JPH1129593A - アミノ基を含む分子とキレート化剤の結合方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 常磁性金属イオンの毒性を軽減し、効果的な
診断的画像を得るための方法を提供すること。 【解決方法】 分子類／マクロ分子類のアミノ基とポリ
アミノポリカルボン酸キレート化剤の結合のための方法
であって、ａ）キレート化剤の反応性エステルの生成に
よる、該キレート化剤の活性化工程；ｂ）該反応性エス
テルと官能基化するための分子のアミノ基との結合工
程；ｃ）未反応キレート化剤の除去工程、及び工程ｂ）
からの結合物の金属錯体の形成工程；ｄ）該金属錯体
と、工程ａ）の反応性キレート化剤類との反応工程；並
びにｅ）未反応キレート化剤の除去工程工程、及びｃ）
と同様の、金属イオンとの第二の錯体化工程を含む方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、マクロ分子当たりのキレート化
基類が高い含量であることを特徴とするマクロ分子キレ
ート化剤を製造するための方法に関する。適切な金属イ
オンとのキレート化の後、該化合物は、ある種の組織、
器官又は身体区分の、一般的又は特定的コントラスト剤
としての診断的画像化において、そのまま、又は他の成
分との組み合わせ若しくは配合物として用いることがで
きる。

【０００２】核磁気共鳴（ＭＲＩ）での診断的画像化に
おいて、特定の身体区分で一定の時間高いシグナルを得
かつ保持するために、ガドリニウムのような常磁性金属
イオンの大量を投与しなければならない。それらの金属
イオンの高い毒性は、ジエチレントリアミノペンタ酢酸
（ＤＴＰＡ）のような適切なキレート化剤との錯体化に
より大きく減少させることができ；更に十分に長く存続
するシグナルが、通常これらの錯体をマクロ分子、例え
ば血清アルブミンのようなタンパク質に結合させること
により得ることができる（Ogan M.D. et al., Invest.
Radiol. 22, 665-671, 1987)。ＤＴＰＡとマクロ分子の
これらの結合物の調製は、一般に、ＤＴＰＡ２無水物、
すなわち商業的に入手し得る生成物と、アミノ基類のよ
うな選択されたマクロ分子の反応性官能基類との反応に
より実施することができる。しかしながら、この方法
は、用いられた反応基の二官能性のために、この反応は
特定的でなく、分子内−及び分子間−橋（架橋）が、マ
クロ分子中に導入されるような数々の欠点がある（Mais
ano F. et al., Bioconj.Chem. 3, 212-217, 1992)。結
合反応において、マクロ分子の反応性基類へのＤＴＰＡ
２無水物のモル比が高くなればなるほど、この重大な欠
点は更に多くなる。一方、高いモル比は、水性媒体中で
の無水物の不安定性のために、適切な結合レベルを得る
ためには必須である。

【０００３】これらの問題を克服するために、イソシア
ナート基のような、マクロ分子のアミノ基類と特異的に
反応する基類を有するモノ反応性のキレート化剤の複雑
で高価な合成を必要とする種々の方法が提案されている
（例えば、Brechbiel, M.W.et al., Inorg. chem. 25,
2772-2781, 1986, Westerberg D.A. et al., J. Med. C
hem. 32, 236-243, 1989)。

【０００４】別の方法として、Ｎ−スクシンイミドエス
テルの形態でのキレート化剤の予備−活性化、続くマク
ロ分子のアミノ基類との反応が考えられ、また記載され
ている（Buckley R.G. and Searle F. Febs Lett. 166,
202-204, 1984; Paxton R.J. et al. Cancer Res. 45,
5694-5699, 1985）。後者の方法は、明らかに有望であ
るが、ＭＲＩ画像化で必要であるように、多数のキレー
ト化剤基を導入するための適当な開発の方法を有してい
ない。該方法は、事実記載されており、閃光計数法でそ
れらの用途の見地で、抗体と放射性金属の結合性キレー
ト化剤のみ開発されている。この診断的技術は、もちろ
ん非常に低用量であることが必要であり、したがって、
マクロ分子と結合したキレート化剤の多くは、この分野
の研究者には興味がないものである。

【０００５】本発明は、マクロ分子へ数多くのキレート
化剤を結合させ、同時に非特異的反応及びいかなる分子
間−又は分子内架橋をも避けてこれらの問題を克服して
いる。本発明の方法の目的は、先ずマクロ分子と結合す
るキレート化剤の予備活性化に基づき、好適にはＮ−ス
クシンイミド〔類似的には、先行技術から既に知られて
いる〕のような適切な反応性誘導体へ移行させる。それ
にもかかわらず、既に記載された方法とは異なって、こ
の方法は、更に、既知の合成的困難をすべて取り除き、
引き続く初めの多段階工程のために、工業的スケールで
の適用を可能にするきわめて高い結合レベルを提供す
る。Ｎ−スクシンイミドエステルのようなキレート化剤
の予備活性化は、事実、入手しうるアミノ基に対する反
応性エステルの大過剰のモル当量の存在においてさえ、
それだけでは、主として二つの理由で、必要な高い結合
レベルを与えることはできない： ａ）マクロ分子と結合するキレート化剤の基類は、他の
キレート化剤分子類に対して静電的に反発し、それによ
り未だ遊離の、空間的に近接したアミノ基の反応性を減
少させ；更に ｂ）結合状態で、反応性エステルは、同時にその反応性
を妨害する加水分解を受ける。

【０００６】結論として、反応性エステルの大過剰でさ
えも、より長い反応時間又はより劇的な反応条件は、こ
の方法の全収量において改善を行わない。逆に、遊離の
アミノ基類と既に結合されているキレート化剤の間の内
部塩架橋の生成は、この状態をより悪くする。

【０００７】今、意外にも、反応性エステル分子の過剰
のモル当量及び温和な反応条件（高い反応温度及び長い
反応時間ではなく）で、最初の結合工程を実施した後、
導入されたキレート化基類は、放射性同位元素を含む適
切な金属イオン類と結合し、空間的に近接のアミノ基の
反応性においけるそれらの阻止作用は、顕著に減少する
ことを見いだした。この点において、第２の結合反応
は、他のキレート化分子類をそれまで反応できなかった
それらのアミノ基へ結合させる。

【０００８】したがって、本発明の目的は、ポリアミノ
ポリカルボン酸キレート化剤類と、アミノ基類を含む分
子との間の結合物を製造するための方法であって、実質
的に、以下の工程：カルボジイミドのような適切な脱水
剤の存在下の、キレート化剤とＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＮＨＳ）の縮合による、好適には所望のキレー
ト化剤のＮ−スクシンイミドエステルのような、反応性
エステルの形成工程（そのエステルとアミノ基を含む分
子との反応は、該分子のアミノ基に対して過剰のモル当
量のエステルである）、過剰のキレート化剤を除去する
得られた結合物の精製工程及び金属イオンとの引き続く
錯体化工程、錯体化した結合物とキレート化剤、すなわ
ちＮ−スクシンイミドエステルとの第２の結合反応工程
（このエステルは残留アミノ基に対して過剰モル当量で
ある）、並びに過剰のキレート化剤を除去する目的結合
物の精製工程及び導入された残留キレート化剤と金属イ
オンとの引き続く第２の錯体化工程を含む。

【０００９】本発明の方法の特に好適な実施態様は、ア
セトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルアミド
から選択される非プロトン溶媒中カルボジイミドと、場
合により有機塩基の存在下の、ＮＨＳとの反応による、
ポリアミノポリカルボン酸キレート化剤、好適にはＤＴ
ＰＡ又はＤＯＴＡのＮ−スクシンイミドエステルの調
製、真空下でのほとんどの溶媒、例えば約９０％溶媒を
蒸発させることによる該エステルの濃縮；アミノ基含有
分子の水性溶媒へのエステル濃縮溶液への徐々の添加、
同時の、塩基、好適にはＮａＯＨの添加によるｐＨの６
〜１０への維持；このとき分子中に存在するアミノ基に
対してエステルの量は出発物質に基づいて計算して５〜
２５０、好適には６〜１００モル当量の過剰であり、反
応時間は１５〜４０℃で、エステル添加の終了から１〜
４８時間の範囲であり、膜技術（透析又は限外濾過）、
若しくはクロマトグラフィー（イオン交換又は立体排除
クロマトグラフィー）、又はそれらの組み合わせによ
る、副生物、不純物及び過剰の試薬の除去を目的とす
る、得られた結合物の精製、結合物と金属イオン又はそ
の塩との錯体化、及び場合により過剰の金属の引き続く
除去、上述の条件下でのＮ−スクシンイミドエステルの
キレート化剤の過剰モル当量と錯体化結合物のまだ遊離
のアミノ基との第２の結合化反応、膜技術、又はクロマ
トグラフィーによる反応副生物からの結合物の精製、及
び目的結合物と金属イオンとの錯体化、及び過剰金属イ
オンを除くため及び／又は化合物の均一性を改善するた
めの、引き続く精製処理を含む。

【００１０】上述の方法による結合物に敏感はポリアミ
ンマクロ分子は、例えばウシ血清アルブミン、インスリ
ン、チトクロームＣ、ミオグロビン、デンドリマー類及
びポリリシン類などである。最も適切な金属イオンのう
ちで、Ｆｅ⁽²⁺⁾、Ｆｅ⁽³⁺⁾、Ｃｕ⁽²⁺⁾、Ｃｒ⁽³⁺⁾、Ｇｄ
⁽³⁺⁾、Ｅｕ⁽³⁺⁾、Ｄｙ⁽³⁺⁾、Ｌａ⁽³⁺⁾、Ｙｂ⁽³⁺⁾又はは
Ｍｎ⁽²⁺⁾が挙げられる。放射性元素は、⁵¹Ｃｒ、⁶⁷Ｇ
ａ、⁶⁸Ｇａ、¹¹¹Iｎ、 ^{9 9m}Ｔｃ、 ¹⁴⁰Ｌａ、 ¹⁷⁵Ｙｂ、
¹⁵³Ｓｍ、 ¹⁶⁶Ｈｏ、⁹⁰Ｙ、 ¹⁴⁹Ｐｍ、 ¹⁷⁷Ｌｕ、⁴⁷Ｓ
ｃ、 ¹⁴²Ｐｒ、 ¹⁵⁹Ｇｄ及び ²¹²Ｂｉであり得る。

【００１１】本発明の方法は、先行技術の教示のそれら
より極めて高いキレート／マクロ分子結合物の割合を提
供する。更に、キレート化剤残基／アミノ基類の比は、
少なくとも５０％の全置換度であり、用いるマクロ分子
によっては、６０／７０％を超えることさえあることを
特徴とする、金属錯体結合物を得ることが可能である。
更に、非特異的架橋反応は阻止される。所望でない不純
物（この場合、過剰のキレート剤及びＮ−ヒドロキシス
クシンイミドのみ）を除去する目的混合物の精製は、し
たがって、以下の実験の部に例示されているように、容
易である。

【００１２】

【実施例】

実施例１：Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ウシ血清アルブミン結合物
の調製 乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＳＯ）１．２リットル
中のＤＴＰＡ４０ｇ（０．１０２mol)の溶液を、加熱及
び攪拌して調製し、次いで室温まで冷却し、ＤＭＳＯの
３００ml中のＮＨＳ１１．７３ｇ（０．１０２mol)の溶
液を加え、次いでＤＭＳＯ４００ml中のＮ′，Ｎ′−ジ
シクロヘキシルカルボジイミド１９．６ｇ（０．０９７
mol)の溶液を滴滴と加えた。混合物を１６時間攪拌し、
次いで濾過し、濾液を５０℃、５Ｐａで蒸発させて約１
６０ml容量の濃厚油状物に濃縮した。

【００１３】この油状物を、０．１M ホウ酸塩緩衝液、
ｐＨ８、０．１M ＮａＣｌの１リットル中のウシ血清ア
ルブミン１ｇの溶液へ少量づつ加え、同時に２N ＮａＯ
Ｈを添加することによりｐＨを８に維持した。添加の終
了時に、混合物を１６時間攪拌し、次いで濾過し、Seph
dexG-25 カラム（８．９×５０cm）上でのクロマトグラ
フィーによる脱塩により副生物及び過剰の試薬を除去し
て精製した。次いで、このタンパク質溶液を、限外濾過
（S1Y30 カートリッジ、Amicon）により１００mlの容量
まで濃縮した。この溶液に、ｐＨ６でガドリニウムとニ
トリロトリ酢酸の錯体の０．６M 溶液１０mlを加え、１
時間平衡化させ、その後ｐＨ８のホウ酸緩衝液で２リッ
トルまで希釈し、限外濾過により再び１００mlに濃縮し
た。

【００１４】得られた化合物は、アルブミン分子当たり
約２５Ｇｄ−ＤＴＰＡ残基を含んでいる。この割合を更
に増大させるために、錯体結合物の溶液は、上述したよ
うにＮ−スクシンイミドエステルで再び処理され、上述
した精製及び錯体化方法に再び付した。錯体化の後、こ
の化合物は最終的には、Sepahacryl S-200 HR カラム
（６５cm×９cm径）上での０．１５M ＮａＣｌでの溶離
による立体排除クロマトグラフィーにより精製された。
このクロマトグラフィーは、また二量体及び市販のＢＳ
Ａに初めから存在する集合体の部分から化合物を精製
し、それによりタンパク質分子（ＢＳＡのアミノ基当た
り６０アミノ基の７５％）当たり４５Ｇｄ−ＤＴＰＡ残
基を有する結合物を提供し、それはクロマトグラフィー
的に均一であり、架橋を含まず、Ｇｄ−ＤＴＰＡを含ま
ない。

【００１５】置換度の決定は、蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）及び
２８０nm(^e２８０nm＝０．６６L・g^-1・cm^-1）でそれぞれ
分光分析的に決定されたタンパク質のそれに対するガド
リニウム濃度を参照して実施された。

【００１６】

【表１】

【００１７】実施例２：他のタンパク質とＧｄ−ＤＴＰ
Ａの結合物の調製 同一の方法に従い、Ｇｄ−ＤＴＰＡはブタインスリン、
ウマチトクロームＣ、ウマミオグロビンと結合し、３、
１３及び１２Ｇｄ−ＤＴＰＡ残基類／タンパク質を含
む、それぞれ１００％、６８％及び６０％アミノ基置換
（表２参照）の結合物を得た。

【００１８】

【表２】

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分子類／マクロ分子類のアミノ基類とポ
   リアミノポリカルボン酸キレート化剤類との結合のため
   の方法であって、 ａ）そのＮ−スクシンイミドエステルのような反応性エ
   ステルの生成による、該キレート化剤類の活性化の工
   程； ｂ）該反応性エステルと、官能基化するための分子類の
   アミノ基類との結合工程； ｃ）未反応キレート化剤の除去工程、及び工程ｂ）から
   の結合物の金属錯体の形成工程； ｄ）該金属錯体と、工程ａ）の反応性キレート化剤との
   反応工程；並びに ｅ）未反応キレート化剤の除去工程、及び工程ｃ）と同
   様の、金属イオンとの第二の錯体化工程を含むことを特
   徴とする方法。
2. 【請求項２】 工程ａ）を、非プロトン溶媒中で、脱水
   剤の存在下、場合により有機塩基の存在下に、ポリアミ
   ノポリカルボン酸キレート化剤とＮ−ヒドロキシスクシ
   ンイミドとを縮合させることにより実施する、請求項１
   記載の方法。
3. 【請求項３】 工程ｂ）を、水性媒体中、６〜１０のｐ
   Ｈで、官能基化するための分子のアミノ基類の数に対
   し、反応性キレート化剤の過剰のモル当量の存在下に行
   う、請求項１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】 工程ｃ）を、膜を用いる方法及び／又は
   クロマトグラフィーにより、不純物、副生物及び過剰な
   試薬を先ず除き、次いで得られた結合物を金属イオン又
   はその塩と反応させて実施する、請求項１〜３のいずれ
   か１項記載の方法。
5. 【請求項５】 工程ｄ）を、錯体結合物の未だ遊離のア
   ミノ基類と反応性キレート化剤の過剰モル当量とを上述
   の条件下に反応させて実施する、請求項１〜４のいずれ
   か１項記載の方法。
6. 【請求項６】 工程ｅ）を、請求項４記載の工程と同様
   に実施する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 【請求項７】 脱水剤が、ジシクロヘキシルカルボジイ
   ミドであり、非プロトン性溶媒が、アセトニトリル、ジ
   メチルスルホキシド及びジメチルホルムアミドの群から
   選択される、請求項２記載の方法。
8. 【請求項８】 キレート化剤の反応性エステルが、アミ
   ノ基類に対して５〜２５０モル当量の過剰であり、ｐＨ
   が、ＮａＯＨの添加により６〜１０に維持され、反応時
   間が、エステル添加の終了から１〜４８時間であり、そ
   して温度が１５〜４０℃に維持される、請求項３記載の
   方法。
9. 【請求項９】 不純物、副生物及び過剰の試薬を、透析
   若しくは限外濾過、イオン交換若しくは立体排除クロマ
   トグラフィー、又はこれらの方法の組み合わせにより除
   去する、請求項４記載の方法。
10. 【請求項１０】 ポリアミノポリカルボン酸キレート化
    剤が、ＤＴＰＡ及ＤＯＴＡから選択される、請求項４記
    載の方法。
11. 【請求項１１】 ポリアミンマクロ分子が、ウシ血清ア
    ルブミン、インスリン、チトクロームＣ、ミヨグロビ
    ン、デンドリマー類及びポリリシン類から選択される、
    請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 【請求項１２】 金属イオンが、Ｆｅ⁽²⁺⁾、Ｆｅ⁽³⁺⁾、
    Ｃｕ⁽²⁺⁾、Ｃｒ⁽³⁺⁾、Ｇｄ⁽³⁺⁾、Ｅｕ⁽³⁺⁾、Ｄｙ⁽³⁺⁾、
    Ｌａ⁽³⁺⁾、Ｙｂ⁽³⁺⁾若しくはＭｎ⁽²⁺⁾又は以下の放射性
    元素類：⁵¹Ｃｒ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、¹¹¹Iｎ、 ^99mＴｃ、
    ¹⁴⁰Ｌａ、 ¹⁷⁵Ｙｂ、 ¹⁵³Ｓｍ、 ¹⁶⁶Ｈｏ、⁹⁰Ｙ、 ¹⁴⁹
    Ｐｍ、 ¹⁷⁷Ｌｕ、⁴⁷Ｓｃ、 ¹⁴²Ｐｒ、¹⁵⁹Ｇｄ、若しく
    は ²¹²Ｂｉである、請求項１〜１１のいずれか１項記載
    の方法。
13. 【請求項１３】 キレート化剤残基／アミノ基類が、高
    い比を有する、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方
    法により得た金属錯体結合物。
14. 【請求項１４】 キレート化剤残基／アミノ基類の比
    が、少なくとも５０％の全置換度であることを特徴とす
    る、請求項１３記載の金属錯体結合物。
15. 【請求項１５】 コントラスト剤として、請求項１３又
    は１４記載の錯体結合物の少なくとも１種を含む、診断
    的医薬組成物。