JP2017503475A - アミロイドβを指向するラクダ科動物単一ドメイン抗体及びその接合体を製造する方法 - Google Patents
アミロイドβを指向するラクダ科動物単一ドメイン抗体及びその接合体を製造する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017503475A JP2017503475A JP2016530013A JP2016530013A JP2017503475A JP 2017503475 A JP2017503475 A JP 2017503475A JP 2016530013 A JP2016530013 A JP 2016530013A JP 2016530013 A JP2016530013 A JP 2016530013A JP 2017503475 A JP2017503475 A JP 2017503475A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vhh
- amyloid
- r3vq
- interest
- substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 title 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 117
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 91
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 73
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 56
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 39
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 37
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 26
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 26
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 26
- -1 p-isothiocyanatobenzyl Chemical group 0.000 claims description 26
- 239000002616 MRI contrast agent Substances 0.000 claims description 23
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 21
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 claims description 20
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 claims description 17
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000011572 manganese Substances 0.000 claims description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 13
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 claims description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 12
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 10
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 8
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 8
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 8
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- SNUSZUYTMHKCPM-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxypyridin-2-one Chemical compound ON1C=CC=CC1=O SNUSZUYTMHKCPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tetramine Chemical compound NCCNCCNCCN VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052692 Dysprosium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 6
- KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N dysprosium atom Chemical compound [Dy] KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 6
- 229960001124 trientine Drugs 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 5
- PWBYYTXZCUZPRD-UHFFFAOYSA-N iron platinum Chemical compound [Fe][Pt][Pt] PWBYYTXZCUZPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 5
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- JLVSRWOIZZXQAD-UHFFFAOYSA-N 2,3-disulfanylpropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(S)CS JLVSRWOIZZXQAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940006190 2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid Drugs 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- VVNCNSJFMMFHPL-VKHMYHEASA-N D-penicillamine Chemical compound CC(C)(S)[C@@H](N)C(O)=O VVNCNSJFMMFHPL-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 3
- ZKKLPDLKUGTPME-UHFFFAOYSA-N diazanium;bis(sulfanylidene)molybdenum;sulfanide Chemical compound [NH4+].[NH4+].[SH-].[SH-].S=[Mo]=S ZKKLPDLKUGTPME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WQABCVAJNWAXTE-UHFFFAOYSA-N dimercaprol Chemical compound OCC(S)CS WQABCVAJNWAXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 claims description 3
- ACTRVOBWPAIOHC-UHFFFAOYSA-N succimer Chemical compound OC(=O)C(S)C(S)C(O)=O ACTRVOBWPAIOHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ACTRVOBWPAIOHC-XIXRPRMCSA-N succimer Chemical compound OC(=O)[C@@H](S)[C@@H](S)C(O)=O ACTRVOBWPAIOHC-XIXRPRMCSA-N 0.000 claims description 3
- CXVCSRUYMINUSF-UHFFFAOYSA-N tetrathiomolybdate(2-) Chemical compound [S-][Mo]([S-])(=S)=S CXVCSRUYMINUSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 claims description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001430 anti-depressive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002555 anti-neurodegenerative effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 claims description 2
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 claims description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 claims description 2
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 claims 1
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 claims 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 abstract description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 72
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 66
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 52
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 42
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 42
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 41
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 41
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 39
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 39
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 37
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 35
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 34
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 30
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 29
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 22
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 20
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 20
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 18
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 17
- 108010064397 amyloid beta-protein (1-40) Proteins 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 15
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 13
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 12
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 12
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 11
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 11
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 11
- 101800001718 Amyloid-beta protein Proteins 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 10
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 10
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 10
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 10
- 208000005145 Cerebral amyloid angiopathy Diseases 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 9
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 9
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 9
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 7
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 7
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 7
- 108010091867 peptide P Proteins 0.000 description 7
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 7
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 6
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 5
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 5
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 5
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 4
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 4
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 4
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 210000005153 frontal cortex Anatomy 0.000 description 4
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 4
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 4
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100203212 Rattus norvegicus Shh gene Proteins 0.000 description 3
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 3
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000013980 iron oxide Nutrition 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000009206 nuclear medicine Methods 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 3
- FCEHBMOGCRZNNI-UHFFFAOYSA-N 1-benzothiophene Chemical compound C1=CC=C2SC=CC2=C1 FCEHBMOGCRZNNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QEQDLKUMPUDNPG-UHFFFAOYSA-N 2-(7-amino-4-methyl-2-oxochromen-3-yl)acetic acid Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C(CC(O)=O)=C2C QEQDLKUMPUDNPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGSBYAPMABPOJP-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(sulfanyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCC(S)S NGSBYAPMABPOJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 6-Maleimidocaproic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 2
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 2
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 206010051290 Central nervous system lesion Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 108700022150 Designed Ankyrin Repeat Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 238000012879 PET imaging Methods 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N Pyrazine Chemical compound C1=CN=CC=N1 KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000399119 Spio Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC=NC2=C1 IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;molecular oxygen Chemical compound O=O.O=C=O UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 2
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical compound C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 230000027928 long-term synaptic potentiation Effects 0.000 description 2
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 125000006353 oxyethylene group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 2
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N quinoxaline Chemical compound N1=CC=NC2=CC=CC=C21 XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 2
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- GKJWHLDKQULMHJ-PZMWFESPSA-N (2r)-4-(1-adamantyl)-n-[2-[4-[4-amino-3-[4-phenoxy-3-(prop-2-enoylamino)phenyl]pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl]piperidin-1-yl]ethyl]-2-methylbutanamide Chemical compound O=C([C@@H](CCC12CC3CC(CC(C3)C1)C2)C)NCCN(CC1)CCC1N(C1=NC=NC(N)=C11)N=C1C(C=C1NC(=O)C=C)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 GKJWHLDKQULMHJ-PZMWFESPSA-N 0.000 description 1
- KTZQTRPPVKQPFO-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzoxazole Chemical compound C1=CC=C2C=NOC2=C1 KTZQTRPPVKQPFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCMCBBGGLRIHSE-UHFFFAOYSA-N 1,3-benzoxazole Chemical compound C1=CC=C2OC=NC2=C1 BCMCBBGGLRIHSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001637 1-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(*)=C([H])C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 1H-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC=NC2=C1 HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003287 1H-imidazol-4-ylmethyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[*])=C1[H] 0.000 description 1
- BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 1H-indazole Chemical compound C1=CC=C2C=NNC2=C1 BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUTDIWAXETZSGJ-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7-bis(carboxymethyl)-10-[2-[2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethylamino]-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetic acid Chemical compound C1CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CCN1CC(=O)NCCN1C(=O)C=CC1=O AUTDIWAXETZSGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 2-amino-9-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purine-6-thione Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=S)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- UXGVMFHEKMGWMA-UHFFFAOYSA-N 2-benzofuran Chemical compound C1=CC=CC2=COC=C21 UXGVMFHEKMGWMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYTMVABTDYMBQK-UHFFFAOYSA-N 2-benzothiophene Chemical compound C1=CC=CC2=CSC=C21 LYTMVABTDYMBQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001622 2-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C(*)C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 2H-isoindole Chemical compound C1=CC=CC2=CNC=C21 VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUDPTGPSBJVHCN-CHUNWDLHSA-N 4-methylumbelliferyl alpha-D-galactoside Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YUDPTGPSBJVHCN-CHUNWDLHSA-N 0.000 description 1
- YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 4-methylumbelliferyl beta-D-galactoside Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- DBTMQODRSDEGRZ-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-(2-oxoethyl)carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 DBTMQODRSDEGRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100040344 Allograft inflammatory factor 1-like Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 230000007082 Aβ accumulation Effects 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- OELDIVRKHTYFNG-WDSKDSINSA-N Cys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS OELDIVRKHTYFNG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100034004 Gamma-adducin Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003638 Glucose-6-Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010086800 Glucose-6-Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101000890921 Homo sapiens Allograft inflammatory factor 1-like Proteins 0.000 description 1
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000799011 Homo sapiens Gamma-adducin Proteins 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001744 Polyaldehyde Polymers 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical compound C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CNC=N1 Chemical compound [N].C1=CNC=N1 GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000003647 acryloyl group Chemical group O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- RFRXIWQYSOIBDI-UHFFFAOYSA-N benzarone Chemical compound CCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(O)C=C1 RFRXIWQYSOIBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004781 brain capillary Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 150000001923 cyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O diazynium Chemical compound [NH+]#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001353 entorhinal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- RYHQMKVRYNEBNJ-BMWGJIJESA-K gadoterate meglumine Chemical compound [Gd+3].CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.OC(=O)CN1CCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC1 RYHQMKVRYNEBNJ-BMWGJIJESA-K 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 210000001879 hippocampal ca1 region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010978 in-process monitoring Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002497 iodine compounds Chemical class 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M iodine-131(1-) Chemical compound [131I-] XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N iron(2+);oxygen(2-) Chemical class [O-2].[Fe+2] VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000555 isopropenyl group Chemical group [H]\C([H])=C(\*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N isothiazole Chemical compound C=1C=NSC=1 ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N isoxazole Chemical compound C=1C=NOC=1 CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 150000002668 lysine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960003194 meglumine Drugs 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M methacrylate group Chemical group C(C(=C)C)(=O)[O-] CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003544 oxime group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RVZRBWKZFJCCIB-UHFFFAOYSA-N perfluorotributylamine Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)N(C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F RVZRBWKZFJCCIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013439 planning Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 125000004368 propenyl group Chemical group C(=CC)* 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 125000001725 pyrenyl group Chemical group 0.000 description 1
- PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N pyridazine Chemical compound C1=CC=NN=C1 PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N quinazoline Chemical compound N1=CN=CC2=CC=CC=C21 JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PNGLEYLFMHGIQO-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3-methoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(OC)=C1 PNGLEYLFMHGIQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000034005 thiol-disulfide exchange Effects 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYNNSCRYTDRFCP-UHFFFAOYSA-N triazene Chemical compound NN=N AYNNSCRYTDRFCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0058—Antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/101—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals
- A61K49/106—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being cyclic, e.g. DOTA
- A61K49/108—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being cyclic, e.g. DOTA the metal complex being Gd-DOTA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
- A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
- A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2821—Alzheimer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/38—Pediatrics
- G01N2800/385—Congenital anomalies
- G01N2800/387—Down syndrome; Trisomy 18; Trisomy 13
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
Abstract
Description
アミロイド沈着は血管病変(アミロイド血管症)にも関連付けることができる。アミロイドは、他の疾患、例えばダウン症候群の過程で同様な形態で蓄積する。
より一般的にいえば、少なくとも8.5の等電点を有するVHHは、マイクロピノサイトーシス及び吸着介在型エンドサイトーシスにより、BBBを横切って移動することが可能である。このVHHは、哺乳動物の血液脳関門を横切る興味対象の物質の送達用ペプチドベクターの製造に使用することができる(国際出願WO 2009/004495及びWO 2010/004432)。
Nabuurs R.J.A.ら(2012, PLoS One, 7:e38284)は、Rutgersらが開示した2つのVHH、すなわちVHH ni3A及びpa2Hをインビボで更に特徴決定した。著者らは、Rutgersらの報告に反して、両VHHが実質性アミロイドβ沈着物及び血管性アミロイドβ沈着物に親和性を示すことを見出した。事実、Rutgers K.S.らは、ヒト組織についての免疫組織化学で、ni3Aが血管性アミロイドβのみを特異的に標的すると報告した。Nabuurs R.J.A.らは更に、VHH ni3A及びpa2Hは脳取込みが低く過ぎてインビボ画像化に使用できないと報告している。
VHH R3VQまた、インビボで、哺乳動物の非障害(non-compromised)血液脳関門を横断することができる。
− 第一のストラテジは、非部位特異的アプローチを利用し、キレート剤(例えば、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA))と本発明に従うVHH又はVHH誘導体のリジン残基との接合工程、続いて、得られたリガンドと興味対象の物質(例えば、常磁性体ガドリニウム(Gd)のようなMRI造影剤)とのキレート化工程を含んでなるものであった。IHC及びMRIによりインビボで評価すると、R3VQ-N-(DOTA/Gd)n'接合体(図9、化合物2)は、マウスにおいて脳血管内注射後にアミロイド斑を認識することができた。
− 第二のストラテジは、部位特異的アプローチを利用し、興味対象の物質を保持するチオール反応性化合物、好ましくは興味対象の物質を保持するマレイミド化合物とのチオ付加(接合工程)によるVHH R3VQの接合体化、より一般的にはC末端又はN末端にシステイン残基を含む任意のVHHの標識化を含むものであった。
1つの好適な実施形態において、前記VHHは、以下:
− 配列番号4(完全長形態のR3VQに相当)、
− 配列番号5(完全長形態のR3VEに相当)、
− 配列番号6(短形態のR3VQに相当)、及び
− 配列番号7(短形態のR3VEに相当)
からなる群より選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号4及び配列番号6からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、又は該アミノ酸配列からなる。
本明細書で使用する場合、用語「VHH」とは、ラクダ科動物(ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカなど)の重鎖抗体からの可変抗原結合ドメインをいう(Nguyen V.K.ら, 2000, The EMBO Journal, 19, 921-930;Muyldermans S., 2001, J Biotechnol., 74, 277-302及びVanlandschoot P.ら, 2011, Antiviral Research 92, 389-407の概説を参照)。VHHはナノボディ(Nb)とも呼ぶことができる。
本発明は、天然、組換え又は合成の上記のとおりのVHHを包含する。
本明細書で使用する場合、用語「組換え」とは、遺伝子操作法(クローニング、増幅)を用いて前記VHHを作製することをいう。
本明細書で使用する場合、用語「合成」とは、インビトロでの化学的又は酵素的合成による前記VHHの作製をいう。
本発明に従うVHHは、単量体又はホモ多量体(例えば、ホモ二量体又はホモ三量体)の形態であることができる。
本発明はまた、本発明に従うVHHを含んでなる単離されたラクダ科動物血清、好ましくはアルパカ血清を提供する。
(式中、
− Pは還元型システイン残基を有しない8〜800アミノ酸ペプチドであり、
− Cはシステイン残基であり、
− Zは1〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは1〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサーを表し、ここで、Zのアミノ酸残基は同一であるか又は異なり、Zはシステイン残基を含有しない)
のオリゴペプチド、好ましくはP-C-Zのオリゴペプチドを提供する。
有利には、アミノ酸スペーサーZのアミノ酸残基は、アラニン、バリン、セリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より、好ましくはアラニン、バリン及びセリンからなる群より選択される。
(式中:
− Pは還元型システイン残基を有しない8〜800アミノ酸ペプチドであり、
− Cはシステイン残基であり、
− Zは
a)2〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは2アミノ酸スペーサーを表す(ここで、Zのアミノ酸残基は、セリン(S)、アラニン(A)、バリン(V)及びグリシン(G)からなる群より、より好ましくはセリン(S)、アラニン(A)及びバリン(V)からなる群より選択され、Zの少なくとも2つのアミノ酸残基は異なる)か、又は
b)2〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは2〜10の中性又は負荷電アミノ酸スペーサーを表す(ここで、Zはジペプチド セリン-アラニン(S-A)又はセリン-バリン(S-V)を含んでなり、Zはシステイン残基を含有しない))
を有し、好ましくは式P-C-Zを有する。
有利には、Zがa)に定義されるものである場合、アミノ酸スペーサーZは、1つ又は少なくとも1つのセリンを含んでなる。
有利には、Zがa)に定義されるものである場合、アミノ酸スペーサーZは、セリン及びアラニン残基のみから本質的になるか、セリン及びバリン残基のみから本質的になる。
本オリゴペプチドの1つの好適な実施形態において、アミノ酸スペーサーZは2アミノ酸の配列、例えば、アミノ酸配列S-A又はS-Vからなる。
アミノ酸ペプチドPはまた、より好ましくなる順に、50〜800、100〜800、100〜700、100〜500、100〜400、100〜300又は100〜250アミノ酸ペプチドであることができる。
有利には、アミノ酸ペプチドPは、抗原に選択的に結合することができるペプチドP'を含んでなるか又はペプチドP'からなる。P'は、好ましくは、ラクダ科動物重鎖抗体の可変ドメイン(VHH)、従来型抗体のFabフラグメント、従来型抗体のF(ab)'2フラグメント、従来型抗体のFvフラグメント、従来型抗体のscFvフラグメント、イムノグロブリン新規抗原レセプター(IgNAR)、ナノフィチン、DARPin、アンチカリン、アフィボディー、アフィリン、アビマー、モノボディー及びクニッツドメインからなる群より選択される。
1つの好適な実施形態において、P'はVHH、例えば本発明に従うVHHである。
式P-C-Zのオリゴペプチドのアミノ酸ペプチドPは、そのC末端に、1〜10アミノ酸スペーサーY、好ましくは1〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサー(ここで、前記アミノ酸スペーサーYのアミノ酸残基は同一か又は異なり、前記アミノ酸スペーサーYはシステイン残基を含有しない)を有することができる。
有利には、アミノ酸スペーサーYのアミノ酸残基は、アラニン、バリン、セリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より、好ましくはアラニン、バリン、セリン及びグリシンからなる群より選択される。
好ましくは、アミノ酸スペーサーYは、4つの中性アミノ酸のスペーサー、例えばアミノ酸配列G-G-G-S(配列番号11)を表す。
式Z-C-Pのオリゴペプチドのアミノ酸ペプチドPはまた、そのC末端に、1〜50アミノ酸配列X(ここで、前記アミノ酸配列Xのアミノ酸残基は同一か又は異なり、前記アミノ酸配列Xはシステイン残基を含有しない)を有することができる。
アミノ酸配列Xは、タグ、例えば6×Hisタグ(配列番号9)、及び酵素切断部位、例えばアミノ酸配列LVPRGS(配列番号10)のトロンビン切断部位を含んでなることができる。
1つの好適な実施形態において、本発明に従うオリゴペプチドは、式P'-C-Z、P'-Y-C-Z、X-P'-C-Z、X-P'-Y-C-Z、Z-C-P'、Z-C-Y-P'、Z-C-P'-X又はZ-C-Y-P'-X(ここで、P'は好ましくはVHH、例えば本発明に従うVHHである)を有する。
1つの特定の実施形態において、前記VHH誘導体は、N末端からC末端へ、アミノ酸タグ、例えば6×Hisタグ、酵素切断部位、例えばトロンビン切断部位、VHH、アミノ酸スペーサー、システイン及び第2のアミノ酸スペーサーを含んでなる。このVHH誘導体は、式X-P'-Y-C-Z(式中、P'はVHHである)を有する本発明に従うオリゴペプチドに相当する。
1つの好適な実施形態において、前記VHH誘導体は配列番号8のアミノ酸配列を有する(R3VQ-SH)。
本発明に従うVHH誘導体をコードするポリヌクレオチドの一例は、配列番号17の配列(R3VQ-SHをコードするヌクレオチド配列)である。
本発明に従うポリヌクレオチドは、組換えDNA技術及び/又は化学的DNA合成の周知の方法により取得してもよい。
本発明はまた、本発明に従うポリヌクレオチドを、宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの転写の調節を可能とする転写プロモーターの制御下に含んでなる組換え発現カセットを提供する。前記ポリヌクレオチドはまた、宿主細胞におけるその翻訳の調節を可能にする適切な制御配列に連結され得る。
本発明はまた、本発明に従うポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター(例えば、組換え発現ベクター)を提供する。有利には、前記組換えベクターは、本発明に従う発現カセットを含んでなる組換え発現ベクターである。
本発明はまた、本発明に従う組換え発現カセット又は組換えベクターを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核生物又は真核生物宿主細胞である。
用語「宿主細胞」とは、外因性核酸が導入された細胞をいい、当該細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、形質転換細胞には、初代形質転換細胞、及び継代数にかかわらず初代形質転換細胞から誘導された子孫が含まれる。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。最初の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫もまた含まれる。
配列番号8のアミノ酸配列のVHH R3VQ-SHを発現する真核生物宿主細胞を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM;28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)に番号I-4819で2013年11月12日に寄託した。
− 本発明に従う組換え発現カセット又は組換えベクターを含有する宿主細胞を準備する工程、
− 前記宿主細胞を培養する工程、
− 及び任意に、式P-C-Z又はZ-C-Pのオリゴペプチドを精製する工程
を含んでなる方法を提供する。
オリゴペプチドを精製する方法は当該分野において周知であり、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー)である。
本発明に従う興味対象の物質は、哺乳動物又はヒトの血液脳関門を透過してもしなくてもよい。興味対象の物質が血液脳関門を透過する場合、本発明に従うVHH、VHH誘導体又はオリゴペプチドの使用により、血液脳関門を横切る前記興味対象の物質の送達を増強させることができる。
1つの実施形態において、前記興味対象の物質は診断又は治療用化合物である。
別の1つの実施形態において、前記興味対象の物質は、診断又は治療用化合物を含んでなるリポソーム又はポリマー性物質である(A. J. L. Villarazaら, Chem Rev. 2010, 110, 2921-2959)。
- 酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ又はβ-ガラクトシダーゼ;
- 蛍光体、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、紫外(UV)領域の波長で励起される青色蛍光色素(例えば、AMCA(7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸);Alexa Fluor(登録商標) 350)、青色光で励起される緑色蛍光色素(例えば、FITC、Cy2、Alexa Fluor(登録商標) 488)、緑色光で励起される赤色蛍光色素(例えば、ローダミン、Texas Red、Cy3、Alexa Fluor(登録商標) 色素546、564及び594)、又は近赤外光で励起される色素(例えば、Cy5)(これらは電子検出器(CCDカメラ、光電子増倍管)で可視化される);
- 放射性同位体、例えば、PET撮像法に使用することができる18F、11C、13N、15O、68Ga、82Rb、44Sc、64Cu、86Y、89Zr、124I、152Tb、又はSPECT/シンチグラフィー研究に使用することができる67Ga、81mKr、99mTc、111In、123I、125I、133Xe、201Tl、155Tb、195mPt、又はオートラジオグラフィー若しくはインサイチュハイブリダイゼーションに使用することができる14C、3H、35S、32P、125I、又は化合物の標識に使用することができる211At-、212Bi-、75Br-、76Br-、131I-、111In、177Lu-、212Pb-、186Re-、188Re-、153Sm-、 90 Y;
- NMR又はMRI造影剤、例えば、常磁性体ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、及び酸化鉄(例えば、MION、SPIO又はUSPIO)又は鉄白金(SIPP)をベースにする超常磁性体、及びX核、例えば、18F、13C、23Na、17O、15N;
- ナノ粒子、例えば、金ナノ粒子(B. Van de Broekら, ACSNano, Vol. 5, No. 6, 4319-4328, 2011)又は量子ドット(A. Sukhanovaら, Nanomedicine, 8 (2012) 516-525)
からなる群より選択される。
診断薬は、検出に使用される場合、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば99Tc若しくは123I、又は核磁気共鳴(NMR)撮像(MRIとしても知られる)用のスピン標識、例えば、13C、9F、Fe、Gd、123I、111In、Mn、15N若しくは7Oを含んでなってもよい。
有利には、前記治療用化合物は、ペプチド、酵素、核酸、ウイルス及び化学物質から選択される。前記治療用化合物は、鎮痛化合物、抗炎症化合物、抗抑うつ化合物、抗痙攣化合物、細胞毒性化合物又は抗神経変性化合物であることができる。
上記の興味対象の物質は、本発明に従うVHH、VHH誘導体又はオリゴペプチドに、該VHH、VHH誘導体若しくはオリゴペプチドの一方の末端部(N末端又はC末端)で又は該VHH、VHH誘導体若しくはオリゴペプチドの1つのアミノ酸の側鎖で、共有結合的又は非共有結合的に直接結合することができる。興味対象の物質はまた、前記VHH又はVHH誘導体に、該VHH若しくはVHH誘導体の一方の末端部で又は該VHH若しくはVHH誘導体の1つのアミノ酸の側鎖で、スペーサーにより間接的に、共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。ペプチド(特に抗体)に興味対象の物質を結合する方法は当該分野において公知である(例えば、TERNYNCK and AVRAMEAS, 1987, 「Techniques immunoenzymatiques」 Ed. INSERM, Paris又はG.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2010, Academic Pressを参照)。
本発明に従うVHH、VHH誘導体又はオリゴペプチドは、当該分野に公知である一般的な有機化学技法を使用して、特定の放射性同位体、NMR若しくはMRI造影剤、蛍光体、ナノ粒子、又は酵素で標識してもよい。例えば、March, J. ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISMS, AND STRUCTURE (第3版, 1985)又はG.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2010, Academic Pressを参照。
具体的には、本発明に従うVHH、VHH誘導体又はオリゴペプチドは、当該分野に公知の幾つかの技法のいずれかにより、SPECT用に123Iで標識することができる。例えば、Kulkarni, 1991, Int. J. Rad. Appl. & Inst. (Part B) 18:647を参照。
本発明はまた、興味対象の物質と直接又は間接にカップリングされた本発明に従うVHH又はVHH誘導体(機能的接合体)を取得するためのカップリング方法に関する。
第1のストラテジによれば、本発明に従うVHH又はVHH誘導体は、非部位特異的アプローチを用いて興味対象の物質に接合される。前記非部位特異的方法は、興味対象の物質と本発明に従うVHH又はVHH誘導体との接合工程を含んでなる。
(i)エステル又は無水物の形態、好ましくはエステルの形態の活性化されたキレート剤を、本発明に従うVHH又はVHH誘導体のリジン残基と接合する工程、及び
(ii)工程(i)のリガンドを興味対象の物質でキレート化する工程
が含まれる。
(i')興味対象の物質を、エステル又は無水物の形態、好ましくはエステルの形態の活性化されたキレート剤でキレート化する工程、及び
(ii')工程(i')の予備キレート化した興味対象の物質を、本発明に従うVHH又はVHH誘導体のリジン残基と接合する工程
を含んでなる。
接合工程(i)又は(ii')の間、温度は、1℃から40℃まで、好ましくは4℃から20℃まで変化してもよい。溶液は1〜6時間撹拌してもよい。好ましくは、pHは接合工程(i)又は(ii')の間、7〜8.5の間で維持する。
接合工程(i)又は(ii')の間、エステル又は無水物の形態の活性化されたキレート剤は、緩衝液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)溶液に溶解してもよい。1つの好適な実施形態において、エステル又は無水物の形態の活性化されたキレート剤とVHH又はVHH誘導体のリジン残基のアミノ官能基との間のモル比は、1〜10の範囲であり、好ましくは4である。
接合工程(i)とキレート化工程(ii)との間、又はキレート化工程(i')と接合工程(ii')との間に、透析濾過又は透析による緩衝液交換工程が存在してもよい。有利には、溶液は、例えばVivaspinTMデバイスを用いて、透析濾過される。この緩衝液交換工程の間、媒体は1〜5℃の範囲の温度で冷却される。この緩衝液交換工程の間、緩衝液は、例えば酢酸ナトリウム溶液と、好ましくは0〜6時間、より好ましくは2〜3時間の撹拌下で、交換される。
キレート化工程(ii)又は(i')の間、溶液を1〜4時間、好ましくは2〜3時間撹拌する。キレート化工程は、好ましくは1〜60℃、より好ましくは4℃で行う。
リジン数に依存して、VHH又はVHH誘導体あたりの興味対象の物質の平均密度は、0〜(リジン数+1)の間で変化してもよい。好ましくは、VHH又はVHH誘導体あたりの興味対象の物質の平均密度は、0〜5の間で変化してもよい。
本発明に従う非部位特異的方法は、本発明に従うVHH及びVHH誘導体に適用でき、その範囲を他のVHHにまで拡げることができる。
− 標識オリゴペプチドは化学的に規定されている。なぜならば、本方法により、ヒト使用の観点(品質管理、安全性など)で必須の特徴である十分に規定された接合体が得られるからである。
− この方法は容易で標準である。なぜならば、興味対象の物質でのオリゴペプチドの標識は、短い反応時間で単純な手順による単一工程で実施することができるからである。工程中のモニタリングの必要がなく、標識の程度と結合性との間での妥協の必要もない。これらは、更なる最適化、実験再現性及び製造規模拡大のための鍵となる利点である。
− この方法は、最終サンプルにおいて、オリゴペプチドの鍵となる特性に影響しない:例えば、PがVHHを含んでなるか又はVHHからなる場合、接合体のpIは、BBB横断を可能にするはずである8.5を超えて維持される。更に、標的に関して接合体と競合し得る非標識オリゴペプチドが残存しない;生理学的pHでの短い反応時間という温和な条件は、オリゴペプチドを、起こり得る変性及び/又は活性喪失から保護する。
− この方法は融通が利く。なぜならば、この方法によれば、種々のオリゴペプチドと造影剤又は他の興味対象の分子とを別々に製造し、その後単一工程で組み合わせることができる柔軟なモジュール型アプローチが可能となるからである。その結果、接合体のセットについて、最適化並びにIHC及びMRIによる川下評価を容易に行うことができる。
及びとりわけ
− この方法により、VHHのリジン又はヒスチジンに対する副反応なしで、かつ、VHHの機能及び3D構造を全体的に維持しつつ、反応工程数を減少させることができる一方、全体収率が改善する。
部位特異的方法の1つの好適な実施形態において、接合工程は、本発明に従うオリゴペプチドと該興味対象の物質を有するチオール反応性化合物との間で行う。
有利には、興味対象の物質を有するチオール反応性化合物は、マレイミド化合物、好ましくは、下記の式(I)又は(I')のマレイミド化合物である。
オリゴペプチドのシステインとチオール反応性化合物との間でのチオ付加は、0〜20℃の範囲の温度、好ましくは4℃で、例えば2〜4時間行うことができる。
オリゴペプチドのシステインとチオール反応性化合物(例えば、下記の式(I)又は(I')のマレイミド化合物)との間でのチオ付加は、好ましくは4〜7.5の範囲のpH、より好ましくはpH6.8で行われる。pHが4未満であれば、反応は進行せず、7.5を超えると、反応は非特異的となる(リジンに反応する)。pHを調整するため、接合工程(i)又は(ii')は、イミダゾールを含むか又は含まないPBS/NaCl中、好ましくはイミダゾールの存在下に行うことができる。精製カラムから直接溶出したタンパク質へのマレイミド化合物のチオ付加のための特異条件を同定することにより、驚くべきことに、工程数の減少及びプロセス全体収率の向上が可能になる。
その後、透析濾過又は透析による緩衝液交換工程が存在してもよい。有利には、溶液は、例えばVivaspinTMデバイスを用いて、透析濾過される。次いで、溶液は、同じ方法(透析濾過)により濃縮されてもよい。
非特異的方法であっても、特異的方法であっても、興味対象の物質は上記のとおりであり得る。
1つの好適な実施形態によれば、興味対象の物質は、上記のとおりの治療用又は診断用化合物、好ましくは、上記のとおりの蛍光体、放射性同位体及びNMR又はMRI造影剤からなる群より選択される診断用化合物である。
本発明者らは、興味対象の物質がNMR又はMRI造影剤である場合、合成した接合体が非標識VHHの重要な機能的特性を保持することを観察した。
1つの好適な実施形態によれば、興味対象の物質は、NMR又はMRI造影剤、例えば、常磁性体ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、酸化鉄(例えば、MION、SPIO、USPIO)又は鉄白金(SIPP)をベースにする超常磁性体、及びX核、例えば、18F、13C、23Na、17O、15Nである。より好ましくは、興味対象の物質は、常磁性体ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)から選択されるNMR又はMRI造影剤である。
興味対象の物質がガドリニウムである場合、DOTAが好ましいキレート剤である。
本発明に関して、チオール反応性化合物は、マレイミド、ハロアセチル、アルキルハライド若しくはアジリジン化合物、アクリロイル誘導体、アリール化剤、又はチオール-ジスルフィド交換試薬(Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson, 2010, Academic Press)である。
本発明に関して、マレイミド化合物は、少なくとも1つのマレイミド官能基、好ましくは1〜6のマレイミド官能基、より好ましくは1つのマレイミド官能基を有する化合物である。
好ましくは、チオール反応性化合物は、マレイミド官能基のC-C二重結合を介してシステイン残基Cと反応するマレイミド化合物である。
− B、B'1、B'2及びB”は、同一か又は異なって、独立して、単結合、又はポリオール(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、好ましくは2〜12のオキシエチレン(OE)単位を有するもの)、ポリオレフィン(好ましくは、2〜12の芳香環を有するもの)、ポリアルキル(好ましくは、2〜12の炭素原子を有するもの)、ビニルポリマー(例えば、ポリ(アルキルメタクリレート)、好ましくは2〜12のメタクリレート基を有するもの)、ポリアルデヒド(好ましくは、2〜12のカルボニル基を有するもの)、ポリ酸エステル(好ましくは2〜12のエステル基を有するもの)から選択されるスペーサーであり、
− D、D'及びD”は、同一か又は異なって、独立して、アミン、アミド、アミノアルコール、尿素、チオ尿素、カルバメート、カルボネート、エステル、エーテル、チオエーテル、アリール、ヘテロアリール(例えば、トリアゾール)、オキシム基から選択され、
− Aは単結合又はキレート剤であり、
− SIは興味対象の物質であり、
− X'は、酸、アミン、アミド、エステル、エーテル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール官能基であり、
− n=1〜100、好ましくはn=1、2又は3)
のマレイミド化合物により該興味対象の物質に結合している)
のものであり得る。
− アルキル基は、(C1〜C12)アルキル基、好ましくは(C1〜C6)アルキル基、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル及びイソブチル基から選択される;
− アルケニル基は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を有する、2〜12(好ましくは2〜6)の炭素原子の炭化水素鎖から選択される。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、2,4-ペンタジエニルが挙げられる;
− アルキニル基は、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を有する、2〜12(好ましくは2〜6)の炭素原子の炭化水素鎖から選択される;
− アリール基は、少なくとも1つの単純な芳香環から誘導される任意の官能基又は置換基を意味し;芳香環は、環の各原子が互いに重なるp-軌道を含む非局在化π系を有する任意の平面環状化合物に相当する。より具体的には、用語 アリールは、フェニル、ビフェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラシル、ピレニル、及びその置換形態を含むが、これらに限定されない。本発明のアリール基は、好ましくは4〜12の炭素原子、より好ましくは5又は6の炭素原子を含んでなる;
− ヘテロアリール基は、少なくとも1つの上記のとおりの芳香環から誘導され、P、S、O及びNから選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含有する任意の官能基又は置換基を意味する。用語 ヘテロアリールは、フラン、ピリジン、ピロール、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、トリアゾール、チアゾール、イソチアゾール、テトラゾール、ピリダゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、ベンゾチオフェン、ベンゾ[c]チオフェン、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾチアゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シノリン、プリン及びアクリジンを含むが、これらに限定されない。本発明のアリール及びヘテロアリール基は、好ましくは4〜12の炭素原子、より好ましくは5又は6の炭素原子を含んでなる;
1つの好適な実施形態によれば、Aはキレート剤であり、興味対象の物質SIはNMR又はMRI造影剤である。
有利には、キレート剤Aは、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,4,7-トリス(カルボキシメチルアザ)シクロドデカン-10-アザアセチルアミド(DO3A)、ニトリロ三酢酸(NTA)、D-ペニシラミン(Pen)、2,3-ジメルカプトコハク酸(DMSA)、2,3-ジメルカプト-1-プロパンスルホン酸(DMPS)、2,3-ジメルカプトプロパノール(BAL)、トリエチレンテトラミン(Trien)、テトラチオモリブデン酸アンモニウム(TTM)アニオン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2-(p-イソチオシアナトベンジル)-6-メチル-ジエチレントリアミン五酢酸(IB4M)又はヒドロキシピリジノン(HOPO)から選択される。
有利には、興味対象の物質SIはガドリニウムであり、キレート剤はDOTAである。
のものであってもよい。
式(I)又は(I')のマレイミド化合物は、固相法により、好ましくはFmoc化学を用いて、より好ましくはFmoc-Gly-Wang樹脂上で合成されてもよい。
式(I')のマレイミド化合物:
もまた本発明の一部である。
本発明はまた、本発明の非部位特異的方法に従って取得可能である、興味対象の物質に接合したVHH又はVHH誘導体、及び、本発明の部位特異的方法に従って取得可能である、興味対象の物質を有するチオール反応性化合物に接合したVHHも提供する。
興味対象の物質がペプチドである場合、本発明に従うVHH又はVHH誘導体及び前記興味対象の物質は、本発明に従うVHH又はVHH誘導体及び適切なペプチドを含む融合ポリペプチドとして遺伝子工学により作製することができる。この融合ポリペプチドは、公知の適切な宿主細胞において、従来方法により発現させることができる。
本発明に従うVHHは、ヒト対象者に投与する場合、ヒトにおける免疫原性を低減させるためにヒト化することができる。ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法は、当該分野において公知である(Vincke C.ら, 2009, J Biol Chem., 284, 3273-84)。
本発明に従う診断薬は、脳撮像、又はアミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病(AD)及びダウン症候群の診断若しくはモニタリングに使用することができる。
本発明はまた、本発明に従うVHH、VHH誘導体又はオリゴペプチド及び上記のような興味対象の物質を含んでなるキットを提供する。
具体的には、本発明はまた、VHH又はVHH誘導体及び上記のような診断薬を少なくとも含んでなる、脳撮像のため、又はアミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群の診断若しくはモニタリングのためのキットを提供する。
本明細書で使用する場合、「対象者」は哺乳動物、好ましくはヒト、最も好ましくはアミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群を有すると疑われるヒトである。
本発明はまた、対象者において、アミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群を診断するためのインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程:
a)インビトロで、前記対象者からの適切な生物学的サンプルを本発明に従う診断薬と接触させる工程、及び
b)前記生物学的サンプルにおいて、アミロイドβ沈着(例えば、アミロイド斑)の存否を決定する工程
を含んでなり、アミロイドβ沈着の存在が、対象者がアミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群を有することを示す方法を提供する。
本発明はまた、対象者において、アミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群の進行又は退行をモニターするためのインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程:
a)インビトロで、前記対象者からの適切な生物学的サンプルを本発明に従う診断薬と接触させる工程、
b)前記生物学的サンプルにおいて、原線維形態のアミロイドβの量を測定する工程、及び
c)工程(b)で測定した量を、前記対象者について以前に得た原線維形態のアミロイドβの量と比較する工程
を含んでなり、原線維形態のアミロイドβの量の有意な増加がアミロイドβ沈着により媒介される疾患の進行のマーカーを構成し、原線維形態のアミロイドβの有意な減少がアミロイドβ沈着により媒介される疾患の退行のマーカーを構成する方法を提供する。
工程b)はまた、VHH-抗原複合体の存否を決定することにより行うことができる。
前記適切な生物学的サンプルは、脳生検又は死後脳組織であり得る。
脳生検又は死後脳組織においてアミロイドβ沈着を検出する方法に関する本発明の観点によれば、該方法は、ホルマリン固定組織を本発明に従う診断薬の溶液とインキュベートすることを含んでいてもよい。インキュベーションに際して、診断用化合物は組織中のアミロイドβ沈着を標識し、染色又は標識されたアミロイドβ沈着は、任意の標準的方法により検出又は可視化することができる。このような検出手段には、顕微鏡観察法、例えば明視野、蛍光、レーザ共焦点及び交差偏光顕微鏡観察が含まれる。生検又は死後組織におけるアミロイドβ量の定量方法には、例えば、本発明に従う診断薬又はその水溶性非毒性塩を生検又は死後組織のホモジネートとインキュベートすることが含まれる。組織は、当該分野において周知の方法により取得し、ホモジナイズする。有利には、診断用化合物は放射性同位体標識化合物であるが、他の診断用化合物、例えば酵素、蛍光体又はNMR若しくはMRI造影剤を使用することもできる。
a)対象者、好ましくはヒトに検出可能量の本発明に従う診断薬を投与する工程、及び
b)前記対象者における診断薬を画像化法により検出する工程
を含んでなる方法を提供する。
本発明に従う方法により、対象者、好ましくはヒトの脳におけるアミロイド沈着の存在及び位置の決定が可能になる。
本明細書で使用する場合、「検出可能量」は、投与された診断薬の量がアミロイドβへの診断薬の結合の検出を可能にするに十分であることを意味する。
本明細書で使用する場合、「画像化有効量」は、投与された診断薬の量がアミロイドβへの診断薬の結合の画像化を可能にするに十分であることを意味する。
インビボ画像化のためには、利用可能な検出装置のタイプは、標識選択の主因である。例えば、ガドリニウム、鉄又はマンガンをベースとする造影剤は、興味対象の物質に結合させた本発明に従うVHH又はVHH誘導体を、磁気共鳴分光法(MRS)又は撮像法(MRI)により検出するために使用することができる。放射性同位体(例えば19F)も、本発明の方法におけるインビボ画像化に特に適切である。使用する装置のタイプは、興味対象の物質の選択における指針を示す。例えば、所与の装置タイプで検出可能な様式の崩壊を示す放射性核種を選択しなければならない。造影剤又は放射性核種の半減期も考慮する。放射性同位体に関しては、半減期は、脳による最大取込み時に依然として検出可能であるように十分に長くあるべきであるが、対象者が有害な放射線を維持しないように十分に短くあるべきである。本発明に従う放射性標識VHH又はVHH誘導体は、放出された適切な波長のガンマ放射線を検出するガンマ撮像法を用いて検出することができる。ガンマ撮像法には、SPECT及びPETが含まれるがこれらに限定されない。SPECT検出のためには、好ましくは、粒子を放出しないが、140〜200keV範囲の光子を多数生じる放射性同位体が選択される。PET検出のためには、放射性標識は、陽電子放出性放射性核種、例えばPETカメラにより検出される2つの511keVガンマ線を生成して消滅する19Fである。
本発明はまた、診断薬としての、本発明に従う診断用化合物に結合したオリゴペプチドを提供する。
本発明はまた、上記のような治療薬及び医薬的に許容され得るキャリアを含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明はまた、医薬、特にアミロイドβ沈着により媒介される疾患(例えばアルツハイマー病及びダウン症候群)の治療に使用する医薬としての、本発明に従うVHH、VHH誘導体、治療薬又は医薬組成物を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「治療」には、疾患、疾患症状又は疾患素因を有する患者に、当該疾患、疾患症状又は疾患素因を治癒し(cure、heal)、緩和し、軽減し、変化させ、修復し(remedy)、寛解し、改善し又はそれらに影響を及ぼすことを目的として、本発明に従うVHH、VHH誘導体、治療薬又は医薬組成物を投与することが含まれる。
用語「予防」は、アミロイドβ沈着により媒介される疾患(例えば、アルツハイマー病)の進行が減速し、及び/又は消失すること、或いはアミロイドβ沈着により媒介される疾患(例えば、アルツハイマー病)の発症が遅延し又は生じないことを意味する。
別の観点において、本発明は、哺乳動物の血液脳関門(好ましくは、ヒト血液脳関門)を横切る興味対象の物質の送達用のペプチドベクターを生産するための、本発明に従うVHH又はVHH誘導体の使用に関する。
本発明はまた、治療薬としての、本発明に従う治療用化合物に結合したオリゴペプチドを提供する。
材料及び方法
1.VHH R3VQの作製、選択及び精製
抗原調製及びアルパカにおける液性免疫応答の誘導
A-β42ペプチド(Aβ42)(1mg−Bachem)を900μlのH2Oに溶解し、激しく撹拌した。100μlのPBS 10×を加え、混合物を使用前1ヶ月間室温にてインキュベートした。250μlの混合物を、最初の免疫用には250μlのフロイント完全アジュバントと混合し、その後の免疫用には250μlのフロイント不完全アジュバントと混合した。一匹の若年成体雄性アルパカ(Lama pacos)を250μgの免疫原で0日目、21日目及び35日目に免疫した。50日目に、血清サンプルを採取し、抗原としてAβ42を用いるELISAにより免疫応答をモニターした。
免疫動物の血液250mlを50日目に採集し、末梢血白血球を、Ficoll(Pharmacia)不連続グラジエントでの遠心分離により単離し、更なる使用まで−80℃で保存した。総RNA及びcDNAを、以前にLafaye P.ら(1995, Res Immunol., 146:373-382)に記載されたように取得し、VHHドメインをコードするDNAフラグメントを、VH遺伝子のそれぞれ3'及び5'フランキング領域にアニールするCH2FORTA4及びVHBACKA6プライマーを用いるPCRにより増幅した。増幅産物を、プライマーVHBACKA4及びVHFOR36、又はプライマーVHBACKA4及びLHH(5' GGACTAGTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3')(配列番号13)(長ヒンジホモ二量体抗体に特異的)を用いる第2ラウンドのPCRにおいてテンプレートとして使用した。プライマーは、増幅産物の5'及び3'末端部に相補的であり、VHH遺伝子の末端部にSfiI及びNotI制限部位が組み込まれていた。PCR産物を消化し、ファージ発現ベクターpHEN1にライゲートした。得られたライブラリは、2つのサブライブラリ(一方はヒンジの無いVHH DNA-コーディング遺伝子に由来し、他方は長ヒンジ抗体遺伝子に由来した)から構成されていた。両方のサブライブラリを用いてファージを作製し単離した後、プールした。
ベクターpHEN1中の選択ナノボディのコーディング配列を、NcoI及びNotI制限部位を用いて、6-ヒスチジンタグを含有する改変細菌発現ベクターpET23にサブクローニングした。形質転換したE. coli BL21(DE3) LysS細胞は、IPTG(0.5mM)での16℃にて一晩の誘導後、細胞質にVHHを発現する。精製VHHを、細胞質抽出物から、Ni2+を担持するHiTrapクルードカラム(GE Healthcare)を製造業者の指示に従って用いるIMAC、続いてSuperdex 75カラム(GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーにより単離した。VHH(特に。R3VQ(His)-NH2;図9の化合物1)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液、300mM NaCl及び500mMイミダゾール緩衝液に溶出させた。
イムノブロット
A-ベータ42ペプチドを、8M尿素を含有するNuPAGE(登録商標)LDSサンプル緩衝液(Invitrogen)に再懸濁した。NuPAGE Novex 4-12% Bis-trisゲル(Invitrogen)を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による分離後、Hybond-C(Amersham)への半乾燥転写を行い、Xcell IIブロットモジュール(Invitrogen)を用いてウェスタンブロッティングを行った。免疫化学反応の前に、メンブレンを4%スキムミルク溶液でブロックした。メンブレンのイムノブロッティングを、VHH、ウサギ抗Hisタグ(eBioscience)ポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(Abcam)により行った。最後に、化学発光キット(GE Healthcare)を用いてペルオキシダーゼ活性を可視化した。
ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Denmark)を、PBSに希釈した1μg/mlのビオチン化A-ベータ40又はA-ベータ42(好ましくはA-ベータ40)との4℃で一晩のインキュベーションにより被覆した。プレートをPBS中0.1% Tween 20の緩衝液で洗浄した。VHH R3VQをPBS中0.5%ゼラチン、0.1% Tween 20の緩衝液で希釈した。37℃で2時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄し、その後、ウサギ抗Hisタグポリクローナル抗体(eBiosciences)、続いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(Abcam)を加え、最後に、製造業者のプロトコルに従ってOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド,Dako)により顕色した。
VHHの結合親和性を、以前(Friguet Bら, 1985, Immunol Methods, 77:305-19)に記載されたように測定した。簡潔には、種々の濃度のAβペプチド(Aβフラグメント1-16、10-20、15-25、22-35及び29-40)を既知量のVHHと、平衡に達するまで、4℃で一晩、溶液状態でインキュベートした。用いたVHH濃度は予備的なELISA較正により測定した。各混合物(100μl)を、抗原を予め被覆したマイクロタイタープレートのウェルに移し、4℃で20分間インキュベートした。プレートをPBS中0.1% Tween 20の緩衝液で洗浄し、β-ガラクトシダーゼ接合ヤギ抗ウサギIg(Biosys, Compiegne, France)及び4-メチルウンベリフェリルα-Dガラクトシド(Sigma)の添加により結合VHHを検出した。355nmでの励起後、460nmの蛍光を読み取った(Fluoroskan, Labsystem, Finland)。「結合抗体の割合の逆数」対「抗原のモル濃度の逆数」をプロットして得られる回帰曲線の傾きからKDを推定した。
VHHをコードするDNAはGATC Biotechが配列決定し、配列はDNAストライダーで処理した。
pIの測定
VHHのpIを、IEF 2-9ゲル(Invitrogen)を用いる等電点電気泳動により測定した。アノードにサンプル適用するNEPGHE(非平衡pHグラジエントゲル電気泳動)を用いた。なぜならば、そのことにより、pH8.5〜10.5を含む塩基性範囲のゲルにおける最適なタンパク質分析が可能となるからである。プロトコルはSERVAGel IEF 3-10指示マニュアルに詳述されていた。
VHH R3VQをガドリニウム(MRI造影剤)に、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)(キレート剤)を用いて接合した。非部位特異的カップリング及び部位特異的カップリングに基づく2つのストラテジを用いた:
− 第一のストラテジは、(i)キレート剤DOTAとVHH(R3VQ-NH2 1)のリジン残基との接合工程、その後の(ii)MRI造影剤(すなわち、ガドリニウム(Gd))でのキレート化工程を含んでなる(図9Aを参照)。このストラテジの結果、逆相高速液体クロマトグラフィー/質量分析(RP-HPLC/MS)により示されるように、ランダムに分布したGd及び或る範囲のGd:VHH化学量論を有するR3VQ-N-(DOTA/Gd)n接合体2の複雑な多分散系混合物が生じた。DOTA接合工程の条件を変化させると、異なるDOTA/Gd密度を有する幾つかの接合体が得られた(全体収率60〜67%)。IHC及びMRIによるインビボ評価で、R3VQ-N-(DOTA/Gd)n接合体は、脳室内注射したマウスにおいてアミロイド斑を認識することができた。
特に断らない限り、アミノ酸誘導体及び試薬は、それぞれNovabiochem及びSigma-Aldrichから購入したものである。ペプチド及びVHH溶液の濃度(正味のタンパク質含量)は、当該化合物を6N HClで110℃にて20時間加水分解した後、Beckman 6300分析装置を用いる定量的アミノ酸分析(AAA)により測定した。RP-HPLC/MS分析は、UV検出装置2487(220nm)と、エレクトロスプレーイオン化(ポジティブモード)源(Waters)を備えたQ-TofmicroTM分光計(Micromass)とに接続したAlliance 2695システムで行った。サンプルをオートサンプラーで4℃に冷却した。線形グラジエントは、アセトニトリル+0.025%ギ酸(A)/水+0.04%TFA+0.05%ギ酸(B)を用いた10分間又は20分間にわたるものであった。用いたカラムはXBridgeTM BEH300 C18(3.5μm,2.1×100mm)(Waters)(グラジエント10〜100% A)であった。ソース温度を120℃に、脱溶媒和温度を400℃に維持した。コーン電圧は40Vであった。サンプルを、0.4〜1mg/ml濃度で、Bを添加したそれぞれの緩衝液に注入した。予想Mr値は、N末端Metが欠失し、1つのジスルフィド結合を有するタンパク質の平均分子量に相当する。Mr分析を同じ分光計において直接注入によるポジティブモードで記録した(ソース温度及び脱溶媒和温度をそれぞれ80℃及び250℃に維持した)。サンプルを水/アセトニトリル(1/1)(0.1%ギ酸を含む)に5μM濃度で溶解した。4の純度を、UV検出装置(220nm)を備えたAgilent 1200ポンプシステムを用いるRP-HPLCにより分析した。用いたカラムはKromasil C18(100Å,5μm,4.6×250mm)(AIT)であり、グラジエントは、アセトニトリル(VWR)(C)/水+0.1%TFA(VWR)(D)を用いた20分間にわたるものであった。
全ての試薬のモル当量を反応基について示す(R3VQあたり5つのNH2及び1つのDOTA/R3VQ接合体の平均)。全体収率(下記表2を参照)には、アフィニティーカラム溶出緩衝液中の出発タンパク質1からの全合成工程が含まれる。全体収率は、最終産物2a〜2fの実際の量を予測量(正味のタンパク質含量)で除算することにより算出した。
アフィニティーカラムから溶出したR3VQ(His)-NH2 VHH 1を、300mM NaClを含有するPBS緩衝液(PBS/NaCl)で透析した。PBS/NaCl(120μl)に溶解した1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸モノ(N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)(DOTA-NHS)(274μg,アミノ基に対して4当量)を、1(480μl,0.60mg/ml)に加え、溶液を室温で撹拌した。アリコート(10μl)を15分ごとに抜き出し、100mM Tris緩衝液(pH7.3)(90μl)で希釈し、HPLC/MSにより分析して反応の進行をモニターした。3時間後、溶液を4℃に冷却し、Vivaspin 500遠心分離フィルターデバイス(3,000 MWCO PES)(Sartorius)を用いて、緩衝液を0.4M 酢酸Na緩衝液(pH5)に交換した。得られたDOTA-VHH接合体(480μl)に、同じ緩衝液(5μl)中のGdCl3(149μg,平均のDOTA基に対して45当量)を加えた。溶液を室温で2.5時間撹拌した。緩衝液を、上記と同じVivaspinデバイスを用いて4℃のPBS/NaClに交換し、溶液を濃縮して、R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)0-2接合体2f(105μl,1.48mg/ml)を得た。全体収率は67%である。
1にDOTA-NHSを少量ずつ加えた(45分ごとに0.5当量、アミノ基に対して合計5.5当量)ことを除き同じプロトコルを用いて接合体2eを得た。溶液を室温で8時間15分間撹拌した。全体収率は60%である。
AAA:Ala 15.8 (16),Arg 9.1 (9),Asp+Asn 13.4 (13),Glu+Gln 16.0 (15),Gly 13.4 (14),His 5.7 (7),Ile 3.1 (3),Leu 8.4 (8),Lys 4.1 (4),Phe 4 (4),Pro 6.1 (7),Ser 11.3 (13),Thr 10.0 (11),Tyr 4.8 (5),Val 11.1 (11)。
MS:15753.0996(C681H1053N209O216S4 計算値15752.3949)
R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)0-2 2f
AAA:Ala 16.0 (16),Arg 10.0 (9),Asp+Asn 12.8 (13),Glu+Gln 15.0 (15),Gly 13.8 (14),His 6.7 (7),Ile 3.0 (3),Leu 8.2 (8),Lys 4.5 (4),Phe 4 (4),Pro 8.5 (7),Ser 10.5 (13),Thr 10.1 (11),Tyr 4.8 (5),Val 11.1 (11).
MS: 16293.1328((DOTA/Gd)1:C697H1076N213O223S4Gd 計算値16293.0263)
16833.5586((DOTA/Gd)2:C713H1099N217O230S4Gd2 計算値16833.6576)
R3VQ-SH 3の製造
Cys操作VHH(R3VQ-SH 3)のコーディング配列を、NcoI及びXhoI制限部位を用いて改変細菌発現ベクターpET23にクローニングした。形質転換したE. coli BL21(DE3) pLysS細胞は、IPTG(0.5mM)での16℃にて一晩の誘導後、細胞質に3を発現する。精製VHHを、細胞質抽出物から、Ni2+を担持するHiTrapクルードカラム(GE Healthcare)を製造業者の指示に従って用いるIMACにより単離した。3を500mMイミダゾールを含有するPBS/NaClに溶出させた。
AAA:Ala 16.1 (16),Arg 10.2 (10),Asp+Asn 13.6 (13),Glu+Gln 11.9 (11),Gly 19.1 (20),His 6.0 (7),Ile 3.1 (3),Leu 8.5 (8),Lys 2.2 (2),Phe 4 (4),Pro 4.3 (4),Ser 15.5 (18),Thr 9.5 (10),Tyr 4.8 (5),Val 12.9 (12)。
MS:15723.4268 (C671H1041N213O217S5 計算値15724.2820)。
4の合成を固相でFmoc-Gly-Wang樹脂(143mg,0.093mmol)からステップワイズに行った。構築ブロック1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリス-tブチル-アセテート-10-(N-α-Fmoc-N-ε-アセトアミド-L-リジン)[Fmoc-Lys(DOTA(OtBu)3))-OH](1.1当量)(Macrocyclics)及び6-マレイミドヘキサン酸(3当量)を、2-(1H-9-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸(HATU)(それぞれ1.06当量及び2.9当量)/ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(それぞれ2.2当量及び6当量)をカップリング試薬として用い、ジメチルホルムアミド(DMF)(Applied Biosystems)を溶媒として用いて、手作業で組み込んだ。Fmoc-Gly-OH(3当量)はDMF中のDIC(3当量)を用いて組み込んだ。Lys、Gly及びマレイミド誘導体を用いるカップリング工程をKaiser試験(E. Kaiserら(1980) Anal. Biochem. 34, 595-598)によりモニターし、それぞれ3時間、2時間及び1時間で完了した。Fmoc保護はDMF中20%ピペリジンを用いて除去した。3つ目のリジン誘導体を用いるカップリングの後、6-マレイミドヘキサン酸を用いる最後のカップリングを、生成物の4分の3(0.07mmol)について行った。
ペプチド-樹脂を10mlのTFA(Applied Biosystems)/水/トリイソプロピルシラン(95/2.5/2.5 v/v/v)に4℃にて懸濁し、4時間RTにて撹拌した。樹脂の濾過後、溶液を濃縮し、粗製生成物をジエチルエーテルで沈降させた。遠心分離後、ペレットを水に溶解し、凍結乾燥させて119mgの粗製DOTA-ペプチドを生成した。これをNMR、MS及びRP-HPLC(グラジエント10〜40% C,保持時間9.2分)により分析した。
13C NMR (D2O):δ 177.11 (1C, CONH Mal),175.15, 174.63, 174.36 (3C, CO Lys),173.26 (2C, CO Mal),172.93 (1C, COOH Gly),171.48, 171.21 (2C, CO Gly),163.04-162.68 (4C, CONH DOTA),134.22 (2C, CH Mal),120.59, 117.69, 114.79, 111.90 (TFA),55.20-53.10 (12C, CH2CO DOTA),54.04, 53.80, 53.47 (3C, CHα),52.20-46.80 (24C, CH2CH2N DOTA),42.38, 41.00 (3C, CH2 Gly),39.10 (3C, CH2ε),37.37 (1C, CH2 6-Mal),35.04 (1C, CH2 2-Mal),30.48, 30.24, 30.23 (3C, CH2β),27.67, 27.33, 24.67 (3C, CH2 3-Mal, CH2 5-Mal, CH2δ),25.43 (1C, CH2 4-Mal),22.43, 22.33, 22.15 (3C, CH2γ)。
MS:[M+H]+ 1925.9888, [M+K]+ 1963.9391 (C82H136N22O31 計算値[M+H]+ 1927.1195, [M+K]+ 1965.2098).
MS:2388.8889 (C82H127N22O31Gd3 計算値2388.7901)。
アフィニティーカラムから溶出したR3VQ-SH VHH 3を300mM NaClを含有するPBS緩衝液(PBS/NaCl)で透析した。水溶液(135μl)の4(1.35mg,VHHあたり1チオール基に対して3当量)を3(1.5ml,PBS/NaCl(pH6.8)中2mg/ml)に加え、溶液を4℃にて3時間撹拌した。次いで、溶液を、Vivaspin 2000遠心分離フィルターデバイス(3,000 MWCO PES)(Sartorius)を用いて透析濾過した。RP-HPLC/MS分析用に、3及び5のアリコート(20μl)を緩衝液B(20μl)で希釈した。更に、ELISA分析用に、3及び5のアリコート(10μl)を100mM Tris緩衝液(pH7.3)(90μl)に希釈した。1mlの5(2.36mg/ml)を収率70%で得た。収率は、最終生成物5の実際量を予測量(正味のタンパク質含量)で除算することにより算出した。
同じ反応をアフィニティーカラム溶出緩衝液(500mMイミダゾールを含有するPBS/NaCl)で直接行い、83%全体収率を得た。よって、R3VQ/Gd接合体の取得プロセスは、接合をアフィニティーカラム溶出緩衝液(PBS/NaCl/イミダゾール))で直接行うと、改善される:i)工程数が2に減り、ii)全体収率が83%まで上昇する。このプロセス改善は別のVHHでも有効であることが確認されている(データは示さず)。
MS:18113.7383 (C753H1168N235O248S5Gd3 計算値18113.0720)。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を、NuPAGE Novex 4-12% Bis-Trisゲル(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて行った。
pIの測定
VHHのpIを、IEF 2-9ゲル(Invitrogen)を用いる等電点電気泳動により測定した。アノードにサンプル適用するNEPGHE(非平衡pHグラジエントゲル電気泳動)を用いた。なぜならば、そのことにより、pH8.5〜10.5を含む塩基性範囲のゲルにおける最適なタンパク質分析が可能となるからである。プロトコルはSERVAGel IEF 3-10指示マニュアルに詳述されていた。
ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート(Thermo Scientific, Denmark)を、PBSに希釈した1μg/mlのビオチン化A-ベータ40又はA-ベータ42(好ましくはA-ベータ40)との4℃で一晩のインキュベーションにより被覆した。プレートをPBS中0.1% Tween 20の緩衝液で洗浄した。非部位特異的ストラテジのためには、R3VQ-NH2 1、R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 2を、PBS中0.5%ゼラチン、0.1% Tween 20の緩衝液で希釈した。37℃で2時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄し、その後、それぞれにウサギ抗Hisタグポリクローナル抗体(eBiosciences)、続いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(Abcam)を加え、最後に製造業者のプロトコルに従ってOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド, Dako)により顕色した。部位特異的ストラテジのためには、R3VQ-SH 3及びR3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5を上記と同じ緩衝液に希釈し、ビオチン化A-ベータ40又はA-ベータ42(好ましくはA-ベータ40)とのインキュベーション後、モノクローナル抗Hisタグ抗体(H1029- Sigma)、続いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体(ab97265-Abcam)を加え、同じ基質で顕色した。
3及び5の結合特性を、固定化A-ベータ40又はA-ベータ42(好ましくはA-ベータ40)の認識を50%阻害し得る可溶性A-ベータ40又はA-ベータ42(好ましくはA-ベータ40)ペプチドの量を測定することにより決定した。簡潔には、種々の濃度のA-ベータ40又はA-ベータ42(好ましくはA-ベータ40)を規定量の3又は5と、平衡に達するまで4℃で一晩インキュベートした。用いたVHH濃度は予備的なELISA較正から推定した。各混合物(100μl)を、抗原を予め被覆したマイクロタイタープレートのウェルに移し、4℃で15分間インキュベートした。0,1% Tween 20を含有するPBSでの洗浄後、非結合VHHを、抗His mAb(H1029-Sigma)、続いてβ-ガラクトシダーゼヤギ抗マウスIg及び4-メチルウンベリフェリル β-D-ガラクトシドの添加により検出した。355nmでの励起後、460nmの蛍光を読み取った(Fluoroskan, Labsystem, Finland)。
免疫組織化学を、アミロイドーシスのトランスジェニックマウスモデル(PS2APPマウス)から得た冠状脳パラフィン切片(5μm厚)について行った。切片はミクロトーム(Microm HM340E)で作製した。切片をキシレン中で脱パラフィン化し(5分,3回)、エタノール(100%×2,90%及び70%;5分間/工程)及び水により再水和させた。次いで、切片を98%ギ酸で5分間前処理し、最後に水に5分間浸漬した。内因性ペルオキシダーゼを3%過酸化水素及び20%メタノールで中和し、非特異結合部位をTBS-0.5% tween(pH8) BSA 2%で30分間ブロックした。以下の工程では、切片を工程間にTBS-tweenで3回濯いだ(5分間/回)。次いで、切片を、TBS-tween中2μg/mlに希釈した一次抗体R3VQ-SHと4℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をマウスモノクローナル抗Hisタグ抗体(H1029-Sigma)で2時間室温で処理し、最後にDako REALTMシステムのペルオキシダーゼ/DABキット(Glostrup, Denmark)を製造業者のプロトコルに従って用いて発色させた。水で洗浄後、切片をHarrisヘマトキシリンで対比染色し、水で再び濯いだ。マウントする前に、切片を段階的エタノール溶液(70、90及び100%)中で脱水し、キシレンで明澄化した。
造影剤のMRI特性を、VnmrJ 2.3が実行されているコンソールとインターフェース接続された7T-分光計(Agilent, USA)で評価した。分光計は、700mT/mのげっ歯類動物用グラジエントインサートを備えていた。方形バードケージコイル(直径:23mm)を送信及び受信に用いた。縦緩和及び横緩和r1及びr2(単位濃度の造影剤あたりの緩和率の変化、すなわち、MRI造影剤としての「有効性」を意味する)を、次式:R1(C)=R1(0)+r1×C(式中、R1(C)は濃度Cの造影剤を含むチューブ中でのR1であり、R1(0)は造影剤を含まないチューブ中でのR1であり、Cは造影剤の濃度である)を用いて、濃度0.2、0.15、0.1、0.05、0.025、0.01及び0mmol/lについてR1(すなわち、1/T1)及びR2(すなわち、1/T2)を造影剤濃度の関数として線形フィッティングすることにより決定した。R2(C)=R2(0)+r2×Cを用いてr2を算出した。サンプルはヘマトクリットチューブ中で撮像した。
T2の算出は、16のエコー時間(TE=10〜160msec)、TR=3300ms、Nex=2、バンド幅=100kHz、FOV=10×10mm2、Mtx=64×64、1スライス、スライス厚=3mmを用いる2Dマルチエコーマルチスライススピンエコー画像に基いた。緩和時間のパラメトリックマップは、指数関数的回帰曲線(S=exp(-TE/T2))(式中、Sは信号強度であり、TEはエコー時間であり、T2は縦緩和時間である)から算出した(ImageJ, MRI Analysis Calculator, Karl Schmidt)。
対象者
AD患者(BraakステージV及びVI)由来のヒト皮質脳組織をNeuroCEB脳バンクから入手した。このバンクは、患者組織(フランスアルツハイマー協会を含む)のコンソーシアムにより運営されている脳献体プログラムに関係するものであり、フランス国法律が要求するとおりに文部科学省(Ministry of Research and Universities)に対して宣言している。フランス国の生命倫理に関する法律に従い、脳献体について書面による明示の同意を得た。
前臨床実験をB6TgPS2APP(Richards J.G., 2003, J Neurosci., 23:8989-9003)及びAPP/PS1dE9(Garcia-Alloza M., 2006, Neurobiol Dis., 24:516-24)トランスジェニックマウスで行った。動物実験の手順は、実験動物の管理及び取扱いについてのEEC(86/609/EEC)及びフランス国の委員会(decree 87/848)の推奨に厳格に従った。動物は高用量のペントバルビタールナトリウム(100mg/kg)を用いて犠牲にし、その後10%緩衝化ホルマリンで灌流固定した。その後、脳を取り出し、ホルマリンに少なくとも24時間浸漬し、4℃で保存した。
組織抽出をGong, Y.ら(2003, Proc Natl Acad Sci U S A, 100:10417-10422)に従って行った。AD患者の前頭皮質(0.2g)を、プロテアーゼ阻害剤(200μg/ml PMSF,2μg/mlペプスタチンA,4μg/mlロイペプチン,30μg/mlベンズアミジンヒドロクロリド)を含有する20倍量のフェノールレッドフリーのハムF12培地(Gibco)又は緩衝液A(PBS(pH7.4),0.32Mスクロース,50mM Hepes,25mM MgCl2,0.5mM DTT)中でホモジナイズし、100,000×gで1時間遠心分離した。ペレットを10倍量のフェノールレッドフリーのハムF12培地又は緩衝液A+プロテアーゼ阻害剤中で再度ホモジナイズし、再び遠心分離した。合わせた上清のタンパク質濃度を測定した。次いで、タンパク質のアリコートを、Centricon-10濃縮器を用いて容量60μl以下にまで濃縮した。
脳抽出物又はA-ベータ42ペプチドを、8M尿素を含有するNuPAGE(登録商標)LDSサンプル緩衝液(Invitrogen)に再懸濁した。NuPAGE Novex 4-12% Bis-trisゲル(Invitrogen)を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による分離後、Hybond-C(Amersham)への半乾燥転写を行い、Xcell IIブロットモジュール(Invitrogen)を用いてウェスタンブロッティングを行った。免疫化学反応の前に、メンブレンを4%スキムミルク溶液でブロックした。メンブレンのイムノブロッティングを、VHH、ウサギ抗Hisタグ(eBioscience)ポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(Abcam)により行った。最後に、化学発光キット(GE Healthcare)を用いてペルオキシダーゼ活性を可視化した。
免疫組織化学は、固定組織(パラフィン包埋切片又は凍結切片)又は非固定の新鮮組織(凍結切片)で行った。標準的なIHCプロトコルを適用し、各組織条件に適合させた。免疫染色実験のほとんどを、パラフィン切片を用いて行ったので、ここでは、パラフィン包埋材料についての詳細なプロトコルを記載する。脳組織の免疫染色は4μm厚のパラフィン切片で行った。ヒト組織及びマウス組織の両方を用いた(ヒトAD患者、TauPS2APPマウス[Grueninger F.ら, 2010, Neurobiol Dis., 37:294-306]及びPS2APPトランスジェニックマウス[Richards, J. G.ら, 2003, The Journal of neuroscience 23, 8989-9003])。切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノール(100%、90%及び70%)(各溶液について5分間)及び最後に10分間の流水(水道水)により再水和させた。次いで、切片を98%ギ酸中で5分間インキュベートし、流水(水道水)下で再度洗浄し、3%過酸化水素及び20%メタノールで内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、最後に水で洗浄した。切片をTBS+0.5% Tween中2%のウシ血清アルブミン中で30分間インキュベートすることにより、非特異結合をブロックした。次いで、適切な希釈率の一次抗体(5〜10μg/mlのVHH His又はStrepタグ)を適用し、スライスを湿潤チャンバ内で室温にて一晩インキュベートした。スライドをTBS-Tweenで洗浄し、TBS-Tween中の二次抗体であるウサギ抗Hisタグ(1/1000)又は自家製ビオチン化抗strep mAb C23-21と室温で1時間インキュベートした。次いで、スライドをDako REALTM検出システムの試薬、ペルオキシダーゼ/DAB+と製造業者の指示に従ってインキュベートした。良好なSN比が得られるまで(約5分間)、色素原(DAB)を発色させた。TBS-Tweenでの洗浄後、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。アミロイド斑の標識のために、ビオチン化4G8(Wisniewski Tら, 1996, B. Biochem J., 313:575-80) mAb(1/10000)又は6F/3D(Akiyama H.ら, 1996, Neurosci let., 206:169-72) mAb(1/200)をポジティブコントロールとして並行して用いた。
MRIをB6TgPS2APP(Richards J.G., 2003, J Neurosci., 23:8989-9003)及びAPP/PS1dE9(Garcia-Alloza M., 2006, Neurobiol Dis., 24:516-24)トランスジェニックマウス(n=2、雌)の脳で行った。MRIを、VnmrJ 2.3が実行されているコンソールとインターフェース接続された7T-分光計(Agilent, USA)で記録した。分光計は、700mT/mのげっ歯類動物用グラジエントインサートを備えていた。バードケージコイル(RapidBiomed, GmbH, Germany)及びマウス脳表面コイル(RapidBiomed GmbH, Germany)をそれぞれ送信及び受信に用いた。
PBS中Triton 0.2%の溶液での4時間の膜透過化後、脳サンプルを、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)及び試験造影剤の溶液に浸漬し、少なくとも24時間4℃で保存後に撮像した。スキャンのために、脳を、Fluorinert(登録商標)(3M, Cergy-Pontoise, France)(MR画像で黒色バックグランドを提供する非プロトン性パーフルオロカーボンベースの液体)を満たした密閉プラスチックチューブ内に配置した。
MR画像は3Dグラジエントエコーシーケンス(FLASH)に基き、T2*w画像を取得した(TR=40ms,TE=15ms,FA=20°,Bw=50kHz,Nex=16,マトリクス=512×512×128,FOV=13×13×13mm2,11時間39分間の合計Tacqについて25×25×100μm3の分解能が得られる)。
本手順を用いて、インビトロ手順の後にMR画像で観察される低信号スポットと、アミロイド斑を明らかにする最も標準的な方法(Petiet A.ら, 2012, Neurobiol Aging, 33:1533-44)で得られたMR画像で観察される低信号スポットとの間で同時位置決めを行った。簡潔には、インビトロ実験後、サンプルをPBS及び希釈率1:200(2.5mM)の0.5Mガドテル酸メグルミンの溶液に浸漬し、少なくとも24時間4℃で保存後に撮像した。MR画像はインビトロ実験に用いた条件と同じ条件で行った。
被験体
VHH R3VQ及びVHH R3VQ接合体のインビボ評価を、上述の認可の下、TauPS2APP(Grueninger F.ら, 2010, Neurobiol Dis., 37:294-306)トランスジェニックマウスで行った。
VHHのインビボ定位注射
麻酔したTauPS2APPトランスジェニックマウス(n=2 雌性)に注射あたり2μlのVHHを0.5μl/分の速度で定位注射した。マウスをイソフルラン(1〜2%)と空気との混合物(1L/分)で麻酔した。マウスを定位フレームに配置し、Dremelを用いて頭蓋を両側で穿孔した。鈍い針先を備えるHamiltonシリンジでMR造影剤を注射した。各マウスに、各半球で前頭皮質及び海馬の計4ヶ所で注射した。前頭皮質の定位座標は、十字縫合から+0.86mm前方、正中線から±1.5mm側方、硬膜から−0.65mm腹側であった。海馬の定位座標は、十字縫合から−2.18mm後方、正中線から±1.5mm側方、硬膜から−1.8mm腹側であった。注射の2時間後又は24時間後にマウスを安楽死させ、マウスにPBS(pH7.6)中4%パラホルムアルデヒドの心臓内灌流を行った。脳を取り出し、同じ固定液中で一晩4℃にて後固定した。4μm厚のパラフィン切片を作製した。大脳組織でのVHHの存在は、上述の標準的な免疫組織化学的手順のいずれかを用いて検出した。
麻酔TauPS2APPマウス(n=2,雌性)にVHHを頸動脈内投与した。麻酔は、ケタミンヒドロクロリド(Imalgen,1/10希釈液50μl)とキシラジン(Rompun,1/40希釈液50μl)との混合物を1回、腹腔内注射して行った。総頸動脈を露出させ、細いシリコンチューブ材のカニューレ(PP25_100FT;Portex, Ashford, UK)を挿入した。蠕動ポンプ(Model PHD 2000;Harvard Apparatus, Boston, MA, USA)を用いて、VHHを頸動脈に定速で注入した。
外側尾静脈注射
マウスを、倒立させた適切な(尾を通すための穴が開けられている)ビーカー内に配置した。静脈を拡張させるため、注射前に動物を温め、尾を微温水に浸した。造影剤の適正な投与を確実にするため、動物の尾静脈にカテーテル(27G,Microflex,Vygon,France)を挿入した後に、MR画像化前の注射を行った。200μlのPBSに溶解した2mgのVHH、VHH R3VQ-DOTA又はVHH R3VQ-S-(DOTA/Gd)3を外側尾静脈に注射した。
インビボMRIを、VnmrJ 2.3が実行されているコンソールとインターフェース接続された上述の7T-分光計(Agilent, USA)で行った(「インビトロMRI」の章を参照)。MRI実験の間、動物をイソフルラン(0.75〜1.5%)とカルボージェン(95% O2 - 5% CO2)との混合物で麻酔し、呼吸速度をモニターした。カルボージェンは、循環血液から生じる信号を低減させるために使用した(Thomasら, 2003)。
MR画像は、高分解能3D-グラジエントエコーシーケンス(29×29×117μm3,FOV:15×15×15mm3,Mtx=512×512×128,TR=30ms,TE=15ms,フリップ角=20°,Nex=1,バンド幅=25kHz,取得時間:32分)を用いて記録した(Petiet, A.ら, 2012, Neurobiol Aging, 33:1533-44)。
T1の算出は、5つのTR値(TR=0.4、0.75、1.5、2.5及び5秒)、TE=14ms、Nex=1、FOV=25×25mm2、Mtx=128×128、6スライス、スライス厚=1mm,バンド幅=50kHzを用いる7つの連続2Dマルチスライススピンエコー画像に基いた。緩和時間のパラメトリックマップは、指数関数的回帰曲線(S=1−exp(-TR/T1))(式中、Sは信号強度であり、TRは繰返し時間であり、T1は縦緩和時間である)から算出した(ImageJ, MRI Analysis Calculator, Karl Schmidt)。緩和時間は前頭皮質領域から測定した。
エキソビボMRI
VHH-S-(DOTA/Gd)3のインビボ脳室内注射(1μg/一側)の6時間後、マウスを灌流し(PFA 4%)、脳を取り出した後にエキソビボMR画像を撮像した。各手順について、等価のGd溶液(すなわち:0.1mM)を用いてコントロール実験を行った。
1.ライブラリ構築及び具体的な抗Aβ VHHの選択
VHHをPCRにより増幅し、ベクターpHEN1にクローニングした。続く形質転換により約108クローンのライブラリが生成された。最良の親和性を示すVHHを、ビオチン化Aβ1-42、Aβ1-40又はAβ1-16ペプチドでの3サイクルのパニングによるファージディスプレイによって選択した。Aβ42パニングからの46クローン、Aβ40パニングからの192クローン及びAβ16パニングからの192クローンをELISAで試験した。Aβ42、Aβ40及びAβ16パニングからのそれぞれ46/46、110/192及び163/192が陽性と判明した。これら陽性クローンを配列決定し、45、65及び118のVHH配列をそれぞれ同定した。最終的に、3つのVHHファミリーを選択した(A7/B10、F12及びR3VQ)(下記表1を参照)。A7/B10 VHHは、ビオチン化Aβ1-42、Aβ1-40又はAβ1-16に対するパニング後それぞれ11倍、64倍及び117倍と判明した。VHH R3VE/Qは、ビオチン化Aβ1-42及びAβ1-40に対するパニング後それぞれ34倍及び1倍と判明した一方、VHH F12はAβ16パニング後に1倍と判明した。
これらVHHをベクターpET23又はベクターpASK IBA2にサブクローニングし、それぞれHisタグ又はストレプトアビジンタグを有するVHHの高レベル発現を可能にした。1〜2mg/l細菌培養物の収量が得られた。単一ドメイン産物は、SDS-PAGEにより純粋〜均質であることが示され(データは示さず);pI値は8.5を超えていた。この2つの構築物を用いて、その後の実験を行った。
R3VQは4℃又は長期保存にはグリセロールとともに−20℃で維持した。R3VQはグリセロールなしの凍結では安定でない。
DLS実験により、R3VQは単量体であり、精製後に凝集しないことが示された。
抗Aβ VHH A7、B10、R3VE、R3VQ及びF12のアミノ酸配列アラインメントを図10に示す。
Aβ及びアミロイド病変に対するVHH R3VQの免疫反応性
ヒトAD脳及びトランスジェニックTauPS2APPマウスにおけるVHH特異的免疫反応性の分布を調べた。R3VQは、抗原賦活化前処理後のヒトパラフィン切片でAβ斑及び大脳アミロイド血管症(CAA)を免疫検出する良好な能力を示した(図1)。野生型マウスでは標識化は観察されなかった。パラフィン包埋組織の結果と同様に、R3VQは、自由浮遊ビブラトーム切片でも(データは示さず)、より重要なことには、抗原賦活化前処理をしていないADヒト脳の新鮮組織及びマウス脳切片でもAβを免疫検出することができることが示された(図2〜3)。注目すべきことに、凍結ミクロトームで得られた自由浮遊切片では、強いバックグランドシグナル及び低いS/N比が観察されたため、この材料のR3VQ IHCへの使用を排除した。VHH A7/B10及びF12は、アミロイド斑を免疫標識して検出することができなかったため、以後、これらVHHを用いる実験は行わなかった。
脳組織におけるVHH R3VQの免疫反応性を確証するため、AD患者から得た脳抽出物でウェスタンブロットイムノアッセイを行った。40〜55kDaのAβオリゴマーに相当する4つの主要バンドがVHH R3VQで免疫検出された。同時に、R3VQは、単量体、二量体及び三量体に相当する6〜17kDaのAβ42ペプチドによる3つのバンドを認識した(図4)。
VHH R3VQは、Aβ42を用いる阻害アッセイにおいて、原線維性の合成Aβ42ペプチドに特異的であることが示された。VHH R3VQは17nMのKDを有していた。VHH R3VQが認識するエピトープを更に決定するために、Aβ40及び種々のAβフラグメント(1-16、10-20、15-25、22-35及び29-40)に相当するペプチドについて50%阻害(IC50)に必要な濃度を測定した。VHH R3VQは、フラグメント1-16も29-40も認識しなかった。Aβ16-35に関するVHH R3VQのIC50は16nMであった。このことから、VHH R3VQはAβ42の中央に位置するエピトープを認識することが示唆される。R3VQは、Rocheが提供するH4安定クローンを用いるフローサイトメトリではAPPを認識しなかった(データは示さず)。
VHH R3VQは定位注射後にインビボでアミロイド斑を標識する
2μgのVHH R3VQをマウス脳の左半球の海馬又は皮質に定位注射した(2マウス)。注射の2時間後又は24時間後、動物を犠牲にし、脳切片を採取した。VHH R3VQが原線維性Aβをインビボで標識したことを示す、アミロイド斑の免疫染色が観察された。更に、脳組織へのVHH R3VQの拡散を示唆する、皮質の茶褐色ハローに気付いた(図5A及び5B)。
VHH R3VQはインビボでBBBを横断する
BBBを横断する能力についてVHH R3VQをインビボで試験した。4mgのVHHを、左頸動脈を介して60分間にわたって注射した。注射後1時間、VHHを大脳組織へ拡散させ、その後マウスを安楽死させ、固定液で灌流した。アミロイド斑の免疫染色が皮質、海馬及び視床で観察された。この染色は、注射した頸動脈の対側の右半球では微かであった。
この実験により、非標識R3VQは、1)緩徐な頸動脈内注入後にBBBを横断することができたこと、2)アミロイド斑をインビボで特異的に認識したこと、及び3)MRI研究の良好な候補であることが示された。
下記表1に、アルパカをペプチドAβ42、オボアルブミンにカップリングしたペプチドAβ1-10又は原線維形態のAβ42を免疫して得られた、アミロイドβを指向するVHHによる免疫標識をまとまる。VHHの選択は、リボソームディスプレイにより選択されたVHH R1.3、R1.5及びR3.3を除き、ファージディスプレイにより行われた。
表1:アルパカをペプチドAβ42、オボアルブミンにカップリングしたペプチドAβ1-10又は原線維形態のAβ42を免疫して得られた、アミロイドβを指向するVHHによる免疫標識。VHH L1-3、L35、61-3、V31-1はLafaye P.ら, 2009, Molecular Immunology, 49:695-704に開示されている。他のVHHは上記方法に従って得た。
非部位特異的アプローチ:
VHHリジン残基への接合を、NHS活性化DOTAを用いて行った。その後、Gdとのキレート化により、可変のDOTA/Gd比を有する接合体を得た(表2)。HPLC/MSによる両工程のモニタリングにより、本プロセスを最適化することができた。ほぼ完全なキレート化を室温で達成することができた。
2つの当初接合体(2a及び2b)は、グリセロールなしでは−20℃での保存中に不安定であることに起因して、Aβ結合活性を有しないことが示された。実験条件を変えることにより、4つの新たな接合体を、0.5〜1mg規模にて良好な回収率(64〜74%)で作製した。第1シリーズ(2c及び2d)は、第2シリーズ(2e及び2f)よりDOTA/Gd密度が高い。ELISAにおけるAβ認識を元のVHH 1と比べると、2c及び2dの結合は低い(〜10%)一方、2e及び2fの結合はほとんど影響をうけていない(50〜100%)。この差は、全体的に低いDOTA/Gd密度及び/又はVHHの固有の安定性に起因する可能性がある。
本ストラテジには、Cys操作R3VQ VHH(R3VQ-SH 3)(配列番号8)と、マレイミド-(DOTA/Gd)3化合物4との接合が含まれる(図9Bを参照)。
DOTAはモノアシル成分を表す。全体収率を括弧内に示す。
チオ付加により4に接合した場合、RP-HPLC/MSで示されるように、3は全て、十分に規定された化合物R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5に変換された(収率79%)。5のpIは、非標識R3VQ-SHのものと比較して僅かに低下していた。R3VQ-SH及びR3VQ-S-(DOTA/Gd)3の結合特性は、ELISAプレートに固定したAβ40及び可溶性Aβ40を用いる競合阻害実験で決定した。50%結合阻害が得られるAβ40濃度は、R3VQ-SH及びR3VQ-S-(DOTA/Gd)3の両方で1μg/mlと計算された。これにより、DOTA/Gdの付加はVHHの結合特性に影響しないことが示唆される。更に、トランスジェニックB6.PS2APPマウスにおけるVHH特異的免疫反応性の分布によれば、R3VQ-SHは、抗原賦活化前処理後のマウスパラフィン切片でAβ斑を免疫検出する良好な能力を示した。
− C末端からN末端に、strepタグ、CysをVal及びSerに変異させたVHH R3VQ、Cys、トロンビン切断部位及びhisタグを含むStrep-R3VQSSfree-Cys-Thr-His。このタンパク質は非常に低い収量(μgタンパク質/l)で発現した。
− C末端からN末端に、タグ(Strep又はHisタグ)、CysをVal及びSerに変異させたVHH R3VQ及びCysを含むStrepタグ-R3VQSSfree-Cys及びHisタグ-R3VQSSfree-Cys;両タンパク質とも非常に低い収量(μgタンパク質/l)で発現した。
− C末端からN末端に、タグ(Strep又はHisタグ)、CysをVal及びSerに変異させたVHH R3VQ、Cys、Ser及びAlaを含むタグ-R3VQSSfree-Cys-Ser-Ala。これらタンパク質は非常に低い収量(μgタンパク質/l)で発現した。
− C末端からN末端に、タグ(Strep又はHisタグ)、トロンビン切断部位、CysをVal及びSerに変異させたVHH R3VQ、Cys、Ser及びAlaを含むタグ-Thr-R3VQSSfree-Cys-Ser-Ala。これらタンパク質は非常に低い収量(μgタンパク質/l)で発現した。
R3VQ-N-(DOTA/Gd)(1-2)は定位注射後にインビボでアミロイド斑を標識する
2μgのVHH R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 (2e)をマウス脳の左半球の海馬又は皮質に定位注射した(2マウス)。注射の4時間後、動物を犠牲にし、脳切片を採取した。R3VQ-N-(DOTA/Gd)n'が原線維性Aβをインビボで標識したことを示す、アミロイド斑の免疫染色が観察された(図6A及び6B)。図6C及び6Dは、注射部位から遠位の視床に存在するアミロイドβ斑の標識を示す。同一マウスで4G8抗体を用いてコントロール実験を行い、アミロイド斑を標識した(図6E)。
インビトロ画像化
R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2の溶液(0.01mMのGdと等価な最終濃度0.02mg/mlの造影剤2e)に浸漬したTauPS2APPマウス脳の画像化により、幾つかの低信号スポットが明らかになった(n=2;図7A、矢印)。これらスポットは、同一条件で、コントロールマウス脳では検出できなかった(データは示さず)。これらスポットは、Gd染色法によるアミロイド斑(図7B、矢印)と同じ位置に存在することが確認できた。たとえ、パラフィン手順により生じた歪みのために、MRIとIHCとの間で正確な位置合わせが可能でなくとも、IHCにより、VHH-DOTA/Gdが広範に拡散したこと及び同一領域でアミロイド斑が標識されたことが確証された(図7C、矢印)。更に、同一条件のコントロールマウス(n=2)の脳画像でも(データは示さず)、同一濃度(すなわち、0.01mM)のガドリニウム溶液に浸漬したTauPS2APPマウスの脳画像でも(図7D)、低信号スポットは検出することができなかった。
脳室内注射後、抗Aβ VHH-Gd 2e(R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2)は、海馬のエキソビボ画像において低信号スポットを示した(図8A、矢印)。これらスポットは、同一マウスでのGd染色により確証されるように、アミロイド斑に対応した(図8B、矢印)。たとえ、パラフィン手順により生じた歪みのために、MRIとIHCとの間で正確な位置合わせが可能でなくとも、IHCにより、同一領域でのアミロイド斑の標識が確証された(図8C、矢印)。更に、R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2に用いた同じ濃度(0.1mM)のガドリニウム溶液を注射したトランスジェニックTauPS2APPマウスでは、低信号スポットを検出することはできなかった。
インビトロMRIによるR3VQ-S-(DOTA/Gd)3の評価
R3VQ-S-(DOTA/Gd)3を上述の部位特異的アプローチにより合成した。HPLC/MS、pI及びIHCアッセイにより、R3VQ-S-(DOTA/Gd)3の生化学的特性(すなわち、HPLC/MSによる純度、pI及びAβに対するIHC反応性)が確証される(図11を参照)。
R3VQ-S-(DOTA/Gd)3がMRコントラスト変化を生じる能力を、上述のように、PS2APPマウス(Richards, J. G.ら, 2003, The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 23, 8989-9003)(n=2)の脳をインビトロで0.1mg/mlのR3VQ-S-(DOTA/Gd)3とインキュベートした後に評価した。7Tで取得した画像により、皮質において、ネガティブコントロール条件下のPS2APPマウス脳と比較して、低信号のスポットが明らかとなった(図12A及び12B)。これら低信号スポットのアミロイド斑としての性質を確証するため、脳を、アミロイド斑のMRI検出に最も標準的な方法として用いられるGd染色手順に供した(図12C)。Gd染色手順後に得られた画像の分析により、Gd染色により検出されたアミロイド斑とR3VQ-S-(DOTA/Gd)3により明らかとなった低信号スポットとが同じ位置に存在することが確認できた(図12、白色矢印)。この結果から、死後組織でR3VQ-S-(DOTA/Gd)3が受動的に拡散してアミロイド沈着を標的し、そのことにより、アミロイド沈着のインビトロMRIによる検出が可能になることが示唆される。
次に、R3VQ-S-(DOTA/Gd)3がMRIによりアミロイド斑を明らかにする能力を、上述のように、18ヶ月齢のPS2APPマウスの尾静脈への静脈内注射(20mg/kg及び50mg/kg)後に調べた。R3VQ-S-(DOTA/Gd)3を静脈内注射したPS2APPマウスから、注射5時間後に脳を取り出し、そのMR画像を11.7Tで取得した。コントロール条件(PBSを注射したPS2APPマウス)のMR画像(図13A及び13B)とは対照的に、R3VQ-S-(DOTA/Gd)3を静脈内注射したマウスの脳についてエキソビボで得た画像は、多くの低信号スポットを示した(図13C及び13D)。これら低信号スポットは、最も標準的なGd染色手順で検出されるアミロイド斑に対応するコントラスト異常と同じ位置に存在した(図13E及び13F)。二光子の結果によれば、これらスポットの強度は50mg/kg用量の場合でより強かった。このことから、R3VQの脳浸透及び脳Aβ病変を標識する能力は用量依存性であることが示唆される。
1.材料及び方法
以下、明示的に言及しない限り、材料及び方法は、実施例1について記載したものと同じである。
2.Aβ陽性病変のインビボターゲッティング
R3VQ-SHとAF488蛍光体との接合
R3VQ VHHと蛍光体との間のカップリングのため、部位特異的接合を上述のとおりに行った。簡潔には、R3VQの配列のC末端部分に追加のシステイン残基を挿入(R3VQ-SHと呼ぶ)することにより、マレイミド-Alexa Fluor(登録商標) 488(AF488)のC末端チオ付加を可能とした。このようにして、1つのVHHが1つのAF488を有する十分に規定された接合体(R3VQ-S-AF488と呼ぶ)を得た(図14)。
SDS-PAGE及びHPLC/MS分析により、当該分子へのAF488の付加に対応する予想分子量(698Daの増加)が示された。このデータにより、カップリング及び接合体の純粋性が確証される(図14A及び14B)。
R3VQ-SH及びR3VQ-S-AF488の等電点(pI)は、IEF 3-10ゲルを用いるNEPHGEにより分析した。R3VQ-SHのpIは8.5〜9.5であり(図14C)、R3VQのpIと類似していた。AF488のR3VQ-SHへの付加によりpIは僅かに低下した(約8.3)が、依然として塩基性であった(図14C)。R3VQ-SH及びR3VQ-S-AF488の水力学半径(RH)をDLSにより測定した。経時的サイズ分布により、R3VQ-SHの平均RHは2.66±0.0788nmであり、R3VQ-S-AF488の平均RHは2.34±0.106nmであることが示され、共に溶液状態で単量体形態であることが示唆された。PS2APPマウスの脳スライスを用いるIHCにより、R3VQ-S-AF488によるアミロイド斑の免疫染色がインビトロで確証された(図14D)。
脳限局注入後のR3VQ-S-AF488の拡散(二光子撮像)
PS2APPマウスに開頭術を施して右後部皮質上に頭蓋開口部を設けた。15μg(10μl)のR3VQ-S-AF488を、硬膜剥離後、露出させた脳に直接適用した。R3VQ-S-AF488の拡散を二光子顕微鏡観察により約2時間追跡した。アミロイド斑及びCAAの代表的な特異的染色が脳実質で検出された。このことから、R3VQ-S-AF488が、皮質周囲注入後に拡散し、細胞外及び血管性のAβ陽性病変をインビボで検出できたことが示唆される(図15)。
先ず、静脈内(iv)注射したVHHの脳透過に有利に働き得る不自然な漏れがないことを裏付けるため、試験マウスの血液脳関門(BBB)の完全性をMRIにより検証した(下記コントロール実験を参照)。
50mg/kg用量のR3VQ-S-AF488を1匹のマウスの尾静脈に注射した。脳における接合体の血管外漏出及び染色を、脳開口部で二光子顕微鏡観察(z=表面〜深さ360μm)により注射後3.5時間記録した。図16Aは、同一領域での30分までの経時的なR3VQ-S-AF488のインビボ画像再構成(最大強度投影 - MIP)を示す。iv注射の数秒後に樹枝状血管の強力な染色が観察されたが、20分後には劇的に低下し、数本の毛細管のみが染色されたままであった。このことから、循環における接合体VHHの短い半減期(10〜20分)が示唆される。注射から短時間で、実質空間において緑色蛍光「雲(cloud)」が形成され、拡がった。このことは、R3VQの定位注射後に観察された球状拡散との類似性を示す(上記参照)。iv注射の30分後にアミロイド斑が可視化され始めた。血管性Aβ(CAA)も観察された。赤色チャネル信号の不在により、蛍光シグナルが特異的であり(データは示さず)、一般的な自家蛍光によるものでないことが証明された。更なる画像化により、アミロイド斑及び血管におけるAβ沈着のインビボ染色が注射の3.5時間後まで残存することが示された(図16B)。このことから、R3VQ-S-AF488の数時間を超える脳半減期が示唆される。R3VQ-S-AF488の静脈内注射の4時間後、脳を採集し、5μm厚パラフィン切片を作製した。次いで、抗His mAbを用いてIHCを行い、R3VQ-S-AF488の拡散及びR3VQ-S-AF488によるアミロイド斑の標識を確証した。R3VQ-S-AF488アミロイド斑の免疫染色が、VHHの散在性ハローに対応する茶褐色バックグランドを伴って、脳全体にわたり観察された(図16C)。より低用量のR3VQ-S-AF488(10mg/kg)を用いて追加実験を行った。Aβ沈着のインビボ検出は観察されたが強度は低下していた。この結果から、R3VQの脳浸透及び脳Aβ病変を標識する能力は用量依存性であることが示唆され、IHCにより確証された(図16D)。
pIが約7.5であるマレイミド-AF488接合R3VEも作製した(図17A及びB)(VHH R3VEは上述のとおりである)。10mg/kg用量のR3VE-S-AF488をPS2APPマウスに静脈内注射した。注射の45分後、脳アミロイド血管症のみが観察され、アミロイド斑は標識されなかった(図17C)。R3VE-S-AF488の静脈内注射の4時間後、脳を採集し、5μm厚パラフィン切片を作製した。次いで、抗His mAbを用いてIHCを行い、脳内でR3VE-S-AF488の存在を検出した(図17D)。同一用量のR3VQ-S-AF488を用いて観察された結果(上記及び図16Dを参照)と比べると、アミロイド斑の非常に限定的な標識が脳全体にわたって観察されたにすぎない。このことから、VHHの表面に存在する正電荷が、BBBを横断するこの抗体の脳浸透に関して、或る役割を担っていることが示唆される。
アミロイドフリーマウスにおける評価
R3VQ-S-AF488をアミロイドフリー野生型マウスC57BL/6に静脈内注射した。二光子顕微鏡観察アッセイにより、脳実質で、非特異的なインビボ染色が観察された(データは示さず)。
従来型IgG抗体との比較
PS2APPマウスへのmAb 4G8-AF488のiv注射では、二光子撮像によりCAAのみが検出され、アミロイド斑は検出されなかった。このことから、この標準の抗Aβイムノグロブリンの有意な血管外漏出はないことが示された(図18)。
二光子実験に用いたPS2APPマウス(2年齢)のBBB透過性を、DOTAREMをiv注射(0.2ml Gd 500mM)して試験した。このMRI造影剤は、血液脳関門の局所漏出を導く病的状態を除き、BBBを横断することができない。ヒトにも用いられるこのMRI検査は、BBB損傷領域で信号増大を示す(V. M. Rungeら, American Journal of Roentgenology, 1994, 162, 431-435;M. A. Ibrahimら, Investigative radiology, 1998, 33, 153-162)。試験したマウスに信号変化がないことから、BBBの完全性が示唆された。他の2匹の年齢適合PS2APPマウスについても、同じ方法でMRI評価を行った。BBBの損傷は観察されなかった(データは示さず)。
Claims (29)
- アミノ酸配列が、N末端からC末端へ、配列番号1のアミノ酸配列(CDR1に相当)、配列番号2のアミノ酸配列(CDR2に相当)及び配列番号3のアミノ酸配列(CDR3に相当)を含んでなることを特徴とする、原線維形態のアミロイドβを指向する単離されたラクダ科動物重鎖抗体可変ドメイン(VHH)。
- 配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号7からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項1に記載のVHH。
- 請求項1又は2に記載のVHHを含んでなるポリペプチドからなり、該ポリペプチドに含まれる前記VHHは原線維形態のアミロイドβに結合することができるVHH誘導体。
- 配列番号8のアミノ酸配列を有することを特徴とするVHH誘導体。
- 請求項1若しくは2に記載のVHH又は請求項3若しくは4に記載のVHH誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチドを、宿主細胞における該ポリヌクレオチドの転写の調節を可能とする転写プロモーターの制御下に含んでなる組換え発現カセット。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチド又は請求項6に記載の組換え発現カセットを含んでなる組換えベクター。
- 請求項6に記載の組換え発現カセット又は請求項7に記載の組換えベクターを含有する宿主細胞。
- 興味対象の物質に、直接又は間接に、共有結合的又は非共有結合的に結合した請求項1若しくは2に記載のVHH又は請求項3若しくは4に記載のVHH誘導体を含んでなる診断薬又は治療薬。
- 興味対象の物質がペプチド、酵素、核酸、ウイルス及び化学物質から選択されることを特徴とする請求項9に記載の治療薬。
- 診断用化合物が酵素、蛍光体、NMR又はMRI造影剤、放射性同位体又はナノ粒子からなる群より選択されることを特徴とする請求項9に記載の診断薬。
- 診断用化合物が常磁性体ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、並びに酸化鉄又は鉄白金をベースとする超常磁性体、並びにX核、例えば18F、13C、23Na、17O、15Nから選択されるNMR又はMRI造影剤であることを特徴とする請求項10に記載の診断薬。
- 治療用化合物が鎮痛化合物、抗炎症化合物、抗抑うつ化合物、細胞毒性化合物、抗痙攣化合物又は抗神経変性化合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項9又は10に記載の治療薬。
- 興味対象の物質が請求項10〜13のいずれか1項に規定の診断又は治療用化合物を含んでなるリポソーム又はポリマー性物質であることを特徴とする請求項9に記載の診断薬又は治療薬。
- 請求項1若しくは2に記載のVHH又は請求項3若しくは4に記載のVHH誘導体と興味対象の物質とをカップリングする非部位特異的方法であって、興味対象の物質と請求項1若しくは2に記載のVHH又は請求項3若しくは4に記載のVHH誘導体との接合工程を含んでなる方法。
- 興味対象の物質がペプチド、酵素、核酸、ウイルス、蛍光体、NMR又はMRI造影剤、化学物質、放射性同位体及びナノ粒子からなる群より選択される診断用又は治療用化合物である請求項15に記載の非部位特異的方法。
- 興味対象の物質がNMR又はMRI造影剤及び金属の放射性同位体から選択される診断用化合物である請求項16に記載の非部位特異的方法。
- 以下の工程:
(i)エステル又は無水物の形態、好ましくはエステルの形態の活性化されたキレート剤を、請求項1若しくは2に記載のVHH又は請求項3若しくは4に記載のVHH誘導体のリジン残基と接合する工程、及び
(ii)工程(i)のリガンドを興味対象の物質でキレート化する工程
を含んでなる請求項17に記載の非部位特異的方法。 - 以下の工程:
(i')興味対象の物質を、エステル又は無水物の形態、好ましくはエステルの形態の活性化されたキレート剤でキレート化する工程、及び
(ii')工程(i')の予備キレート化した興味対象の物質を、請求項1若しくは2に記載のVHH又は請求項3若しくは4に記載のVHH誘導体のリジン残基と接合する工程
を含んでなる請求項17に記載の非部位特異的方法。 - 興味対象の物質が常磁性体ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、並びに酸化鉄又は鉄白金をベースとする超常磁性体、並びにX核、例えば18F、13C、23Na、17O、15Nから選択されるNMR又はMRI造影剤である請求項18又は19に記載の非部位特異的方法。
- キレート剤が1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,4,7-トリス(カルボキシメチルアザ)シクロドデカン-10-アザアセチルアミド(DO3A)、ニトリロ三酢酸(NTA)、D-ペニシラミン(Pen)、2,3-ジメルカプトコハク酸(DMSA)、2,3-ジメルカプト-1-プロパンスルホン酸(DMPS)、2,3-ジメルカプトプロパノール(BAL)、トリエチレンテトラミン(Trien)、テトラチオモリブデン酸アンモニウム(TTM)アニオン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2-(p-イソチオシアナトベンジル)-6-メチル-ジエチレントリアミン五酢酸(IB4M)又はヒドロキシピリジノン(HOPO)から選択される請求項18又は19に記載の非部位特異的方法。
- 興味対象の物質がガドリニウム(Gd)であり、キレート剤がDOTAである請求項18又は19に記載の非部位特異的方法。
- 請求項15〜22のいずれか1項に記載の非部位特異的方法に従って取得し得る、興味対象の物質に接合したVHH。
- 請求項1若しくは2に記載のVHH又は請求項3若しくは4に記載のVHH誘導体及び診断薬を少なくとも含んでなる、脳撮像のため、又はアミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群の診断若しくはモニタリングのためのキット。
- 対象者における、アミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群の診断又はモニタリングのための、請求項9〜12及び14のいずれか1項に記載の診断薬の使用。
- 対象者において、アミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群を診断するためのインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程:
a)インビトロで、前記対象者からの適切な生物学的サンプルを請求項9〜12及び14のいずれか1項に記載の診断薬と接触させる工程、及び
b)前記生物学的サンプルにおいて、アミロイド斑のようなアミロイドβ沈着の存否を決定する工程
を含んでなり、アミロイドβ沈着の存在が、対象者がアミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群を有することを示す方法。 - 対象者において、アミロイドβ沈着により媒介される疾患、例えばアルツハイマー病及びダウン症候群の進行又は退行をモニターするためのインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程:
a)インビトロで、前記対象者からの適切な生物学的サンプルを請求項9〜12及び14のいずれか1項に記載の診断薬と接触させる工程、
b)前記生物学的サンプルにおいて、原線維形態のアミロイドβの量を測定する工程、及び
c)工程(b)で測定した量を、前記対象者について以前に得た原線維形態のアミロイドβの量と比較する工程
を含んでなり、原線維形態のアミロイドβの量の有意な増加がアミロイドβ沈着により媒介される疾患の進行のマーカーを構成し、原線維形態のアミロイドβの有意な減少がアミロイドβ沈着により媒介される疾患の退行のマーカーを構成する方法。 - 対象者におけるアミロイドβ沈着のインビボ画像化法であって、以下の工程:
a)対象者、好ましくはヒトに検出可能量の請求項9〜12及び14のいずれか1項に記載の診断薬を投与する工程、及び
b)前記対象者における診断薬を画像化法により検出する工程
を含んでなる方法。 - 請求項9、10、13及び14のいずれか1項に記載の治療薬及び医薬的に許容され得るキャリアを含んでなる医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13306553.2 | 2013-11-13 | ||
EP20130306553 EP2873679A1 (en) | 2013-11-13 | 2013-11-13 | Camelid single-domain antibody directed against amyloid bêta and methods for producing conjugates thereof |
PCT/IB2014/066019 WO2015071856A1 (en) | 2013-11-13 | 2014-11-13 | Camelid single-domain antibody directed against amyloid bêta and methods for producing conjugates thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017503475A true JP2017503475A (ja) | 2017-02-02 |
JP6546166B2 JP6546166B2 (ja) | 2019-07-17 |
Family
ID=49619859
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016530013A Active JP6546166B2 (ja) | 2013-11-13 | 2014-11-13 | アミロイドβを指向するラクダ科動物単一ドメイン抗体及びその接合体を製造する方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9738712B2 (ja) |
EP (2) | EP2873679A1 (ja) |
JP (1) | JP6546166B2 (ja) |
KR (1) | KR102306065B1 (ja) |
CN (1) | CN105916879B (ja) |
WO (1) | WO2015071856A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020004492A1 (ja) * | 2018-06-26 | 2020-01-02 | 協和キリン株式会社 | Cell Adhesion Molecule3に結合する抗体 |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10112988B2 (en) * | 2012-01-09 | 2018-10-30 | Icb International, Inc. | Methods of assessing amyloid-beta peptides in the central nervous system by blood-brain barrier permeable peptide compositions comprising a vab domain of a camelid single domain heavy chain antibody against an anti-amyloid-beta peptide |
EP2873680A1 (en) * | 2013-11-13 | 2015-05-20 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Oligopeptide and methods for producing conjugates thereof |
US20170267784A1 (en) | 2014-10-23 | 2017-09-21 | Singh Molecular Medicine, Llc | Single domain antibodies directed against intracellular antigens |
EP3101012A1 (en) | 2015-06-04 | 2016-12-07 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | New gadolinium chelate compounds for use in magnetic resonance imaging |
TWI746473B (zh) | 2015-11-02 | 2021-11-21 | 美商辛分子醫藥有限公司 | 針對細胞內抗原之單域抗體 |
CN105542005B (zh) * | 2016-02-03 | 2018-11-09 | 大连理工大学 | 一种抗人淀粉样β肽的纳米抗体及其应用 |
US10975060B2 (en) | 2016-11-28 | 2021-04-13 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | High relaxivity gadolinium chelate compounds for use in magnetic resonance imaging |
EP3883613A1 (en) | 2018-11-23 | 2021-09-29 | Bayer Aktiengesellschaft | Formulation of contrast media and process of preparation thereof |
TW202300517A (zh) | 2021-03-12 | 2023-01-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 抗類澱粉β抗體及其用途 |
WO2022251048A1 (en) | 2021-05-24 | 2022-12-01 | Eli Lilly And Company | Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof |
CN116942857A (zh) * | 2023-08-14 | 2023-10-27 | 江南大学 | 一种手性含铁超粒子纳米材料及其制备方法与其在磁共振造影剂中应用 |
CN117471007B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-08-09 | 广东省中医院(广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院) | 一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1129593A (ja) * | 1997-04-18 | 1999-02-02 | Bracco Spa | アミノ基を含む分子とキレート化剤の結合方法 |
JP2007535492A (ja) * | 2003-12-01 | 2007-12-06 | イムノメディクス, インコーポレイテッド | タンパク質とキレート剤とのコンジュゲートを調製するための改良された方法 |
JP2008515446A (ja) * | 2004-10-13 | 2008-05-15 | アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ | アミロイド−βに対するナノ抗体及びアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療のためのナノ抗体TMを含むポリペプチド |
JP2009508521A (ja) * | 2005-09-23 | 2009-03-05 | アカデミッシュ ジーケンハイス レイデン | タンパク凝集に関連する疾患の診断予防及び治療のためのvhh |
JP2010533130A (ja) * | 2007-06-29 | 2010-10-21 | インスティティ・パスツール | 目的物質の送達用ペプチドベクターの製造のためのvhh抗体の使用及びその適用 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4666829A (en) | 1985-05-15 | 1987-05-19 | University Of California | Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis |
US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
FR2846667B1 (fr) | 2002-11-06 | 2004-12-31 | Pasteur Institut | Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives |
EP2009445A1 (en) * | 2007-06-29 | 2008-12-31 | Institut Pasteur | Use of a camelid single-domain antibody for detecting an oligomeric form of an amyloid beta peptide and its applications |
EP2143735A1 (en) | 2008-07-10 | 2010-01-13 | Institut Pasteur | Variable domains of camelid heavy-chain antibodies directed against glial fibrillary acidic proteins |
US10112987B2 (en) * | 2012-01-09 | 2018-10-30 | Icb International, Inc. | Blood-brain barrier permeable peptide compositions comprising a vab domain of a camelid single domain heavy chain antibody against an amyloid-beta peptide |
-
2013
- 2013-11-13 EP EP20130306553 patent/EP2873679A1/en not_active Withdrawn
-
2014
- 2014-11-13 JP JP2016530013A patent/JP6546166B2/ja active Active
- 2014-11-13 CN CN201480063897.0A patent/CN105916879B/zh active Active
- 2014-11-13 EP EP14808730.7A patent/EP3068799B1/en active Active
- 2014-11-13 KR KR1020167013619A patent/KR102306065B1/ko active IP Right Grant
- 2014-11-13 US US15/035,582 patent/US9738712B2/en active Active
- 2014-11-13 WO PCT/IB2014/066019 patent/WO2015071856A1/en active Application Filing
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1129593A (ja) * | 1997-04-18 | 1999-02-02 | Bracco Spa | アミノ基を含む分子とキレート化剤の結合方法 |
JP2007535492A (ja) * | 2003-12-01 | 2007-12-06 | イムノメディクス, インコーポレイテッド | タンパク質とキレート剤とのコンジュゲートを調製するための改良された方法 |
JP2008515446A (ja) * | 2004-10-13 | 2008-05-15 | アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ | アミロイド−βに対するナノ抗体及びアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療のためのナノ抗体TMを含むポリペプチド |
JP2009508521A (ja) * | 2005-09-23 | 2009-03-05 | アカデミッシュ ジーケンハイス レイデン | タンパク凝集に関連する疾患の診断予防及び治療のためのvhh |
JP2010533130A (ja) * | 2007-06-29 | 2010-10-21 | インスティティ・パスツール | 目的物質の送達用ペプチドベクターの製造のためのvhh抗体の使用及びその適用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
NEUROBIOL AGING, vol. 32, JPN6018024557, 2011, pages 1774 - 1783, ISSN: 0003827839 * |
PLOS ONE, vol. 7, JPN6018024559, 2012, pages 38284, ISSN: 0003827840 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020004492A1 (ja) * | 2018-06-26 | 2020-01-02 | 協和キリン株式会社 | Cell Adhesion Molecule3に結合する抗体 |
JPWO2020004492A1 (ja) * | 2018-06-26 | 2021-08-26 | 協和キリン株式会社 | Cell Adhesion Molecule3に結合する抗体 |
JP7397445B2 (ja) | 2018-06-26 | 2023-12-13 | 協和キリン株式会社 | Cell Adhesion Molecule3に結合する抗体 |
US11873337B2 (en) | 2018-06-26 | 2024-01-16 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Antibody binding to cell adhesion molecule 3 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3068799A1 (en) | 2016-09-21 |
EP2873679A1 (en) | 2015-05-20 |
CN105916879A (zh) | 2016-08-31 |
US9738712B2 (en) | 2017-08-22 |
JP6546166B2 (ja) | 2019-07-17 |
WO2015071856A1 (en) | 2015-05-21 |
CN105916879B (zh) | 2020-07-03 |
KR102306065B1 (ko) | 2021-09-29 |
EP3068799B1 (en) | 2019-08-28 |
US20160347831A1 (en) | 2016-12-01 |
KR20160102971A (ko) | 2016-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6546166B2 (ja) | アミロイドβを指向するラクダ科動物単一ドメイン抗体及びその接合体を製造する方法 | |
US11124563B2 (en) | Camelid single-domain antibody directed against phosphorylated tau proteins and methods for producing conjugates thereof | |
Li et al. | Camelid single-domain antibodies: A versatile tool for in vivo imaging of extracellular and intracellular brain targets | |
JP6914655B2 (ja) | オリゴペプチド及びその接合体を製造する方法 | |
US11498974B2 (en) | Brain delivery protein | |
Vandesquille et al. | Chemically-defined camelid antibody bioconjugate for the magnetic resonance imaging of Alzheimer's | |
Roche | Chemically-defined camelid antibody bioconjugate for the magnetic resonance imaging of Alzheimer’s disease 2 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170822 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180620 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180703 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181001 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181126 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181226 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190521 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190620 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6546166 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |