給されたD
TPA−グラフト化ポリ（Ｌ−リシン）の調製。
−キャリヤーである；上記パートＡを参照のこと）： 例2:アルデヒド末端基（heading group）を供給されたD
TPA−グラフト化ポリ（Ｌ−リシン）の調製。
ａ）アルキルオキシカルボニル−保護されたリシンのＮ
−カルボキシ無水物（NCA）の重合を、例１（Ａ）に開
示されるアミノ−ジオール誘導体化Eupergitキャリヤー
のアミン基により開始した。保護されたリシンモノマ
ー、すなわちε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシ
ン（BL）及びε−フルオレニルメチル−オキシカルボニ
ル−Ｌ−リシン（FL）を、Bachem（Switzerland）から
購入した。
−カルボキシ無水物（NCA）の重合を、例１（Ａ）に開
示されるアミノ−ジオール誘導体化Eupergitキャリヤー
のアミン基により開始した。保護されたリシンモノマ
ー、すなわちε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシ
ン（BL）及びε−フルオレニルメチル−オキシカルボニ
ル−Ｌ−リシン（FL）を、Bachem（Switzerland）から
購入した。
その対応するNCAを、THFにおける固体トリホスゲンとの
反応により、W.H.Dalyなど、Tetrahedron Letters 46
（1988）5859に従って調製した。
反応により、W.H.Dalyなど、Tetrahedron Letters 46
（1988）5859に従って調製した。
ｂ）10mモルのBL−又はFL−NCAを、上記例１で調製され
たアミノ−ジオール誘導体化キャリヤー2g（0.1mモル）
と共に、Rotavapor装置を用いて40mのジオキサン（BL
−NCA）又はDMF（FL−NCA）において室温で３日間、撹
拌した。ビーズを排水し、そしてジオキサン又はDMF、
次にCH2Cl2により連続的に洗浄し；最後に、それらを真
空下で乾燥せしめ、そして重量を計った。得られたポリ
マーの量を、キャリヤーの重量の上昇により決定した。
収率90％（BL）,40％（FL）。
たアミノ−ジオール誘導体化キャリヤー2g（0.1mモル）
と共に、Rotavapor装置を用いて40mのジオキサン（BL
−NCA）又はDMF（FL−NCA）において室温で３日間、撹
拌した。ビーズを排水し、そしてジオキサン又はDMF、
次にCH2Cl2により連続的に洗浄し；最後に、それらを真
空下で乾燥せしめ、そして重量を計った。得られたポリ
マーの量を、キャリヤーの重量の上昇により決定した。
収率90％（BL）,40％（FL）。
ポリ−（ε−フルオレニルメチルオキシカルボニル−
Ｌ−リシン）（PFL）−誘導体化支持体（5g）のメチル
フルオレニル基を、DMF中、ピペリジンの20％溶液50m
中で30分間、撹拌することによって除去した。次にビー
ズをDMF及びCH2Cl2により返復して洗浄し、そして真空
下で乾燥せしめた。保護解除の収率は100％近くであっ
た。
Ｌ−リシン）（PFL）−誘導体化支持体（5g）のメチル
フルオレニル基を、DMF中、ピペリジンの20％溶液50m
中で30分間、撹拌することによって除去した。次にビー
ズをDMF及びCH2Cl2により返復して洗浄し、そして真空
下で乾燥せしめた。保護解除の収率は100％近くであっ
た。
対応するポリ（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
リシン）（PBL）−誘導体化ビーズ（1g）を、HBr:AcOH
の33:67混合物50m中で60分間、撹拌し、次にH20,EtOH
及びCH2Cl2により返復的に洗浄することによって保護解
除し、そして真空下で乾燥せしめた。この場合、ニンヒ
ドリン試験は、不完全である保護解除及び追加の操作が
FLの除去による100％近くの保護解除に起因する、誘導
体化物を好ましくは用いて実施されたことを示した。
リシン）（PBL）−誘導体化ビーズ（1g）を、HBr:AcOH
の33:67混合物50m中で60分間、撹拌し、次にH20,EtOH
及びCH2Cl2により返復的に洗浄することによって保護解
除し、そして真空下で乾燥せしめた。この場合、ニンヒ
ドリン試験は、不完全である保護解除及び追加の操作が
FLの除去による100％近くの保護解除に起因する、誘導
体化物を好ましくは用いて実施されたことを示した。
ｃ）保護解除されたポリリシン（PL）−誘導体化Euperg
it 1gを、caDTPA 1gを含むDMSO 20mに室温で24時
間、懸濁した。次に、1gのcaDTPAを添加し、そしてその
混合物をさらに24時間、撹拌した。これを、残存する遊
離アミノ基の不在がニンヒドリンにより確かめられるま
で（無色）、くり返した。次に、ビーズを再び分離し、
そして洗浄し、DMSOを除いた。
it 1gを、caDTPA 1gを含むDMSO 20mに室温で24時
間、懸濁した。次に、1gのcaDTPAを添加し、そしてその
混合物をさらに24時間、撹拌した。これを、残存する遊
離アミノ基の不在がニンヒドリンにより確かめられるま
で（無色）、くり返した。次に、ビーズを再び分離し、
そして洗浄し、DMSOを除いた。
ｄ）DTPA−グラフトされたPL−キャリヤーを、0.1Mのリ
ン酸（0.01Mの過ヨウ素酸ナトリウム）緩衝液（pH7.0）
20mに懸濁し、そして暗室で30分間、撹拌した。キャ
リヤーを排水し、そして同じ緩衝液により洗浄した。濾
液及び洗浄液を再結合し、そして水に対する透析により
精製した（5000のMWカットオフ膜）。残留物を凍結乾燥
せしめ、約50％の収率のポリマーを得た。アルデヒド基
の分析は、約15％のポリマー鎖が反応性−CHO基を供給
されたことを示した。この収率は、キャリヤーの開放の
ために適度な酸化条件を用いて高められ得ることが推定
される。その反応は下記に例示される（単にFL態様が示
されている）： 例3.チオール前基（leading group）を供給されたDTPA
−グラフト化されたポリ−（Ｌ−リシン）の調製。
ン酸（0.01Mの過ヨウ素酸ナトリウム）緩衝液（pH7.0）
20mに懸濁し、そして暗室で30分間、撹拌した。キャ
リヤーを排水し、そして同じ緩衝液により洗浄した。濾
液及び洗浄液を再結合し、そして水に対する透析により
精製した（5000のMWカットオフ膜）。残留物を凍結乾燥
せしめ、約50％の収率のポリマーを得た。アルデヒド基
の分析は、約15％のポリマー鎖が反応性−CHO基を供給
されたことを示した。この収率は、キャリヤーの開放の
ために適度な酸化条件を用いて高められ得ることが推定
される。その反応は下記に例示される（単にFL態様が示
されている）： 例3.チオール前基（leading group）を供給されたDTPA
−グラフト化されたポリ−（Ｌ−リシン）の調製。
ａ）プロパン−チオールのグラフト化
水、及び熱い硝酸により洗浄された、リン酸緩衝液
（0.1M,pH7,1mMのEDTA）50m中、ガラスチップ（Fluka
AGからの調節された多孔性ガラス（PG−10−1000）4.2
4gの懸濁液に、1:1の酢酸緩衝液／エタノール溶液（pH
4）20m中、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラ
ン（3.7m）の撹拌された（２時間）溶液4.24mを添
加した。ガラスチップを一晩、撹拌し、1:1の水／エタ
ノール溶液により洗浄し、そしてジチオジピリジン1.2g
（10mモル）を含むエタノール（20m）に再懸濁した。
２時間後、ガラスチップを除き、そしてエタノールによ
り洗浄し、次に乾燥せしめた。収率は、ガラス1g当たり
チオール基７μモルであった。類似する技法を、シリカ
粒子（Aerosil−A300）、アルミナ及び二酸化チタン（P
25）をチオール化するために適用した。
（0.1M,pH7,1mMのEDTA）50m中、ガラスチップ（Fluka
AGからの調節された多孔性ガラス（PG−10−1000）4.2
4gの懸濁液に、1:1の酢酸緩衝液／エタノール溶液（pH
4）20m中、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラ
ン（3.7m）の撹拌された（２時間）溶液4.24mを添
加した。ガラスチップを一晩、撹拌し、1:1の水／エタ
ノール溶液により洗浄し、そしてジチオジピリジン1.2g
（10mモル）を含むエタノール（20m）に再懸濁した。
２時間後、ガラスチップを除き、そしてエタノールによ
り洗浄し、次に乾燥せしめた。収率は、ガラス1g当たり
チオール基７μモルであった。類似する技法を、シリカ
粒子（Aerosil−A300）、アルミナ及び二酸化チタン（P
25）をチオール化するために適用した。
ｂ）開始剤のグラフト化
チオール化されたガラスチップ（1.75g）を、DMF 20m
に懸濁し、そしてひじょうに過剰のスシテアミン（25
0mg,3mモル）を添加した。その懸濁液を一晩撹拌し、そ
してガラスチップを分離し、そして連続的にDMF、クロ
ロホルム、エタノール、希釈水性酸、NaHCO3及び最後に
DMFにより洗浄した。
に懸濁し、そしてひじょうに過剰のスシテアミン（25
0mg,3mモル）を添加した。その懸濁液を一晩撹拌し、そ
してガラスチップを分離し、そして連続的にDMF、クロ
ロホルム、エタノール、希釈水性酸、NaHCO3及び最後に
DMFにより洗浄した。
ｃ）ε−保護されたリシンの重合
この方法は、例２に開示される方法に類似した。FL−
NCA 10mモルを、微量のアミン不純物を排除するために
新しく蒸留されたDMF 50mにおいて上記に示されるよ
うにして調製されたアミン−置換キャリヤー1mモルと共
に室温で48時間、撹拌し、その後、それらを分離し、そ
してDMF及び次にCH2Cl2により洗浄した。保護解除は、D
MF中、ピペリジン溶液を用いて、例２に記載されるよう
にしてもたらされた。
NCA 10mモルを、微量のアミン不純物を排除するために
新しく蒸留されたDMF 50mにおいて上記に示されるよ
うにして調製されたアミン−置換キャリヤー1mモルと共
に室温で48時間、撹拌し、その後、それらを分離し、そ
してDMF及び次にCH2Cl2により洗浄した。保護解除は、D
MF中、ピペリジン溶液を用いて、例２に記載されるよう
にしてもたらされた。
ｄ）保護解除されたε−NH2基に基づくcaDTPAのグラフ
ト化 この方法は例２に開示される方法に正確に同じであっ
た。但し、過剰のcaDTPAを用い、そして遊離NH2基の実
質的な消耗が達成されるまで反応の進行を可能にした。
次に、ガラスチップを分離し、そしてジオキサン及びCH
2Cl2により洗浄し、DMSOを解除した。
ト化 この方法は例２に開示される方法に正確に同じであっ
た。但し、過剰のcaDTPAを用い、そして遊離NH2基の実
質的な消耗が達成されるまで反応の進行を可能にした。
次に、ガラスチップを分離し、そしてジオキサン及びCH
2Cl2により洗浄し、DMSOを解除した。
ｅ）DTPA−グラフト化ポリマーの開放
固定されたDTPA−誘導体化ポリリシンを有するガラス
チップを、リン酸緩衝液（0.1M,pH7,1mMのEDTA）20m
に懸濁し、そしてジチオトレイトール100mgを添加し
た。一晩の撹拌の後、ガラスチップを濾過により除き、
そして同じ緩衝液により洗浄し；濾液は、真空下での蒸
発の後、チオール末端基を有するポリマーの形で生成物
を供給した（収率76％）。
チップを、リン酸緩衝液（0.1M,pH7,1mMのEDTA）20m
に懸濁し、そしてジチオトレイトール100mgを添加し
た。一晩の撹拌の後、ガラスチップを濾過により除き、
そして同じ緩衝液により洗浄し；濾液は、真空下での蒸
発の後、チオール末端基を有するポリマーの形で生成物
を供給した（収率76％）。
その反応は下記に要約され、ここでＲは固定ガラスキ
ャリヤーを示す。キャリヤーの表面は、シラン誘導体と
の縮合を可能にする高い密度のヒドロキシ基（吸着され
た湿気又はシリカの）を供給される。
ャリヤーを示す。キャリヤーの表面は、シラン誘導体と
の縮合を可能にする高い密度のヒドロキシ基（吸着され
た湿気又はシリカの）を供給される。
例4:選択された領域にMRIコントラストエンハンサーを
運ぶための共役体ベクターにおけるホーミング成分とし
てアルデヒド官能基を有するDTPA−グラフト化ポリマー
の使用。
運ぶための共役体ベクターにおけるホーミング成分とし
てアルデヒド官能基を有するDTPA−グラフト化ポリマー
の使用。
0.9mg（約6nモル）の非特異的ヒト免疫グロブリンnIg
（Sigma）を、１％酢酸緩衝液（pH5.5）0.9mに溶解
し；次にある量のアルデヒド末端を有するポリマー（例
２を参照のこと）及び水20μに溶解されたある量のシ
アノ硼水素化ナトリウムを添加し、ここで前記量は、1/
10/5のモル比の抗体／アルデヒド／還元剤を供給するよ
うな量である。室温で８時間の撹拌の後、新たにシアノ
硼水素化物の一部を添加し、そして撹拌を16時間続け
た。その後、その混合物を、過剰の還元剤及び未反応ポ
リマーを除去するために、10mM（0.15MのNaCl）のリン
酸緩衝液（PBS）（pH7.2）により100,000MWカットオフ
膜を通してダイアフィルトレートした。
（Sigma）を、１％酢酸緩衝液（pH5.5）0.9mに溶解
し；次にある量のアルデヒド末端を有するポリマー（例
２を参照のこと）及び水20μに溶解されたある量のシ
アノ硼水素化ナトリウムを添加し、ここで前記量は、1/
10/5のモル比の抗体／アルデヒド／還元剤を供給するよ
うな量である。室温で８時間の撹拌の後、新たにシアノ
硼水素化物の一部を添加し、そして撹拌を16時間続け
た。その後、その混合物を、過剰の還元剤及び未反応ポ
リマーを除去するために、10mM（0.15MのNaCl）のリン
酸緩衝液（PBS）（pH7.2）により100,000MWカットオフ
膜を通してダイアフィルトレートした。
次に、その溶液を、Beckmanから入手でき、そしてPBS
により平衡化されたゲル透過カラム上でクロマトグラフ
ィー処理した。次の２つのピークを得た:nIgを含む第１
の画分及びポリマーにより結合された所望するnIgを含
む第２の画分。この後者の画分を、常磁性イオンを錯化
するために直接的に使用され、そしてその後、インビボ
MRI実験のために注入され得る生成物を得るために10,00
0MWカットオフ膜を用いて限外濾過により濃縮した。こ
の材料は、Ig １モル当たり約50〜約100のGd+3を錯化
することができた。他の実験においては、nIgが他の標
的因子により置換され、そして類似する結果が得られ
た。
により平衡化されたゲル透過カラム上でクロマトグラフ
ィー処理した。次の２つのピークを得た:nIgを含む第１
の画分及びポリマーにより結合された所望するnIgを含
む第２の画分。この後者の画分を、常磁性イオンを錯化
するために直接的に使用され、そしてその後、インビボ
MRI実験のために注入され得る生成物を得るために10,00
0MWカットオフ膜を用いて限外濾過により濃縮した。こ
の材料は、Ig １モル当たり約50〜約100のGd+3を錯化
することができた。他の実験においては、nIgが他の標
的因子により置換され、そして類似する結果が得られ
た。
例5:インビボにおける選択された領域にMRIコントラス
トエンハンサーを選択的に運ぶための注入可能な共役体
におけるホーミング成分としてチオール官能基を有する
DTPA−グラフト化ポリマーの使用。
トエンハンサーを選択的に運ぶための注入可能な共役体
におけるホーミング成分としてチオール官能基を有する
DTPA−グラフト化ポリマーの使用。
PBS緩衝液0.9m中、nIg（又はInstitute of Biochem
istry,Lausanneからの抗−マウスCEA 35）0.9mgに、DMF
50μに溶解されたSigmaからのＮ−スクシンイミジル
−４−（Ｎ−アレインイミド）ブチレート（SMBU）60n
モルを添加した。室温で１時間放置した後、その溶液
を、PBSにより10,000MWカット−オフ膜を通してダイア
フィルトレートし、過剰のSMBUを除去した。
istry,Lausanneからの抗−マウスCEA 35）0.9mgに、DMF
50μに溶解されたSigmaからのＮ−スクシンイミジル
−４−（Ｎ−アレインイミド）ブチレート（SMBU）60n
モルを添加した。室温で１時間放置した後、その溶液
を、PBSにより10,000MWカット−オフ膜を通してダイア
フィルトレートし、過剰のSMBUを除去した。
次に、PBS 40μ中、SH−官能基を有するDTPA−ポリ
リシン（例３を参照のこと）16nモルを添加した。室温
で２時間放置した後、その共役体を精製し（上記例４に
おけるようにして）、インビボMRIコントラスト増強試
験のために使用される注入可能溶液を供給した。
リシン（例３を参照のこと）16nモルを添加した。室温
で２時間放置した後、その共役体を精製し（上記例４に
おけるようにして）、インビボMRIコントラスト増強試
験のために使用される注入可能溶液を供給した。
例６
マクロ−架橋されたポリスチレン樹脂のビーズ（Poly
sciencesからの）を、TFA中で48時間、エッチングし、
次にそれらをDMF、ジオキサン及びMeOHにより連続的に
洗浄した。そのビーズ15.5gを、80mのCHCl3に懸濁
し、そして臭化第二錫（1.8m,13.7mモル）及びブロモ
メチル−メチル−エーテル（18.6m,228mモル）の混合
物を、窒素下で０℃で撹拌された前記懸濁液に滴下し
た。しばらく放置した後、樹脂を、ジオキサン−HCl 3N
（3:1）、ジオキサン、メタノール及びクロロホルムに
より連続的に洗浄した。乾燥させたビーズをDMF 90m
に懸濁し、そしてその懸濁液をN2下で100℃に加熱し
（還流コンデンサー）、その後、少々のDMF中、チオ尿
素2.1g（27.9mモル）の溶液を添加し、そしてその混合
物を100℃で一晩、放置した。DMFにより洗浄した後、支
持体を、ビス（３−アミノプロピルアミン）3.6gを含む
DMF 90mに再び懸濁し、そして窒素下で100℃で一晩加
熱した。次に、ビーズを、DMF、ジオキサン及びクロロ
ホルムにより連続的に洗浄し、次にそれらを真空下で乾
燥せしめた。
sciencesからの）を、TFA中で48時間、エッチングし、
次にそれらをDMF、ジオキサン及びMeOHにより連続的に
洗浄した。そのビーズ15.5gを、80mのCHCl3に懸濁
し、そして臭化第二錫（1.8m,13.7mモル）及びブロモ
メチル−メチル−エーテル（18.6m,228mモル）の混合
物を、窒素下で０℃で撹拌された前記懸濁液に滴下し
た。しばらく放置した後、樹脂を、ジオキサン−HCl 3N
（3:1）、ジオキサン、メタノール及びクロロホルムに
より連続的に洗浄した。乾燥させたビーズをDMF 90m
に懸濁し、そしてその懸濁液をN2下で100℃に加熱し
（還流コンデンサー）、その後、少々のDMF中、チオ尿
素2.1g（27.9mモル）の溶液を添加し、そしてその混合
物を100℃で一晩、放置した。DMFにより洗浄した後、支
持体を、ビス（３−アミノプロピルアミン）3.6gを含む
DMF 90mに再び懸濁し、そして窒素下で100℃で一晩加
熱した。次に、ビーズを、DMF、ジオキサン及びクロロ
ホルムにより連続的に洗浄し、次にそれらを真空下で乾
燥せしめた。
樹脂（15.5g,512μ当量の−SH）を、システアミン0.8
g（10.4mモル）を含む50％水性エタノール140mに懸濁
し、そして混合物のアリコートによるI2/KI溶液の追加
の還元が観察されなくなるまで３％H2O2をそれらに添加
した。一晩の撹拌の後、ビーズを水性エタノール、次に
水により洗浄した。それらを1:1のモル比のMeOH:クロロ
ホルムによりSoxhlet装置で一晩さらに抽出し、次にそ
れらを真空下で乾燥せしめた。
g（10.4mモル）を含む50％水性エタノール140mに懸濁
し、そして混合物のアリコートによるI2/KI溶液の追加
の還元が観察されなくなるまで３％H2O2をそれらに添加
した。一晩の撹拌の後、ビーズを水性エタノール、次に
水により洗浄した。それらを1:1のモル比のMeOH:クロロ
ホルムによりSoxhlet装置で一晩さらに抽出し、次にそ
れらを真空下で乾燥せしめた。
アミノ化されたジスルフィドグラフト固相8gの部分
を、ジオキサン3mに懸濁し、そしてジオキサン20m
中、γ−ベンジルグルタメートのＮ−カルボキシ無水物
（BG−NCA）5.2gの溶液を添加した。３日間の撹拌の
後、樹脂を排水し、そしてジオキサン、MeOH及びCHCl3
により連続的に洗浄した。ベンゼン35mに懸濁された
固定化ポリグルタメートを有する上記ビーズ4gの部分を
HBrにより飽和されたベンゼン40mに置き、そして１時
間撹拌し、HBr泡立てを行なった。次に、ガスの導入を
停止し、そして撹拌を一晩続け、その後、ビーズを集
め、そして通常のようにしてすすぎ、ここで最後の溶媒
はジクロロメタンであった。その後、固定化されたポリ
グルタメートの遊離カルボキシル官能基を、通常の条件
下でエチレンジアミンによりアミノ化し、そして遊離ア
ミンを末端に有する側鎖とcaDTPAとの反応を前の例に開
示されているようにして生ぜしめた。最後に、ビーズを
DMFに懸濁し、そしてチオール活性化ポリキレート化剤
分子を、３％（溶媒の体積に基づいて）のチオエタノー
ルを添加することによって開放した。開放性の収率は、
120℃で72時間後、50％を越えた。最終生成物を、濾過
による固相の分離及び減圧下での濾液の蒸発の後に得
た。
を、ジオキサン3mに懸濁し、そしてジオキサン20m
中、γ−ベンジルグルタメートのＮ−カルボキシ無水物
（BG−NCA）5.2gの溶液を添加した。３日間の撹拌の
後、樹脂を排水し、そしてジオキサン、MeOH及びCHCl3
により連続的に洗浄した。ベンゼン35mに懸濁された
固定化ポリグルタメートを有する上記ビーズ4gの部分を
HBrにより飽和されたベンゼン40mに置き、そして１時
間撹拌し、HBr泡立てを行なった。次に、ガスの導入を
停止し、そして撹拌を一晩続け、その後、ビーズを集
め、そして通常のようにしてすすぎ、ここで最後の溶媒
はジクロロメタンであった。その後、固定化されたポリ
グルタメートの遊離カルボキシル官能基を、通常の条件
下でエチレンジアミンによりアミノ化し、そして遊離ア
ミンを末端に有する側鎖とcaDTPAとの反応を前の例に開
示されているようにして生ぜしめた。最後に、ビーズを
DMFに懸濁し、そしてチオール活性化ポリキレート化剤
分子を、３％（溶媒の体積に基づいて）のチオエタノー
ルを添加することによって開放した。開放性の収率は、
120℃で72時間後、50％を越えた。最終生成物を、濾過
による固相の分離及び減圧下での濾液の蒸発の後に得
た。
本発明の態様においては、EDTA又はDTPAの構造により
例示される一般的な線状主鎖のポリアルキレンアミノポ
リカルボキシルキレート化剤が主に使用された。本来、
他の構造を有するキレート化剤、すなわち星形化合物、
たとえばニトリロトリ酢酸及びトリエチレンアミノヒキ
サ酢酸相同体、並びにミクロテトラザドデカンテトラ酢
酸（DOTA）のような高分子環状キレート化剤及び他の類
似する構造体がまた使用され得る（たとえばDE−Ａ−34
01052を参照のこと）。ヒドロキシ、アルコキシ又はア
ミド基により置換される１又は複数のカルボキシル基に
よるポリアルキレンアミノポリカルボン酸の誘導体がま
た本発明の方法において使用でき；アルコキシ側基を有
するキレート化剤の典型的な例は、１つの末端カルボキ
シがベンシルオキシ基（BOPTA）により置換されているD
TPA類似体である。
例示される一般的な線状主鎖のポリアルキレンアミノポ
リカルボキシルキレート化剤が主に使用された。本来、
他の構造を有するキレート化剤、すなわち星形化合物、
たとえばニトリロトリ酢酸及びトリエチレンアミノヒキ
サ酢酸相同体、並びにミクロテトラザドデカンテトラ酢
酸（DOTA）のような高分子環状キレート化剤及び他の類
似する構造体がまた使用され得る（たとえばDE−Ａ−34
01052を参照のこと）。ヒドロキシ、アルコキシ又はア
ミド基により置換される１又は複数のカルボキシル基に
よるポリアルキレンアミノポリカルボン酸の誘導体がま
た本発明の方法において使用でき；アルコキシ側基を有
するキレート化剤の典型的な例は、１つの末端カルボキ
シがベンシルオキシ基（BOPTA）により置換されているD
TPA類似体である。
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フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 47/48
A61K 49/00
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (12)
- 【請求項１】対象の器官又は組織に選択的に運ばれる常
磁性MRIコントラストエンハンサー種を担持することが
できる投与可能な標的結合体を提供するための、生物組
織の生物活性細胞マーカー部位に特異的に応答しそして
／又は結合する標的因子とのカップリングのために使用
されるべき結合体成分IIIを製造するための方法であっ
て、ここで前記結合体成分IIIは少なくとも１つのポリ
アルキルアミノポリカルボキシルキレート化基を担持
し、そして下記式： 〔式中、X1は−CHO又は−SH基であり;AlKは−Ｓ−結合
により任意に中断されていてもよいC1〜C4のアルキレン
であり;Zは−COO−結合により任意に中断されていても
よいC1〜C4のアルキレンであり；少なくとも１つのＹは
その遊離酸形で又は常磁性イオンとの錯体としてのポリ
アルキレンアミノポリカルボン酸キレート化基分子を表
わし、もし存在するなら他のＹはＨであり、ｎは０〜10
0の整数であり、そしてＭは−NHとＹとの間の結合を表
わし、この結合は、Ｙの−COと−NHとを含むアミド結合
である〕 を有し； 下記段階： 1a）下記式I: 〔式中、Ｘは−Ｓ−又は−CHOH−であり、そしてAlk、
Ｚ及びｎは前記で定義された通りである〕 で表わされる化合物を、キレート化基Ｙのアシル化誘導
体II a（ここで、そのカルボキシル官能基の少なくとも
１つがアシル化誘導体形、すなわち分子間もしくは分子
内無水物、ハライド、反応性アミド又は反応性エステル
形で存在する）によりアシル化し；又は 1b）ベンゼンアゾニウム、ハロアセトアミド−フェニ
ル、ハロアセトアミド−ベンジル、イソシアネートフェ
ニル、イソチオシアネートフェニル及びアゾイミデート
から選択された反応性架橋官能基によりアルキレン炭素
上で置換された前記ポリアルキレンアミンポリカルボキ
シルキレート化剤の誘導体II bと、前記化合物Ｉとを反
応せしめ、ここで前記段階（1a）又は（1b）は、下記
式： で表わされる中間体IVを提供し、次に ２）IVの−XX−結合を分離することにより成分IIIを提
供する； ことを含んで成り； ここで式Ｉ及びIVにおけるＲは、化合物Ｉ及びIVにおけ
る分子の残りが直接的に又は前記固相の表面上に前もっ
てグラフトされたリンカーの中間手段により共有結合さ
れる固定化固相を定義し、ここで前記固相は段階（２）
における分離の後、回収可能であり、そしてその後、も
う１つの製造サイクルに再使用され得ることを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】ポリアルキレンアミノポリカルボン酸キレ
ート化剤の前記誘導体II aが、下記式： を有し、少なくとも２つのgem−アセトキシ基がイミノ
ジ酢酸無水物環の形で存在する分子間無水物の構造を有
する請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】Ｒで示される前記固相が多孔性又は非多孔
性の有機又は無機の粒子又はビーズから構成される請求
の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】前記有機相が、ポリスチレン、セファロー
ス、アガロース、チオセファロース、ポリアクリレー
ト、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリアミド及
びポリイミドから選択されたポリマー樹脂であり、そし
て前記無機相が、ガラス、シリカ、アルミナ、ZrO2又は
TiO2の多孔性又は非多孔性濾過ビーズ又は粉末から選択
されたガラス、金属酸化物又はセラミックである、請求
の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項５】式Ｉ及びIVにおいて、X1が−SHであり、Ｘ
が−Ｓ−であり、Alkがエチレンであり、Ｚがテトラメ
チレンであり、ｎが50〜110であり、そしてｍが２であ
る、請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項６】式Ｉ及びIVにおいて、X1が−SHであり、Ｘ
が−Ｓ−であり、Alkがエチレンであり、Ｚが−（CH2）
−COO（CH2）２−であり、ｎが50〜110であり、そして
ｍが２である、請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項７】前記分離段階（２）が加水分解によりもた
らされる請求の範囲第５又は６項記載の方法。 - 【請求項８】式Ｉ及びIVにおいて、X1が−CHOであり、A
lkが−CH2S（CH2）２であり、Ｚが（CH2）４であり、ｎ
が50〜110であり、そしてｍが２である、請求の範囲第
２項記載の方法。 - 【請求項９】式Ｉ及びIVにおいて、X1がCHOであり、Ｘ
がCHOHであり、Alkが−CH2S（CH2）２であり、Ｚが（CH
2）４であり、ｎがゼロであり、そしてｍが２である請
求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項１０】前記分離段階（２）が酸化によりもたら
される請求の範囲第８又は９項記載の方法。 - 【請求項１１】タンパク質へのカップリングのための反
応性末端基X1を有し、そして下記式III: 〔式中、X1は−CHO又は−SH基であり;Alkは−Ｓ−結合
により任意に中断されていてもよいC1〜C4のアルキレン
であり;Zは−COO−結合により任意に中断されていても
よいC1〜C4のアルキレンであり；少なくとも１つのＹは
その遊離酸形で又は常磁性イオンとの錯体としてのポリ
アルキレンアミノポリカルボン酸キレート化剤分子を表
わし、もし存在するなら他のＹはＨであり、ｎは０〜10
0の整数であり、そしてＭは−NHとＹとの間の結合を表
わし、この結合は、Ｙの−COと−NHとを含むアミド結合
である〕 を有するポリアルキルアミノポリカルボキシルキレート
化剤。 - 【請求項１２】下記式： を有する請求の範囲第11項記載のキレート化剤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH91810589.1 | 1991-07-22 | ||
| EP91810589A EP0529175B1 (en) | 1991-07-22 | 1991-07-22 | Conjugates chelated with paramagnetic metals for targetting |
| PCT/EP1992/001560 WO1993001837A1 (en) | 1991-07-22 | 1992-07-10 | Conjugated moieties for chelating paramagnetic metals |
Publications (2)
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