KR20160102971A - 올리고펩티드 및 그 결합체를 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아밀로이드 β 및 이의 결합체와 관련된 낙타과 중쇄 항체의 분리된 가변 도메인에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아밀로이드 β 침착에 의해 매개되는 질병을 치료하거나 진단하기 위한 이들 항체 결합체의 용도에 관한 것이다.

Description

올리고펩티드 및 그 결합체를 생산하는 방법 {CAMELID SINGLE-DOMAIN ANTIBODY DIRECTED AGAINST AMYLOID BETA AND METHODS FOR PRODUCING CONJUGATES THEREOF}
본 발명은 아밀로이드 β 및 그 결합체 (conjugates)와 관련된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아밀로이드 β 침착물에 의해 매개되는 질병을 치료하거나 진단하기 위한 이들 항체 결합체의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 또한 관심 물질 (기능적 결합체)과 결합된 VHH를 얻기 위한 결합 방법에 관한 것이며, 더욱 일반적으로는 관심 물질과 결합된 올리고펩티드에 관한 것이다.
모든 치매의 약 70%의 경우는 인지에 중요한 뇌 영역 및 신경 회로의 선택적 손상과 관련된 알츠하이머 질환 (AD)에 기인한다. 알츠하이머 질환은 특히 해마의 피라미드 뉴런 (pyramidal neurons) 및 대부분 아밀로이드 침착물의 밀집한 중심을 함유하고 후광을 발산하는 무수히 많은 아밀로이드 플라크에서의 신경원섬유 엉킴 (neurofibrillary tangles)을 특징으로 한다.
세포 외 신경염 플라크는 "아밀로이드 β", "A-베타", "아밀로이드 P", "AP4", "Aβ", "βA4", "P-A4" 또는 "AP"라고 불리는 대부분 섬유성인 다량의 펩티드를 함유한다 (Selkoe (1994), Ann. Rev. Cell Biol. 10, 373-403; Koo (1999), PNAS Vol. 96, 9989-9990 페이지; US 4,666,829 또는 Glenner (1984), BBRC 12, 1131를 참조할 것). 이러한 β 아밀로이드는 "알츠하이머 전구체 단백질/β-아밀로이드 전구체 단백질" (APP)로부터 유래된다. APP들은 막 내재성 당단백질이며 (Sisodia (1992), PNAS Vol. 89, 6075페이지 참고), 원형질막 프로테아제인 α-세크레타아제에 의하여 Aβ 서열 내부에서 내부단백질분해적으로 절단된다. 또 다른 세크레타아제의 활성, 특히 β-세크레타아제 및 γ-세크레타아제 활성은 39　아미노산 (Aβ39), 40 아미노산 (Aβ40), 42 아미노산 (Aβ42) 또는 43 아미노산 (Aβ43)과 같이 상이한 크기의 단백질을 포함하는 아밀로이드-β의 세포외 방출을 야기한다 (Sinha (1999), PNAS 96, 11094-1053; Price (1998), Science 282, 1078-1083; WO　00/72880 또는 Hardy (1997), TINS 20, 154를 참고할 것). Aβ는 인간의 형태가 전술된 Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43와 관련되어 있는 다수 개의 자연적으로 발생하는 형태를 갖는다고 알려져 있다. Aβ42 형태는 (N-말단으로부터 시작되는) 아미노산 서열 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (서열번호 12)를 갖는다. Aβ41, Aβ40, Aβ39에서, C-말단 아미노산 A, IA 및 VIA가 각각 결실되어 있다. Aβ43-형태에서 추가적인 트레오닌 잔기가 상기 서술된 서열 (서열번호 12)의 C-말단에서 포함되어 있다. APP 유전자의 돌연변이는 Aβ 서열의 변형 및 증가된 Aβ축적을 야기할 수 있다.
이러한 세포외 신경염 플라크의 주요 성분은 수용성인 Aβ40 또는 Aβ42 형태이다. 그러나, AD 병리학에서 중심 구조로서 비수용성 섬유성 아밀로이드에 대한 초기 집중이 지난 15년간 진행되어 왔다. 이는 인간 뇌에서 올리고머 Aβ의 수용성 분절의 발견과 같은 몇몇 놀라운 발견에 기인한다 (Kuo Y.M. et al.,1996, J Biol Chem, 271, 4077-81). 이들 분리된 용해성 올리고머는 배지에서 뉴런에 독성을 지녔다. 올리고머 Aβ의 존재 및 독성은 그 후 확인되었고 이들 구조에 ADDLs (Aβ-유래 용해성 리간드)라는 이름이 제안되었다 (Lambert M.P. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U.S.A., 95, 6448-53). 조건에 따라, ADDL 조성은 최대 24-량체까지 더욱 거대한 구조를 갖는 삼량체-육량체를 주요하게 포함한다. ADDL은 해마의 CA1 영역 및 내비 피질 (entorhinal cortex)에서 뉴런을 선택적으로 죽이는 동안 소뇌에서 뉴런을 남겨두는 중요한 영역적으로 선택적인 신경독성을 나타낸다. 또한, 올리고머는 래트 생체 (Walsh D.M. et al., 2002, Nature, 416, 535-9) 및 해마 절편에서 (Wang H.W. et al., 2002, Brain Res., 924, 133-40; Wang Q. et al., 2004, J　Neurosci., 24, 3370-8) 해마성 장기 강화 (long-term potentiation, LTP)를 저해할 수 있다. 인지 결함이 특히 활성을 갖는 삼량체, 더 낮은 빈도로는 이량체 및 사량체인 아밀로이드 β의 용해성 올리고머 형태의 낮은 함량에 직접적으로 연관된다는 점이 밝혀졌다 (Cleary J.P. et al., 2005, Nat Neurosc., 8, 79-84; Townsend M. et al., 2006, J Physiol, 572, 477-92).
아밀로이드 플라크는 알츠하이머 질환의 출현 훨씬 전 (최대 30년)에 출현하며 (Sperling R.A., 2011, Alzheimer's and Dementia, 7:280-92; Villemagne V.L., 2013, Lancet Neurol., 12:357-67), 아밀로이드 캐스케이드 가설에 따르면 아밀로이드는 모든 AD 병변을 야기하는 캐스케이드 과정에 관련되어 있다 (Hardy J.A., 1992, Science, 256:184-5). 따라서 아밀로이드의 초기 발견은 알츠하이머 질환 및 그 치료의 후속조치에 중요하다. 아밀로이드 플라크의 촬영은 또한 신약을 탐색하기 위하여 동물 모델에 있어서 중요하다.
아밀로이드 축적은 또한 혈관 병변에 연관될 수 있다 (아밀로이드 맥관장애). 아밀로이드는 다운증후군과 같은 다른 질환의 경로에서 유사한 형태로 축적된다.
아밀로이드 질환, 특히 알츠하이머 질환의 병변을 발견하기 위하여 몇몇 방법이 개발되었다. 최근에는, 인간에서 가장 광범위하게 사용되는 방법은 양전자 방사 단층 촬영 (PET)에 기초한다. 아밀로이드 부하는 11C-PIB (Klunk W.E., 2004, Ann Neurol., 55:306-19) 또는 18F-AV-45 (Doraiswamy P.M., 2012, Neurology, 79:1636-44)와 같은 PET 방사리간드를 사용함으로써 예를 들어 환자 생체 내 평가될 수 있으나, 동물에서는 더욱 곤란한 점이 있다. 화합물을 방사 표지해야하는 점은 PET-기반 방법의 주요한 단점이다. 인간에 있어서, 이는 이온화 방사능에 대한 노출을 야기한다. 임상 전 연구에서, 단지 제한된 수의 기관만이 방사능 화합물을 취급하도록 허용되어 있으며, PET 실험은 신약 개발을 위한 대규모 평가 및 통상적인 진단에는 사용될 수 없다. 또한, 11C (20분)와 같은 동위원소의 짧은 반감기는 PIB와 같이 11C에 기초한 리간드를 사용할 때, 그곳에 사이클로트론이 존재할 것을 필요로 한다. 18F에 기초한 리간드는 더욱 긴 반감기 (110분)를 가지나, 이러한 반감기도 여전히 상대적으로 짧다. 이는 신중한 계획을 필요로 하는 제한된 보관 기간을 갖는 방사추적자의 공급, 취급 및 관리와 관련하여 강력한 수송수단을 필요로 한다. 또한, PET 촬영은 해상도가 낮아 작은 뇌 크기의 AD 동물 모델에서 전형적인 임상 전 연구에 사용하는 것을 방해한다. 요약하자면, 환자 및 동물 모델 모두에 있어서, 생체 내 AD 및 다운 증후군 뇌 병변을 지체 없이 촬영할 수 있는 새로운 대안이 제시되어야 하는 것이다.
PET 촬영법 이외에, 핵자기공명 (NMR) 촬영 또는 자기공명 촬영 (MRI)이 AD 뇌 병변을 탐지하기 위하여 사용될 수 있다. 지난 십 여년 동안, MRI에 의해 플라크를 탐지할 수 있는 새로운 접근법을 개발하기 위한 수많은 노력이 행해졌다. 콘트라스트 촉진제 없이 수행되는 과정은 순환하는 철분의 아밀로이드 플라크 내에서 자연적으로 발생하는 축적에 기인한 몇몇 Aβ 축적의 시각화를 가능케 한다. 그러나, 아밀로이드 축적 내에서의 철분 축적은 인간에서는 낮을 수 있으며 (Dhenain M., 2002, NMR Biomed., 15:197-203), 질환의 후기 또는 생쥐의 국부적 뇌 영역에서만 발생한다. 몇몇 과정은 특이적인 콘트라스트 촉진제의 사용에 기초한다. 몇몇 그룹은 예를 들어 가돌리늄 (Gd) 또는 단결정 산화철 나노입자 (MION)로 자기적으로 표지된 Aβ-유래 펩티드를 이용하는 개발된 콘트라스트 촉진제를 갖는다 (Wadghiri, Y.Z., 2003, Magn Reson Med., 50:293-302; Poduslo, J.F., 2002, Neurobiol Dis., 11:315-329). 체외 및 체내 탐지가 이러한 방법들로 수행되어 왔으나, 여전히 높은 효율 및 재생성으로 수행될 수 없고 유해할 수 있는 혈액-뇌 장벽 (BBB)의 침투를 요한다 (예를 들어, 혈액-뇌 장벽을 일시적으로 개방하기 위한 만니톨의 사용). 따라서 이들 방법이 BBB를 개방해야 하는 요구의 단점을 지니며, 따라서 비-실험적 환경에서는 사용되지 않는다. 다른 그룹은 아밀로이드 플라크를 표적으로 하는 항체를 이용하여 아밀로이드를 표적화하기 위한 방법을 개발하였다 (Ramakrishnan, M., 2008, Pharm Res., 25:1861-1872). MRI에 의하여 아밀로이드 플라크를 탐지하기 위한 최근의 접근법은 BBB (폴리아민 변형 Fab 단편)를 통과하기 위한 증가된 잠재력을 나타내며, 아밀로이드 플라크를 표적화하는 작은 항체 단편의 사용에 기초한다. 이들 항체는 MRI에 의하여 이들의 탐지를 가능케 하는 콘트라스토포어 (contrastophore)에 연결된다 (Ramakrishnan, M., 2008, Pharm Res., 25:1861-1872). 그러나, 알부민과 같은 다른 거대 원형질 단백질과 마찬가지로, 항체는 BBB를 쉽게 통과하지 못하며 일반적으로 순환계의 원형질 구획에 갇히게 된다. BBB를 통하여 항체 분자를 더욱 효율적으로 운반하기 위한 잠재적인 한가지 방법은 표면 카르복실기가 일차 아미노기와 결합되고 항체의 등전점 (isoelectric point, pI)이 증가되는 양이온화 (cationization)이다 (Bickel U. et al., 2001, Adv Drug Deliv Rev., 46:247-279). 양이온화된 단백질의 양전하는 세포 표면의 음전하에 결합하며, 이러한 상호작용은 양이온화된 단백질의 세포 내부로의 흡수-매개 엔도시토시스를 촉발한다. 면역글로불린의 양이온화와 관련하여, 최근의 연구는 이러한 과정이 생체 외에서 분리된 뇌 모세혈관에 의하여 향상된 흡수 매개 엔도시토시스를 야기하며, 이러한 엔도시토시스 과정은 생체 내에서 양이온화된 IgG의 그물 통과세포외배출 (net transcytosis)을 야기한다는 것을 밝혔다. 양이온화된 항체를 적용하는 데 주요한 제한요인은 이들의 항원 결합 특성의 감소이다. 실질적으로, 통상적으로 항원과의 결합에 관여하는 아르기닌 및 리신이 양이온화 과정에 의하여 변형되기 때문에, 양이온화된 모노클론 항체의 친화도가 영향을 받게 된다 (Triguero D. et al., 1991, J Pharmacol Exp Ther. 258:186-192).
전형적인 면연글로불린은 약 150 kDa의 결합된 분자량을 가지며 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄로 구성되는 이종사량체 (heterotetramer)이다. 낙타과에서 상당량의 혈청 항체는 약 80 kD의 분자량을 갖는 동종이량체 (homodimeric) IgGs이다. 이들 중쇄 면역글로불린 (Ig)은 세 개의 도메인을 함유하며,이들의 가변영역은 VHH로 불린다. 재조합 VHHs (~12-14 kD 크기)는 완전한 항원-결합 도메인으로 구성되며, 광범위한 항원-결합 레퍼토리를 나타낸다. 이들의 고가변성 영역은 확장되며, 더욱 친수성인 아미노산에 의하여 (전형적인 항체의 VL과 상호작용하는) 세 개 내지 네 개의 소수성 틀 잔기의 치환체와 같은 독특한 특성을 나타낸다. 확장된 CDR를 안정화시키기 위하여, VHHs는 기본 이황화 결합에 부가하여 단봉낙타에서는 CDR1와 CDR3 사이에 라마에서는 CDR2와 CDR3사이에 추가적인 이황화 결합을 지닐 수 있다 (Harmsen, M.M. and De Haard H.J., 2007, Appl Microbiol Biotechnol., 77:13-22; Muyldermans S., 2001, J Biotechnol., 74:277-302). 전형적인 파라토프 (paratopes)는 오목 또는 편평한 구조에 국한되는 반면, 확장된 CDR3 루프는 볼록 형태를 취할 수 있다 (Muyldermans S., 2001, J Biotechnol., 74:277-302). 이러한 특성은 VHHs가 전형적인 항체에는 거의 면역력이 없는 독특한 에피토프를 인지하는 것을 가능케 한다 (Lafaye P. et al., 2009, Mol Immuno., 46:695-704; Wernery U., 2001, J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health., 48:561-568). VHHs가 처음에는 모든 결합 효과가 배제되는 일가 항체로 정의될지라도, 생체 외에서 IC50으로 측정된 이들의 생물학적 활성은 전형적이 이가 항체 분자와 유사할 수 있다 (Thys B. et al., 2010, Antiviral Research., 87:257-264).
동종이량체 VHHs가 생체 내 면역진단에 대하여 새로운 관점을 제공할 것이라고 제안되었다. 파아지 디스플레이와 같은 방법이 항원-특이적인 VHH를 면역된 낙타 또는 라마의 VHH 레퍼토리로부터 선택하기 위하여 기술되어 왔다. VHH 유전자는 파아지 디스플레이 벡터에서 복제되며, 항원 바인더는 패닝 (panning)에 의하여 획득되고 선택된 VHH는 세균 내에서 발현된다. 재조합 VHHs는 단지 하나의 도메인만이 복제되어야 하고, 이들 VHHs가 잘 발현되며, 수성 환경에서 고용해성이고 고온에서 안정하기 때문에, 전형적인 항체 단편 (Fab or scFv)과 비교하여 많은 장점을 갖는다. 약 12-14　kDa인 이들의 작은 크기 때문에, VHHs는 약 60 kDa의 한계를 갖는 신장 필터를 신속하게 통과하며, 이로 인하여 신속한 혈액 정화가 가능하다. 또한, 작은 크기는 신속한 조직 관통을 가능케 한다. scFv에 대하여는 4시간이고 IgG에 대하여는 50시간인 것과 비교하여, VHH의 약 2시간인 짧은 혈청 반감기는, 비특이적으로 결합된 VHH가 빠르게 조직으로부터 제거될 것이라는 것이 예상되기 때문에, 영상법을 이용하는 생체 내 진단 및 장애 치료에서 장점이 된다.
Li T. 등 (2012, Faseb J., 26:3969-3979)은 성상세포 (astrocytes)에 특이적인 매개 섬유 단백질인, GFAP에 대향되는 VHHs를 획득했다. 살아있는 생쥐에서 내-경동맥 투여를 이용함으로써, 기 저자들은 이러한 고유의 VHHs가 BBB를 자연스럽게 통과할 수 있고, 뇌 세포로 확산될 수 있으며, 성상세포 내로 침투할수 있고 GFAP 에피토프를 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 트랜스바디 (transbodies)로 역할한다는 점을 밝혔다 (국제출원 WO 2010/004432를 또한 참고할 것).
더욱 일반적으로, 적어도 8.5의 등전점을 갖는 VHH는 미소음 세포 활동 (micropinocytosis) 및 흡수 매개 엔도시토시스에 의하여 BBB를 가로질러 이동할 수 있다. 이러한 VHH는 관심 물질을 포유동물 혈액-뇌 장벽을 가로질러 운반하기 위하여 펩티드 벡터의 관통에 사용될 수 있다 (국제출원 WO 2009/004495 및 WO　2010/004432).
국제출원 WO 2004/044204는 생체 내에서 아밀로이드 β 펩티드 42 (Aβ42)에 특이적으로 결합할 수 있는 낙타과 단쇄 항체 (VHHs)의 가변적인 단편의 라이브러리의 제조를 개시한다. 이들 VHHs는 라마 카포스 (Lama pacos)를 Aβ42로 면역화시킴으로써 획득되었다. 이러한 VHHs 중에서, VHH V31-1로 불리는 하나의 특이한 VHH가 ELISA에 의하여 섬유 형태로 그리고 면역 조직화학에 의하여 신경 내부 Aβ42에서 Aβ42 펩티드 (Aβ42)의 카르복실 말단을 특이적으로 인식하는 것으로 기술되었다. 그러나, 국제출원 WO 2009/004494에서, 국제출원 WO 2009/044204의 발명자들은 WO　2004/044204에서 기술된 것과 대조되는 면역 조직화학에 의하여 VHH V31-1이 수용성 섬유성 형태로 Aβ42를 인식하지 않는 반면, 특이적으로 Aβ42의 수용성 저분자 올리고머 (즉, 단량체, 이량체, 사량체, 및 십이량체)를 인식한다는 점을 명확하게 나타내었다 (Lafaye P. et al., 2009, Mol Immunol., 46:695-704를 또한 참고할 것). 국제출원 WO 2009/004494에서, 국제출원 WO 2009/044204의 발명자들은 WO 2004/044204에 개시된 두 개의 VHHs, 즉 VHH 61-3 및 VHH L1-3을 더욱 연구하였다. 이들은 면역 조직화학에 의하여 염색된 AD 뇌 조직 절편이 VHH 61-3에 대하여 매우 경미한 뉴런 내 면역반응성을 나타내고, VHH L1-3에 대하여 탐지할 수 없을 정도의 뉴런 내 면역반응성을 나타낸다는 점을 밝혔다.
Rutgers K.S. 등 (2011, Neurobiol. Aging, 32:1774-83)은 파아지 디스플레이에 의하여 아밀로이드 β에 대하여 특이적인 8 개의 라마-유래 중쇄 항체 단편 (VHHs)을 비-면역 및 면역 라이브러리로부터 선별하는 것과 파아지-ELISA, 면역 조직화학 및 표면 플라즈몬 공명에 의한 이들의 아밀로이드 β에 대한 친화도 및 특이성을 보고한다. 상기 저자들은 8개의 VHHs는 생체 외에서 구분되는, 즉 구분되는 면역원과 일치하는 아밀로이드 β 에피토프를 인식한다는 점을 밝혔다. 상기 저자들은 또한 이들 VHHs의 3개는 혈관성 및 유조직성 (parenchymal) 아밀로이드 β 축적물을 인식하는 반면, 나머지 5개의 VHHs는 (유조직성 아밀로이드 β에 결합하지 못하며) 혈관성 아밀로이드 β를 특이적으로 인식한다는 점을 밝혔다. 상기 저자들은 혈관성 및 유조직성 아밀로이드 β 축적물이 에피토프 존재/가용성 면에서 불균일 (heterogeneous)하며, 아밀로이드 β에 특이적인 VHHs가 혈관성 및 유조직성 아밀로이드 β 축적물을 구분하기 위한 생체 내 영상법에 대한 반응제로서 사용될 수 있다고 결론 내렸다.
Nabuurs R.J.A. 등 (2012, PLoS One, 7:e38284)은 생체 내에서 Rutgers 등에 의하여 개시된 두 개의 VHHs, 즉 VHHs ni3A 및 pa2H를 더욱 특징지었다. 상기 저자들은 Rutgers 등에서 보고된 것과는 상반되게, 두 VHHs 모두 혈관성 및 유조직성 아밀로이드 β 축적물에 대한 친화도를 나타냄을 발견하였다. 실제로, Rutgers K.S. 등은 면역 조직화학을 통해 ni3A는 인체 조직에서 단지 혈관성 아밀로이드 β만을 특이적으로 표적화함을 보고하였다. Nabuurs R.J.A. 등은 VHHs ni3A 및 pa2H가 생체 내 영상법에 사용되기에는 너무 낮은 뇌 흡수율을 갖는다는 점을 추가로 보고하였다.
따라서, 아밀로이드 β 축적물에 의하여 매개되는 질병을 진단할 수 있고, 이러한 질병, 특히 알츠하이머 질환 및 다운증후군의 경과를 생체 내에서 신경 영상법에 의하여 관찰할 수 있는 수단 및 방법이 요구된다. 또한, 이러한 질병을 치료할 수 있는 수단 및 방법이 요구되기도 한다.
본 발명에 이르도록 한 전체적인 연구에서, 본 발명자들은 알파카 (alpaca)를 Aβ42로 면역화시켰다. 이들은 R3VQ 및 R3VE라고 불리는 두 개의 VHHs를 획득하였다. R3VQ 및 R3VE는 각각 아미노산 서열 4 및 5를 가지며, 모두 아미노산 서열 1의 CDR1 (상보성 결정 영역 1), 아미노산 서열 2의 CDR2, 및 아미노산 서열 3의 CDR3을 포함한다. R3VQ는 아미노산 서열의 위치 7에서 단지 하나의 아미노산만이 R3VE와 다르며, R3VQ 및 R3VE의 7번 잔기는 각각 글루타민 (Q) 및 글루탐산 (E)이다. VHHs R3VQ 및 R3VE 모두의 아미노산 서열의 처음 3개의 잔기 (M-A-E) 및 마지막 2개의 잔기 (S-S)는 이들 VHHs의 특성에 변화를 주지 않는 채로 제거될 수 있다. 이들 아미노산 잔기가 결실된 VHHs R3VQ 및 R3VE는 구분없이 각각 R3VQ 및R3VE로 지칭된다. R3VQ 및 R3VE는 유사한 특성을 지닌다.
ELISA 및 면역 조직화학으로 생체 내에서 평가될 때, R3VQ 및 R3VE는 Ab에 대한 유사한 결합 특성을 지닌다. VHH R3VQ은 아밀로이드 β의 섬유상 형태를 특이적으로 인식할 수 있으나, 올리고머 (즉, 비-섬유성) 형태는 특이적으로 인식하지 못한다. 면역 조직화학 기법을 이용함으로써, 본 발명자들은 (VHH R3VE와 마찬가지로) 이러한 VHH가 죽은 생쥐 모델로부터 채취한 아밀로이드 축적을 지니는 뇌 절편 상에서와 마찬가지로 인간 AD 뇌 조직 샘플에 존재하는 아밀로이드 플라크를 특이적으로 표지한다는 점을 발견하였다.
VHH R3VQ는 또한 생체 내에서 포유동물의 비타협적인 혈액 뇌 장벽을 가로지를 수 있다.
또한, VHH R3VQ를 하기 전략에 따라, MRI 콘트라스트제 (contrast agent), 및 킬레이트제와 같은 관심 물질에 결합시켰다:
- 일차 전략은 위치 비-특이적인 접근을 이용하는 것이었으며, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)과 같은 킬레이트제와 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체의 리신 잔기의 결합단계와, 이어 획득된 리간드와 상자성 제재인 가돌리늄 (Gd) 등의 MRI 콘트라스트제와 같은 관심 물질 간의 킬레이션 단계를 포함하였다. IHC 및 MRI에 의하여 생체 내에서 평가되었을 때, R3VQ-N-(DOTA/Gd)n' 결합체 (도 9, 화합물 2)는 생쥐에서 뇌 혈관 내 주입 후에 아밀로이드 플라크를 인식할 수 있었다.
- 이차 전략은 VHH R3VQ의 결합을 수반하는 위치 특이적인 접근, 및 더욱 일반적으로 관심 물질을 함유하는 티올-반응 화합물, 바람직하게는 관심 물질을 함유하는 말레이미도 화합물로 티오-부가 (결합단계)에 의하여 C- 또는 N-말단에 시스테인 잔기를 포함하는 모든 VHH의 표지를 이용하는 것이었다.
상기 위치 비-특이적인 결합은 초기 버퍼 교환이 요구되는 반면, R3VQ-SH 3 와 말레이미도-(DOTA/Gd)3 4 간의 위치 특이적인 결합은 PBS/NaCl/이미다졸 버퍼 내에서 직접적으로 수행될 수 있었다. 시스테인 상에서의 특이적인 티오-부가는 A. Papini et al., Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 39, 348-355; B. Rudolf et al., J. Organomet. Chem, 1996, 522, 313-315; J. Paulech et al., Biochim. Biophys. Acta, 2013, 1834, 372-379에서 종래 언급된 어떠한 잠재적인 부반응 (side reaction)도 없이, 상기 전략이 다단계의 반응을 줄일 수 있도록 하고, 과정의 전체 수율을 개선할 수 있는 온화한 조건에서 효율적으로 제어될 수 있었다. 따라서, VHH의 리신 또는 히스티딘 상에서 어떠한 부반응도 없고, 기능 및 VHH 구조가 전체적으로 유지되는 채로 상당한 정도로 전체 수율을 개선한다는 점은 놀라운 것이다.
재조합 단백질은 부동화된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의하여 이들의 정제가 가능한 His-태그로 통상적으로 발현된다. Ni2 + 니트릴로트리아세트산 수지를 사용할 때, 이들은 전형적으로 500 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 버퍼로 배출된다. 위치 비-특이적인 접근 (도 9a)에 있어서, 이미다졸의 질소는 NHS 에스터 용해를 촉진할 수 있으며 (즉,반응성 물질을 분해시킴), 이에 따라 결합을 방해한다 (G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 2013; P.　Cuatrecasas et al., Biochemistry, 1972, 11, 2291-2299). 따라서, 이미다졸을 제거하기 위하여 업스트림 친화도 정제와 상기 결합 간의 과정에 버퍼 교환 단계가 반드시 포함되어야 한다. 전체 수율은 60 내지 67%에 이른다. 버퍼 교환 (도 9b, 방법 1) 후에 일차 위치 특이적 실험 (도 9b)이 또한 수행되었으며, 이를 통해 70%의 수율로 결합체 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5를 얻었다. 몇몇 그룹에 의하여 이전에 보고된 바와 같이, 이미다졸과 말레이미드기 간의 부반응이 예상되었으며, 이는 히스티딘 측쇄 알킬화를 나타내었다 (A. Papini et al.; B. Rudolf et al.; J. Paulech et al.). 그럼에도, 말레이미도-(DOTA/Gd)3 4는 친화도 칼럼 배출 버퍼 (도 9b, 방법 2)에서 말레이미드 제재의 제한된 초과로, 또한 이미다졸의 다량의 몰량 초과에도 불구하고 R3VQ-SH VHH 3에 직접적으로 결합될 수 있었다. 이러한 두 번째 전략은 83%의 전체 수율을 나타내었다.
따라서, 본 발명은 아밀로이드 β의 섬유상 형태에 대한 (VHH라고 불리는) 낙타과 중쇄 항체의 분리된 가변 도메인을 제공하며, 그 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로, 아미노산 서열번호 1 (CDR1에 대응), 아미노산 서열번호 2 (CDR2에 대응) 및 아미노산 서열번호 3 (CDR3에 대응)을 포함한다.
바람직한 구현 예에서, 상기 VHH는
- R3VQ의 전장 형태에 대응된,서열번호 4,
- R3VE의 전장 형태에 대응되는 서열번호 5,
- R3VQ의 단편 형태에 대응되는 서열번호 6, 및
- R3VE의 단편 형태에 대응되는 서열번호 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성되며, 바람직하게는 서열번호 4 및 6으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
선행 특색에 부가하여, 본 발명은 본 발명을 예시하는 실시 예뿐만 아니라 첨부된 도면에 관한 하기 상세한 설명으로부터 드러난 다른 특색을 더욱 포함한다.
도 1은 인간 파라핀 절편 상에서 VHH R3VQ를 이용한 아밀로이드 플라크의 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 6F3D (Akiyama H. et al., 1996, Neurosci lett., 206:169-72)가 비교 항-Aβ 항체로 사용되었다.
도 2는 신선한 인간 AD 뇌조직 (a 및 b)상에서 VHH R3VQ를 이용한 아밀로이드 β 플라크의 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 4G8 (Wisniewski T. et al., 1996, B. Biochem J., 313:575-80)가 비교 항-Aβ 항체로 사용되었다 (c 및 d).
도 3은 신선한 형질전환 TauPS2APP 생쥐 조직 (a)상에서 VHH R3VQ를 이용한 아밀로이드 플라크의 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 4G8가 비교 항-Aβ 항체로 사용되었다 (b).
도 4는 VHH R3VQ (페놀 레드-프리 Ham's F12 배지 (Gibco) 또는 프로테아제 저해제 [200　㎍/㎖ PMSF, 2 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 4 ㎍/㎖ 류펩틴, 30 ㎍/㎖ 벤즈아미딘 염산염]를 함유하는 버퍼 A [PBS, pH 7.4, 0.32 M 수크로오스, 50 mM Hepes, 25 mM MgCl2, 0.5 mM DTT])에 의하여 밝혀진 인간 뇌 추출물 및 Aβ42 상에서의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 5a는 VHH R3VQ의 정위 (stereotaxic) 주입 후의 신선한 형질전환 TauPS2APP 생쥐 파라핀 침적 절편에서 아밀로이드 β 플라크의 면역조직화학적 염색을 나타낸다.
도 5b는 도 5a의 확대도이다.
도 6a는 R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 2e의 정위 주입 후의 신선한 형질전환 TauPS2APP 생쥐 파라핀 침적 절편에서 아밀로이드 β 플라크의 면역조직화학적 염색을 나타낸다.
도 6b는 도 6a의 확대도이다.
도 6c는 주입 위치에서 멀리 떨어진 곳의 시상에서 존재하는 아밀로이드 β플라크의 표지를 나타낸다.
도 6d는 도 6c의 확대도이다.
도 6e는 동일한 생쥐에게 4G8 항체로 아밀로이드 플라크를 표지하기 위하여 수행된 대조구를 나타낸다.
도 7a는 항-Aβ VHH-Gd 2e (R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 콘트라스트제 (0.02 mg/ml, 0.01mM의 Gd에 상응함) 용액에서, 형질전환 TauPS2APP 생쥐 뇌의 흡수 후에, 시험관 내에서 MR 영상은 낮은 강도의 점 (흰색 화살표)을 나타낸다.
도 7b는 Gd-염색에 의하여 밝혀진 동일한 생쥐 상에서의 아밀로이드 플라크의 MRI 검출을 나타낸다.
도 7b는 동일한 생쥐 (화살표) 상에서 Gd-염색에 의하여 밝혀진 아밀로이드 플라크의 MRI 동위치 지정을 나타낸다.
도 7c는 동일한 생쥐 (화살표) 상에서 아밀로이드 β 플라크의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 7d는 동일한 농도 (0.01 mM)에서 R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 2e를 이용하여 가돌리늄 용액으로 흡수시킨 형질전환 TauPS2APP 생쥐의 대조구를 나타낸다.
도 8a는 뇌실 내 주입 후, 항-Aβ VHH-Gd 2e (R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2; 1㎍/㎖에서 1㎖/측)가 해마 (흰색 화살표)에서 생체 외 MR 영상에서 낮은 강도의 점을 나타내었다.
도 8b는 동일한 생쥐 (화살표) 상에서 Gd-염색에 의하여 밝혀진 아밀로이드 플라크의 MRI 동위치 지정을 나타낸다.
도 8c는 동일한 생쥐 (화살표)의 아밀로이드 β 플라크의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 8d는 동일한 농도 (0.01 mM)에서 R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2를 이용하여 형질전환 TauPS2APP 생쥐에 가돌리늄 용액을 주입한 대조구를 나타낸다.
도 9는 위치 비-특이적인 접근 (a) 및 위치 특이적인 접근 (b)에 의한 표지된 VHH (R3VQ)의 합성을 나타낸다. VHHs 1 및 3은 PBS/NaCl/이미다졸 버퍼에서 친화도 칼럼으로부터 배출되었다. 1은 버퍼 교환 (a) 후에 위치 비-특이적인 접근에 의한 결합과 관계되었으며, 3은 위치 특이적인 방법 (b)에 의하여 버퍼 교환과 함께 (방법 1) 또는 버퍼 교환 없이 (방법 2) 결합되었다. 접합 위치가 단백질 상에 표시되어 있다. 표지는 각각 다분산 혼합물 (실시 예로 나타난 2f, 및 2e) 및 화학적으로 정의된 결합체 (실시 예로 나타난 5)를 야기하였다. n' = DOTA/Gd의 VHH에 대한 평균량 (상이한 위치에서 임의적으로 분산됨). m = DOTA/Gd의 VHH에 대한 정확한 양 (단일 위치에 위치됨). (괄호로 표시된) 전체 수율은 친화도 칼럼 배출 버퍼 (순수 펩티드 내용물)에서 출발 단백질로부터 모든 단계를 포함한다. 말레이미도-(DOTA/Gd)3 화합물 4 (c)의 고상 합성이 도 9 (c)에 기술되어 있다. 4가 커플링제로서 Fmoc 화학 및 HATU/DIEA를 이용하여 전형적인 고상 펩티드 방법에 의하여 제조되었다. 전체 수율이 괄호로 표시되어 있다. DOTA 구조식이 내부에 표시되어 있다.
도 10은 (a) 항-Aβ VHHs A7, B10, R3VE, R3VQ 및 F12의 아미노산 서열 정렬; CDR1, CDR2, CDR3가 밑줄로 표시되었다. (b) R3VQ-SH 3의 아미노산 서열, (c) R3VE-SH의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 11은 위치 특이적 결합에 의하여 획득된 VHH R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 (화합물 5 도 9)의 특성 분석 및 평가를 나타낸다. (a) HPLC/MS. (b) IEF. (c) iv 주입 후의 뇌에서 VHHs의 IHC 검출에 의한 BBB 관통 평가. 결합되지 않은 단백질 R3VQ-SH와의 비교가 a, b에 나타나 있다.
도 12는 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3로 시험관 배양한 후의 아밀로이드 플라크의 MRI 검출을 나타낸다. 음성 대조구 PS2APP생쥐 뇌 (A)에서 어떠한 대조적인 비정상이 검출되지 않는 반면, R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 (B, 흰색 화살표)와 함께 PS2APP 생쥐 뇌의 시험관 배양 후에 몇몇 낮은 강도의 점들이 드러났다. 이러한 낮은 강도는 MRI (C, 흰색 화살표)에 의한 아밀로이드 플라크를 위한 금본위 양성 대조구로서 사용된 Gd-염색 과정으로 드러난 아밀로이드 플라크로 공위치화되었다. 실험은 7T 분광계 상에서 수행되었다.
도 13은 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3를 iv 주입한 후의 아밀로이드 플라크의 생체 외 MRI 검출을 나타낸다. 생쥐에 PBS (음성 대조구, A-B) 또는 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3를 20mg/kg (C) 또는 50mg/kg (D)로 정맥 내 주입하였으며 5시간 후에 이를 희생시켰다. 추출되고 고정된 뇌에서 11.7T로 MR 이미지가 획득되었다. 음성 대조구는 주입된 뇌 (C 및 D, 흰색 화살표)와 비교하여 강한 대조적 비정상 (A 및 B)을 나타내지 않았다. 이들 낮은 강도 점들은 20mg/kg와 비교하여 50mg/kg에서 더욱 강하고 뚜렷하였다. 이들 낮은 강도 점들은 양성 대조구 과정 (E 및 F, 흰색 화살표)에 의하여 밝혀진 아밀로이드 플라크로 공위치화 되었다.
도 14는 위치 특이적 결합에 의하여 획득된 VHH R3VQ-S-AF488의 시험관 내 분석 및 평가를 나타낸다. 아밀로이드 플라크 상에서 (a) HPLC/MS. (b) SDS-PAGE. (c) IEF. (d) IHC. 결합되지 않은 단백질 R3VQ-SH가 a, b, c에 나타나 있다.
도 15는 2년생 PS2APP 생쥐에서 피질 표면상에 R3VQ-S-AF488를 상위 뇌 투입한 후의 아밀로이드 플라크 및 CAA의 생체 내 영상화를 나타낸다. 화살표는 CAA의 표지를 나타낸다. 축적 막대 = 50μm.
도 16은 이-광자 현미경을 이용한 R3VQ-S-AF 488의 생체 내 영상화를 나타낸다. (a) R3VQ-S-AF488를 2년생 PS2APP 생쥐에 정맥 주입한 후의, 피질의 표면으로부터 360 μm 깊이에서 투사 용적을 갖는 최대강도투사 (MIP) 재건을 이용한 뇌에서의 생체 내 영상화. T0는 정맥 주입 전의 기본 영상화를 나타낸다. 축적 막대는 50μm이다. 빈 화살표머리는 혈관 Aβ를 나타내며, 채워진 화살표머리는 유조직성 Aβ 축적을 나타낸다. (b) R3VQ-S-AF488를2년생 PS2APP 생쥐에 정맥 주입하고 3.5시간 경과한 후의 생체 내 영상화. 빈 화살표머리는 혈관 Aβ를 나타내며, 채워진 화살표머리는 유조직성 Aβ 축적을 나타낸다. (c) 항-His mAb를 이용하여 R3VQ-S-AF488가 정맥 주입된 PS2APP 생쥐에서 아밀로이드 플라크의 면역조직화학 염색. R3VQ에 의한 아밀로이드 플라크의 면역염색이 전체 뇌를 통해 관찰되었다. (d) PS2APP 생쥐에서 R3VQ-S-AF488를 10㎎/㎏으로 정맥 주입한 것과 50㎎/㎏으로 정맥 주입한 것의 아밀로이드 플라크 면역염색의 비교가 IHC 신호에서 투여량에 의존적임을 나타냄.
도 17은 이-광자 현미경을 이용한 R3VE의 생체 내 영상화를 나타내며, 염기성 pI는 VHH가 BBB를 가로지르는 데 중요하다. (a) R3VQ 및 R3VE 화합물의 IEF 분석. R3VE는 R3VQ보다 VHH 및 결합체 모두에 대하여 덜 염기성이다 (R3VE-S-AF488에 대하여 대략 7.5의 pI). (b) R3VQ-S-AF488가 주입된 생쥐와 비교하여, R3VE-S-AF488가 10㎎/㎏의 복용량으로 정맥 내 주입된 생쥐에서 뇌 아밀로이드 맥관 장애만이 관찰되었다. (c) R3VQ-S-AF488가 10㎎/㎏으로, R3VE-S-AF488가 10㎎/㎏으로 정맥 주입된 생쥐에서의 항-His mAb를 이용한 조직학적 염색의 비교.
도 18은 mAb 4G8-AF488 (10㎎/㎏)를 2년생 PS2APP 생쥐에 정맥 주입한 후의 생체 내 영상화를 나타낸다. mAb 4G8의 존재는 혈관에서만 관찰된다. 외부 혈관 신호는 참조 채널 (적색)에서도 관측되므로 이는 인위적인 것이다.
여기에 사용되는 용어 "분리된 (isolated)"은 그 자연 환경의 구성으로부터 분리된 VHH를 의미한다. 몇몇 구현 예에서, VHH는 95%를 초과하여 정제되며, 또는 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 겔 여과, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의하여 결정될 때에는 99% 순도를 갖는다.
항체 순도의 평가 방법과 관련하여, e.g., Flatman et al., 2007, J. Chromatogr. B 848:79-87를 참고할 것.
여기에 사용된 용어 "VHH"는 낙타과 (낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카 등)의 가변 항원 결합 도메인 중쇄 항체 (Nguyen V.K. et al., 2000, The EMBO Journal, 19, 921-930; Muyldermans S., 2001, J Biotechnol., 74, 277-302 and for review Vanlandschoot P. et al., 2011, Antiviral Research 92, 389-407를 참고할 것)를 의미한다. VHH는 또한 나노바디 (Nb)로도 불린다.
유리하게도, 본 발명에 따른 VHH는 바람직하게는 8.5 내지 9.5의 기본 등전점을 갖는다.
본 발명은 앞서 정의된 자연, 재조합 또는 합성 VHHs를 포함한다.
여기에 사용된 용어 "재조합"은 상기 VHH를 생산하기 위한유전공학적 방법 (클로닝, 증폭)의 사용을 의미한다.
여기에 사용된 용어 "합성"은 상기 VHH를 생체 외에서 화학적 또는 효소적 합성에 의하여 생산하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 VHH는 단량체 또는 동종이량체 또는 동종삼량체와 같은 동종다량체의 형태일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 VHH를 포함하는 분리된 낙타과 혈청, 바람직하게는 알파카 혈청을 제공한다.
본 발명은 또한 P-C-Z 또는 Z-C-P의 화학식을 갖는 올리고펩티드를 제공하며, 여기서
P는 감소된 시스테인 잔기를 갖지 않는 8 내지 800개의 아미노산 펩티드이며,
C는 시스테인 잔기이고,
Z는 1 내지 10개의 아미노산 스페이서, 바람직하게는 1 내지 10개의 중성 또는 음전하를 띠는 아미노산 스페이서를 나타내며, 상기 Z의 아미노산 잔기는 동일하거나 상이하고, Z는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.
유리하게, 아미노산 스페이서 Z의 아미노산 잔기는 알라닌, 발린, 세린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어지는 군, 바람직하게는 알라닌, 발린 및 세린으로부터 선택된다.
바람직한 구현 예에서, 올리고펩티드는 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P, 바람직하게는 P-C-Z를 가지며,
P는 감소된 시스테인 잔기를 갖지 않는 8 내지 800개의 아미노산 펩티드이며,
C는 시스테인 잔기이고,
- Z는 아래와 같다.
a) 2 내지 10개의 아미노산 스페이서, 바람직하게는 2개의 아미노산 스페이서이며, Z의 아미노산 잔기는 세린 (S), 알라닌 (A), 발린 (V) 및 글리신 (G)으로 이루이진 군, 더욱 바람직하게는 세린 (S), 알라닌 (A) 및 발린 (V)으로부터 선택되고, 여기서, Z의 적어도 두 개의 아미노산 잔기가 상이하며, 또는
b) 2 내지 10개의 아미노산 스페이서, 바람직하게는 2 내지 10개의 중성 또는 음전하를 띠는 아미노산 스페이서이며, 여기서 Z는 디펩티드 세린-알라닌 (S-A) 또는 세린-발린 (S-V)을 포함하며, Z는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.
유리하게, 시스테인 잔기 C는 입체 구조적으로 접근 가능하다.
유리하게, Z가 a)로 정의될 때, 아미노산 스페이서 Z는 하나 또는 적어도 하나의 세린을 포함한다.
유리하게, Z가 a)로 정의될 때, 아미노산 스페이서 Z는 세린 및 알라닌 잔기만으로 또는 세린 및 발린 잔기만으로 구성된다.
이러한 올리고펩티드의 바람직한 구현 예에서, 아미노산 스페이서 Z는 아미노산 서열 S-A 또는 S-V와 같은 2개의 아미노산 서열로 구성된다.
아미노산 펩티드 P는 또한 더욱 바람직한 순으로, 50 내지 800, 100 내지 800, 100 내지 700, 100 내지 500, 100 내지 400, 100 내지 300 또는 100 내지 250의 아미노산 펩티드이다.
유리하게, 아미노산 펩티드 P는 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 펩티드 P'을 포함하거나 이로 구성된다. P'은 바람직하게는 낙타과 중쇄 항체 (VHH)의 가변 도메인, Fab, F(ab)'2Fv 또는 전형적인 항체의 scFv 단편, 면역글로불린 신규 항원 수용체 (IgNAR), 나노피틴 (nanofitin), DARPin, 안티칼린 (anticalin), 아피바디 (affibody), 아필린 (affilin), 아비머 (avimer), 모노바디 (monobody) 및 쿠니츠 (kunitz) 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Fab, F(ab)'2Fv 및 전형적인 항체의 scFv 단편은 통상의 기술자에게 공지기술로 잘 알려져 있다. IgNARs는 Dooley H. et al., 2006, Dev Comp Immunol., 30:43-56에 소개되어 있다. 나노피틴 (예를 들어, 아피틴)은 Mouratou B. et al., 2007, Proc Natl Acad Sci U.S.A., 104: 17983-8에 소개되어 있다. DARPins은 Binz H.K. et al., 2003, J. Mol. Biol., 332: 489-503에 소개되어 있다. 안티칼린은 Skerra A, 2008, FEBS J., 275:2677-83에 소개되어 있다. 아피바디는 Nord K. et al., 1997, Nature Biotechnol., 15:772-777에 소개되어 있다. 아필린은 Ebersbach H. et al., 2007, J. Mol. Biol., 372:172-185에 소개되어 있다. 아비머는 Silverman J. et al., 2005, Nature Biotechnol., 23:1556-1561에 소개되어 있다. 모노바디 (또는 아드넥틴)은 Koide A. et al., 1998, J. Mol. Biol., 284:1141-51에 소개되어 있다. 쿠니츠 도메인은 Lehmann A., 2008, Expert opinion on biological therapy, 8:1187-99에 소개되어 있다.
바람직한 구현 예에서, P'은 본 발명에 따른 VHH와 같은 VHH이다.
화학식 P-C-Z의 올리고펩티드의 아미노산 펩티드 P는 그 C-말단에 1 내지 10개의 아미노산 스페이서 Y를 갖고, 바람직하게는 1 내지 10개의 중성 또는 음전하를 띠는 아미노산 스페이서를 가지며, 여기서 상기 아미노산 스페이서 Y의 아미노산 잔기는 동일하거나 상이하며, 상기 아미노산 스페이서 Y는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다.
화학식 Z-C-P의 올리고펩티드의 아미노산 펩티드 P는 그 N-말단에 1 내지 10개의 아미노산 스페이서 Y를 갖고, 바람직하게는 1 내지 10개의 중성 또는 음전하를 띠는 아미노산 스페이서를 가지며, 여기서 상기 아미노산 스페이서 Y의 아미노산 잔기는 동일하거나 상이하며, 상기 아미노산 스페이서 Y는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다.
유리하게, 아미노산 스페이서 Y의 아미노산 잔기는 알라닌, 발린, 세린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민, 바람직하게는 알라닌, 발린, 세린 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 아미노산 스페이서 Y는 아미노산 서열 G-G-G-S (서열번호 11)와 같은 4개의 중성 아미노산 스페이서를 나타낸다.
화학식 P-C-Z의 올리고펩티드의 아미노산 펩티드 P는 또한 그 N-말단에 1 내지 50개의 아미노산 서열 X를 가질 수 있으며, 여기서 상기 아미노산 서열 X의 아미노산 잔기는 동일하거나 상이하며, 상기 아미노산 서열 X는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다.
화학식 Z-C-P의 올리고펩티드의 아미노산 펩티드 P는 또한 그 C-말단에 1 내지 50개의 아미노산 서열 X를 가질 수 있으며, 여기서 상기 아미노산 서열 X의 아미노산 잔기는 동일하거나 상이하며, 상기 아미노산 서열 X는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다.
상기 아미노산 서열 X는 6xHis 태그 (서열번호 9)와 같은 태그 및 아미노산 서열 LVPRGS (서열번호 10)의 트롬빈 절단 위치와 같은 효소 절단 위치를 포함할 수 있다.
바람직한 구현 예에서, 본 발명에 따른 올리고펩티드는 화학식 P'-C-Z, P'-Y-C-Z, X-P'-C-Z, X-P'-Y-C-Z, Z-C-P', Z-C-Y-P', Z-C-P'-X, 또는 Z-C-Y-P'-X를 가지며, 여기서 P'은 바람직하게는 본 발명에 따른 VHH와 같은 VHH이다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩티드에 포함되는 상기 VHH가 아밀로이드 β의 섬유상 형태에 결합할 수 있는 경우, 본 발명에 따른 VHH를 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 VHH 유도체를 제공한다.
특정 구현 예에서, 상기 VHH 유도체는 N-말단으로부터 C-말단으로, 6xHis 태그와 같은 아미노산 태그, 트롬빈 절단 위치와 같은 효소 절단 위치, VHH, 아미노산 스페이서, 시스테인 및 이차 아미노산 스페이서를 포함한다. 이러한 VHH 유도체들은 P'이 VHH인 화학식 X-P'-Y-C-Z를 갖는 본 발명에 따른 올리고펩티드에 대응한다.
바람직한 구현 예에서, 상기 VHH 유도체는 서열번호 8의 아미노산 서열 (R3VQ-SH)을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고펩티드, VHH, 또는 VHH 유도체를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 VHH 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 예시로는 서열번호 17의 서열 (R3VQ-SH)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 들 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 주지된 재조합 DNA 기술 및/또는 화학적 DNA 합성 방법에 의하여 획득될 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 전사 조절을 가능케 하는 전사 프로모터의 제어를 받는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 카세트를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 숙주 세포 내에서 번역 조절을 가능케 하는 적절한 제어 서열에 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 (예를 들어, 재조합 발현 벡터)를 제공한다. 유리하게, 상기 재조합 벡터는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터이다.
여기에 사용되는 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산으로 증식가능한 핵산분자를 의미한다. 상기 용어는 도입될 숙주세포의 게놈에 삽입된 벡터뿐만 아니라, 자기복제가능한 핵산을 포함한다. 특정 벡터는 이들이 기능적으로 연결된 핵산의 발현에 관여할 수 있다. 여기서 이러한 벡터를 "발현 벡터"라고 지칭한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 발현 카세트 또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주세포를 제공한다. 숙주세포는 원핵 또는 진핵 숙주세포이다.
상기 용어 "숙주세포"는 외래 핵산이 도입된 세포를 의미하며, 이들 세포의 번식체 (progeny)를 포함한다. 숙주세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대 수에 관계없이 이로부터 유래된 번식체를 포함한다. 번식체는 모세포와 핵산 조성이 완전히 동일하거나 또는 돌연변이를 포함할 수도 있다. 최초로 형질전환된 세포 내에서 선별되거나 또는 선택될 때 동일한 기능 및 생물학적 활성을 지니는 돌연변이 번식체도 여기에 포함된다.
서열번호 4의 아미노산 서열의 VHH R3VQ를 발현하는 원핵 숙주세포가 2013년 11월 12일에 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France에 수탁번호 I-4818로 기탁되었다.
서열번호 8의 아미노산 서열의 VHH R3VQ-SH를 발현하는 원핵 숙주세포는 2013년 11월 12일에 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France에 수탁번호 I- 4819로 기탁되었다.
본 발명은 또한 앞에서 정의된 숙주세포 내에서 본 발명에 따른 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 올리고펩티드를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
- 본 발명에 따른 재조합 발현 카세트 또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주세포를 제공하는 단계;
- 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및
- 선택적으로 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 올리고펩티드를 정제하는 단계;를 포함한다.
올리고뉴클레오티드를 정제하는 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온교환 크로마토그래피, 겔투과 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피)와 같이 공지기술로 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 직접적 또는 간접적으로, 공유결합으로 또는 비공유결합으로 관심 물질에 결합된 본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드를 포함하는 진단 또는 치료제를 제공한다.
본 발명에 따른 관심 물질은 포유동물 또는 인간 혈액-뇌 장벽을 투과할 수 있거나 또는 투과하지 못할 수 있다. 만약 관심 물질이 상기 혈액-뇌 장벽을 통과하는 경우라면, 본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드를 사용하는 것은 관심 물질을 혈액-뇌 장벽을 가로질러 전달하는 것을 강화시킬 수 있다.
일 구현 예에서, 관심 물질은 진단 또는 치료 화합물이다.
다른 구현 예에서, 상기 관심 물질은 진단 또는 치료 화합물을 포함하는 리포좀 또는 중합체이다 (A. J. L. Villaraza et al., Chem Rev. 2010, 110, 2921-2959).
유리하게, 상기 진단 화합물은 아래 열거된 것들로부터 선택된다.
- 서양고추냉이 과산화효소 (horseradish peroxidase), 알카라인 인산화효소 (alkaline phosphatase), 글루코오스-6-인산화효소 또는 베타-갈락토시다아제와 같은 효소;
- 전자 검출수단 (CCD 카메라, 광전자배증관 (photomultipliers))으로 가시화 할 수 있는 녹색 형광 단백질 (GFP), 스펙트럼의 자외선 (UV) 부분에서 여기되는 청색 형광 염료(예를 들어, AMCA (7-아미노-4-메틸쿠라민-3-아세트산); Alexa Fluor® 350), 청색광에 의하여 여기되는 녹색 형광 염료 (예를 들어, FITC, Cy2, Alexa Fluor® 488), 녹색광에 의하여 여기되는 적색 형광 염료 (예를 들어, 로다민, Texas Red, Cy3, Alexa Fluor® 염료 546, 564 및 594), 또는 원-적색광으로 여기되는 염료 (예를 들어, Cy5)와 같은 형광포어 (fluorophore);
- PET 영상법에 사용될 수 있는 18F, 11C, 13N, 15O, 68Ga, 82Rb, 44Sc, 64Cu, 86Y, 89Zr, 124I, 152Tb 또는 SPECT/신티그라프 연구에 사용될 수 있는 67Ga, 81mKr, 99mTc, 111In, 123I, 125I, 133Xe, 201Tl, 155Tb, 195mPt, 또는 오토라디오그래피 또는 제위치 혼성화법 (in situ hybridisation)에 사용될 수 있는 14C, 3H, 35S, 32P, 125I, 또는 상기 화합물을 표지하는 데 사용될 수 있는 211At-, 212Bi-, 75Br-, 76Br-, 131I-, 111In, 177Lu-, 212Pb-, 186Re-, 188Re-, 153Sm-, 90Y와 같은 방사성 동위원소;
- 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn)에 기초한 상자성 제재, 및 (MION, SPIO 또는 USPIO와 같은) 산화철, 및 철 백금 (SIPP)에 기초한 초상자성 제재 및18F, 13C, 23Na, 17O, 15N와 같은 X-핵과 같은 NMR 또는 MRI 콘트라스트제;
- 금 나노입자 (B. Van de Broek et al., ACSNano, Vol. 5, No. 6, 4319-4328, 2011) 또는 양성자 도트 (A. Sukhanova et al., Nanomedicine, 8 (2012) 516-525)와 같은 나노입자.
바람직한 구현 예에서, 상기 진단 화합물은 MRI 콘트라스트제이며, 더욱 바람직하게는 가돌리늄이다. 상기 진단 제재가 검출에 사용되는 경우, 이는 신티그라프 연구용으로 예를 들어, 99Tc 또는 123I와 같은 방사성 원소를 포함하거나 (MRI로도 알려진) 핵자기공명 영상법을 위하여 13C, 9F, Fe, Gd, 123I, 111In, Mn, 15N 또는 7O와 같은 스핀 표지를 포함할 수 있다.
유리하게, 상기 치료제 화합물은 펩티드, 효소, 핵산, 바이러스 및 화학 물질로부터 선택된다. 이는 진통제 화합물, 항염증제 화합물, 항우울제 화합물, 항경련제 화합물, 세포독성 화합물 또는 항-신경퇴행성 화합물일 수 있다.
앞서 정의된 바와 같은 관심 물질은 직접적으로 공유결합 또는 비공유결합적으로 본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드에 이들의 (N 또는 C 말단인) 말단부 중 어디에도 결합될 수 있으며, 또는 상기 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드의 아미노산 중 어느 하나의 측쇄에 결합될 수 있다. 관심 물질은 또한 간접적으로 공유결합 또는 비공유결합적으로 스페이서를 통하여 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드에 이들의 말단부 중 어느 하나에 결합될 수 있으며, 또는 상기 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드의 아미노산 중 어느 하나의 측쇄에 결합될 수 있다. 관심 물질을 펩티드, 특히 항체에 결합시키는 전통적인 결합 방법은 공지기술로 알려져 있다 (예를 들어, Ternynck and Avrameas, 1987, "Techniques immunoenzymatiques" Ed. INSERM, Paris 또는 G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2010, Academic Press를 참고할 것).
많은 화학적 교차결합 방법 또한 공지기술로 알려져 있다. 교차결합 제재는 동종이관능적 (homobifunctional) (즉, 동일한 반응을 수행하는 두 개의 작용기를 갖는 것)일 수 있으며, 또는 이종이관능적 (heterobifunctional) (즉, 두 개의 서로 다른 작용기를 갖는 것)일 수 있다. 많은 교차결합 제재가 상업적으로 구입 가능하다. 이들의 구체적인 사용법은 상업적인 공급자로부터 용이하게 입수할 수 있다. 폴리펩티드 교차결합 및 결합체 제조에 관하여는 일반적으로 Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press (1991)를 참조할 것.
본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드는 공지기술로 알려진 일반 유기화학을 이용하여 특이적인 방사성 동위원소 또는 NMR 또는 MRI 콘트라스트제 또는 형광포어 또는 나노입자 또는 효소로 표지될 수 있다. 예를 들어, March, J. ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISMS, AND STRUCTURE (3rd Edition, 1985) 또는 G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2010, Academic Press를 참고할 것.
또한, 본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드는 이에 한정되는 것은 아니나, 131I, 125I, or 123I와 같은 모든 적절한 방사성 요오드 동위원소로, 직접적으로 디아조늄 요오드를 통하여 디아조화된 아미노 유도체의 요오드화에 의하여 (Greenbaum, 1936, F. Am. J. Pharm., 108:17를 참고할 것), 또는 불안정한 디아조화된 아민을 안정한 트리아진으로 변환하는 것에 의하여, 또는 공지기술로 알려진 수단에 의하여 요오드 화합물로 추가적으로 변환할 수 있는 비-방사성 할로겐화 전구체를 안정한 트리-알킬 주석 유도체로 변환하는 것에 의하여 표지될 수 있다. Satyamurthy and Barrio, 1983, J. Org. Chem., 48: 4394; Goodman et al., 1984, J. Org. Chem., 49:2322, 및 Mathis et al., 1994, J. Labell. Comp. and Radiopharm., 905; Chumpradit et al., 1991, J. Med. Chem., 34: 877; Zhuang et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1406; Chumpradit et al., 1994, J. Med. Chem. 37:4245을 참고할 것.
특히, 본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드는 공지기술로 알려진 몇몇 기법에 의하여 SPECT에 대하여 123I로 표지될 수 있다. 예를 들어, Kulkarni, 1991, Int. J. Rad. Appl. & Inst. (Part B) 18: 647을 참고할 것.
본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드는 또한 Technetium-99m (99mTc)와 같은 공지된 방사성 표지로 방사표지될 수 있다. 이러한 금속이온에 결합하는 리간드를 도입하기 위한 치환체의 변형은 방사성 표지 분야의 통상의 기술로서 과도한 실험없이 효율적으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 금속 방사표지된 VHH 또는 VHH 유도체는 그 후 아밀로이드 β축적물을 탐지하는데 사용될 수 있다. 99mTc의 방사표지된 유도체를 제조하는 것은 공지기술로 주지되어 있다. 예를 들어, Zhuang et al., 1999, Nuclear Medicine & Biology, 26:21 7-24; Oya et al., 1998, Nuclear Medicine & Biology, 25: 135-40; Horn et al., 1997, Nuclear Medicine & Biology, 24:485-98를 참고할 것.
본 발명은 또한 관심 물질 (기능적 결합체)와 직접적 또는 간접적으로 결합된 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체를 획득하기 위한 결합 방법에 관한 것이다.
첫 번째 전략에 따라, 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체는 위치 비-특이적인 접근에 의하여 관심 물질에 결합된다. 상기 위치 비-특이적인 방법은 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체에 관심 물질을 결합시키는 단계를 포함한다.
관심 물질이 (예를 들어, 상자성 제재인 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn) 및 산화철 또는 철 백금에 기초한 초상자성 제재, 및 18F, 13C, 23Na, 17O, 15N와 같은 X-핵)과 같은 NMR 또는 MRI 콘트라스트제, 또는 (예를 들어, 90Y, 177Lu, 64Cu, 99mTc, 111In, 212Pb, 212Bi와 같은) 금속성 방사성 동위원소와 같이, 금속인 경우, 상기 위치 비-특이적인 방법은 킬레이트제를 도입하며, 다음 단계를 포함한다.
(i) 에스터 또는 무수물의 형태로, 바람직하게는 에스터 형태로 활성화되는 킬레이트제를 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체의 리신 잔기에 결합시키는 단계.
(ii) 상기 단계 (i)의 리간드를 관심 물질에 킬레이팅시키는 단계.
킬레이트제를 도입하는 위치 비-특이적인 방법의 대안은 관심 물질이 그 내부에 킬레이트제로 "미리 킬레이트화되는" 것이며, 이는 다음의 단게를 포함한다.
(i') 에스터 또는 무수물의 형태로, 바람직하게는 에스터 형태로 활성화되는 킬레이트제로 관심 물질을 킬레이팅시키는 단계, 및
(ii') 단계 (i')의 미리 킬레이트화된 관심 물질을 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체의 리신 잔기로 결합시키는 단계.
결합단계 (i) 또는 (ii') 동안, 온도는 1 내지 40℃, 바람직하게는 4 내지 20℃로 가변될 수 있다. 상기 용액을 1 내지 6시간 동안 교반시킬 수 있다. 바람직하게는, 결합단계 (i) 또는 (ii') 동안 pH는 7 내지 8.5로 유지된다.
상기 결합단계 (i) 또는 (ii')는 PBS/NaCl에서 이미다졸의 존재 또는 부존재하에, 바람직하게는 이미다졸의 존재하에 수행될 수 있다.
상기 결합단계 (i) 또는 (ii') 동안, 에스터 또는 무수물의 형태로 활성화되는 킬레이트제는 인산완충용액 (PBS)과 같은 버퍼 용액에 용해될 수 있다. 바람직한 구현 예에서, 에스터 또는 무수물의 형태로 활성화되는 킬레이트제와 VHH 또는 VHH 유도체의 리신 잔기의 아미노기 간의 몰비는 1 내지 10, 바람직하게는 4이다.
결합단계 (i)와 킬레이팅 단계 (ii) 사이, 또는 킬레이팅 단계 (i')와 결합단계 (ii') 사이에서, 투석여과 (diafiltration) 또는 투석용해 (dialyse)에 의한 버퍼 교환단계가 추가될 수 있다. 유리하게, 상기 용액은 예를 들어, Vivaspin™ 장치로 투석여과될 수 있다. 이러한 버퍼 교환단계 동안, 배지는 1 내지 5℃로 냉각된다. 이러한 버퍼 교환단계 동안, 상기 버퍼용액은 바람직하게는 0 내지 6시간, 더욱 바람직하게는 2 내지 3시간 동안 교반하면서, 예를 들어, 초산나트륨 용액으로, 교환될 수 있다.
킬레이팅 단계 (ii) 또는 (i') 동안, 상기 용액은 1 내지 4시간 동안, 바람직하게는 2 내지 3시간 동안 교반된다. 상기 킬레이팅 단계는 바람직하게는 1 내지 60℃에서, 더욱 바람직하게는 4℃에서 수행된다.
그 후, 투석여과 또는 투석용해에 의한 이차 버퍼 교환단계가 수행될 수 있다. 유리하게, 상기 용액은 예를 들어, Vivaspin™으로 투석여과된다. 이러한 이차 버퍼 교환단계 동안, 상기 배지는 1 내지 5℃로 냉각된다. 이러한 이차 버퍼 교환단계 동안, 상기 버퍼용액은 예를 들어, 혼합물 PBS/NaCl로 교환되며, 동일한 방법 (투석여과)으로 농축될 수 있다.
리신의 숫자에 따라, VHH 또는 VHH 유도체에 대한 관심 물질 평균 밀도는 0에서 리신 숫자 +1의 범위로 가변될 수 있다. 바람직하게는, VHH 또는 VHH 유도체에 대한 관심 물질 평균 밀도는 0 내지 5로 가변될 수 있다.
본 발명에 따른 위치 비-특이적인 방법은 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체에 적용되며, 다른 VHH로 확장될 수 있다.
이차 전략에 따라, 바람직하게는 본 발명에 따른 VHH 유도체를 포함하는 본 발명에 따른 올리고펩티드는 위치 특이적인 접근을 이용하여 관심 물질에 결합된다. 상기 위치 특이적인 접근은 아래 장점을 갖는다:
- 표지된 올리고펩티드는 화학적으로 정의됨에 따라, 이러한 방법이 인간에 대한 사용의 관점에서 주요한 특징인 잘 정의된 결합체를 가능하게 한다 (품질관리, 안전성 등).
- 방법이 쉽고 표준적이어서, 관심 물질로 올리고펩티드를 표지하는 것은 짧은 반응시간과 일관된 절차로 하나의 단계로 수행될 수 있다. 과정 도중의 모니터링이 요구되지 않으며, 표지 정도와 결합특성 간에 극복해야할 상쇄 요인이 존재하지 않는다. 이러한 점들은 추가적인 최적화, 실험 반복, 및 수율 향상을 위한 주요한 장점이다.
- 상기 방법은 예를 들어, 최종 샘플에서 P는 VHH를 포함하거나 이로 구성되며, 결합체의 pI는 BBB 관통을 가능케 할 수 있는 8.5를 초과하여 유지되는 것과 같은 올리고펩티드 주요 특성에 영향을 미치지 않는다. 또한, 표적에 대한 결합체와 경쟁할 수 있는 표지되지 않고 남은 올리고펩티드가 존재하지 않는다. 생리학적 pH에서의 짧은 반응시간은 올리고펩티드가 잠재적으로 분해되거나/또는 활성을 잃는 것을 방지해 준다.
- 상기 방법은 다양한 올리고펩티드 및 콘트라스트제, 또는 기타 관심분자가 각각 별도로 제조될 수 있고, 그 후 하나의 단계에서 통합될 수 있다는 면에서 유연하며 단위화된 접근을 가능케 하므로 광범위한 활용도를 갖는다. 결과적으로, 한 세트의 결합체는 최적화 및 IHC 및 MRI에 의한 후속 평가에 대한 용이한 접근을 가능케 한다.
- 그리고, 무엇보다도, 상기 방법은 VHH의 리신 또는 히스티딘에 대한 부반응 없이 그리고, VHH의 기능 및 3차원 구조를 전체적으로 유지하면서, 반응 단계의 수를 줄이면서 전체적인 수율의 향상을 가능케 한다.
본 발명에 따른 위치 특이적인 방법은 본 발명에 따른 올리고펩티드와 티올-반응성 기능 (function)을 함유하는 관심 물질 사이의 결합 단계를 포함한다.
상기 위치 특이적인 방법의 바람직한 구체 예에서, 상기 결합 단계는 본 발명에 따른 올리고펩티드와 상기 관심의 물질을 함유하는 티올-반응성 화합물 사이에서 수행된다.
유리하게, 관심의 물질을 함유하는 티올-반응성 화합물은 말레이미도 화합물, 바람직하게는 하기에 정의된 바와 같은 화학식 1 또는 1'의 말레이미도 화합물이다.
상기 올리고펩티드의 시스테인과 티올-반응성 화합물 사이의 티오-부가 (thio-addition)는 0 내지 20℃, 바람직하게는 4℃에서, 예를 들어 2 내지 4시간 동안 수행될 수 있다.
상기 올리고펩티드의 시스테인과, 하기에 정의된 화학식 1 또는 1'의 말레이미도 화합물과 같은, 티올-반응성 화합물 사이의 티오-부가는 바람직하게는 4 내지 7.5 범위의 pH, 더욱 바람직하게는 6.8의 pH에서 실행될 수 있다. pH = 4 아래에서는 상기 반응은 이루어지지 않으며, 7.5를 초과하는 경우는 (리신에 대한 반응이) 특이적이지 않다. pH를 조정하기 위하여, 결합 단계 (i) 또는 (ii')이 PBS/NaCl에서 이미다졸의 존재 또는 부존재하에, 바람직하게는 이미다졸의 존재하에 수행될 수 있다. 정제 칼럼으로부터 직접적으로 배출된 단백질에 대한 말레이미도 화합물의 티오-부가를 위한 이러한 특이적인 조건을 밝혀낸 것은 단계를 줄이고 과정의 전체적인 수율을 향상시키는 것을 가능케 한다는 점에서 놀라운 것이다.
그 후, 투석여과 또는 투석용해에 의하여 버퍼 교환 단계가 수행될 수 있다. 유리하게, 상기 용액은 예를 들어, Vivaspin™ 장치로 투석여과될 수 있다. 그 후, 상기 용액은 동일한 방법 (투석여과)에 의하여 농축될 수 있다.
그러나, 결합 단계 (i) 또는 (ii')이 PBS/NaCl에서 이미다졸의 존재하에 수행되는 경우, (이미다졸을 제거하지 않도록) 연속적인 투석여과 또는 투석용해 과정을 수행하지 않는 것이 바람직하다.
비-특이적인 방법이건 또는 특이적인 방법이건 간에, 관심 물질은 앞서 정의된 것일 수 있다.
바람직한 구현 예에 따라, 관심 물질은 앞서 정의된 치료 또는 진단 화합물이며, 바람직하게는 앞서 정의된 바와 같은 형광포어, 방사성 동위원소 및 NMR 또는 MRI 콘트라스트제로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 화합물이다.
본 발명자들은 관심 물질이 NMR 또는 MRI 콘트라스트제일 때, 합성된 결합체는 표지되지 않은 VHH의 핵심적인 기능적인 특징을 보유한다는 점을 관찰하였다.
바람직한 구현 예에 따라, 관심 물질은 상자성 제재인 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn), 및 (MION, SPIO 또는 USPIO와 같은) 산화철, 및 철 백금 (SIPP)에 기초한 초상자성 제재 및 18F, 13C, 23Na, 17O, 15N와 같은 X-핵과 같은 NMR 또는 MRI 콘트라스트제이며, 더욱 바람직하게는 관심 물질은 상자성 제재인 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn)으로부터 선택되는 상자성 제재이다.
킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 1,4,7-삼(카르복시메틸라자)시클로도데칸-10-아자아세틸아미드 (DO3A), 니트릴로트리아세트산 (NTA), D-페니실라민 (Pen), 2,3-디메르캅토숙신산 (DMSA), 2,3-디메르캅토-1-프로판숙신산 (DMPS) (O.　Andersen, Chem. Rev., 1999, 99, pp. 2683-2710), 2,3-디메르캅토프로판올 (BAL), 트리에틸렌테트라민 (Trien), 암모늄 테트라티오몰리베이트 (TTM) 음이온 (G.J. Brewer, F.K. Askari, J. Hepatol., 2005, 42, pp. S13-S21), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 2-(p-이소티오시아네이토벤질)-6-메틸-디에틸렌트리아민펜타아세트산 (IB4M) 또는 하이드록시피리디논 (HOPO) (Villaraza et al., Chem. Rev., 2010, 110, 2921)으로부터 선택된다.
관심 물질이 가돌리늄일 때, DOTA가 바람직한 킬레이트제이다.
본 발명은 또한 전술된 바와 같은 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 올리고펩티드를 제공하고, 여기서 상기 시스테인 잔기 C는 황화물 결합, 바람직하게는 티오에테르 또는 이황화물 결합을 통해 적어도 하나의 관심의 물질에 연결된다. 유리하게, 상기 시스테인 잔기 C는 상기 관심의 물질을 함유하는 티올-반응성 화합물을 통해 적어도 하나의 관심의 물질과 연결된다.
본 발명의 관점에서, 티올-반응성 화합물은 말레이미도, 할로아세틸, 알킬 할라이드 또는 아지리딘 화합물, 아크릴로일 유도체, 아크릴화제, 또는 티올-이황화물 교환제 (exchange reagent) (Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson, 2010, Academic Press)이다.
본 발명의 관점에서, 말레이미도 화합물은 적어도 하나의 말레이미도 기능, 바람직하게는 1 내지 6 말레이미도 기능, 및 좀 더 바람직하게는 하나의 말레이미도 기능을 함유하는 화합물이다.
바람직하게는, 상기 티올-반응성 화합물은 상기 말레이미드 기능의 C-C 이중 결합을 통해 시스테인 잔기 C와 반응하는 말레이미도 화합물이다.
본 발명의 말레이미도 화합물은 하기와 같은 화학식 1일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pct00001
여기서,
- 동일하거나 상이한 B, B'1, B'2, 및 B"는 바람직하게는 2 내지 12개의 옥시에틸렌 (OE) 단위를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 폴리올, 바람직하게는 2 내지 12개의 방향족 고리를 갖는 폴리올레핀, 바람직하게는 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 폴리알킬, 바람직하게는 2 내지 12개의 메타크릴레이트기를 갖는 폴리(알킬 메타크릴레이트)와 같은 비닐 폴리머, 바람직하게는 2 내지 12개의 카르보닐기를 갖는 폴리알데히드, 바람직하게는 2 내지 12개의 에스터기를 갖는 다중산에스터로부터 선택되는 독립적으로 단일결합 또는 스페이서이며,
- 동일하거나 상이한 D, D' 및 D"는 아민, 아미드, 아미노-알코올, 요소, 티오요소, 카르밤산염, 탄산염, 에스터, 에테르, 티오에테르, 아릴, 트리아졸, 옥심기와 같은 헤테로 아릴로부터 독립적으로 선택되고,
- A는 단일결합 또는 킬레이트제이며,
- SI는 관심 물질이고,
- X'은 산, 아민, 아미드, 에스터, 에테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴기이며,
- n = 1 내지 100이고, 바람직하게는 n = 1, 2 또는 3이다.
본 발명에서,
- 알킬기는 (C1-C12)알킬기, 및 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸 및 이소부틸 라디칼과 같은 (C1-C6)알킬기 중에서 선택된다.
- 알킬렌기는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 2 내지 12 탄소 원자, 바람직하게는 2 내지 6의 탄소 원자의 탄화수소 체인에서 선택되며, 알킬렌기의 예시로는 에테닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 2,4-펜타디에닐이 포함된다.
- 알키닐기는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 2 내지 12 탄소 원자, 바람직하게는 2 내지 6 탄소 원자의 탄화수소 체인중에서 선택된다.
- 아릴기는 적어도 하나의 단일 방향족 고리, 모든 평면 환형 화합물에 대응하는 방향족 고리에 대응하며, 고리의 각각의 원자가 p-오비탈을 포함하고, 상기 p-오비탈이 상호 간에 겹치는 비국소적인 p 시스템으로부터 유래된 모든 작용기 또는 치환기를 의미한다. 더욱 구체적으로, 이에 한정되는 것은 아니나, 용어 아릴은 페닐, 비페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 안트라실, 피레닐, 및 이들의 치환체를 포함한다. 본 발명의 아릴기는 바람직하게는 4 내지 12 탄소 원자를, 더욱 바람직하게는 5 또는 6 탄소 원자를 포함한다.
- 헤테로아릴기는 앞서 정의된 최소 하나의 방향족 고리로부터 유래되고, P, S, O 및 N로부터 선택되는 적어도 하나의 이종원자를 함유하는 모든 작용기 또는 치환체를 의미한다. 이에 한정되는 것은 아니나, 용어 헤테로아릴은 퓨란, 피리딘, 피롤, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 트리아졸, 티아졸, 이소티아졸, 테트라아졸, 피리다졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 벤조푸란, 이소벤조푸란, 인돌, 이소인돌, 벤조티오펜, 벤조[c]티오펜, 벤즈이미다졸, 인다졸, 벤조옥사졸, 벤지소옥사졸, 벤조티아졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 시놀린, 퓨린 및 아크리딘을 포함한다. 본 발명의 아릴 또는 헤테로아릴기는 바람직하게는 4 내지 12 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 5 또는 6 탄소 원자ㄹ르를 포함한다.
본 발명에 따른 산, 아민, 아미드, 에스터, 에테르 및 티오에테르기는 바람직하게는 1 내지 12, 더욱 바람직하게는 1 내지 6 탄소 원자를 갖는다.
바람직한 구현 예에 따르면, A는 킬레이트제이며, 관심 물질 SI는 NMR 또는 MRI 콘트라스트제이다.
유리하게, 킬레이트제 A는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 1,4,7-삼(카르복시메틸라자)시클로도데칸-10-아자아세틸아미드 (DO3A), 니트릴로트리아세트산 (NTA), D-페니실라민 (Pen), 2,3-디메르캅토숙신산 (DMSA), 2,3-디메르캅토-1-프로판숙신산 (DMPS), 2,3-디메르캅토프로판올 (BAL), 트리에틸렌테트라민 (Trien), 암모늄 테트라티오몰리베이트 (TTM) 음이온, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 2-(p-이소티오시아네이토벤질)-6-메틸-디에틸렌트리아민펜타아세트산 (IB4M) 또는 하이드록시피리디논 (HOPO)으로부터 선택된다.
유리하게, 관심 물질 SI는 가돌리늄이고, 킬레이트제는 DOTA이다.
특히 바람직한 구현 예에 따라, 본 발명의 말레이미도 화합물은 화학식 1'일 수 있다.
[화학식 1']
Figure pct00002
여기서, B, B'1, B'2, B", A, SI 및 n은 앞서 정의된 것과 같다.
화학식 1 또는 1'의 말레이미도 화합물은 고상방법을 통하여, 바람직하게는 Fmoc 화학, 더욱 바람직하게는 Fmoc-Gly-Wang 수지상에서 합성될 수 있다.
화학식 1'의 말레이미도 화합물은 아래와 같다.
[화학식 1']
Figure pct00003
여기서, B, B'1, B'2, B", A, SI 및 n은 본 발명의 일부로 앞서 정의된 것과 같다.
본 발명의 다른 목적은 적어도 하나의 관심의 물질에 연결된, 바람직하게는 티올-반응성 화합물, 좀 더 바람직하게는 본 발명에 따라 정의된 말레이미도 화합물을 통하여 적어도 하나의 관심의 물질에 연결된 시스테인 잔기를 갖는 올리고펩티드를 제공하는 것이며, 상기 올리고펩티드는 본 발명의 위치 특이적 방법에 따라 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 위치 비-특이적인 방법에 따라 얻을 수 있는 관심 물질에 결합된 VHH 또는 VHH 유도체, 및 또한 본 발명의 위치 특이적인 방법에 따라 얻을 수 있는 관심 물질을 함유하는 티올-반응성 화합물에 결합된 VHH를 제공한다.
관심 물질이 펩티드일 때, 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체 및 상기 관심 물질은 유전공학을 통하여 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체 및 적절한 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드로 생산될 수 있다. 융합 폴리펩티드는 공지된 적절한 숙주세포 내에서 간편하게 발현될 수 있다.
본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체, 올리고펩티드, 치료 또는 진단 제재는 정맥내, 동맥내, (척수액을 통하여) 척추강 내로, 복강내, 근육내 또는 피하 주사와 같은 주사로, 또는 비강내 적하에 의하여 대상체 (포유동물 또는 인간)에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 VHH가 인간 대상체에 투여될 때, 이는 인간에게 면역성을 감소시키기 위하여 인간화 (humanized)될 수 있다. 인간화 항체 또는 이의 단편 생산방법은 공지기술로 알려져 있다 (Vincke C. et al., 2009, J Biol Chem., 284, 3273-84).
본 발명에 따른 진단 제재는 알츠하이머 질환 (AD) 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병을 진단하거나 관찰하기 위한 뇌 영상화에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체 또는 올리고펩티드 및 앞서 정의된 관심 물질을 포함하는 키트를 제공한다.
특히, 본 발명은 또한 적어도 하나의 VHH, VHH 유도체 및 앞서 정의된 진단 제재를 포함하며, 뇌 영상화 또는 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병을 진단하거나 관찰하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 진단 제재를 대상체 내에서 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병을 진단하거나 관찰하기 위하여 사용하는 용도를 제공한다.
여기에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이며, 가장 바람직하게는 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병을 갖는 것으로 의심되는 인간이다.
본 발명은 또한 대상체에서 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병을 진단하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법을 제공하며, 이는 하기 단계를 포함한다:
a) 시험관 내에서 상기 대상체로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 진단 제재에 접촉시키는 단계, 및
b) 상기 생물학적 샘플 내에 아밀로이드 플라크와 같은 아밀로이드 β축적물의 존재 여부를 결정하는 단계.
아밀로이드 β축적물의 존재는 상기 대상체가 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병을 갖는다는 것을 나타낸다.
단계 b)는 VHH-항원 복합체 (즉, 아밀로이드 β의 섬유상 형태에 관련된 VHH)의 존재 유무를 결정함으로써 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병의 진전 또는 퇴행을 관찰하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법을 제공하며, 이는 하기 단계를 포함한다:
a) 시험관 내에서 상기 대상체로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 진단 제재에 접촉시키는 단계,
b) 상기 생물학적 샘플 내에 아밀로이드 β의 섬유상 형태의 양을 결정하는 단계, 및
c) 단계 b)에서 결정된 양을 상기 대상체에 대하여 이전에 획득된 아밀로이드 β의 섬유상 형태의 양과 비교하는 단계.
아밀로이드 β의 섬유상 형태의 양의 상당한 증가는 아밀로이드 β축적에 의하여 매개되는 상기 질병의 진전에 대한 마커를 형성하며, 아밀로이드 β의 섬유상 형태의 양의 상당한 감소는 아밀로이드 β축적에 의하여 매개되는 상기 질병의 퇴행에 대한 마커를 형성한다.
여기서 사용되는 용어 "상당한 증가" 및 "상당한 감소"는 이전에 결정되었고 비교 양으로서 사용된, 대상체로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플 내에서 각각 아밀로이드 β의 섬유상 형태의 양과 비교하여, 적절한 생물학적 샘플 내에서 각각 아밀로이드 β의 섬유상 형태의 더 많거나 또는 더 적은 양을 의미한다.
단계 b)는 또한 VHH-항원 복합체의 존재 유무를 결정함으로써 수행될 수 있다.
상기 적절한 생물학적 샘플은 뇌 생검체 또는 사후 뇌조직일 수 있다.
본 발명은 또한, 뇌 생검체 또는 사후 뇌조직 내에서 아밀로이드 β축적을 탐지하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 포르말린-고정 조직을 본 발명에 따른 진단 제재 용액과 함께 배양하는 단계를 수반할 수 있다. 배양 단계 동안, 진단 화합물은 조직 내에서 아밀로이드 β축적을 표지하며, 염색되거나 표지된 아밀로이드 β축적은 모든 표준 방법에 의하여 검출되거나 시각화될 수 있다. 이러한 검출 수단은 명시야 (bright-field), 형광, 레이저-공초점 (laser-confocal) 및 교차-분극 (cross-polarization) 현미경과 같은 현미경 기법을 포함한다. 생검체 또는 사후 조직에서 아밀로이드 β의 양을 정량하는 방법은 예를 들어, 본 발명에 따른 진단 제재, 또는 이들의 수용성, 무독성 염을 생검체 또는 사후 조직의 균질액과 함께 배양하는 단계를 수반한다. 상기 조직은 공지기술로 주지된 방법에 의하여 획득되며 균질화된다. 효소, 형광포어 또는 NMR 또는 MRI 콘트라스트제와 같은 기타 진단 화합물이 사용될 수 있을지라도, 유리하게는, 상기 진단 화합물은 방사성 동위원소로 표지된 화합물이다.
본 발명은 또한 대상체에서 아밀로이드 β축적을 생체 내 영상화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 대상체, 바람직하게는 인간에게 본 발명에 따른 진단 제재의 검출 가능한 양을 투여하는 단계,
b) 영상화 방법에 의하여 상기 대상체 내에서 상기 진단 제재를 검출하는 단계.
본 발명에 따른 이러한 방법은 대상체, 바람직하게는 인간의 뇌에서 아밀로이드 축적의 존재와 위치를 결정하는 것을 가능케 한다.
여기서 사용된 용어 "검출 가능한 양"은 투여된 진단 제재의 양이 진단 제재가 아밀로이드 β에 결합된 것을 검출할 수 있을 정도로 충분한 것을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "유효한 양을 영상화하는"은 투여된 진단 제재의 양이 진단 제재가 아밀로이드 β에 결합된 것을 영상화할 수 있을 정도로 충분한 것을 의미한다.
영상화 방법은 생체 내에서 아밀로이드 β 축적을 검출하기 위하여 사용되는 자기공명 분광법 (MRS) 또는 영상화 (MRI)와 같은 비침습적인 신경영상화, 또는 양성자 방사 단층촬영 (PET) 또는 단일광자방출단층촬영 (SPECT)과 같은 감마 영상화를 포함한다.
생체 내 영상화를 위한 목적으로 사용 가능한 검출 장비의 종류는 주어진 표지를 선택하는 데 있어서 주요한 요인이 된다. 예를 들어, 가돌리늄, 철 또는 망간 기반의 콘트라스트제는 관심 물질에 연결된 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체를 자기공명 분광법 (MRS) 또는 영상화 (MRI)로 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 19F와 같은 방사성 동위원소가 또한 본 발명의 방법에서 생체 내 영상화에 특히 적절하다. 사용될 장비의 유형은 관심 물질의 선택을 안내할 것이다. 예를 들어, 선택된 방사성핵산염 (radionucleide)은 장비의 주어진 유형에 의하여 검출가능한 분해되는 종류이어야 한다. 다른 고려 요인으로는 상기 콘트라스트제 또는 방사성핵산염의 반감기를 들 수 있다. 방사성 동위원소의 경우, 반감기는 뇌에 의하여 최대로 흡수되었을 때 여전히 검출 가능할 정도로 충분히 길어야 하는 반면, 대상체가 유해한 방사능을 유지하지 않을 정도로 충분히 짧아야 한다. 본 발명에 따른 방사표지된 VHH 또는 VHH 유도체는 적절한 파장의 방출된 감마 조사가 검출되는 감마 영상화를 이용하여 검출될 수 있다. 감마 영상화 방법은 이에 한정되는 것은 아니나, SPECT 및 PET을 포함한다. 바람직하게는, SPECT 검출의 경우, 선택된 방사성 동위원소는 입자 방출이 결여될 것이나, 140-200 keV 범위의 상당량의 광자를 생산할 것이다. PET 검출의 경우, 방사표지는 PET 카메라에 의하여 검출될 수 있는 두 511 keV 감마선을 형성하기 위하여 전멸되는 19F와 같은 양성자-방출 방사핵종 (radionuclide)일 것이다.
일반적으로, 검출가능한 진단 제재의 양은 환자의 연령, 병태, 성별 및 질병의 정도, 만약의 사용금지사유, 동시에 수반되는 치료 및 해당 분야의 의사에 의하여 조정될 다른 가변요인과 같은 고려요인에 따라 다양할 것이다. 대상체에 대한 투여는 국부적이거나 전신적일 수 있으며, 정맥내, 동맥내, (척추액을 통한) 척수내 등으로 수행될 수 있다. 투여는 또한 검사 대상이 되는 신체에 따라 피하로 또는 강내로 수행될 수 있다. 상기 화합물이 상기 아밀로이드 β에 결합하기에 충분한 시간, 예를 들어, 30분 내지 48시간이 경과한 후에, 조사 대상이 되는 대상체의 영역이 MRS/MRI, SPECT, 평면 섬광 영성화, PET, 및 새롭게 개발되는 영상화 기법 등과 같은 통상적인 영상화기법에 의하여 검사된다. 정확한 프로토콜이 전술된 바와 같이 환자에 특이적인 요인에 따라, 그리고 검사 대상이 되는 신체 부위, 투여 방법 및 사용되는 표지의 종류에 따라 필요적으로 가변적일 것이다.
본 발명은 또한 진단 제재로서의 본 발명에 따른 진단 화합물에 연결된 올리고펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 앞서 정의된 치료제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
여기서 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약제학적 투여과 함께 사용 가능한 모든 용매, 분산매질, 피복체, 항세균성 및 항진균성제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것이다. 적절한 담체는 관련 분야의 표준 참고서인 Remington's Pharmaceutical Sciences의 최신판에 기술되어 있다. 이러한 담체 및 희석제의 바람직한 예시로는 이에 한정되는 것은 아니나, 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민. 리포좀, 양이온성 지질이 포함되며, 고정된 오일과 같은 비수용성 운반체가 사용될 수도 있다. 약제학적으로 활성이 있는 물질에 대한 이러한 매질 및 제재의 사용은 공지기술로 잘 알려져 있다. 앞서 정의된 치료제와 함께 사용될 수 없는 어떠한 전 매질 또는 제재를 제외하고는, 본 발명에서 이들의 사용이 고려된다.
본 발명은 또한 특히 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병의 치료에 사용되는 의약치료제로서의 본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체, 치료제 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병의 예방 또는 치료방법을 제공하며, 이는 이를 필요로 하는 대상체에 본 발명에 따른 치료제 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
여기서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 본 발명에 따른 VHH, VHH 유도체, 치료제 또는 약제학적 조성물을 장애, 장애 증상 또는 장애에 대한 성향을 갖는 환자에게 장애, 장애 증상, 또는 장애의 성향을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 처치, 향상, 개선하거나 영향을 미치기 위한 목적으로 투여하는 것을 포함한다.
상기 용어 "예방"은 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병의 경과가 감소되거나/또는 제거되는 것을 의미하며, 또는 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β축적에 의해 매개되는 질병의 개시가 지연 또는 제거되는 것을 의미한다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체를 전술된 바와 같은 관심 물질을 포유동물 혈액-뇌, 바람직하게는 인간 혈액-뇌 장벽을 가로질러 운반하기 위한 펩티드 벡터를 제조하기 위하여 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료제로서의 본 발명에 따른 치료 화합물에 연결된 올리고펩티드를 제공한다.
실시 예 1: 가돌리늄 콘트라스트제에 연결된 항-A베타 VHHs의 제조 및 이들의 시험관 내/ 생체 내 평가
물질 및 방법
1. VHH R3VQ의 생산, 선별 및 정제
항원 제조 및 알파카에서 체액성 면역 반응의 유도
A-베타 42 펩티드 (Aβ42) (1 mg-Bachem)를 900 ㎕ H2O에 용해시키고 교반하였다. 100 ㎕ PBS 10x를 첨가하였으며, 상기 혼합물을 실온에서 사용 전에 한 달간 배양하였다. 일차 면역화를 위해 250 ㎕의 혼합물을 250 ㎕의 Freund 완전 보조제와 혼합하였고, 후속 면역화를 위하여 250 ㎕의 Freund 불완전 보조제와 혼합하였다. 다 자란 수컷 알파카 (Lama pacos) 한 마리를 0, 21 및 35일째 되는 날 250㎍의 면역원으로 면역시켰다. 50일째 되는 날, 혈청 샘플을 취하였으며, Aβ42 항원을 이용하여 ELISA에 의하여 면역 반응을 관찰하였다.
라이브러리 구축 및 확장 (panning)
250 ㎖의 면역화된 동물 혈액을 50일째 채취하였으며, Ficoll (Pharmacia) 불연속 구배 상에서 주변 혈액 림프구를 원심분리에 의하여 분리하였고, -80℃로 사용할 때까지 보관하였다. Lafaye P. et al. (1995, Res Immunol., 146:373-382)에 기술된 바와 같이, 전체 RNA 및 cDNA를 획득하였고, VH 유전자의 3' 및 5'의 측면 영역에 각각 결합하는 CH2FORTA4 및 VHBACKA6 프라이머를 이용하여 VHH 도메인을 인코딩하는 DNA 단편을 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물을 긴 힌지 동종이량체 항체에 특이적인 프라이머 VHBACKA4 및 VHFOR36 또는 프라이머 VHBACKA4 및 LHH (5' GGACTAGTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3') (서열번호 13)를 이용하는 두 번째 PCR에서 주형으로 이용하였다. 상기 프라이머는 증폭 산물의 5' 및 3' 말단과 VHH 유전자의 말단에 도입된 SfiI 및 NotI 제한 위치에 상보적이다. PCR 산물을 용해하였고, 파아지 발현 벡터 pHEN1에 연결하였다. 결과적인 라이브러리는 하나는 힌지가 없는 VHH DNA-인코딩 유전자로부터 유래되고, 다른 하나는 긴 힌지 항체 유전자로부터 유래되는 두 개의 서브-라이브러리로 구성되었다. 파아지가 생산되었고, 두 개의 서브-라이브러리 모두를 이용하여 분리하였으며, 이어 풀을 구축하였다.
상기 라이브러리를 전술된 바와 같이 (Lafaye P. et al., 2009, Mol Immunol. 46:695-704), 비오틴이 결합된 Aβ1-42, Aβ1-40 또는 Aβ1-16 펩티드와 대등한 반응성을 갖도록 확장시켰다. 상기 라이브러리 (1013 형질전환 단위)를 각각의 비오틴 결합된 펩티드와 함께 37℃에서 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 배양함으로써 확장하였고, 상기 혼합물을 스트렙타비딘 비드와 함께 37℃에서 15분간 배양하였다. 세 번에 걸친 확장 동안, 서로 상이한 블로킹제를 사용하였다. 2% 탈지유, 1:4로 희석된 Licor, 및 4% BSA가 각각 사용되었다. 사용된 비오틴이 결합된 펩티드의 농도를 매번 확장시마다 각각 100 nM, 50 nM 및 10 nM로 감소시켰다. 검출의 위하여 (아래 참고), HRP/anti-M13 모노클론 항체 결합체 (GE Healthcare)를 이용하여 표준 ELISA 절차에 의해 파아지 클론을 선별하였다.
VHHs의 발현
벡터 pHEN1에서 선별된 나노바디의 암호화 서열을 NcoI 및 NotI 제한 위치를 이용하여 6-히스티딘 태그를 함유하는 변형된 세균 발현 벡터 pET23로 서브-클론하였다. 형질전환된 E. coli BL21 (DE3) LysS 세포는 IPTG (0.5 mM)로 16℃에서 하룻밤 동안 유도된 뒤에 세포질에서 VHH를 발현한다. 정제된 VHHs를 Ni2 + (GE Healthcare)로 하전된 HiTrap 크루드 칼럼을 이용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 세포질 추출물로부터 IMAC로 분리하였으며, 이어 Superdex 75 칼럼 (GE Healthcare)으로 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. VHHs (특히 R3VQ(His)-NH2; 도 9에서 화합물 1)을 50mM 인산나트륨 버퍼, 300mM NaCl 및 500mM 이미다졸 버퍼에서 배출하였다.
2. VHH R3VQ의 생화학적 특성 결정
면역블롯
NuPAGE Novex 4-12% Bis-tris 겔 (Invitrogen), Hybond-C 상에서의 반-건조 이동 (Amersham) 및 웨스턴 블로팅을 이용한 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (PAGE)을 Xcell II 블롯 모듈 (Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. 면역화학 반응 전에, 막을 4% 탈지유로 차단하였다. VHH로 막의 면역블로팅을 수행하였으며, 래빗 항-His 태그 (eBioscience) 폴리클론 항체와 이어 과산화효소 표지된 염소 항-래빗 면역글로불린 (Abcam)에 의하여 탐색되었다. 마지막으로, 화학형광 키트 (GE Healthcare)를 이용하여 과산화효소 활성을 시각화하였다.
ELISA
스트렙타비딘-코팅된 마이크로적정 플레이트 (Thermo Scientific,Denmark)를 PBS에서 희석된 1 ㎍/ml의 비오틴결합된 A-베타 40 또는 A-베타 42 (바람직하게는 A-베타 40)로 하룻밤 동안 배양에 의하여 코팅하였다. 플레이트를 PBS에서 버퍼 0.1% Tween 20으로 세척하였다. VHH R3VQ를 PBS에서 버퍼 0.5% 젤라틴 0.1% Tween 20으로 희석하였다. 37℃에서 2시간 배양한 후에, 각각 래빗 항-His 태그 폴리클론 항체 (eBiosciences)를 첨가하기 전에 세척하였으며, 과산화효소 표지된 염소 항-래빗 면역글로불린 (Abcam)을 처리하고, 최종적으로 OPD (o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드, Dako)로 탐색하였다.
ELISA에 의한 해리 상수 결정
VHHs의 결합 친화도를 전술된 바와 같이 결정하였다 (Friguet B. et al., 1985, Immunol Methods, 77:305-19). 간략하게, 다양한 농도의 Aβ펩티드 (Aβ 단편 1-16, 10-20, 15-25, 22-35 및 29-40)를 4℃에서 하룻밤 동안 용액 내에서 알려진 양의 VHH와 함께 평형에 도달할 때까지 배양하였다. 사용된 VHH 농도는 예비 ELISA 조정에 의하여 결정되었다. 각각의 혼합물 (100㎕)을 항원으로 미리 코팅된 마이크로적정 플레이트의 웰로 옮겼으며, 4℃에서 20분간 배양하였다. 상기 플레이트를 PBS 내에서 버퍼 0.1% Tween 20으로 세척하였으며, 결합된 VHHs를 베타-갈락토시다아제-결합 염소 항-래빗 Igs (Biosys, Compiegne, 프랑스) 및 4-메틸럼벨리페릴 α-D 갈락토시드 (Sigma)를 첨가함으로써 검출하였다. 355 nm에서 여기시킨 후, 460nm에서 형광을 측정하였다 (Fluoroskan, Labsystem, Finland). 항원의 몰 농도의 역수에 대한 결합된 항체의 비율의 역수를 플로팅하여 획득된 퇴행 곡선의 경사도로부터 KD를 평가하였다.
서열 분석
VHH 암호화 DNAs를 GATC Biotech로 서열분석했으며, 서열을 DNA 스트라이더로 처리하였다.
pI 결정
VHHs의 pI를 IEF 2-9 Gel (Invitrogen)를 이용한 등전점 초점법에 의헤 결정하였다. pH 8.5 내지 10.5을 포함하는 염기성 범위의 겔에서 최적의 단백질 분석이 가능하므로, 양극에서 샘플 응용과 함께 NEPGHE (불평형 pH 구배 겔 전기영동)가 사용되었다. SERVAGel IEF 3-10 지침서에 절차가 자세히 기술되어 있다.
3. MRI 콘트라스트제에 대한 VHH R3VQ 결합 및 합성된 콘트라스트제의 MRI 특성 결정
VHH R3VQ를 가돌리늄 (MRI 콘트라스트제)에 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA) (킬레이트제)로 결합시켰다. 위치 비특이적 및 위치 특이적인 두 가지 전략을 사용하였다:
- 첫 번째 전략은 (i) 킬레이트제 DOTA를 VHH (R3VQ-NH2 1)의 리신 잔기에 결합시키는 단계, 및 (ii) MRI 콘트라스트제, 즉, 가돌리늄 (Gd)로 이어 킬레이팅시키는 단계를 포함한다 (도 9a 참고). 이를 통하여 임의로 분포된 Gd를 가지며, 역상 고성능액체크로마토그래피/질량분석기 (RP-HPLC/MS)에 의해 나타나는 바와 같이, 일정 범위의 Gd:VHH 화학양론을 갖는 결합체 R3VQ-N-(DOTA/Gd)n 2의 복합 다중분산 혼합물이 제조되었다. DOTA 결합단계의 조건을 변경시킴으로써, 상이한 DOTA/Gd 밀도 (전체수율 60-67%)를 갖는 몇몇 결합체가 제조되었다. IHC 및 MRI에 의하여 생체 내 평가되었을 때, R3VQ-N-(DOTA/Gd)n 결합체는 생쥐에 뇌혈관 내 주입된 후, 아밀로이드 플라크를 인식할 수 있었다.
- 두 번째 전략은 VHH R3VQ를 말레이미도 화합물로 표지하는 것을 수반하는 위치 특이적 접근을 이용하는 것이었다 (도 9b 참고). N 말단으로부터 C말단으로 6-히스티딘 태그, 트롬빈 절단 위치, R3VQ VHH 서열, 및 이어 G3S 스페이서 및 세 개의 추가적인 아미노산 CSA을 함유하는 Cys-재조합 R3VQ (R3VQ-SH 3)가 고발현되도록 pET23벡터에서 클로닝되었다. SDS-PAGE 및 RP-HPLC/MS에 의하여 단일 도메인 생산물이 순수한 균질성을 갖는 것으로 나타났다. R3VQ-SH의 pI 값은 8.5-9였다. 말레이미도-(DOTA/Gd)3 화합물 4가 9-플루오르에닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 화학을 이용한 고상 펩티드 합성법에 의해 제조되었다. 말레이미도-(DOTA/Gd)3 화합물에 티오-부가에 의하여 결합될 때, R3VQ-SH는 완전히 명확하게 정의된 화합물인 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5로 전환되었으며, 이는 RP-HPLC/MS에 의하여 70% 수율을 갖는 것으로 나타났다. R3VQ-S-(DOTA/Gd)3의 pI는 표지되지 않은 R3VQ-SH 중 하나와 비교하여 약간 감소되었다. R3VQ-SH 및 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3의 결합특성은 ELISA 플레이트 및 용해성 Aβ40에 결합된 Aβ40를 수반하는 경쟁 억제 실험으로 결정되었다. 50%의 결합억제를 나타내는 Aβ40의 농도는 R3VQ-SH 및 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 모두에 대하여 1㎍/㎖인 것으로 계산되었으며, 이는 DOTA/Gd의 추가가 VHH 결합특성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, 형질전환 B6 PS2APP 생쥐에서의 VHH-특이적인 면역활성에 이어, R3VQ-SH는 항원 회수 예비처리 후에 생쥐 파라핀 절편 내에서 Aβ플라크를 면역탐지하는 우수한 능력을 나타내었다.
3.1. 일반적 합성 방법
별도로 특정된 사항이 없으면, 아미노산 유도체 및 제재들은 각각 Novabiochem 및 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 펩티드 및 VHH 용액 농도 (순수 단백질 용량)는 6N HCl로 110℃에서 20시간 동안 화합물을 가수분해한 후, Beckman 6300 분석기를 이용하여 정량 아미노산 분석 (AAA)에 의하여 결정되었다. UV 검출기 2487 (220 nm) 및 Q-Tofmicro™ 분광기 (Micromass)와 결합하여 전자스프레이 이온화 (양성 모드) 소스 (Waters)로 Alliance 2695 시스템상에서 RP-HPLC/MS 분석을 수행하였다. 샘플을 4℃로 냉각시켰다. 아세토니트릴 + 0.025% 포름산 (A)/물 + 0.04%TFA + 0.05% 포름산 (B)를 이용하여 10 또는 20분 동안 선형 밀도구배를 수행하였다. 사용된 칼럼은 XBridge™ BEH300 C18 (3.5μm, 2.1x100 mm) (Waters) (밀도구배 10-100% A)였다. 소스 온도는 120℃로 유지하였으며, 탈용매화 온도는 400℃로 유지하였다. 콘 (cone) 전압은 40V였다. 상기 샘플을 0.4-1 mg/ml 농도로 B로 추가된 각각의 버퍼에 주입하였다. 예상된 Mr 값은 N-말단 제거된 Met 및 하나의 이황화 결합을 갖는 단백질의 평균 질량과 상응한다. 상기 Mr 분석은 직접 투입에 의한 양성 모드로 동일한 분광기 상에 기록되었다 (소스 온도 및 탈용매화 온도는 각각 80℃ 및 250℃로 유지되었다). 상기 샘플은 5μM 농도로 0.1% 포름산을 갖는 물 /아세토니트릴 (1/1)에서 용해되었다. 4의 순도는 UV 검출기를 갖는 Agilent 1200 펌프 시스템을 이용하여 220 nm에서 RP-HPLC 에 의하여 분석되었다. 사용된 칼럼은 Kromasil C18 (100 , 5μm, 4.6x250 mm) (AIT)이었고, 아세토니트릴 (VWR) (C) / 물 + 0.1%TFA (VWR) (D)를 이용하여 20분 이상 구배를 수행하였다.
3.2. 위치 비-특이적 접근
모든 제재의 몰 평형이 반응기에 대한 상대 값으로 표시되었다 (R3VQ 당 5 NH2 및 DOTA / R3VQ 결합체의 평균). 전체 수율 (하기 표 2를 참고할 것)은 친화도 칼럼 용출 버포에서 출발 단백질 1로부터의 모든 합성 단계를 포함한다. 이들은 최종 산물 2a-f의 실질적인 양을 이들의 예상 양 (실제 단백질 함량)으로 나눔으로써 계산되었다.
친화도 칼럼으로부터 배출된 R3VQ(His)-NH2 VHH 1를 300 mM NaCl (PBS/NaCl)을 함유하는 PBS 버퍼에서 투석하였다. PBS/NaCl (120 ㎕)에 용해된 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산모노(N-하이드록시숙신이미드 에스테르) (DOTA-NHS) (274μg, 아미노기에 상대적으로 4 eq)를 1 (480㎕, 0.60 mg/ml)에 첨가하였고 상기 용액을 실온에서 교반하였다. 부분 표본 (10㎕)를 매 15분마다 추출하였으며, 이를 100 mM Tris 버퍼 pH 7.3 (90㎕)로 희석하였고, 반응 진행을 관찰하기 위하여 HPLC/MS로 분석하였다. 3시간 후에, 상기 용액을 4℃로 냉각시켰으며, 상기 버퍼를 Vivaspin 500 원심분리 여과 장치 (3,000 MWCO PES) (Sartorius)를 이용하여 0.4M Na 아세테이트 버퍼 pH 5로 교환하였다. 결과적인 DOTA-VHH 결합체 (480㎕)를 GdCl3 (149㎍, 평균 DOTA 기에 상대적으로 45 eq)와 함께 동일한 버퍼 (5㎕)에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 전술된 것과 동일한 Vivaspin 장치를 이용하여 4℃에서 상기 버퍼를 PBS/NaCl로 교환하였으며, 상기 용액을 R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)0-2 결합체 2f (105㎕, 1.48 ㎎/㎖)에 상응하도록 농축하였다. 수율은 67%이다.
결합체 2e가 DOTA-NHS가 1에 비율에 따라 (매 45분 마다 0.5 eq, 아미노기에 상대적으로 전체 5.5 eq) 첨가된 것을 제외하고는 동일한 과정을 이용하여 획득되었다. 상기 용액을 실온에서 8시간 15분간 교반하였다. 전체 수율은 60%이다.
R3VQ(His)-NH2 1
AAA: Ala 15.8 (16), Arg 9.1 (9), Asp+Asn 13.4 (13), Glu+Gln 16.0 (15), Gly 13.4 (14), His 5.7 (7), Ile 3.1 (3), Leu 8.4 (8), Lys 4.1 (4), Phe 4 (4), Pro 6.1 (7), Ser 11.3 (13), Thr 10.0 (11), Tyr 4.8 (5), Val 11.1 (11).
MS: 15753.0996 (C681H1053N209O216S4 calcd 15752.3949)
R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)0-2 2f
AAA: Ala 16.0 (16), Arg 10.0 (9), Asp+Asn 12.8 (13), Glu+Gln 15.0 (15), Gly 13.8 (14), His 6.7 (7), Ile 3.0 (3), Leu 8.2 (8), Lys 4.5 (4), Phe 4 (4), Pro 8.5 (7), Ser 10.5 (13), Thr 10.1 (11), Tyr 4.8 (5), Val 11.1 (11).
MS: 16293.1328 ((DOTA/Gd)1: C697H1076N213O223S4Gd calcd 16293.0263)
16833.5586 ((DOTA/Gd)2: C713H1099N217O230S4Gd2 calcd 16833.6576)
3.3. 위치 특이적 접근
R3VQ-SH 3의 생산
Cys-재조합 VHH (R3VQ-SH 3)의 암호화 서열을 NcoI 및 XhoI 제한 위치를 이용하여 변형된 세균 발현 벡터 pET23에서 클로닝하였다. 형질전환된 E. coli BL21 (DE3) pLysS 세포는 16℃에서 IPTG (0.5 mM)로 하룻밤 동안 유도된 후에 3을 발현한다. 정제된 VHHs를 IMAC에 의하여 Ni2 + (GE Healthcare)로 하전된 HiTrap 조 칼럼를 이용하여 제조자의 지시에 따라, 분리되었다. 500mM 이미다졸을 함유하는 PBS/NaC에서 3이 배출되었다.
AAA: Ala 16.1 (16), Arg 10.2 (10), Asp+Asn 13.6 (13), Glu+Gln 11.9 (11), Gly 19.1 (20), His 6.0 (7), Ile 3.1 (3), Leu 8.5 (8), Lys 2.2 (2), Phe 4 (4), Pro 4.3 (4), Ser 15.5 (18), Thr 9.5 (10), Tyr 4.8 (5), Val 12.9 (12).
MS: 15723.4268 (C671H1041N213O217S5 calcd 15724.2820).
말레이미도-(DOTA/Gd)3 4의 합성
Fmoc-Gly-Wang 수지 (143 mg, 0.093 mmol)로부터 4의 합성이 고상으로 단계적으로 수행되었다. 빌딩 블럭 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-삼-t부틸-아세테이트-10-(N-a-Fmoc-N-e-아세트아미도-L-리신)[Fmoc-Lys(DOTA(OtBu)3))-OH] (1.1 eq) (Macrocyclics) 및 6-말레이미도헥사노익산 (3 eq)를 커플링제로 2-(1H-9-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸루로늄 헥사플루오르인산 (HATU) (각각 1.06 및 2.9 eq)/디이소프로필에틸아민 (DIEA) (각각 2.2 및 6 eq) 및 용매로 디메틸포름아미드 (DMF) (Applied Biosystems)를 이용하여 손으로 투입하였다. Fmoc-Gly-OH (3 eq)를 DIC (3 eq)로 DMF 내에서 혼합하였다. Lys, Gly 및 말레이미도 유도체를 이용한 결합단계가 Kaiser test (E. Kaiser et al (1980) Anal. Biochem. 34, 595-598)로 관찰되었으며, 각각 3시간, 2시간, 및 1시간에 완성되었다. Fmoc 보호는 20% 피페리딘으로 DMF 내에서 제거되었다. 세 번째 리신 유도체 이후에, 6-말레이미도헥사노익산을 이용한 마지막 결합단계가 생산물 3/4 상에서 (0.07 mmol) 수행되었다.
펩티드-수지를 10 ㎖의 TFA (Applied Biosystems) / 물 / 트리이소프로필실란 (95/2.5/2.5 v/v/v)을 4℃에서 현탁시켰으며, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 상기 수지의 여과 후에, 상기 용액을 농축하였으며 조 생산물을 디에틸 에테르로 침전시켰다. 원심분리 후에, 펠릿을 물에 용해시켰고, NMR, MS, 및 RP-HPLC (구배 10-40% C, 유지 시간 9.2 분)에 의해 분석된 119㎎의 조 DOTA-펩티드를 얻기 위하여 동결건조하였다.
1H NMR (D2O)　: d 6.69 (s, 2H, CH Mal), 4.18 (m, 2H, 2CHa), 4.08 (m, 1H, CHa), 3.87-3.78 (m, 6H, CH2 Gly), 3.74-3.48 (b, 24H, CH2CO DOTA), 3.34 (t, 2H, CH2 6-Mal, J5,6=0,017 Hz), 3.30-2.99 (b, 48H, CH2CH2N DOTA), 3.06 (b, 6H, CH2e), 2.14 (m, 2H, CH2 2-Mal), 1.74-1.53 (m, 6H, CH2b), 1.49-1.34 (m, 10H, CH2d, CH2 3-Mal, CH2 5-Mal), 1.29-1.18 (m, 6H, CH2g), 1.16-1.06 (m, 2H, CH2 4-Mal).
13C NMR (D2O)　: d 177.11 (1C, CONH Mal), 175.15, 174.63, 174.36 (3C, CO Lys), 173.26 (2C, CO Mal), 172.93 (1C, COOH Gly), 171.48, 171.21 (2C, CO Gly), 163.04-162.68 (4C, CONH DOTA), 134.22 (2C, CH Mal), 120.59, 117.69, 114.79, 111.90 (TFA), 55.20-53.10 (12C, CH2CO DOTA), 54.04, 53.80, 53.47 (3C, CHa), 52.20-46.80 (24C, CH2CH2N DOTA), 42.38, 41.00 (3C, CH2 Gly), 39.10 (3C, CH2e), 37.37 (1C, CH2 6-Mal), 35.04 (1C, CH2 2-Mal), 30.48, 30.24, 30.23 (3C, CH2b), 27.67, 27.33, 24.67 (3C, CH2 3-Mal, CH2 5-Mal, CH2d), 25.43 (1C, CH2 4-Mal), 22.43, 22.33, 22.15 (3C, CH2g).
MS: [M+H]+ 1925.9888, [M+K]+ 1963.9391 (C82H136N22O31 calcd [M+H]+ 1927.1195, [M+K]+ 1965.2098).
DOTA-펩티드 매개체 (99 ㎎)를 0.4M Na 아세테이트 버퍼 pH 5 (41 ㎖)에서 용해하였으며, Gd(OAc)3.xH2O (123 ㎎, DOTA에 상대적으로 2 eq). 95℃에서 25분간 교반한 후, 상기 용액을 냉각시켰으며, C18 역상 칼럼 (2 g, 직경 1.5 cm) 상에 로딩하였다. 상기 칼럼을 네 부피 배의 물로 세척하였고, 산물을 79 ㎎이 되도록 동결건조 후에 세 부피 배의 물/아세토니트릴 1/1로 용출시켰다. 조 DOTA/Gd를 아세토니트릴+0.1%TFA / 버퍼 D로 40분 이상, 5/95부터 35/65까지 (20 ㎖/분, 유지 시간 18분)의 구배를 이용하여 역상 플래시 크로마토그래피 (30x200 ㎜)에 의하여 정제하였다. 주 분절을 동결건조시킨 후, 전체 수율 44%로 61㎎의 4를 획득하였다 (전체 수율은 모든 합성 단계를 포함하며, 이는 상기 수지상에 로딩된 최초의 Gly에 기초한 분리된 산물 4의 순수 펩티드 함량에 기초하여 계산되었다). 4를 MS 및 RP-HPLC로 분석하였다 (구배 5-35% C, 유지시간 12.2분, 순도 >90%).
MS: 2388.8889 (C82H127N22O31Gd3 calcd 2388.7901).
R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5의 합성
친화도 칼럼으로부터 배출된 R3VQ-SH VHH 3를 300 mM NaCl (PBS/NaCl)을 함유하는 PBS 버퍼 내에서 투석하였다. 4 (1.35 mg, VHH 당 1 티올기에 상대적으로 3 eq)를 3 (1.5 ㎖, PBS/NaCl pH 6.8 내에서 2㎎/㎖)에 첨가하였고 상기 용액을 4℃에서 3시간 동안 교반하였다. 그 후, 상기 용액을 Vivaspin 2000 원심분리 여과 장치 (3,000 MWCO PES) (Sartorius)를 이용하여 투석 여과하였다. 3과 5의 부분 표본 (20 ㎕)을 버퍼 B (20 ㎕)로 RP-HPLC/MS 분석을 위하여 희석시켰다. 또한, 3과 5의 부분 표본 (10 ㎕)을 100 mM Tris 버퍼 pH 7.3 (90 ㎕)에서 ELISA 분석을 위하여 희석시켰다. 1 ㎖의 5 (2.36　㎎/㎖)를 70%의 수율로 획득하였다. 최종 산물 5의 실제량을 그 예상량 (순수 단백질 함량)으로 나눔으로써 이를 계산하였다.
친화도 칼럼 용출 버퍼 (500 mM 이미다졸을 함유하는 PBS/NaCl)에서 동일한 반응이 직접적으로 수행되었으며, 83%의 전체 수율을 나타내었다. 따라서 R3VQ/Gd 결합체를 얻는 과정은 친화도 칼럼 용출 버퍼 (PBS/NaCl/이미다졸)에서 결합이 직접적으로 수행될 때 개선된다. i) 단계의 수가 둘로 감소되며, ii) 전체 수율은 83%까지 증가된다. 이러한 과정 개선은 또 다른 VHH (데이터 나타나지 않음)에 대한 확인으로 또한 확증되었다.
AAA: Ala 14.9 (16), Arg 10.2 (10), Asp+Asn 12.2 (13), Glu+Gln 11.1 (11), Gly 24.6 (23), His* (7), Ile 3.1 (3), Leu 8.5 (8), Lys 11.7* (5), Phe 4 (4), Pro 4.8 (4), Ser 14.9 (18), Thr 9.1 (10), Tyr 5.0 (5), Val 12.6 (12). [*His는 암모늄과 함께 공-용리 (co-elution)에 기인하여 결정될 수 없다. Lys는 분석 조건에서 말레이미도 유도체와 공-용리에 기인하여 과대평가된다.]
MS: 18113.7383 (C753H1168N235O248S5Gd3 calcd 18113.0720).
SDS-PAGE 전기영동
제조자의 지침에 따라, NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen)을 이용하여 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (PAGE)을 수행하였다.
pI 결정
IEF 2-9 겔 (Invitrogen)을 이용한 등전점 초점법에 의해 VHHs의 pI를 결정하였다. pH 8.5 내지 10.5를 포함하는 겔의 염기성 범위에서 최적의 단백질 분석이 가능하여, 양극에서 샘플 적용과 함께 NEPGHE (불평형 pH 구배 겔 전기영동)이 사용되었다. 과정은 SERVAGel IEF 3-10 지침서에 자세히 기술되어 있다.
ELISA
스트렙타비딘-코팅된 마이크로적정 플레이트 (Thermo Scientific, Denmark)를 4℃에서 1㎍/㎖의 비오틴 결합된 A-베타 40 또는 A-베타 42 (바람직하게는 A-베타 40)와 함께 밤새 배양함으로써 코팅하였으며, PBS에서 희석하였다. 플레이트를 PBS에서 버퍼 0.1% Tween 20으로 세척하였다. 위치 비특이적 전략에서, R3VQ-NH2 1, R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 2e가 PBS 내의 버퍼 0.5% 젤라틴 0.1% Tween 20에서 희석되었다. 37℃에서 2시간 배양 후, 각각 래빗 항-His 태그 폴리클론 항체 (eBiosciences), 이어 염소 항-래빗 면역글로불린 (Abcam)으로 표지된 과산화효소를 첨가하기 전에 플레이트를 다시 세척하였으며, 마지막으로 제조자의 지침에 따라 OPD (o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드, Dako)에 의해 추출하였다. 위치 특이적인 전략에서, 비오틴결합된 A-베타 40 또는 A-베타 42 (바람직하게는 A-베타 40)로 배양한 후, R3VQ-SH 3 및 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5를 전술된 바와 같은 동일한 버퍼에서 희석시켰으며, 모노클론 항-His 태그 항체 (H1029- Sigma), 이어 과산화효소 표지된 염소 항-생쥐 항체 (ab97265-Abcam)를 첨가하였고, 동일한 기질로 추출하였다.
친화도 결정
고정된 A-베타 40 또는 A-베타 42 (바람직하게는 A-베타 40) 인식의 50% 억제가 가능한 용해성 A-베타 40 또는 A-베타 42 (바람직하게는 A-베타 40) 펩티드의 양을 측정함으로써 3 및 5의 특성을 결정하였다. 간략하게, 다양한 농도의 A-베타 40 또는 A-베타 42 (바람직하게는 A-베타 40)를 정의된 3 또는 5의 양으로 평형에 도달할 때까지 4℃에서 밤새 배양하였다. 사용된 VHH 농도는 예비적인 ELISA 조정으로부터 추론되었다. 각각의 혼합물 (100 ㎕)을 항원으로 미리 코팅된 마이크로적정 플레이트의 웰로 옮겼으며, 4℃에서 15분간 배양하였다. 0,1% Tween 20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 결합되지 않은 VHH를 항-His mAb (H1029-Sigma), 이어 b-갈락토시다아제 염소 항-생쥐 Igs 및 4-메틸룸벨리페릴 b-D-갈락토시드를 첨가함으로써 검출하였다. 355 nm에서 여기시킨 후, 460 nm에서 형광을 측정하였다 (Fluoroskan, Labsystem, Finland).
면역 조직화학
면역 조직화학이 아밀로이드증을 갖는 형질전환 생쥐 모델 (PS2APP mice)로부터 획득된 파라핀 관상 뇌 절편 (5 μm 두께)상에서 수행되었다. 상기 절편은 미세절단 (Microm HM340E)으로 얻었다. 크실렌 (5분, 3회)에서 상기 절편을 파라핀 제거하였고,에탄올로 다시 수화하였으며 (100% x 2, 90 및 70%; 5분 /단계), 물에 넣었다. 그 후, 이들을 98% 포름산으로 5분 동안 전처리하였으며, 마지막으로 5분간 물에 침지시켰다. 내재성 과산화효소를 3% 과산화수소 및 20% 메탄올로 중화시켰으며,비특이적 결합 위치를 BS-0.5% tween pH8 BSA 2%로 30분간 차단하였다. 하기 단계에서, 각 단계 사이에서, TBS-tween로 절편을 3회 5분/시간 세척하였다. 그 후, 상기 절편을 일차 항체 R3VQ-SH로 4℃에서 밤새 배양하였으며, TBS-tween에서 2㎍/㎖로 희석하였다. 그 후, 상기 절편을 생쥐 모노클론 항-His-태그 항체 (H1029-Sigma)로 2시간 동안 실온에서 처리하였고, 마지막으로 제조자 지침에 따라, Dako REALTM 시스템 Peroxidase/DAB Kit (Glostrup, Denmark)로 현상하였다. 물로 세척한 후, 절편을 Harris 헤마톡실린으로 대비-염색하였으며, 물로 다시 세척하였다. 올리기 전에, 절편을 등급화된 에탄올 용액 (70, 90 및 100%)으로 탈수시켰고, 크실렌에서 세척하였다.
3.4. 합성된 콘트라스트제의 MRI 특성
콘트라스트제의 MRI 특성을 콘솔 동작 VnmrJ 2.3로 나타나는 7T-분광기 (Agilent, USA)상에서 평가하였다. 분광기에 700 mT/m의 설치류 구배 삽입물을 장착하였다. 방출 및 수용을 위하여 직각 새장 코일 (직경: 23㎜)를 사용하였다. 종축 및 횡축 완화도 r1 및 r2 (MRI 콘트라스트제로서의 "효율"을 의미하는 제재의 단위 농도당 완화 비율의 변화)를 0.2, 0.15, 0.1, 0.05, 0.025, 0.01,및 0 mmol/l 농도에 대한 콘트라스트제 농도의 함수로서 R1 (즉, 1/T1) 및 R2 (즉, 1/T2)의 선형 피트로부터 다음 방정식을 이용하여 결정하였다: R1(C) = R1(0) + r1 x C, 여기서, R1(C)는 농도 C에서 콘트라스트제를 함유하는 튜브 내의 R1이며, ,R1(0)은 콘트라스트제가 없는 튜브 내의 R1이고, C는 상기 콘트라스트제의 농도이다. r2를 계산하기 위하여, R2(C) = R2(0) + r2 x C가 사용되었다. 이들 샘플은 헤마토크리트 튜브 내에서 영상화되었다.
T1 계산은 스무 개의 TR 값 (TR = 0.021, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5 sec)을 갖는 일곱 단계의 연속 2D 멀티-슬라이스 스핀 에코 이미지에 기반하였다, TE =14ms, Nex = 4, FOV = 10x10mm2, Mtx = 64x64, 1 슬라이스, 슬라이스 두께 = 3mm, 대역폭 = 50kHz). 완화시간의 매개변수 지도를 지수함수 회귀곡선 (S = 1 - exp(-TR/T1))으로부터 계산하였으며, 여기서 S는 신호 강도이고, TR은 반복시간이며 T1은 종축 완화시간이다 (ImageJ, MRI Analysis Calculator, Karl Schmidt).
T2 계산은 16 에코 시간 (TE = 10 to 160 msec)를 이용한 2D 멀티-에코 멀티-슬라이스 스핀 에코 이미지에 기반하였다; TR = 3300ms; Nex = 2 ; 대역폭 = 100kHz, FOV = 10x10mm2, Mtx = 64x64, 1 슬라이스, 슬라이스 두께 = 3mm. 완화시간의 매개변수 지도를 지수함수 회귀곡선 (S = exp(-TE/T2))로부터 계산하였으며, 여기서 S는 신호 강도이고, TE는 에코 시간이며 T2는 종축 완화시간이다 (ImageJ, MRI Analysis Calculator, Karl Schmidt).
4. 면역조직화학, 생화학 및 시험관 내 MRI에 의한 VHH R3VQ, 및 VHH R3VQ 결합체의 시험관 내 특성
대상체
AD 환자 (Braak 단계 V 및 VI)의 인간 피질 뇌조직을 NeuroCEB 뇌 은행으로부터 얻었다. 상기 은행은 (France Alzheimer Association을 포함하는) 환자 연합 컨소시엄에 의하여 운영되는 뇌 기증 프로그램과 관련되어 있으며, 프랑스 법에 의하여 요구되는 바와 같이 연구 기관 및 대학에 공표되었다. 프랑스 생명윤리법에 따라 뇌 기증자에 대한 명백한 서면 동의를 얻었다.
6TgPS2APP (Richards J.G., 2003, J　Neurosci., 23:8989-9003) 및 APP/PS1dE9 (Garcia-Alloza M., 2006, Neurobiol Dis., 24:516-24) 형질전환 ㅅ새생쥐에서 임상 전 실험을 수행하였다. 실험 동물의 보호 및 사용에 대한 EEC (86/609/EEC) 및 프랑스 국립 위원회 (선언 87/848)의 권고에 엄격하게 따라, 동물 실험 절차를 수행하였다. 실험 동물은 다량의 펜토바르비탈 (100 mg/kg)로 희생시켰으며, 그 후 10% 포르말린으로 살포고정하였다. 그 후, 이들의 뇌를 제거하여, 최소 24시간 동안 포르말린에 침지하고 4℃에서 보관하였다.
조직 추출
Gong, Y. et al. (2003, Proc Natl Acad Sci USA, 100:10417-10422)에 따라 조직 추출을 수행하였다. AD 뇌 (0.2 g)의 전두 피질을 프로테아제 억제제 (200㎍/㎖ PMSF, 2 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 4 ㎍/㎖ 류펩틴, 30 ㎍/㎖ 벤즈아미딘 염화수소) 함유하는 페놀 레드-프리 Ham's F12 배지 (Gibco) 또는 버퍼 A (PBS, pH 7.4, 0.32 M sucrose, 50 mM Hepes, 25 mM MgCl2, 0.5 mM DTT) 20부피로 균질화하였으며, 100,000 x g에서 1시간 동안 원심분리하였다. 10 부피의 페놀 레드-프리 Ham's F12 배지 또는 버퍼 A와 프로테아제 억제제로 펠릿을 재균질화하였으며, 재원심분리하였다. 결합된 상층액의 단백질 농도가 결정되었다. 그 후, Centricon-10 농축기를 이용하여 단백질의 부분 표본을 60㎕ 또는 그 이하의 부피로 원심분리하였다.
면역 블롯
뇌 추출물 또는 A-베타 42 펩티드를 8M 요소를 함유하는 NuPAGE®LDS 샘플 버퍼 (Invitrogen)에서 재현탁하였다. NuPAGE Novex 4-12% Bis-tris 겔 (Invitrogen)을 이용한 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (PAGE)에 의한 분리 후, Xcell II 블롯 모듈 (Invitrogen)을 이용하여 Hybond-C (Amersham)상에서의 반-건조 이동 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 면역화학 반응 전에, 막을 4% 탈지유 용액에서 차단하였다. 막의 면역 블롯을 VHH로 수행하였으며, 래빗 항-His 태그 (eBioscience) 폴리클론 항체, 및 이후의 과산화효소 표지된 염소 항-래빗 면역글로불린 (Abcam)에 의해 밝혀졌다. 마지막으로, 과산화효소 활성을 화학형광 키트 (GE Healthcare)를 이용하여 시각화하였다.
면역조직화학
고정된 조직 (파라핀-침지되거나 냉동된 절편), 또는 선택적으로 고정되지 않은 신선한 조직 (냉동 절편) 상에서 면역조직화학을 수행하였다. 표준 IHC 프로토콜을 적용하였으며, 각각의 조직 조건에 따라 조정하였다. 파라핀 절편을 이용하여 수행되는 대부분의 면역염색 실험과 관련하여, 파라핀-침지된 재료의 구체적인 과정은 여기에 제시된다. 4μm 두께의 파라핀 절편 상에서 뇌조직의 면역염색을 수행하였다. 인간 및 생쥐 조직 모두를 사용하였다 Human AD 환자, TauPS2APP 생쥐 [Grueninger F. et al., 2010, Neurobiol Dis., 37:294-306] 및 PS2APP 형질전환 생쥐 [Richards, J. G., et al 2003, The Journal of neuroscience 23, 8989-9003]). 절편을 크실렌에서 파라핀을 제거하였고, 에탄올 (100%, 90%, 및 70%)로 각각의 용액마다 5분씩 다시 수화하였으며, 최종적으로 10분간 흐르는 수돗물로 처리하였다. 그 후, 이들을 98% 포름산에서 5분간 배양하였고, 흐르는 수돗물오 다시 세척하였으며, 3% 과산화수소를 갖는 내재성 과산화효소로 냉각시켰고, 최종적으로 물로 세척하였다. 비-특이적인 결합은 상기 절편을 30분간 2% 소 혈청 알부민으로 TBS+0.5% Tween에서 배양함으로써 차단되었다. 그 후, 일차 항체 (5-10 ㎍/㎖의 VHH His 또는 Strep 태그)의 적절한 희석이 적용되었고, 슬라이스를 실온으로 가습 챔버 내에서 밤새 배양하였다. TBS-Tween로 슬라이스를 세척하였고, 1/1000에 대하여 이차 항체 래빗 항-His Tag 또는 직접 제작한 비오틴 결합된 항-strep mAb C23-21로 TBS-Tween에서 실온으로 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 슬라이스를 제조자의 지침에 따라 Dako REALTM 검출 시스템의 제재, Peroxidase/DAB+와 함께 배양하였다. 우수한 신호-대-잡음 비가 획득될 때까지 (약 5분) 발색성 (DAB) 발현이 수행되었다. TBS-Tween로 세척한 후, 슬라이스를 헤마톡실린으로 대조 염색하였다. 플라크 표지를 위하여, 비오틴이 결합된 4G8 (Wisniewski T et al., 1996, B. Biochem J., 313:575-80) mAb (1/10000) 또는 6F/3D (Akiyama H. et al., 1996, Neurosci let., 206:169-72) mAb (1/200)가 평행하게 양성 대조구로 사용되었다.
시험관 내 MRI
B6TgPS2APP (Richards J.G., 2003, J Neurosci., 23:8989-9003) 및 APP/PS1dE9 (Garcia-Alloza M., 2006, Neurobiol Dis., 24:516-24) 형질전환 생쥐 (n=2, 암컷) 상에서 MRI를 수행하였다. 7T-분광기 (Agilent, USA)로 MRI를 기록하였고,콘솔 구동 VnmrJ 2.3로 접속하였다. 분광기에 700mT/m의 설치류 구배 삽입체를 장착하였다. 새장 코일 (RapidBiomed, GmbH, Germany) 및 생쥐 뇌 표면 코일 (RapidBiomed GmbH, Germany)을 각각 방출 및 수용을 위하여 사용하였다.
PBS 내에서 Triton 0.2% 용액에서 4시간 동안의 막 투과 후에, 뇌 샘플을 인산 버퍼 염수 (PBS) 용액에 침지하였으며, 콘트라스트제를 시험하고 4℃에서 적어도 24시간 동안 영상화 전에 저장하였다. 스캐닝을 위하여, 뇌를 단단한 플라스틱 튜브에 넣고 MR 이미지에서 검정색 배경을 제공하는 아프로토닉 퍼플루오르카본-기반 액체인, Fluorinert® (3M, Cergy-Pontoise, France)를 채웠다.
MR 이미지는 T2*w 이미지 (TR = 40 ms, TE = 15 ms, FA = 20?, Bw = 50 kHz, Nex = 16, 매트릭스 = 512 x 512 x 128, FOV = 13 x 13 x 13 mm2, 11시간 39분의 전체 Tacq에 대하여 25 x 25 x 100 ?m3의 해상도를 나타냄)를 얻기 위하여 사용된 (FLASH) 3D 구배-에코 서열에 기반하였다.
Gd-염색 방법: 아밀로이드 플라크 검출을 위한 황금 표준 방법.
이와 같은 절차는 시험관 내 절차 후에 MR 이미지상에서 나타나는 저밀도 점들 간의 공위치화, 및 아밀로이드 플라크를 드러내는 황금 표준 방법을 구축하기 위하여 사용되었다 (Petiet A. et al., 2012, Neurobiol Aging, 33:1533-44). 간략하게, 시험관 내 실험 후에, 샘플을 PBS 및 0.5 M 가도터레이트 메글루민 용액에 1:200 (2.5 mM)의 희석으로 침지하였고, 영상화 이전에 최소 24시간 동안 4℃에서 저장하였다. MR 이미지를 시험관 내 실험에서 사용된 것과 같은 동일한 조건으로 구현하였다.
5. VHH R3VQ, 및 VHH R3VQ 결합체의 생체 내 평가
대상체
VHH R3VQ, 및 VHH R3VQ 결합체의 생체 내 평가를 전술한 허가 하에 TauPS2APP (Grueninger F. et al., 2010, Neurobiol Dis., 37:294-306) 형질전환 생쥐상에서 수행하였다.
VHH의 생체 내 정위 주입
TauPS2APP (n=2 암컷) 형질전환 마취 생쥐에서 2 ㎕의 VHH로 0.5㎕/분의 비율로 생체 내 정위 주입을 수행하였다. 이소플루란 (1-2%) 및 공기 (1 L/분)의 혼합물로 생쥐를 마취시켰다. 이들을 정위 틀에 올렸고, 두개골을 Dremel로 측면으로 구멍내었다. MR 콘트라스트제를 주입하기 위하여 Blunt Hamilton 시린지를 사용하였다. 각각의 생쥐에 각각의 반구에서 전측 피질 및 해마에 4회 주입하였다. 전두 피질에서의 정위 좌표는 시상봉합과 관상봉합의 접합점 (bregma)으로부터 전방 +0.86mm, 중앙선으로부터 측방 ±1.5mm, 경뇌로부터 -0.65　mm 내강 쪽이었다. 해마에서 정위 좌표는 시상봉합과 관상봉합의 접합점으로부터 -2.18mm 후방있고, 중앙선으로부터 측방 ±1.5mm, 경뇌로부터 -1.8　mm 내강쪽이었다. 주입 후, 2 또는 24시간 경과 후, 생쥐들을 안락사시켰고, PBS (pH 7.6) 내 4% 파라포름알데히드를 심장 내 살포하였다. 뇌를 제거하여 4℃에서 하룻밤 동안 동일한 고정제로 후고정하였다. 4μm 두께의 파라핀 절편을 제조하였다. 전술된 표준 면역조직화학 절차 중 어느 하나를 이용하여 뇌 조직에서 VHH의 존재가 검출되었다.
아밀로이드증을 갖는 생쥐 모델에서 VHH의 경동맥 내 살포
마취된 TauPS2APP 생쥐 (n=2, 암컷)에서 VHH의 경동맥 내 살포를 수행하였다. 케타민 염화수소 (Imalgen, 50 ㎕의 희석 용액 1/10) 및 크실라진 (Rompun, 50　㎕의 희석 용액 1/40)의 혼합물을 복강 내로 한 번 주입하여 마취를 수행하였다. 일반 경동맥을 노출시켰으며, 섬세한 실리콘 튜빙으로 캐뉼러삽입을 수행하였다 (PP25_100FT; Portex, Ashford, UK). VHH를 일정 비율로 연동 펌프 (Model PHD 2000; Harvard Apparatus, Boston, MA, USA)를 이용하여 경동맥 내로 주입하였다.
측면 정맥 주입
꼬리를 위한 구멍을 갖는 적절한 뒤집힌 비커에 생쥐를 넣었다. 주입 전에 동물을 따뜻하게 하였으며, 정맥 혈관 확장을 유발하기 위하여 꼬리를 미적지근한 물로 적셨다. 콘트라스트제의 적절한 투여를 보장하기 위하여, 카테터 (27G, Microflex, Vygon, France)를 동물의 꼬리 정맥 내로 삽입한 후, MR 이미지 전에 주입을 수행하였다. 200 ㎕ PBS에 용해된 VHH, VHH R3VQ-DOTA, 또는 VHH R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 2㎎을 그 후 측면 꼬리 동맥 내로 주입하였다.
생체 내 MRI
콘솔 동작 VnmrJ 2.3로 나타나는 7T-분광기 (Agilent, USA)상에서 생체 내 MRI를 수행하였다 (시험관 내 MRI 부분 참고). MRI 실험 동안, 동물을 이소플루란 (0.75 -1.5%) 및 카르보겐 (95% O2 - 5% CO2) 혼합물로 마취시켰으며, 이들의 호흡율을 관찰하였다. 카르보겐은 순환 혈액으로부터 나오는 신호를 감소시키기 위하여 사용되었다 (Thomas et al., 2003).
고 해상도 3D-구배 에코 서열 (29*29*117 μm3, FOV: 15*15*15mm3, Mtx=512*512*128, TR=30ms, TE=15ms, 플립 각도=20°, Nex=1, 대역폭=25kHz, 획득 시간: 32분 (Petiet, A. et al., 2012, Neurobiol Aging, 33:1533-44)를 이용하여 MR 이미지를 기록하였다.
T1 계산은 다섯 개의 TR 값 (TR=0.4, 0.75, 1.5, 2.5, 및 5s, TE=14ms, Nex=1, FOV=25x25mm2, Mtx=128x128, 6 슬라이스, 슬라이스 두께=1mm, 대역폭=50kHz)을 갖는 일곱 개의 연속적인 2D 멀티-슬라이스 스핀 에코 이미지이 기반하였다. 완화 시간의 매개 변수 지도를 지수함수 회귀곡선 (S = 1 - exp(-TR/T1))로부터 계산하였으며, 여기서 S는 신호 강도이고, TR은 반복시간이며 T1은 종축 완화시간이다 (ImageJ, MRI Analysis Calculator, Karl Schmidt). 완화시간은 뇌의 전측에서 피질 영역으로부터 측정되었다.
생체 외 MRI
VHH-S-(DOTA/Gd)3 (1 ㎍/측)를 생체 내 뇌 혈관 내 주입한 지 6시간 후에, 생쥐를 살포하고 (PFA 4%) 그 뇌를 생체 외 MR 이미지 전에 추출하였다. 각각의 과정마다, (즉　0.1mM)의 Gd 평형 용액을 이용하여 대조구 실험을 수행하였다.
결과
1. 라이브러리 구축, 및 특이적인 항-Aβ VHH의 선별
VHHs를 PCR로 증폭하였으며, 베터 pHEN1에서 클로닝하였다. 연속적인 형질전환으로 약 108 클론의 라이브러리를 구축하였다. 비오틴 결합된 Aβ1-42, Aβ1-40 또는 Aβ1-16 펩티드로 3회 확장 사이클을 통하여 파아지 디스플레이에 의하여 최상의 친화도를 나타내는 VHHs를 선별하였다. 46 개체의 클론이 ELISA에 의하여 Aβ40로부터 192개의 클론 및 Aβ16로부터 192개의 클론인 Aβ42 확장으로부터 테스트되었다. 46/46, 110/192 및 163/192가 Aβ42, Aβ40 및 Aβ16 확장으로부터 양성인 것으로 각각 밝혀졌다. 이들 양성 클론의 서열을 결정하였으며, 각각 45, 65 및 118 VHH 서열들이 밝혀졌다. 최종적으로 3개의 VHH 패밀리가 선택되었다 (A7/ B10, F12 및 R3VQ) (하기 표 1을 참고할 것). 각각 비오틴 결합된 Aβ1-42, Aβ1-40 또는 Aβ1-16에 대한 확장 후에 A7/B10 VHHs가 11, 64 및 117 번 발견되었다. 비오틴 결합된 Aβ1-42 및 Aβ1-40에 대한 확장 후에 VHH R3VE/Q는 각각 34회 및 1회 발견된 반면, VHH F12는 Aβ16 확장 후에 1회 발견되었다.
이들 VHHs는 높은 수준의 VHH 발현을 위하여 각각 His-태그 또는 스트렙타비딘-태그로 벡터 pET23 또는 벡터 pASK IBA2에서 서브클론되었다. 1-2　㎎/ℓ의 세균 배양 수율을 획득하였다. 단일 도메인 산물이 SDS-PAGE (데이터 나타나지 않음)에 의하여 균질성에서 순수한 것으로 나타났으며, 이들의 pI 값은 8.5를 넘었다. 상기 두 개의 구축체로 연속적인 실험을 수행하였다.
R3VQ는 4℃로 보존되거나 또는 장기 보존을 위해서는 -20℃로 보존된다. 이는 글리세린 없이 냉동되는 경우 불안정하다. DLS 실험은 R3VQ가 단량체라는 점과 정제 후에 뭉치지 않는다는 것을 나타내었다. 항-Aβ VHHs A7, B10, R3VE, R3VQ 및 F12의 아미노산 서열 정열이 도 10에 나타나 있다.
2. VHH R3VQ에 의한 아밀로이드 플라크의 인식
VHH R3VQ의 Aβ 및 아밀로이드 병변에 대한 면역활성
인간 AD 뇌 및 형질전환 TauPS2APP 생쥐에서 VHH-특이적 면역활성의 분포가 검사되었다. R3VQ는 항원 회수 전처리 후에 인간 파라핀 절편에서 Aβ 플라크 및 뇌 아밀로이드 맥관 장애 (CAA)를 면역 검출하는 우수한 능력을 나타내었다 (도 1). 야생형 생쥐에서는 어떠한 표지도 관찰되지 않았다. 파라핀-침지된 조직상에서의 결과를 비교할 때, R3VQ를 이용한 Aβ면역검출이 자유-부유 진동절단 절편, 더욱 중요하게는 AD 인간 뇌 및 생쥐 뇌 절편의 신선한 조직상에서 어떠한 항원 회수 전처리의 사용 없이도 용이하게 획득될 수 있다는 점 (데이터 나타나지 않음)이 밝혀졌다. 특히, 강한 배경 신호 및 낮은 신호/잡음비가 동결 절편 상에서 얻어진 자유-부유 절편으로 관찰되었으며, R3VQ IHC에 대한 이러한 물질의 사용을 배제하였다. VHH A7/B10 및 F12에 대하여 아밀로이드 플라크 면역표지를 관측할 수 없었으며, 이들 VHHs를 이용한 더 이상의 실험을 수행하지 않았다.
뇌 조직상에서 VHH R3VQ의 면역활성을 확인하기 위하여, AD 환자로부터 얻은 뇌 추출물 상에서 웨스턴-블롯 면역분석을 수행하였다. 40 내지 55 kDa 사이의 Aβ올리고머에 상응하는 4개의 주요한 밴드가 VHH R3VQ로 면역검출되었다. 대응되게 R3VQ가 단량체,이량체 및 삼량체에 상응하는 6 내지 17　kDa 사이의 Aβ42 펩티드로 3개의 밴드를 인식하였다 (도 4).
R3VQ는 Aβ42의 중앙 영역을 인식한다.
VHH R3VQ는 Aβ42를 이용한 억제 분석에서 섬유상 합성 Aβ42 펩티드에 특이적인 것으로 나타났다. VHH R3VQ 는17 nM의 KD를 갖는다. VHH R3VQ에 의하여 인식되는 에피토프를 추가로 결정하기 위하여, 상이한 Aβ 절편 (1-16, 10-20, 15-25, 22-35 및 29-40)에 상응하는 Aβ40 및 펩티드에 대하여 50% 억제에 요구되는 농도 (IC50)가 결정되었다. VHH R3VQ는 1-16 및 29-40 어느 것도 인식하지 못하였다. Aβ 16-35에 대한 VHH R3VQ의 IC50은 16 nM이었으며, 이는 VHH R3VQ가 Aβ42의 중앙에 있는 에피토프를 인식함을 나타낸다. Roche에 의해 제공되는 H4 안정 클론을 이용한 플로우 혈구계산에 의하여 R3VQ는 APP를 인식하지 못하였다 (데이터 나타나지 않음).
VHH R3VQ는 정위 주입 후 아밀로이드 플라크를 생체 내에서 표지한다.
2 ㎍의 VHH R3VQ를 생쥐 (2마리) 뇌의 좌반구의 해마 또는 피질로 정위적으로 주입하였다. 주입 2시간 또는 24시간 후에, 동물을 희생시켰고, 뇌 절편을 회수하였다. 아밀로이드 플라크의 면역염색으로 VHH R3VQ가 생체 내에서 섬유상 Aβ를 표지한 것으로 관찰되었다. 또한, 피질 내의 갈색 후광이 관찰되었으며, 이는 VHH R3VQ가 뇌조직 내로 확산 되었음을 나타낸다 (도 5a 및 5b).
VHH R3VQ는 생체 내에서 BBB를 가로지른다.
BBB를 가로지르는 능력에 대하여 VHH R3VQ를 생체 내에서 테스트하였다. VHH 4㎎를 좌 경동맥을 통하여 60분 이상 주입하였다. 주입 후, VHH가 뇌 조직으로의 확산될 수 있도록 생쥐를 마취 및 고정제로 살포하기 전에 1시간 방치하였다. 아밀로이드 플라크의 면역염색이 피질, 해마 및 시상에서 관찰되었다. 이러한 염색은 주입된 경동맥에 반대 측방인 우반구에서 희미하였다.
상기 실험은 표지되지 않은 R3VQ가 1) 느린 내부-경동맥 주입 후, BBB를 가로지를 수 있었으며, 2) 생체 내에서 아밀로이드 플라크를 특이적으로 인식할 수 있었고, 3) MRI 연구를 위한 훌륭한 후보가 된다는 점을 밝혔다.
VHH R3VQ와 아밀로이드 β와 관련된 공지의 VHHs의 비교
하기 표 1은 알파카를 오발부민 또는 섬유상 형태의 Aβ42에 결합된 펩티드 Aβ1-10, 펩티드 Aβ42로 면역시켜 얻은 아밀로이드 β와 관련된 VHHs의 표지를 요약하여 나타낸다. 리보좀 디스플레이에 의하여 선별된 VHHs R1.3, R1.5 및 R3.3을 제외하고는 파아지 디스플레이를 이용하여 VHHs의 선별을 수행하였다.
알파카를 오발부민 또는 섬유상 형태의 Aβ42에 결합된 펩티드 Aβ1-10, 펩티드 Aβ42로 면역시켜 얻은 아밀로이드 β와 관련된 VHHs의 표지. VHHs L1-3, L35, 61-3, V31-1는 Lafaye P. et al., 2009, Molecular Immunology, 49:695-704에 개시되어 있다. 기타 VHHs는 전술된 방법에 따라 획득되었다.
VHH 클론 면역원 선별 표지
아밀로이드
맥관장애 (CAA)		 아밀로이드
올리고머		 아밀로이드
플라크
Aβ42올리고머 Aβ42코팅된 튜브
LI-3 0 0 0
L35 0 0 0
61-3 0 0 0
V31-1 0 ++ 0
Aβ1-10 코팅된 튜브
L3 0 0 0
L4 0 0 0
L7 0 0 0
V2 0 0 0
V17 0 0
V11 0 0 0
OVA Aβ1-10 Aβ1-10 코팅된 튜브
NN1 ++ 0 0
NN3 ++ 0 +
NN4
섬유상 Aβ42 Aβ42코팅된 튜브
2D5 0 0 0
3F7 0 0 0
2A5 0 0 0
3B4 0 0 0
3B10 0 0 0
3H7 0 0 0
섬유상 Aβ42 리보솜 디스플레이+
Aβ42코팅된 튜브
R1.3 ++ 0 0
R1.5 0 0 0
R2.3 ++ 0 0
R3.3 ++ 0 +
섬유상 Aβ42 비오틴결합된 Aβ40 또는 비오틴결합된 Aβ16 비오티닐+ 자성 비드
B10 0 0 0
A7 0 0 0
F12 0 0 0
섬유상 Aβ42 비오틴결합된 Aβ42
+ 자성 비드
R3VE
R3VQ		 ++ 0 +++
대조구
AcM 6F/3D +++ +++
상기 결과는 27개의 VHHs 중에서 단지 VHH R3VE/Q만이 아밀로이드 올리고머가 아닌, 아밀로이드 맥관장애 및 아밀로이드 플라크를 표지할 수 있음을 나타낸다.
3. MRI 콘트라스트제에 항체의 결합
위치 비-특이적 접근
NHS-활성화 DOTA를 이용하여 VHH 리신 잔기에 결합을 수행하였다. Gd로 후속 킬레이팅을 수행하여 단백질 상에 다양한 비율의 DOTA/Gd로 결합체를 형성하였다 (표 2). HPLC/MS에 의한 두 단계 모두의 관찰이 과정을 최적화시킬 수 있었다. 거의 완벽한 킬레이션이 실온에서 수행될 수 있었다.
두 개의 초기 결합체 (2a 및 b)는 글리세린 없이 -20℃에서 저장하는 동안의 불안정성 때문에 Aβ 결합 활성을 보이지 않았다. 실험 조건을 다양화시킴으로써, 우수한 회수율 (64-74%)로 0.5-1 mg으로 네 개의 새로운 결합체가 제조되었다. 첫 번째 시리즈 (2c 및 d)가 두 번째 시리즈 (2e and f)보다 더 높은 DOTA/Gd 밀도를 가진다. ELISA에서의 본래의 VHH 1 Aβ 인식과 비교하여, 2e 및 2f의 결합이 거의 영향을 받지 않은 반면 (50 내지 100%), 2c 및 2d의 결합은 낮다 (~10%). 이러한 차이는 DOTA/Gd의 전체적인 더 낮은 밀도 및/또는 VHH의 본래적인 안정성에 기인하는 것으로 보인다.
R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd) 결합체
화합물
 실험조건 평균
DOTA/단백질b 		평균
Gd/단백질b 		전체 수율 (%) ELISA 대
본래의 VHH
초기저장 결합a 킬레이팅a
2a -20℃ 12×2eq, 12h 20℃, 2h30 (3)4 5(6) (3)4(5) 67 -
2b -20℃ 12×2eq, 12h 60℃, 15분 (3)4(5) (3)4(5) 65 -
2c -20℃+글리세롤 12×2eq, 12h 20℃, 2h30 (1)2(3) (1)2(3) nd +
2d -20℃+글리세롤 12×2eq, 12h 60℃, 20분 (1)2(3) (1)2(3) nd +
2e +4℃ 11×5eq, 8h15 20℃, 2h30 (0)12(3) (0)12(3) 60 ++
2f +4℃ 4eq, 3h 20℃, 2h30 (0)1(2) (0)1(2) 67 ++
a 반응은 실온에서 수행됨.
b MS에 의하여 결정됨. 부수적인 화합물은 괄호에 표시됨.
위치 특이적 접근:
이러한 전략은 말레이미도-(DOTA/Gd)3 화합물 4를 갖는 Cys-재조합 R3VQ VHH (R3VQ-SH 3) (SEQ ID NO 8)의 표지를 수반한다 (도 9b 참고).
DOTA는 모노아실 모이티로 표현된다. 전체 수율은 괄호에 표시된다.
티오추가에 의하여 4에 결합될 때, 3은 전체적으로 RP-HPLC/MS에 의하여 나타난 바와 같이 79% 수율을 갖는 잘 정의된 화합물 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 5로 변했다. 5의 pI는 표지되지 않은 R3VQ-SH 중 어느 하나와 비교하여 약간 감소하였다. R3VQ-SH 및 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3의 결합특성은 ELISA 플레이트 및 용해성 Aβ40에 결합된 Aβ40를 수반하는 경쟁 억제 실험으로 결정되었다. 50% 결합 억제를 보이는 Aβ40의 농도는 R3VQ-SH 및 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 모두에 대하여 1㎍/㎖인 것으로 계산되었으며, 이는 DOTA/Gd의 첨가가 VHH 결합 특성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 또한, 형질전환 B6.PS2APP 생쥐에서, VHH-특이적 면역활성의 분포에 따라, R3VQ-SH는 항원 회수 전처리 후에 생쥐 파라핀 절편에서 Aβ 플라크를 면역 검출하는 우수한 능력을 나타내었다.
말레이미도-DOTA/Gd에 대한 결합을 위한 C-말단 Cys 잔기를 갖는 R3VQ-SH가 구축되었다 (도 9). 배지 1리터당 15 ㎎의 정제된 단백질이 발현된다. 그러나, 몇몇 구축체가 이전에 구현되었으며, 아래에 요약된다:
- C말단에서 N말단으로 스트렙타비딘 태그, Cys가 Val 및 Ser으로 돌연변이된 VHH R3VQ, Cys, 트롬빈 절단 위치 및 히스티딘 태그를 함유하는 Strep-R3VQSS프리-Cys-Thr-His. 이러한 단백질은 매우 낮은 수율 (㎍단백질/ℓ)로 발현되었다.
- C말단에서 N말단으로 (스트렙타비딘 또는 히스티딘 태그 중 하나의) 태그, Cys가 Val 및 Ser으로 돌연변이된 VHH R3VQ, Cys를 함유하는 Tag-R3VQSS프리-Cys 및 His Tag-R3VQSS프리-Cys; 두 단백질 모두 매우 낮은 수율 (㎍단백질/ℓ)로 발현되었다.
- C말단에서 N말단으로 (스트렙타비딘 또는 히스티딘 태그 중 하나의) 태그, Cys가 Val 및 Ser으로 돌연변이된 VHH R3VQ, Cys, Ser 및 Ala을 함유하는 Tag-R3VQSS프리-Cys-Ser-Ala; 이들 단백질은 매우 낮은 수율 (㎍단백질/ℓ)로 발현되었다.
- C말단에서 N말단으로 (스트렙타비딘 또는 히스티딘 태그 중 하나의) 태그, 트롬빈 절단 위치, Cys가 Val 및 Ser으로 돌연변이된 VHH R3VQ, Cys, Ser 및 Ala을 함유하는 Tag-Thr R3VQSS프리-Cys-Ser-Ala. 이들 단백질은 매우 낮은 수율 (㎍단백질/ℓ)로 발현되었다.
4. Gd 콘트라스트제로 결합된 VHH R3VQ로 아밀로이드 플라크의 검출
R3VQ-N-(DOTA/Gd)(1-2) l는 정위 주입 후에 생체 내에서 아밀로이드 플라크를 표지한다.
VHH R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2 (2e) 2㎍을 생쥐 뇌 (2마리)의 좌반구의 해마 및 피질로 정위주입하였다. 주입 4시간 후에, 동물을 희생시켰으며 뇌 절편을 수집하였다. 아밀로이드 플라크의 면역 염색이 관찰되었으며, 이는 R3VQ-N-(DOTA/Gd)n'가 섬유상 Aβ를 생체 내에서 표지하였음을 나타낸다 (도 6a 및 6b). 도 6c 및 6d는 주입 위치에서 멀리 떨어진 시상에 존재하는 아밀로이드 β플라크의 표지를 나타낸다. 4G8 항체로 아밀로이드 플라크를 표지하기 위하여 동일한 생쥐 상에서 대조구 실험을 수행하였다 (도 6e).
시험관 내 영상화
R3VQ-N-(DOTA/Gd)1- 2용액에 침지된 TauPS2APP 생쥐의 뇌 영상화 (0.01mM의 Gd에 해당하는, 0.02 mg/ml의 최종 농도의 2e 콘트라스트제)는 Gd-염색 방법에 의하여 드러난 아밀로이드 플라크로 공위치화될 수 있었던, 동일한 조건 (데이터 나타나지 않음)의 대조구 생쥐 이미지의 뇌에서 검출될 수 없었던 몇몇 낮은 밀도의 점들 (n=2; 도 7a, 화살표)을 드러냈다 (도 7b, 화살표). 파라핀 절차에 의한 왜곡으로 MRI와 IHC 간에 점-대-점 등록이 불가능하였을지라도, IHC는 VHH-DOTA/Gd의 대량 확산 및 동일한 영역에서의 아밀로이드 플라크의 표지를 확인하였다 (도 7c, 화살표). 또한, 낮은 밀도의 점들이 동일한 조건 (n = 2, 데이터 나타나지 않음)으로 대조구 생쥐 이미지의 뇌에서 또는 동일한 농도 (즉, 0.01mM; 도 7d)로 가돌리늄 용액에 침지된 TauPS2APP 생쥐의 뇌에서 검출될 수 있었다.
뇌 내, 경동맥 내 또는 IV 주입 후의 생체 외 영상화
뇌 혈관 내 주입 후, 항-Aβ VHH-Gd 2e (R3VQ-N-(DOTA/Gd)1- 2)는 해마에서 (도 8a) 생체 외 이미지상에서 낮은 밀도의 점들을 나타내었으며, 이는 동일한 생쥐 (도 8b)상에서의 Gd-염색에 의하여 확인된 아밀로이드 플라크에 대응된다. 파라핀 절차에 의한 왜곡으로 MRI와 IHC 간에 점-대-점 등록이 불가능하였을지라도, IHC는 동일한 영역 (도 8c, 화살표)에서 아밀로이드 플라크의 표지를 확인하였다. 또한, R3VQ-N-(DOTA/Gd)1-2에서 사용된 것과 동일한 농도 (0.1 mM)의 가돌리늄 용액의 형질전환 TauPS2APP 생쥐의 주입에서 낮은 밀도의 점들이 검출되지 않았다.
생체 내 MRI에 의한 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 평가
전술된 위치 특이적 접근에 의하여 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3를 합성하였다. HPLC/MS, pI, 및 IHC 분석은 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3의 생화학적 특성 (즉, HPLC/MS에 의한 순도, pI, 및 Aβ에 대한 IHC 반응성)을 확인하였다 (도 11).
PS2APP 생쥐의 뇌를 시험관 내 배양한 후, 전술된 바와 같이, 0.1㎎/㎖의 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3로 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3가 MR 콘트라스트 변형을 유발하는 능력을 평가하였다 (Richards, J. G., et al., 2003, The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 23, 8989-9003) (n=2). 7T에서 획득된 이미지는 음성 대조구 조건에서 PS2APP 생쥐의 뇌와 비교하여 피질에서 낮은 밀도의 점들을 드러냈다 (도 12A 및 B). 이러한 낮은 밀도의 점들의 아밀로이드 플라크로서의 특성을 확인하기 위하여, 뇌를 아밀로이드 플라크의 MRI 검출에 대한 황금 표준 방법으로서 사용되는 Gd-염색 과정을 거쳤다 (도 12C). Gd-염색 과정 후에 획득된 이미지 분석은 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3에 의하여 드러나 낮은 밀도의 점들의 Gd-염색에 의하여 검출된 아밀로이드 플라크의 동시-등록 (co-registration)을 가능하게 하였다. 이러한 결과는 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3가 사후조직 및 표적 아밀로이드 축적물로 수동적으로 확산되어, 시험관 내에서 MRI에 의한 검출을 가능하게 함을 나타낸다.
주변 (정맥 내) 주입 후의 생체 외 MRI에 의한 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3의 평가
그 후, 전술된 바와 같은 18월령의 PS2APP 생쥐의 꼬리 정맥에 (20 mg/kg 및 50 mg/kg로) 정맥 내 주입된 후, MRI에 의하여 아밀로이드 플라크를 드러내는 R3VQ-S-(DOTA/Gd)3 능력을 조사하였다. 주입 5시간 후의 뇌 추출 후에, R3VQ-S-(DOTA/Gd)3가 정맥 내로 주입된 PS2APP 생쥐의 11.7T에서 획득된 MR 이미지를 획득하였다. 대조구 조건 (PBSRK 주입된 PS2APP 생쥐)의 MR이미지와 대조적으로 (도 13A 및 B), R3VQ-S-(DOTA/Gd)3가 정맥 내로 주입된 생체 외 뇌상에서 획득된 이미지는 수많은 낮은 밀도의 점들을 나타내었다 (도 13C 및 D). 이들 낮은 밀도의 점들은 황금 표준 Gd-염색 절차로 검출된 아밀로이드 플라크에 상응하는 콘트라스트 이상과 함께 동시 등록되었다 (도 13E 및 F). 이들 점들은 50 mg/kg로 더욱 밀도가 높았으며, 이-광자 결과에 따라, 이는 R3VQ 뇌 관통 및 뇌 Aβ병변을 표지하는 능력이 양에 의존적임을 나타낸다.
실시 예 2: 형광포어 제재에 결합된 항-A베타 VHHs의 생성 및 시험관 내/ 생체 내 평가
1. 물질 및 방법
이후 명백하게 언급되지 않는 한, 물질 및 방법은 실시 예 1에 기술된 것과 같다.
2. Aβ-양성 병변에 대한 생체 내 표적화
R3VQ-SH와 AF488 형광포어의 결합
R3VQ VHH와 형광포어 간의 결합을 수행하기 위하여, 전술된 바와 같은 위치 특이적 결합을 수행하였다. 간략히, 추가적인 시스테인 잔기를 R3VQ 서열(R3VQ-SH로 언급됨)의 C 말단부에 삽입하였고, 이에 따라 말레이미도-Alexa Fluor® 488 (AF488)의 C 말단 티오-부가가 가능하였다. 이러한 방법에 의하여, VHH 상에 단일 AF488를 갖는 R3VQ-S-AF488로 언급된 잘 정의된 결합체를 획득하였다 (도 14).
SDS-PAGE 및 HPLC/MS 분석은 상기 분자에 AF488를 첨가한 것에 상응하는 예상된 분자량 (698 Da 증가)을 나타내었다. 이들 데이터는 결합체의 표지 및 순도를 확인한다 (도 14a 및 b).
R3VQ-SH 및 R3VQ-S-AF488의 등전점 (pI)을 IEF 3-10 겔을 이용하여 NEPHGE로 분석하였다. R3VQ-SH의 pI는 8.5 내지 9.5 (도 14c)였으며, 이는 R3VQ의 pI와 비슷했다. AF488를 R3VQ-SH에 추가한 것은 약 8.3인 pI를 약간 감소시켰으나, 여전히 염기성이었다 (도 14c). R3VQ-SH 및 R3VQ-S-AF488의 유체역학적 반경 (RH)을 DLS로 측정하였다. 시간에 대한 크기 분포는 R3VQ-SH에 대하여 2.66±0.0788 nm의 평균 RH 및 R3VQ-S-AF488에 대하여 2.34±0.106 nm의 평균 RH를 나타내었으며, 이는 이들 모두 용액에서 단량체임을 나타낸다. R3VQ-S-AF488에 의한 아밀로이드 플라크 면역염색이 PS2APP 생쥐의 뇌 절편을 이용한 IHC에 의하여 시험관 내에서 확인되었다 (도 14d).
상부 뇌 주입 후의 R3VQ-S-AF488의 확산 (이-광자 영상화)
우측 후방 피질에 대하여 두개골 창을 확보하기 위하여 PS2APP 생쥐의 개두를 수행하였다. 경뇌막을 벗겨낸 후, 15 ㎍ (10㎕)의 R3VQ-S-AF488를 노출된 뇌에 직접 투입하였다. 이-광자 현미경에 의하여 약 2시간 동안 R3VQ-S-AF488 확산이 수행되었다. 전형적으로 특이적인 아밀로이드 플라크 및 CAA의 염색이 뇌 유조직에서 관찰되었으며, 이는 R3VQ-S-AF488가 주위피층으로 주입된 후, 확산되어 생체 내에서 세포 외 및 혈관성 Aβ-양성 병변을 검출할 수 있음을 나타낸다.
정맥 내 주입 후 R3VQ-S-AF488의 확산 (이-광자 영상화)
정맥 내 주입된 VHHs의 인위적으로 쉬운 뇌 관통이 가능할 수 있는 새는 부분이 없음을 확실하게 하기 위하여 MRI로 실험대상 생쥐의 혈액-뇌 장벽 (BBB)이 완전한지 확인하였다 (하기 대조구 실험 참고).
50-㎎/㎏ 용량의 R3VQ-S-AF488를 생쥐의 꼬리 정맥에 주입하였다. 뇌에서의 결합체 분출 및 염색을 뇌 창 (z=표면에서 최대 360 μm 깊이) 상에서 이-광자 현미경을 이용하여 주입 후 3.5시간 동안 기록하였다. 도 16a는 동일한 영역에서 최대 30분간 R3VQ-S-AF488의 영상화 재구축 (최대 강도 투사 - MIP)을 나타낸다. 정맥 주입 몇 초 후, 수지상 혈관의 강한 염색이 관찰되었고, 20분 후에 단지 몇몇의 모세혈관만이 염색상태로 남은 채 급격하게 감소하였다. 이는 결합된 VHH의 순환계에서의 짧은 반감기를 나타냈다 (10 - 20분). 주입 직후, 녹색 형광 "구름"이 형성되었으며, 유조직 공간으로 퍼져나갔고, R3VQ 정위 주입 후에 관찰된 구상 확산과 유사성을 보였다. 정맥 내 주입 30분 후에, 아밀로이드 플라크가 보이기 시작하였다. 혈관성 Aβ또한 관찰되었다. 붉은 채널에서의 신호의 부재는 형광 신호가 특이적이며 (데이터 나타나지 않음), 일반적인 자가 형광 때문이 아님을 나타내었다. 추가적인 영상화에 의하여 플라크에서의 Aβ축적의 생체 내 염색 및 혈관이 주입 후 최대 3.5시간 유지되었음 (도 16b)이 밝혀졌고, 이는 R3VQ-S-AF488의 뇌 반감기가 몇 시간 이상 연장됨을 의미한다. R3VQ-S-AF488의 정맥 내 주입 4시간 후에, 뇌를 회수하여 5μm두께의 파라핀 절편을 준비하였다. 그 후, R3VQ-S-AF488에 의한 아밀로이드 플라크의 확산 및 표지를 확인하기 위하여 항-His mAb로 IHC를 수행하였다. 전체 뇌에 걸쳐 VHH의 확산 후광에 상응할 수 있는 갈색 배경을 수반하여 R3VQ-S-AF488에 의한 아밀로이드 플라크의 면역 염색이 관찰되었다. 더 적은 양의 R3VQ-S-AF488 (10 ㎎/㎏)로 추가적인 실험이 수행되었으며, Aβ 축적의 생체 내 검출이 감소된 강도로 관찰되었다. 이들 결과는 R3VQ 뇌 관통 및 뇌 Aβ 병변을 표지할 수 있는 능력이 투여량에 의존적임을 나타내었으며, 이는 IHC로 확인되었다 (도 16d).
VHH의 염기성 pI가 BBB를 가로지르는 능력에 관한 주요한 요인이다.
말레이미도-AF488 결합된 R3VE가 또한 준비되었으며, 그 pI는 약 7.5였다 (도 17a 및 b) (VHH R3VE는 전술됨). 10㎎/㎏ 용량의 R3VE-S-AF488를 PS2APP 생쥐에 정맥 내 주입하였다. 주입 45분 후, 뇌 아밀로이드 맥관 장애만이 아밀로이드 플라크의 표지 없이 관찰되었다 (도 17c). R3VE-S-AF488를 정맥 내로 주입한 지 4시간 후에, 뇌를 회수하여 5μm 두께의 파라핀 절편을 준비하였다. 그 후, 뇌에서 내재성 R3VE-S-AF488의 존재를 검출하기 위하여 항-His mAb로 IHC를 수행하였다. 동일한 용량을 이용한 R3VQ-S-AF488로 획득된 결과와 비교하여 (전술한 내용 및 도 16d 참고), 전체 뇌에 걸쳐 단지 아밀로이드 플라크의 매우 제한된 표지만이 관찰되었으며, 이는 VHHs 표면상에 존재하는 양성 전하가 이러한 항체가 BBB를 관통할 수 있도록 하는 주요한 역할을 수행함을 나타낸다.
대조구 실험
아밀로이드가 없는 생쥐에서의 평가
아밀로이드가 없는 야생형 C57BL/6 생쥐에 R3VQ-S-AF488를 정맥 내로 주입하였다. 이-광자 현미경 분석을 이용하여 뇌 유조직에서의 어떠한 생체 내의 특이적인 염색도 관찰되지 않았다 (데이터 제시되지 않음).
전통적인 IgG 항체와의 비교
mAb 4G8-AF488를 정맥 내로 PS2APP 생쥐에 주입하는 것은 단지 CAA를 이-광자 영상화에 의하여 관찰하는 것을 가능하게 하며, 아밀로이드 플라크는 관찰할 수 없고, 이는 이러한 표준 항-Aβ 면역글로불린의 심각한 일혈이 발생하지 않음을 나타낸다 (도 18).
이-광자 영상화에 사용된 생쥐에서의 혈관-뇌 장벽의 완전성 평가
이-광자 실험에 사용된 PS2APP 생쥐 (2년생)의 BBB 투과성을 DOTAREM 정맥 주입 (0.2 ㎖ Gd 500 mM)을 이용하여 테스트하였다. 이러한 MRI 콘트라스트제는 장벽의 국부적인 누수를 야기하는 병적인 증상을 제외하고는 BBB를 가로지를 수 없다. 인간에게도 사용된 이러한 MRI 실험은 BBB가 파괴된 영역에서의 신호의 증가를 나타낸다 (V. M. Runge et al., American Journal of Roentgenology 1994, 162, 431-435; M. A. Ibrahim et al., Investigative radiology, 1998, 33, 153-162). 테스트된 생쥐의 신호 변화의 부재는 이들의 BBB의 완전성을 의미하였다. 다른 두 마리의 연령이 맞는 PS2APP 생쥐 또한 동일한 방법을 이용하여 MRI 평가되었으며, 어떠한 BBB 파괴도 관찰되지 않았다 (데이터 나타나지 않음).
SEQUENCE LISTING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE INSTITUT PASTEUR <120> CAMELID SINGLE-DOMAIN ANTIBODY DIRECTED AGAINST AMYLOID BETA AND METHODS FOR PRODUCING CONJUGATES THEREOF <130> XRN/SM/cc/F226-199 <150> EP13306553.2 <151> 2013-11-13 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VHH R3VE/Q <400> 1 Ala Asp Ser Gly Ser Thr Phe Arg Asn Tyr Asn Ile Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VHH R3VE/Q <400> 2 Ala Val Ser Arg Thr Gly Ile Ser Thr His Val Ala Asp Ser Leu Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VHH R3VE/Q <400> 3 Ala Ala Gly Arg Pro Gly Val Gly Ala Val Asn Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Lama pacos <400> 4 Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr 1 5 10 15 Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Asp Ser Gly Ser Thr Phe Arg 20 25 30 Asn Tyr Asn Ile Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Gln Ala Arg 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Claims (29)

  1. 아밀로이드 β의 섬유상 형태에 대한 낙타과 중쇄 항체의 분리된 가변 도메인 (VHH)으로, 이의 아미노산 서열이 N-말단에서 C-말단으로, 아미노산 서열번호 1 (CDR1에 대응), 아미노산 서열번호 2 (CDR2에 대응) 및 아미노산 서열번호 3 (CDR3에 대응)을 포함하는 아밀로이드 β의 섬유상 형태에 대한 낙타과 중쇄 항체의 분리된 가변 도메인.
  2. 청구항 1에서,
    상기 VHH는 SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6 및 SEQ ID NO. 7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 β의 섬유상 형태에 대한 낙타과 중쇄 항체의 분리된 가변 도메인.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2의 VHH를 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 VHH 유도체로서, 상기 폴리펩티드에 포함된 VHH는 아밀로이드 β의 섬유상 형태에 결합할 수 있는 VHH 유도체.
  4. 아미노산 서열 SEQ ID NO. 8을 갖는 것을 특징으로 하는 VHH 유도체.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2의 VHH 또는 청구항 3 또는 청구항 4의 VHH 유도체를 를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 전사 조절을 가능케 하는 전사 프로모터의 제어를 받는 청구항 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 카세트.
  7. 청구항 5의 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 6의 재조합 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 청구항 6의 재조합 발현 카세트 또는 청구항 7의 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  9. 직접적 또는 간접적으로, 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 관심 물질에 결합된, 청구항 1 또는 청구항 2의 VHH 또는 청구항 3 또는 청구항 4의 VHH 유도체를 포함하는 진단 또는 치료제.
  10. 청구항 9에서,
    상기 관심 물질은 펩티드, 효소, 핵산, 바이러스 및 화학 물질로부터 선택되는 치료제.
  11. 청구항 9에서,
    상기 진단 화합물은 효소, 형광포어, NMR 또는 MRI 콘트라스트제, 방사성 동위원소, 또는 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제.
  12. 청구항 10에서,
    상기 진단 화합물은 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn)에 기초한 상자성 제재, 및 산화철 또는 철 백금 (SIPP)에 기초한 초상자성 제재, 및 18F, 13C, 23Na, 17O, 15N와 같은 X-핵으로부터 선택된 NMR 또는 MRI 콘트라스트제인 치료제.
  13. 청구항 9 또는 청구항 10에서,
    상기 치료 화합물은 진통제 화합물, 항-염증제 화합물, 항우울제 화합물, 세포독성 화합물, 항경련제 화합물, 또는 항-신경퇴행성 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제.
  14. 청구항 9에서,
    상기 관심 물질은 청구항 10 내지 13중 어느 한 항에 따른 진단 또는 치료 화합물을 포함하는 중합체 또는 리포좀인 진단 또는 치료제.
  15. 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 VHH 또는 청구항 3 또는 청구항 4에 따른 VHH 유도체와 관심 물질의 결합 단계를 포함하는, 청구항 1 또는 청구항 2의 VHH 또는 청구항 3 또는 청구항 4의 VHH 유도체와 관심 물질을 결합시키기 위한 위치 비-특이적 방법.
  16. 청구항 15에서,
    상기 관심 물질은 펩티드, 효소, 핵산, 바이러스, 형광포어, NMR 또는 MRI 콘트라스트제, 화학 물질, 방사성 동위원소 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 진단 또는 치료 화합물인 위치 비-특이적 방법.
  17. 청구항 16에서,
    상기 관심 물질은 NMR 또는 MRI 콘트라스트제 및 금속성 방사성 동위원소로부터 선택된 진단 화합물인 위치 비-특이적 방법.
  18. 청구항 17에서,
    (i) 에스터 또는 무수물의 형태로, 바람직하게는 에스터 형태로 활성화된 킬레이트제를 청구항 1 또는 청구항 2의 VHH 또는 청구항 3 또는 청구항 4의 VHH 유도체의 리신 잔기에 결합시키는 단계, 및
    (ii) 상기 단계 (i)의 리간드를 관심물질에 킬레이팅시키는 단계를 포함하는 위치 비-특이적 방법.
  19. 청구항 17에서,
    (i') 에스터 또는 무수물의 형태로, 바람직하게는 에스터 형태로 활성화된 킬레이트제로 관심 물질을 킬레이팅시키는 단계, 및
    (ii') 단계 (i')의 미리-킬레이트화된 관심 물질을 청구항 1 또는 청구항 2의 VHH 또는 청구항 3 또는 청구항 4의 VHH 유도체의 리신 잔기와 결합시키는 단계를 포함하는 위치 비-특이적 방법.
  20. 청구항 18 또는 청구항 19에서,
    상기 관심 물질은, 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn)에 기초한 상자성 제재, 및 산화철 또는 철 백금 (SIPP)에 기초한 초상자성 제재, 및 18F, 13C, 23Na, 17O, 15N과 같은 X-핵으로부터 선택된 NMR 또는 MRI 콘트라스트제인 위치 비-특이적 방법.
  21. 청구항 18 또는 청구항 19에서,
    상기 킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 1,4,7-삼(카르복시메틸라자)시클로도데칸-10-아자아세틸아미드 (DO3A), 니트릴로트리아세트산 (NTA), D-페니실라민 (Pen), 2,3-디메르캅토숙신산 (DMSA), 2,3-디메르캅토-1-프로판숙신산 (DMPS), 2,3-디메르캅토프로판올 (BAL), 트리에틸렌테트라민 (Trien), 암모늄 테트라티오몰리베이트 (TTM) 음이온, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 2-(p-이소티오시아네이토벤질)-6-메틸-디에틸렌트리아민펜타아세트산 (IB4M) 또는 하이드록시피리디논 (HOPO)으로부터 선택되는 위치 비-특이적 방법.
  22. 청구항 18 또는 청구항 19에서,
    상기 관심 물질은 가돌리늄 (Gd)이고, 상기 킬레이트제는 DOTA인 위치 비-특이적 방법.
  23. 청구항 15 내지 22중 어느 한 항의 위치 비-특이적 방법에 따라 얻을 수 있는 관심 물질에 결합된 VHH.
  24. 적어도 청구항 1 또는 청구항 2의 VHH 또는 청구항 3 또는 청구항 4의 VHH 유도체, 및 진단 제재를 포함하는, 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은, 아밀로이드 β 축적에 의해 매개되는 질병의 뇌 영상용, 또는 진단용 또는 관찰용 키트.
  25. 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은, 아밀로이드 β 축적에 의해 매개되는 질병을 진단하거나 또는 관찰하기 위한 청구항 9-12 및 14중 어느 한 항에 따른 진단 제재의 용도.
  26. a) 시험관 내에서 대상체로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플을 청구항 9-12 및 14중 어느 한 항에 따른 진단 제재와 접촉시키는 단계, 및
    b) 상기 생물학적 샘플 내에 아밀로이드 플라크와 같은 아밀로이드 β 축적물의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 아밀로이드 β 축적물의 존재는 상기 대상체가 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β 축적에 의해 매개되는 질병을 갖는다는 것을 나타내는,
    시험관 내 또는 생체 외에서, 대상체에서 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β 축적에 의해 매개되는 질병을 진단하기 위한 방법.
  27. a) 시험관 내에서 대상체로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플을 청구항 9-12 및 14중 어느 한 항에 따른 진단 제재와 접촉시키는 단계,
    b) 상기 생물학적 샘플 내에 아밀로이드 β의 섬유상 형태의 양을 결정하는 단계, 및
    c) 단계 b)에서 결정된 양과 상기 대상체에 대해 이전에 얻어진 아밀로이드 β의 섬유상 형태의 양을 비교하는 단계를 포함하고,
    아밀로이드 β의 섬유상 형태의 양의 상당한 증가는 아밀로이드 β 축적에 의하여 매개되는 질병의 진전에 대한 마커를 구성하며, 아밀로이드 β의 섬유상 형태의 양의 상당한 감소는 아밀로이드 β 축적에 의해 매개되는 질병의 퇴행에 대한 마커를 구성하는,
    시험관 내 또는 생체 외에서, 대상체에서 알츠하이머 질환 및 다운증후군과 같은 아밀로이드 β 축적에 의해 매개되는 질병의 진전 또는 퇴행을 관찰하기 위한 방법.
  28. a) 대상체, 바람직하게는 인간에게 청구항 9-12 및 14중 어느 한 항에 따른 진단 제재의 검출 가능한 양을 투여하는 단계, 및
    b) 영상화 방법에 의하여 상기 대상체 내에서 상기 진단 제재를 검출하는 단계를 포함하는,
    대상체에서 아밀로이드 β 축적을 생체 내 영상화하는 방법.
  29. 청구항 9, 10, 13 및 14중 어느 한 항에 따른 치료제, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
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