ITMI960458A1

ITMI960458A1 - Polichelanti, loro complessi con ioni metallici, loro preparazione e loro usi

Info

Publication number: ITMI960458A1
Application number: IT96MI000458A
Authority: IT
Inventors: Luigia Gozzini; Federico Maisano; Marcella Murru
Original assignee: Bracco Spa
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1996-03-08
Publication date: 1997-09-08
Also published as: US6719958B1; ITMI960458A0; WO1997032862A1; AU2094697A; EP0885202A1; EP1151997A1; JP2000506152A; ZA971995B; IT1283218B1

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "POLICHELANTI , LORO COMPLESSI CON IONI METALLICI, LORO PREPA-RAZIONE E LORO USI"

La presente invenzione riguarda una nuova classe di polichelanti, i loro chelati complessi con ioni metallici e i loro sali, che possono essere utilizzati, come tali o in associazione o formulazione con altri componenti, nell'imaging diagnostico come agenti di contrasto generali o specifici per un certo tessuto,organo o compartimento corporeo.

La nuova classe di agenti di contrasto è costituita da molecole o macromolecole ottenute unendo covalentemente chelanti o chelati di ioni metallici ad un "carrier" costituito da una struttura o "backbone" organico comprendente uno o più gruppi amminici primari cui detti chelanti sono attaccati tramite ponti alchilici. Questa classe è caratterizzata dal fatto che almeno uno o più gruppi amminici primari del "carrier" sono bifunzionalizzati con residui alchilici recanti attaccate dette unità chelanti o i relativi chelati metallici o loro sali, mentre gli eventuali ammino gruppi primari rimanenti possono essere presenti in forma libera (salificata o meno) oppure monofunzionalizzata con detti residui chelanti/chelati. Tale classe di agenti di contrasto contiene un numero elevato di residui chelanti/chelati per molecola, in quanto ai gruppi amminici primari presenti nel "carrier" possono essere legati, dipendentemente dalla struttura dello stesso e, conseguentemente, dalla reattività di detti gruppi amminici, fino a due agenti chelanti/chelati per ogni animino gruppo.

Questa invenzione si riferisce anche ad un processo per la preparazione di dette molecole, come pure alle possibili utilizzazioni delle stesse.

Complessi formati da agenti chelanti e da opportuni ioni metallici sono in uso sia in medicina nucleare che nell'imaging con risonanza magnetica (MRI). Nella medicina nucleare i chelati di metalli radioattivi hanno trovato applicazione sia nel settore diagnostico (scintigrafia,PET o tomografia a emissione di positroni) sia in quello terapeutico. Nella medicina nucleare sono ampiamente utilizzate macromolecole con elevata biospecificità quali, ad esempio, anticorpi e più recentemente polipeptidi. In questo ultimo caso si tratta di analoghi (sia agonisti che antagonisti) di un polipeptide biologicamente attivo. Un esempio di questo approccio è Octreoscan, un derivato della somatostatina cui è stato legato un corpiesso di <111>In<(3+)>,che è stato sviluppato per la visualizzazione e localizzazione di tumori di origine neuroendocrina. Un problema presentato da questi derivati è quello dell'attività biologica propria della macromolecola indirizzo/ "carrier" le cui dosi devono essere tali da consentire la migliore visualizzazione dell'organo sotto indagine senza indurre una apprezzabile azione farmacologica. La possibilità di aumentare il numero di siti diagnosticamente efficaci per molecola "carrier" permetterebbe di diminuire le dosi da somministrare per ottenere lo stesso effetto diagnostico e quindi di ridurre la possibilità di effetti indesiderati legati alla attività farmacologica della stessa.Questo problema diventa ancora più importante quando si ha la necessità di non modificare alcuni dei gruppi amminici, precisamente quelli che sono coinvolti nel riconoscimento recettoriale o nella attività biologica. Per esempio è noto che la lisina in posizione B29 dell'insulina può essere modificata senza comprometterne l'attività biologica, mentre ciò non vale per la modifica degli α-ammino grippi. La presente invenzione, consentendo di massimizzare il grado di sostituzione dei gruppi amminici, permette di ovviare a questo problema e risulta ancora più vantaggiosa per tecniche diagnostiche caratterizzate da una minore sensibilità, come ad esempio l’MRI.

Nella preparazione di agenti di contrasto biospecifici per MRI, l'approccio più comune è stato quello di far reagire macromolecole, come ad esempio proteine e polilisine, con agenti chelanti fomiti di un gruppo funzionale reattivo, capace di coniugarsi col gruppo e-amminico delle lisine, preferibilmente tramite formazione di legami amidici o analoghi, e successiva complessazione con il gadolinio (ad es. Ogan et al., Invest.Radiol., 1987, 22, 665-671).Non risulta però che in questo modo sia stato possibile legare più di una unità chetante per gruppo amminico. Anzi il numero totale di chelanti per proteina è di noma molto più basso rispetto al numero totale dei gruppi amminici teoricamente funzionalizzabili presenti nella stessa. Ad esempio, Lewis et al. (Bioconj. Chem., 1994, 5, 565-576) riportano la coniugazione dell'agente chelante DOTA {acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N',Ν'',N''’-tetraacetico) al citocromo c via attivazione con N-idrossisulfosuccinimide.Aumentando il rapporto molare tra estere attivo del DOTA e citocromo c da 10:1 a 100:1 il numero medio di chetanti attaccati alla proteina aumenta da 2,64 a 8,79, su un totale di 19 animino gruppi disponibili.

Inoltre, la successiva formazione del complesso col gadolinio non assicura che la stessa avvenga quantitativamente. Il risultato complessivo è che non tutti i gruppi amminici sono funzionalizzati con residui chelanti e che non tutti i chelanti introdotti vengono poi saturati col gadolinio. Né d'altra parte lo stato dell'arte insegna a funzionalizzare i gruppi amminici liberi delle macromolecole di interesse inpiegando direttamente i chelati complessi,o i loro sali, in modo da ottenere almeno il massimo di chelazione possibile. Al riguardo si possono citare ad esempio i seguenti documenti: US 4,855,353, EP-A-481526, EP-A-243929,EP-A-255471, WO 9514491, GB 2169598 B, EP-A-038546, WO 9014881. In conseguenza di questo fatto, dosi diagnosticamente ottimali di detti mezzi di contrasto comportano la somministrazione di quantità elevate di "carrier" macromolecolare, con i conseguenti indesiderati effetti biologici. Sarebbe invece altamente desiderabile riuscire a veicolare dosi efficaci di chelato metallico con quantitativi sostanzialmente minori di macromolecole "carrier".

La presente invenzione consente di risolvere questo problema permettendo di legare fino a due unità di chelante, o, meglio, direttamente di complesso metallico, a ogni gruppo amminico primario in grado di reagire presente sulla struttura "carrier", dove questa struttura può ad esempio essere una macromolecola come una proteina, un polimero,oppure un peptide, un amminoacido o anche una semplice ammina o una poliammina. Questo aspetto dell'invenzione si rivela straordinariamente utile nei casi in cui uno o più ammino gruppi della molecola indirizzo devono essere mantenuti come tali (ad esempio con opportune protezioni facilmente rimovibili) per conservare 1'attività biologica o le caratteristiche di organo specificità della stessa (vedasi il caso precedentemente citato dell'insulina). In questi casi infatti la dialchilazione degli altri gruppi amminici del "carrier" con opportuni chelanti/chelati permette di ottenere ugualmente un numero di siti diagnosticamente o terapeuticamente attivi per molecola superiore a quello ottenibile secondo l'insegnamento dello stato dell'arte.

Lo stesso si può dire per quei "carrier" poliamminici in cui non tutti gli ammino gruppi primari sono dotati di elevata reattività (ad esempio a causa della struttura spaziale che il polimero assume durante la reazione di alchilazione). Anche in questo caso la possibilità di attaccare due residui chelanti/chelati per ammino gruppo reattivo consente di ottenere prodotti finali più efficaci rispetto a quelli ottenuti con metodi noti. Un esempio tratto dallo stato dell'arte è rappresentato dalla sopra citata domanda di brevetto WO 9514491 in cui è riportata la preparazione di agenti diagnostici basati sulla coppia ionica Gd-DTPA-Lisina (1:1) e dermatan solfato (nell'esempio di pag.

77), in grado di visualizzare in modo selettivo strutture endoteliali. Anche in questo caso il rapporto tra residui chelanti/chelati e ammino gruppi della lisina non supera l'unità (abbiamo infatti una sola unità chelante contro i due gruppi amminici della lisina).Secondo il processo della presente invenzione è invece possibile ottenere derivati della lisina con almeno due residui chelanti/chelati su uno dei due animino gruppi, o addirittura due residui chelanti/chelati per ogni ammino gruppo (per un totale di quattro chelanti/chelati contro i due ammino gruppi; esempi da 3 a 6 seguenti), con il conseguente vantaggio che: a) i quantitativi di dermatan solfato necessari per ottenere lo stesso effetto diagnostico vengono almeno dimezzati e conseguentemente anche i suoi effetti anticoagulanti,

b) la coppia ionica risultante è stabilizzata dall'elevata carica positiva del derivato lisinico, in quanto in questo caso i gruppi amminici non vengono acilati, ma alchilati.

E' quindi oggetto della presente invenzione una nuova classe di polichelanti/polichelati e loro sali biologicamente compatibili nei quali un residuo organico reca un numero m di gruppi amminici primari, con m variabile da 1 a 1000,

detti gruppi amminici essendo funzionalizzati con uno o due residui chelanti per un numero complessivo n di residui, con n variabile da 2 a 2m,

detti residui chelanti essendo legati a detti gruppi amminici tramite una catena alchilenica, detta catena essendo eventualmente interrotta da eteroatomi scelti tra 0, N, S, oppure da gruppi carbonilici, tiocarbonilici, ammidici, esterei, tioureici, tioammidici o residui aromatici, ed essendo inoltre p il numero dei rimanenti gruppi amminici primari liberi non funzionalizzati,con p variabile da 0 a m-1,

caratterizzati dal fatto che almeno uno di detti gruppi amminici primari è funzionalizzato con due di detti residui chelanti e dal fatto che

In tal modo il numero totale dei residui chelanti/chelati (n) risulta sempre maggiore del numero dei gruppi amminici primari funzionalizzati (m-p). In termini matematici la situazione descritta è rappresentabile dalla seguente disequazione:

dove m, n e p hanno i significati precedentemente definiti. In altri termini, definendo come p il rapporto fra il numero dei residui chelanti/chelati inseriti sul "carrier" e il numero complessivo dei gruppi amminici primari funzionalizzati (mono e dialchilati), detto rapporto deve essere sempre superiore alla unità, cioè:

Inoltre, poiché il numero massimo di chelanti/chelati per ammino gruppo è 2, anche p non può superare tale valore.

Risulterà quindi che:

Detto rapporto p, è un parametro caratterizzante dell'invenzione e la differenzia dallo stato dell'arte, laddove lo stesso risulta sempre uguale all'unità.

Fanno pure parte dell'invenzione i complessi di tali chelanti con gli ioni bivalenti o trivalenti degli elementi aventi numero atomico compreso fra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, o fra 57 e 83 e i loro sali fisiologicamente compatibili. Particolarmente preferiti sono Fe^<2+>^,

Sono, quindi, oggetto della presente invenzione polichelanti o polichelati e loro sali di formula:

nella quale

L è un residuo (o backbone) organico recante m gruppi amminici primari, con m variabile tra 1 e 1000,

F è un residuo -(CH2)q-T-K,

dove

T è un legame semplice o una catena alchilenica, eventualmente interrotta da uno o più eteroatomi scelti fra 0, N, S oppure da gruppi carbonilici, tiocarbonilici, annidici, esterei, tioureici, tioammidici o residui aromatici, detta catena essendo legata covalentemente ad un atomo di C,0,N,P di un residuo K,

K è un chelante lineare o ciclico poliamminopolicarbossilico o poliamminopolifosfonico o poliamminopolifosforico, o poliammino polifosfinico,o un suo chelato metallico,o un suo sale,

q è un numero intero compreso tra 1 e 10,

p è un numero compreso tra 0 e m-1,

z è un numero compreso tra 0 e m-1,

x è un numero compreso tra l e m,

con la condizione che p+x+z = m, e in cui gli ioni metallici chelati sono ioni paramagnetici o radioisotopi bi- o trivalenti.

Una prima classe di composti preferiti è costituita da composti in cui:

L è scelto nel gruppo costituito da: spermidina, spermina, 4,9-diossadodecandiammina, 3,6-diossaottandiammina, etanolammina e omologhi, fosfatidiletanolammina e loro derivati, sfingosina, alchilaminine, alchilendiammine, dietilentriammina, trietilentetrammina, tris-(2-amminoetil)ammina, geffamina, N-glucosammina, lisina e derivati,ornitina, glieina, acido amminobutirrico, acido amminocaproico, taurina e loro derivati, insulina, chimotripsinogeno A, mioglobina, albumina, citocromo c, polilisine ramificate e lineari, poliornitine ramificate e lineari, amminozuccheri, polipeptidi, ormoni, fattori di crescita,anticorpi;

- T è un legame semplice oppure una catena alchilenica, contenente un gruppo estereo, ammidico o carbonilaminino, legata covalentemente a un atomo di azoto o di carbonio di un residuo K,

- K è il residuo di un acido poliamminopolicarbossilico scelto nel gruppo costituito da:

EDTA, DTPA, BOPTA, EOB-DTPA, DOTA, loro derivati e loro chelati metallici o loro sali;

gli ioni metallici chelati sono selezionati fra gli ioni bi- o trivalenti degli elementi aventi numero atomico variabile fra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, o fra 57 e 83 o gli ioni dei seguenti

Una seconda classe di composti preferiti è costituita da conposti in cui F è un residuo chelante di formula (I)

nelle quali

A corrisponde ad un legame semplice oppure ad un gruppo -(CH2)sR1~ dove s è un numero intero compreso tra 1 e 5 e

R è un legame semplice oppure è uguale a CONH, NHCO, NHCSNH, C6H4NHCSNH, COO,0C0,0, S,

B corrisponde a -D-(CH2)t<_ >· ìn cui

t è un numero intero compreso tra 1 e 9 e

D è uguale ad un legame semplice,oppure è uguale a -0-, -NH-, R fra loro uguali o diversi sono H

Una terza classe di composti in cui F è un residuo di formula (III) o (IV)

oppure di formula (V)o (VI)

Una quarta classe di composti preferiti è costituita dai composti:

oppure F è un residuo di formula (III) oppure di formula (IV) e L è scelto nel grippo costituito da insulina, mioglobina, citocromo c, chimotripsinogeno,polilisina.

Conposti particolarmente preferiti sono quelli in cui:

T è un legame semplice oppure una catena alchilenica, contenente un grippo estere, amido o carbonilammino, legata covalentemente ad un atomo di azoto o di carbonio,di un chelante/chelato K,

K è selezionato fra EDTA, DTPA,BOPTA, EOB-DTPA,DOTA, loro derivati, o loro chelati metallici o loro sali,

q è compreso fra 1 e 5 e

Per meglio chiarire la struttura dei composti dell'invenzione, a titolo esemplificativo, nella formula (A) seguente viene schematizzata la struttura di un polichelante/polichelato oggetto della presente invenzione,dove L,K, T, sono come definiti in precedenza;

Il prodotto schematizzato nella formula (A) è stato ottenuto a partire da un "backbone" L contenente 2 animino gruppi primari (m=2) uno dei quali è stato dialchilato con due residui K-T-CH2<- >il conposto risultante possiede quindi due nuclei chelanti/chelati su un azoto (n=2) e un gruppo amminico libero (p=l). Ne risulta che m-p è uguale a 1, quindi n > m- p. Conseguentemente p = 2. Un prodotto di questo tipo è descritto nell'Esempio 4.

Analogamente nella formula (B) seguente viene schematizzata la struttura di un polichelante/polichelato oggetto della presente invenzione ottenuto a partire da un "backbone" L poliamminco contenente 19 ammino gruppi primari (m = 19)

Il "backbone" L è stato funzionalizzato con residui K-T-CH2-·· H composto risultante possiede 9 ammino gruppi liberi (p = 9) e un totale di 15 gruppi alchilici (n = 15). Ne risulta che m-p è uguale a 10, quindi n > m-p e p - 1,5, cioè sempre > 1.Un prodotto di questo tipo è descritto nell'Esempio 10.

I composti della presente invenzione si possono ad esempio ottenere attraverso uno qualsiasi dei processi sintetici noti all'esperto per 1'alchilazione delle animine primarie come ad esempio L'llchilazione con alogenuri alchilici. Tuttavia, noi abbiamo sorprendentemente trovato che, contrariamente all'insegnamento prevalente dello stato dell'arte, anche l'alchilazione riduttiva è un metodo utile e particolarmente efficiente per la preparazione delle ammine terziarie oggetto della presente invenzione. Infatti, esiste una vasta letteratura (G.E. Meares & R.E. Feeney, Anal. Biochem. 224, 1-16, 1995) in cui viene descritto l'uso dell’alchilazione riduttiva per coniugare diverse aldeidi con proteine in presenza di un opportuno riducente. In generale però, con la sola esclusione della formaldeide, la formazione di ammine terziarie non viene osservata. Questo è comunemente attribuito al reciproco ingombro sterico tra l'ammina e l'aldeide.Recentemente è stato riportato che con un'ammina stericamente poco ingombrante quale la glieina si può avere la formazione anche dell'ammina terziaria ma solo come sottoprodotto della reazione (J.-P. Sani et al.,Tetrahedron Lett. 35, 1131-1184, 1994).Noi abbiamo sorprendentemente trovato che in opportune condizioni sperimentali l'ingombro sterico dei due reagenti non è più limitante, per cui ammine terziarie possono essere ottenute con buone rese anche a partire da aldeidi non piccole e da gruppi amminici primari appartenenti anche a macromolecole.

In via generale, è essenziale che l'aldeide, legata a un residuo chelante, o un suo chelato, o un suo sale, mediante una catena alchilenica come sopra definita, sia in eccesso molare da 5 a 40 volte il numero di gruppi amminici primari.

In particolare, il procedimento secondo la presente invenzione comprende la reazione di un composto chelante di formula (VII)

dove K,T,q sono come sopra descritti, o un suo chelato, o un suo sale, con un conposto poliamminico di formula (Vili)

dove p+z+x=m e L, p , z, x e m sono come sopra descritti, in un mezzo di reazione, in condizioni di amminazione riduttiva, caratterizzato dal fatto che il composto di formula (VII) è in eccesso molare da 5 a 40 volte il numero m, dove m dei gruppi amminici primari, e si opera in presenza di un agente riducente specifico del legame imminico, ma non dell'aldeide,detto riducente essendo in eccesso di 5-60 volte rispetto ai gruppi amminici primari di partenza.

Preferibilmente, detto mezzo di reazione è scelto fra un tampone acquoso, a pH compreso fra 5 e 10, alcoli a basso peso molecolare, un solvente aprotico dipolare, eventualmente in miscela con detto tampone acquoso, la temperatura di reazione è compresa fra -5 e 60"C per un tempo compreso tra 2 e 170 h.

Una prima realizzazione particolarmente preferita del procedimento secondo la presente invenzione prevede:

un chelato di formula (VII), o un suo sale, in un eccesso molare rispetto ai gruppi amminici iniziali di 20-35 volte;

il mezzo di reazione è un tampone acquoso a pH compreso tra 7-9, oppure metanolo,oppure una miscela dei due;

l'agente riducente è sodiocianoboroidruro;

la temperatura varia tra 15-30 “C;

la durata della reazione va da 10-72 h.

In una seconda realizzazione particolarmente preferita nel procedimento secondo la presente invenzione la reazione di alchilazione riduttiva avviene tra un chelante di formula (Vili) e un residuo poliamminico L, seguita dalla successiva formazione del relativo complesso metallico e/o di un suo sale.

Intermedi aldeidici preferiti per la preparazione dei composti della presente invenzione sono i conposti di formule (I)e (II)seguenti;

A corrisponde ad un legame semplice oppure ad un gruppo ~(CH2)s<R>1" dove s è un numero intero compreso tra 1 e 5 e è un legame semplice oppure è uguale a CONH,NHCO,NHCSNH, C5H4NHCSNH,COO,0C0, 0, S

B corrisponde a -D-(CH 2t-, in cui

t è un numero intero compreso tra 1 e 9 e

D è uguale ad un legame semplice,oppure è uguale a -0-, -NH-, <on la >condizione che uno solo dei

sostituenti R può essere diverso da H,

essendo detti composti (I) e (II) sia sotto forma di chelante che di complesso con uno ione metallico bi- o trivalente selezionato tra quelli descritti in precedenza,o di un loro sale.

Particolarmente preferiti sono i seguenti intermedi di formula da (III)a (VI)

1 'acido 10-[2-OSSO-2-[(3-ossopropil)animino]etil]-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-l,4,7-triacetico, e il suo relativo complesso di gadolinio di formula (IV)

1<1>acido 3,6,9,12-tetraaza-ll,15-diosso-3,6,9-tris(carbossimetil)-pentadecanoico di formula (V), e il suo relativo complesso di gadolinio di formula (VI)

come pure i loro sali.

"Carrier" particolarmente preferiti su cui inserire i chelanti di formula (I), (II), o i loro complessi metallici, sono ammino derivati quali ammine e poliammine primarie con l'esclusione dell'ammoniaca, amminoacidi, polipeptidi, poliamminoacidi, proteine, anticorpi, amminozuccheri, polimeri lineari o ramificati contenenti ammino gruppi primari o loro derivati.

Ammine particolarmente preferite sono ad esempio spermidina, spermina, etanolammina, fosfatidiletanolammina e loro derivati, sfingosina, dietilentriammina, tris-(2-amminoetil)ammina, geffamina, N-glucosammina.

Amminoacidi particolarmente preferiti sono α-amminoacidi e non, lisina, omitina, glieina, acido 4-amminobutirrico, acido amminocaproico, taurina. Macromolecole particolarmente preferite sono: insulina, chimotripsinogeno A, mioglobina, albumina, citocromo c, polilisine ramificate e lineari, poliornitine ramificate e lineari, ormoni, fattori di crescita.

Particolarmente preferiti sono i prodotti ottenuti per reazione tra i composti di formula (IV) e (VI) con gli ammino derivati definiti precedentemente.

La preparazione degli intermedi preferiti dell'invenzione è esenplificata nei seguenti Schemi 1 e 2, per i casi in cui i gruppi R sono uguali a H nei composti di formula (I ) e (II ) mentre il gruppo A corrisponde a -CH2CONH- (via lb) e, rispettivamente, a un legame semplice (via la) e B è definito come in formula (I ) e (II ) .

Schema 1

Il processo illustrato nello Schema 1 può essere così riassunto: preparazione di un sintone reattivo dell'aldeide, corrispondente alla formula X-A-B-Y, dove A può essere assente (schema la, A = legame semplice)o presente (schema 1b,A = CH2CONH),<x >rappresenta un gruppo uscente, preferibilmente scelto nel gruppo costituito da alogeni, OTs, OMs, OTf e Y rappresenta l'aldeide protetta con un gruppo protettivo scelto preferibilmente tra quelli labili a pH acido, in particolare i derivati dell'1,3-diossolano e dell'1,3-diossano;

reazione fra il TAZA (1,4,7,10-tetraazaciclododecano, prodotto commerciale)e il sintone aldeidico preparato precedentemente a dare il prodotto di condensazione 1:1;

reazione con l'acido bromoacetico e contemporaneo sblocco della aldeide protetta a dare gli agenti chelanti di formula (I), in cui R=H.

eventuale formazione del complesso metallico desiderato e/o del suo sale mediante chelazione dello ione metallico, preferibilmente ottenuta facendo reagire gli agenti chelanti di formula (I) con un metallo, nella sua forma di sale o di ossido, eventualmente in presenza della quantità di base o di acido necessaria alla neutralizzazione a dare i relativi complessi metallici.

Schema 2

Il processo illustrato nello Schema 2 può essere così riassunto: preparazione di un sintone reattivo dell'aldeide, corrispondente alla formula X-B-Y, dove X rappresenta un gruppo uscente, preferibilmente scelto nel gruppo costituito da alogeni, OTs, OMs, OTf e Y rappresenta un gruppo protettivo del gruppo aldeidico, preferibilmente scelto tra quelli labili a pH acido, in particolare i derivati dell'1,3-diossolano e dell'1,3-diossano e B è definito come in precedenza;

trasformazione di X in ammina a dare il sintone H2N-B-CHO- protetta; condensazione fra la dianidride del DTPA {acido dietilentriammino pentaacetico, prodotto commerciale) con il sintone aldeidico preparato precedentemente;

sblocco della aldeide protetta a dare gli agenti chelanti di formula (II), in cui R=H;

eventuale formazione del complesso come descritto per lo Schema 1. A differenza dell'insegnamento generalizzato dello stato dell'arte, è stato sorprendentemente trovato che è possibile, anzi conveniente, coniugare direttamente e con rese elevate i "carrier" amminici o poliamminici sopra citati direttamente con i complessi metallici dei chelanti di formula (I) e (II) invece che con i rispettivi chelanti. Questo risulta particolarmente vantaggioso perché i prodotti ottenuti non necessitano del successivo passaggio di complessazione evitando in questo modo una incorporazione incompleta non specifica del metallo. In tal modo inoltre non si sottopone un prodotto potenzialmente degradabile alle condizioni spesso drastiche richieste dalla complessazione.Risulta infine molto più semplice la purificazione del prodotto finale.

La reazione di alchilazione riduttiva per la preparazione dei polichelanti/polichelati, oggetto della presente invenzione, avviene secondo le seguenti indicazioni:

reazione di un chelante di formula (I)o (II)o di un loro complesso metallico con 1'amminoderivato "carrier" d'interesse o un suo sale in un eccesso da 5 a 40 volte rispetto al numero complessivo dei gruppi amminici primari dello stesso, preferibilmente da 20 a 35 volte;

il mezzo di reazione è generalmente un tampone acquoso quale fosfato, borato, bicarbonato, carbonato, acetato e simili ad un pH compreso fra 5 e 10; oppure è costituito da un alcool a basso peso molecolare quale ad es. MeOH, EtOH, iPrOH, butanoli; o da un solvente aprotico dipolare quale ad es. DMF, DMSO, DMA, eventualmente in miscela con soluzioni acquose tampone quali quelle su accennate;

la reazione avviene in presenza di un agente riducente specifico del legame imminico,ma non dell'aldeide, in un eccesso da 5 a 60 volte rispetto ai gruppi amminici dell'amminoderivato di partenza, laddove esempi preferiti di detto riducente sono rappresentati da sodiocianoboroidruro (NaCNEI^), piridina borano, trimetilammina borano e analoghi;

la temperatura della reazione è compresa fra -5 e 60 "C, preferibilmente fra i 15-30’C;

il tempo di reazione varia da 2 a 170 h,preferibilmente da 10 a 72 h.

Ovviamente quando la reazione di alchilazione riduttiva è condotta coniugando il chelante di formula (I) o (II) con il "carrier" amminico, il passaggio successivo comprende la formazione del relativo conplesso metallico,secondo metodi noti al tecnico del ramo.

Tamponi particolarmente preferiti sono i tamponi fosfato e borato a pH compreso tra 7 e 9. Solventi preferiti sono metanolo, DMF e DMSO. La concentrazione dell'animino derivato "carrier" nel mezzo di reazione è conpreso tra 0,1 e 40% (p/v). L'agente riducente preferito è sodiocianoboroidruro.

Un ulteriore inaspettato vantaggio della alchilazione riduttiva, rispetto agli altri metodi di alchilazione, è rappresentato dalla specificità della reazione che ne permette l'applicazione a proteine e amminoderivati che contengono altri gruppi funzionali. La specificità della reazione è stata ad esempio confermata con le proteine. In tutti i casi l'analisi degli amminoacidi delle proteine così modificate, risulta identica a quella della proteina di partenza tranne che per la lisina e l'eventuale amminoacido amminoterminale. La possibilità che i composti di formula (I) e (II) e i loro complessi metallici possano reagire con la catena laterale di altri amminoacidi a dare prodotti idrolizzabili, che potrebbero sfuggire alla individuazione mediante l'analisi degli amminoacidi, è stata esclusa.

Infatti,ad esempio, il complesso di gadolinio di formula (IV) non ha reagito con un modello a catena peptidica che manca di gruppi amminici primari liberi. Questo esperimento è stato condotto con l'ormone che rilascia l'ormone luteinizzante (luteinizing hormonereleasing hormone, o LHRH), un peptide con il gruppo ammino-terminale protetto, avente sequenza p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Glyammide e di massa 1182,3. La spettrometria di massa ha mostrato che la sua massa è rimasta immutata dopo reazione con il complesso di gadolinio di formula (IV) nelle condizioni usate per la modificazione delle proteine.

Viceversa i prodotti ottenuti dalla reazione del complesso di gadolinio di formula (IV) con le proteine, oggetto della presente invenzione, contengono un numero di molecole di conplesso maggiore degli ammino gruppi teoricamente disponibili (a e e).

Di conseguenza una grande parte degli (a e e)-ammino gruppi ha subito la doppia alchilazione.

Per esempio, la modifica degli e-ammino gruppi lisinici con il conplesso di gadolinio di formula (IV) da origine ai seguenti prodotti:

L'idrolisi dei prodotti (VII) e (VIII) fornisce Ne-(3-amminopropil)lisina e Ne,Ne-bis(3-amminopropil)lisina che possono essere utilizzate per la caratterizzazione del tipo di sostituzione.

La Tabella 1 seguente illustra il vantaggio peculiare della presente invenzione in cui i prodotti ottenuti sono caratterizzati da un valore del rapporto p sempre maggiore di 1.

Tabella 1. Confronto fra le caratteristiche di alcuni dei prodotti preferiti dell'invenzione e lo stato dell'arte

Dalla tabella risulta chiaramente che i prodotti ottenuti secondo l'insegnamento dello stato dell'arte sono caratterizzati da un valore di p= 1,mentre quelli della presente invenzione hanno valori di p sempre > 1 (in alcuni casi fino al massimo valore consentito, cioè 2, equivalente alla disostituzione completa dei gruppi amminici del "carrier"). Inoltre il contenuto percentuale (in peso) di Gd per molecola "carrier" risulta, a parità di "carrier" impiegato, mediamente ben più alto per i composti della presente invenzione. Infatti, ad esempio, tale valore risulta uguale a 8,1% per il prodotto (D0TA)a;7gcitocromo c descritto da Lewis et al. (Bioconj. Chem. 1994, 5, 565-576), ipotizzando una completa complessazione, mentre per il derivato del citocromo c descritto nell'Esempio 11 della presente invenzione tale valore risulta di 10,9%. Considerando di somministrare per un esperimento di MRI una dose di 100 pinoli di Gd/kg, nel caso del prodotto di Lewis et al. si dovrebbero somministrare 11,4 pinoli di prodotto/kg,mentre per il prodotto della presente invenzione tale dose è di 6,8 pmoli/kg (cioè quali la metà). In realtà gli stessi autori (Lewis et al.) sostengono che l'efficienza della chelazione con ioni metallici varia da 84,5 a 97,7% (Bioconj. Chem. 1994,5,565-576, Tabella 1 pg. 567). Considerando che per il composto della presente invenzione tale valore è 100%, il beneficio finale risulta ancora superiore.

I composti oggetto della presente invenzione posseggono un largo campo di applicazione. In particolare i complessi con metalli paramagnetici trovano impiego,opportunamente formulati, in tutte quelle procedure diagnostiche basate sulla risonanza magnetica.

I chelati, oggetto della presente invenzione, possono anche essere usati in medicina nucleare. In questo caso però lo ione metallico che viene chelato è un radioisotopo che emette particelle per esempio <51>Cr,

I complessi metallici oggetto della presente invenzione possono anche essere inglobati in liposomi, impiegati come vescicole uni o multilamellari oppure usati in associazione con un "carrier" anionico idrofilico e idrosolubile. Tale "carrier" è un saccaride, oligosaccaride, polisaccaride o glicosoamminoglicano contenente gruppi solfato, come ad es. eparina solfato, condroitina solfato, dermatan solfato.

Nella parte sperimentale vengono riportate a titolo d'esempio le preparazioni di alcuni conposti della presente invenzione.

ESEMPIO 1

Metodi analitici per la caratterizzazione dei composti preparati.

Analisi di spettrometria di massa

Le masse dei prodotti della presente invenzione sono state determinate utilizzando la tecnica di Electrospray Ionization (ESI-MS), che permette l'analisi di complessi metallici. I prodotti di tipo macromolecolare sono stati analizzati anche utilizzando la tecnica Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight (MALDI-TOF) con uno strumento Lasermat 2000 (Finnigan Mat) e usando l'acido a-ciano-4-idrossicinnamico {ACH)o l'acido sinapinico come matrici.

Analisi elementare

Le percentuali di C, H, e N sono state ottenute secondo metodi standard. Il contenuto di gadolinio è stato determinato mediante spettrometria di emissione (ICP-ES) oppure mediante fluorescenza ai raggi X (XRF). In quest'ultimo caso, i campioni sono stati completamente mineralizzati in un apparecchio a microonde prima dell'analisiAnalisi degli amminoacidi

Nel caso dei composti ottenuti a partire da proteine, il contenuto di proteina è stato determinato mediante analisi quantitativa degli amminoacidi.Le analisi sono state condotte dopo idrolisi dei prodotti a 110 "C in 6 N HC1 per 22 h.Gli idrolizzati sono stati analizzati con un analizzatore Carlo Erba 3A-29, fornito di un rivelatore a ninidrina post-colonna.

Determinazione dei gruppi amminici liberi

Per i prodotti di tipo macromolecolare, il parametro "p" (gruppi amminici liberi) è stato determinato con un saggio basato sulla fluorescamina come descritto in Stocks S.J., Andrew J.M., Ramey C.W., Brooks D.E., Anal. Biochem., 1986, 154(1), 232-234. La risposta del composto in analisi è stata paragonata a quella della corrispondente macromolecola non-modificata. Nel caso dei composti ottenuti a partire da proteine, il contenuto di proteina è stato determinato mediante analisi quantitativa degli amminoacidi. Le concentrazioni delle proteine non modificate sono basate sui coefficienti di assorbimento nei casi della insulina (6377,5 nm = 0/957 mL-mg-1 cm-1) e del chimotripsinogeno A (^282 nm <= >2,03 mL mg-1 cm-1), mentre per la mioglobina ed il citocromo c è stato usato il metodo piridina-emocromogeno (Riggs, A., Methods in Enzymol., 1981, 76, 20-21).

Cromatografia ad esclusione sierica

Nel caso dei composti ottenuti a partire da proteine, l'omogeneità del prodotto è stata verificata mediante cromatografia ad esclusione sierica. Campioni di ciascun composto sono iniettati (25 pL) in una colonna Superdex 75-HR 10/30 (Pharmacia) equilibrata in 0,2 M NH4HCO3. La cromatografia è stata eseguita in stanza fredda (6-7<e>C) a 0,5 mL/min e seguita con rivelatore a 280 nm.

ESEMPIO 2

Il prodotto è stato preparato seguendo la procedura descritta nell'Esempio 4 della domanda di brevetto WO 95/32741, pagina 49.

Gli spettri 1⁄2-NMR, -^C-NMR, IH e MS sono in accordo con la struttura indicata

B) Complesso di gadolinio dell'acido 10-[2-osso-2-[(3-ossopropil)-animino]etil]-l,4,7,10-tetraazaciclododecan-l,4,7-triacetico

Ad una soluzione del composto A) (2,9 g; 0,0063 mol) in H2O (3000 mL) è aggiunto ossido di gadolinio (1,14 g; 0,00315 mol). La miscela di reazione è scaldata a 50 “C per 20 h. La reazione è seguita mediante HPLC. La miscela di reazione è filtrata su filtro Millipore (0,45 mm) e, per evaporazione a secchezza è ottenuto il prodotto desiderato (3,85 g; 0,00627 mol).

Resa quantitativa p.f . : > 280"C

Quantizzazione glicole etilenico (GC) : 1,35% (standard esterno)

Titolo HPLC: 94% (in area %)

Titolo K.F. : 9,25%

Analisi elementare H Gd N

% cale.: 37,18 4,94 25,63 11,41

% trov.: 33,36 5,67 23,30 10,16

Gli spettri IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

ESEMPIO 3

Si sciolgono 4 g del composto 2B) (6,5 mmol) in 10 mL di metanolo e si raffredda a -5<*>C, mantenendo in atmosfera di azoto. A parte, si prepara una soluzione di 0,45 g di Να-carbobenzilossi-L-lisina (Z-lisina, 1,6 mmol) e 0,1 g KOH in 4 mL di MeOH, che viene versata nel reattore. Si aggiungono infine 0,6 g di NaCNBH3 (9,5 mmol)e si mantiene sotto agitazione a -5C per 18 h. Si evapora il solvente e si riprende il residuo con 10 mL di una miscela CH3CN/H2O/acido trifluoroacetico (TFA) 10:90:0,1. Si filtra per eliminare il residuo insolubile e si purifica su colonna LiChrosorb RP-18 25x250 mm (E. Merck) eluendo isocr eticamente con la stessa miscela CH3CN/H2O/TFA. Si uniscono le frazioni omogenee in base all'analisi effettuata nelle stesse condizioni su colonna analitica e si evapora fino a secchezza. Il residuo è lavato con etere e seccato sotto vuoto. Si ottengono 1,9 g del prodotto desiderato, contenente tracce di TFA. ;; ;; Per dimostrare la struttura del prodotto si idrolizza in 6 N HCl per 20 h a 110<°>C. Il prodotto di idrolisi è la Ne,Ne-bis(3-amminopropil)-lisina come confermato da analisi di massa (MH<+>: 261) e NMR. Dalla cromatografia su colonna Lichrosorb RP-18 (25x250 mm), si raccolgono anche frazioni contenenti il prodotto di monoalchilazione. Resa: 14% (200 mg) ;Spettro ESI-MS :879 (ΜΗ^) ;Il rapporto p per il prodotto descritto in questo esempio è 2. ;ESEMPIO 4 ;; ;; 0,5 g del composto ottenuto nell'Esempio 3 sono sciolti in 50 mL di metanolo, cui si aggiungono 0,25 g di 20% Pd(0H)2/C. Si sottopone ad idrogenazione a P e T ambiente per 10 min,dopodiché si lava il reattore con azoto per eliminare la CC>2 formatasi e si riprende l'idrogenazione per altri 10 min. La miscela di reazione è quindi filtrata ed evaporata. Il residuo è triturato in etere etilico, filtrato e seccato.Resa 400 mg (88%) ;Spettro ESI-MS: 1342 (MH<+>) ;Il rapporto p per il prodotto descritto in questo esempio è 2. ;ESEMPIO 5 ;; ;; 2 g del composto 2B) (3,25 mmol) sono sciolti in 10 mL metanolo e raffreddati a -5'C. A questo si aggiunge una soluzione di 100 mg lisina.HC1 (0,55 mmol) e 26 mg LiOH (1,1 mmol) in 4 mL metanolo e, da ultimo, 310 mg di NaCNBH^ (4,93 mmol). Si lascia in agitazione a -5’C per 60 ore, quindi si evapora il solvente, si riprende il residuo in 5 mL 3⁄40, si filtra e si purifica su resina scambiatrice di ioni (AG-50W-X4, Bio-Rad) equilibrata in 0,1 M piridina/acido acetico pH 5,6. Dopo aver allontanato l'eccesso del prodotto 2B) e i sottoprodotti della reazione non trattenuti dalla colonna, si eluisce con 1 M piridina/acido acetico pH 5,6. Le frazioni contenenti il prodotto (TLC: Silica 60-F254, Eluente: etanolo/25% ammoniaca 1:1; Rf=0,36) sono riunite, seccate, riprese in acqua e liofilizzate estesamente. Si ottengono 425 mg di prodotto (40% dalla lisina).MALDI-TOF MS:1943 (MH* calcolato 1940).

Il rapporto p per il prodotto descritto in questo esempio è 1,5. ESEMPIO 6

2 g del composto 2B) (3,25 mmol) sono sciolti in 10 mL metanolo e raffreddati a -5°C in un reattore con ricadere. A questo si aggiunge una soluzione di 75 mg lisina.HC1 (0,41 mmol) e 20 mg LiOH (0,82 nmol) in 3 mL metanolo e, da ultimo, 310 mg di NaCNBH3 (4,93 mmol). Si lascia in agitazione a -5eC per 4 ore,quindi a temperatura ambiente (21°C) per 40 ore. Si aggiungono quindi altri 0,5 g del composto 2B) (0,82 mmol) sciolti in 2 mL metanolo e 77 mg di NaCNBH3 (1,23 mmol); si scalda per 2 ore a 50°C e quindi si lascia a t.a. per 17 ore. Si aggiungono 3 mL 3⁄40 per sciogliere l'intorbidamento formatosi e si scalda nuovamente a 50 "C per 3 ore, lasciando poi per altre 18 ore a t.a.. Si evapora il solvente,si riprende il residuo in 5 mL H2O si filtra e si purifica su resina scambiatrice di ioni (AG-50W-X4, Bio-Rad) equilibrata in 0,1 M NH4HCO3. Dopo aver allontanato l'eccesso del prodotto 2B) e i sottoprodotti della reazione non trattenuti dalla colonna, si eluisce con un gradiente 0,1-2 M NH4HCO3.

Le frazioni contenenti i prodotti di tri- e di tetra-alchilazione (TLC: Silica 60-F254, Eluente: etanolo/25% ammoniaca 1:1; Rf=0,36) sono riunite, seccate e riprese in 3 mL acqua. Si purifica mediante HPLC preparativa su colonna LiChrosorb RP-18 (250 x 25 mm) eluendo con gradiente da 5 a 20% acetonitrile contenente 0,1% TFA. Dopo alcune frazioni contenenti il prodotto di trisostituzione si raccolgono frazioni contenenti il prodotto desiderato.Queste sono portate a secco, riprese in acqua e liofilizzate estesamente.

Resa: 90 mg.MALDI-TOF MS: 2543 (MH+ calcolato 2538).

Il rapporto γ per il prodotto descritto in questo esempio è 2.

ESEMPIO 7

Να-carbobenzilossi-Ne,Ne-bis-F4-aza-5-oxo-6-(1.4.7.10-tetraazaciclododecil-4.7.10-triacetatoIesill-L-lisina

Si sciolgono 3 g del composto 2A) (6,5 mmol)e 2 g trietilammina in 10 mL di metanolo e si raffredda a -5"C, mantenendo in atmosfera di azoto. A parte, si prepara una soluzione di 0,45 g di Nacarbobenzilossi-L-lisina (Z-lisina, 1,6 mmol) e 0,1 g KOH in 4 mL di MeOH, che viene versata nel reattore. Si aggiungono infine 0,6 g di NaCNBHg (9,5 mmol) e si mantiene sotto agitazione a -5“C per 18 h. Si evapora il solvente e si riprende il residuo con 10 mL di una miscela CH3CN/H2O/acido trifluoroacetico (TFA) 10:90:0,1. Si filtra per eliminare il residuo insolubile e si purifica su colonna LiChrosorb RP18 25x250 mm (E. Merck) eluendo isocr eticamente con la stessa miscela CH3CN/H2O/TFA. Si uniscono le frazioni omogenee in base all'analisi effettuata nelle stesse condizioni su colonna analitica e si evapora fino a secchezza. Il residuo è lavato con etere e seccato sotto vuoto. Si ottengono 1,3 g del prodotto desiderato, contenente tracce di TEA.

Sottoponendo ad idrogenazione il prodotto descritto nel presente esempio è stato ottenuto il derivato Ne,Ne-bis-[4-aza-5-oxo-6-(ì,4,7,10-tetraazaciclododecil-4,7,10-triacetato)esil]-L-lisina.

ESEMPIO 8

Procedimento per_la coniugazione del composto 2B)con insulina.

Ad una soluzione di 20 mg di insulina porcina, sale sodico (Calbiochem n. 407696, Mr 5778; 10 pmol gruppi amminici) in 13 mL di tampone borato 0,1 M pH 8 si aggiungono 95 mg del composto 2B) e 15 mg di NaCNBH3. Dopo 4 ore di reazione a 20°C si aggiungono altri 95 mg del composto 2B)e 15 mg di NaCNBH3.

La reazione di coniugazione avviene con un rapporto molare complessivo di 30:1 del composto 2B) rispetto ai gruppi amminici presenti e di 1,5 :1 fra il NaCNBH3 e il composto 2B). Dopo altre 16 ore a temperatura ambiente, la separazione del coniugato dall'eccesso di reagente e dai prodotti collaterali è stata ottenuta per cromatografia ad esclusione sterica su Sephacryl S-100HR (Pharmacia). La colonna (45x8,9 cm) è stata eluita con 0,15 M NH4HCO3 a 20 mL/min. Il prodotto finale è stato concentrato e dissalato per ultrafiltrazione/diafiltrazione su membrana Amicon YM-3.

Il prodotto è risultato omogeneo all'analisi con cromatografia ad esclusione sterica (tR = 24,99 min). Il dosaggio con fluorescamina ha evidenziato la presenza di solo 0,1 mol gruppi NH2/mol proteina. Il contenuto di Gd è pari a 4,6 mol/mol proteina.La spettrometria di massa ha mostrato segnali corrispondenti alla massa dell'insulina più, rispettivamente, 2, 3, 4 e 5 residui del composto 2B). L'analisi degli amminoacidi (Tab. 2) mostra un eccellente accordo con la composizione dell'insulina non modificata, ad esclusione degli amminoacidi lisina, glieina e fenilalanina che risultano diminuiti di una unità. Poiché gli ultimi due amminoacidi sono gli ammino terminali delle due catene dell'insulina questo è stata una conferma che sia gli a- che gli egruppi amminici prendono parte alla reazione. La bassa quantità di cisteina trovata è dovuta alla tipica instabilità di questo amminoacido nelle condizioni di idrolisi e non è stata considerata.

Il rapporto p per il prodotto descritto in questo esempio è 1,59. ESEMPIO 9

Procedimento per la coniugazione del composto 2B)con mioglobina.

Si procede come per l'Esempio 8, utilizzando mioglobina da cuore di cavallo (commercializzata dalla Sigma, n. M-1882, Mr 17567) e tampone borato pH 8,5. Le quantità usate sono:

0,5 g mioglobina (0,56 mmol NH2) in 100 mL tampone

10,37 g composto 2B)aggiunto in due riprese (16,9 mmol)

1,6 g NaCNHH3 aggiunto in due riprese (25,4 mmol).

Il prodotto è risultato omogeneo all'analisi con cromatografia ad esclusione sferica (tR = 19,58 min). Il dosaggio con fluorescamina ha evidenziato la presenza di solo 0,5 mol gruppi NJ^/mol proteina. Il contenuto di Gd è pari a 27,9 mol/mol proteina. La spettrometria di massa ha mostrato segnali corrispondenti alla massa della mioglobina più, rispettivamente, da 29 a 33 residui del composto 2B).

L'analisi degli amminoacidi è stata utilizzata per determinare il contenuto in proteina del conposto preparato ed ha mostrato un eccellente accordo con la composizione della mioglobina non modificata, ad esclusione della lisina che invece di 19 è risultata prossima allo zero.

Il rapporto p per il prodotto descritto in questo esempio è 1,43.

ESEMPIO 10

Procedimento per la coniugazione del composto 2B) con chimotripsinogeno

Si procede come per l'Esempio 8, utilizzando chimotripsinogeno A da pancreas bovino (commercializzato da E. Merck, n. 2306, Mr 25656) e tampone borato pH 9.Le quantità usate sono:

0,5 g chimotripsinogeno A (0,29 mmol NH2) in 100 mL tampone

5,38 g composto 2B) aggiunto in due riprese (8,77 mmol)

0,82 g NaCNBH3 aggiunto in due riprese (13,2 mmol).

Il prodotto è risultato omogeneo all'analisi con cromatografia ad esclusione sterica (tR = 19,55 min). Il dosaggio con fluorescamina ha evidenziato la presenza di solo 0,2 mol gruppi proteina. Il contenuto di Gd è pari a 28,2 mol/mol proteina. La spettrometria di massa ha mostrato un segnale allargato il cui centro corrisponde alla massa del chimotripsinogeno A più 26,6 residui del composto 2B). L'analisi degli amminoacidi è stata utilizzata per determinare il contenuto in proteina del conposto preparato ed ha mostrato un eccellente accordo con la composizione del chimotripsinogeno non modificato, ad esclusione della lisina che invece di 14 è risultata prossima allo zero.

Il rapporto p per il prodotto descritto in questo esempio è 1,91. ESEMPIO 11

Procedimento per la coniugazione del composto 2B)con citocromo c.

Si procede come per 1'Esempio 8, utilizzando citocromo c da cuore di cavedio (commercializzato da Sigma, n.C-7752, Mr 12360). Le quantità usate sono:

20 mg citocromo c (32 pmol NH2) in 10 mL tampone

0,55 g composto 2B)aggiunto in due riprese (0,9 mmol)

100 mg NaCNBH3 aggiunto in due riprese (1,6 mmol).

Prima della purificazione su colonna, la miscela di reazione è dializzata contro tampone borato par allontanare NaCNBH3 non reagito e quindi trattata con potassio ferricianuro (concentrazione finale 5 mM) per riossidare il ferroione del grippo eme.

Il prodotto è risultato omogeneo all'analisi con cromatografia ad esclusione sterica. Non essendo possibile eseguire il dosaggio con fluorescamina a causa dell’interferenza del gruppo eme, i gruppi airaninici liberi sono stati determinati con TNBS (Habeeb A.F.S.A. Anal. Biochem. , 1966, 14, 328-336) ottenendo un valore di 9 mol gruppi Nl^/mol proteina. Il contenuto di Gd è pari a 14/6 mol/mol proteina. La spettrometria di massa ha mostrato un segnale allargato in cui sono visibili 3 massimi corrispondenti alla massa del citocromo c più 15, 16 e 17 residui del composto 2B) .

Il rapporto p per il prodotto descritto in questo esempio è 1,46. ESEMPIO 12

Procedimento per la coniugazione del composto 2A)con insulina.

Ad una soluzione di 10 mg di insulina porcina, sale sodico (Calbiochem n. 407696, Mr 5778; 5,2 pmol gruppi amminici) in 7 mL di tampone borato 0,1 M pH 8 si aggiungono 70 mg del composto 2A) (0,155 mmol),mantenendo il pH a 8 con 1 N NaOH. Si aggiungono quindi 15 mg di NaCNBH^ e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 20 ore.

La miscela di reazione è concentrata per ultrafiltrazione (membrana Amicon YM-3) e quindi caricata su Sephacryl S-100HR (Pharmacia). La colonna (2,2x100 cm) è stata eluita con 0,15 M NH4HCO3 a 1 mL/min. Il prodotto finale è stato concentrato e dissalato per ultrafiltrazione/diafiltrazione su membrana Amicon YM-3.

Il prodotto è risultato omogeneo all'analisi con cromatografia ad esclusione sferica.

Il dosaggio con fluorescamina ha evidenziato la presenza di 0,3 mol gruppi NH2/mol proteina.

La spettrometria di massa ha mostrato segnali corrispondenti alla massa dell'insulina più, rispettivamente, 2, 3 e 4 residui del composto 2A). Dall'integrazione dei segnali si calcola il numero medio di sostituenti pari a 3,4.

Il rapporto p per il prodotto descritto in questo esempio è 1,26. Seguendo la stessa procedura si ottengono i seguenti derivati:

- [Formula III]mioglobina

[Formula IIICitocromo c

[Formula III]chimotripsinogeno

ESEMPIO 13

Procedimento per la coniugazione del composto 2A) con polilisina..

Ad una soluzione di 10 mg di polilisina bromidrato (Sigma n.P0879, Mr 1000-4000; 52 μιηοΐ gruppi amminici considerando una media di 10 residui Lys e Mr 2108, in base ad analisi MALDI-TOF MS) in 7 mL di tampone borato 0,1 M pH 8 si aggiungono 1 g del composto 2A) (1,6 mmol), mantenendo il pH a 8 con 1 N NaOH. Si aggiungono quindi 150 mg di NaCNBH3 e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 72 ore.

La miscela di reazione è caricata su Sephacryl S-100HR (Pharmacia). La colonna (8,9x45 cm) è stata eluita con 0,15 M NH4HCO3 a 20 mL/min. Il primo picco è stato concentrato per evaporazione e quindi liofilizzato (52 mg).

La spettrometria di massa (MALDI-TOF) ha mostrato un'ampia distribuzione di segnali nella zona tra 7000 e 13000,centrata attorno a 9600 che corrisponde alla massa media della polilisina più 14 unità del composto 2A).

Il dosaggio con fluorescamina ha evidenziato la presenza di 1,2 mol gruppi NH2/mol prodotto,assunto Mr = 9600.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composti polichelanti nei quali un residuo organico reca un numero m di gruppi amminici primari, con m variabile da 1 a 1000, detti gruppi amminici essendo funzionaiizzati con uno o due residui chelanti per un numero complessivo n di residui, con n variabile da 2 a 2m, detti residui essendo legati a detti gruppi amminici tramite una catena alchilenica, detta catena essendo eventualmente interrotta da eteroatomi scelti tra 0, N, S, oppure da gruppi carbonilici, tiocarbonilici, ammidici, esterei, tioureici, tioammidici o residui aromatici, ed essendo inoltre p il numero dei rimanenti gruppi amminici primari liberi non funzionalizzati,con p variabile da 0 a m-1, caratterizzati dal fatto che almeno uno di detti gruppi amminici primari è funzionalizzato con due di detti residui chelanti e dal fatto che

loro chelati metallici e loro sali fisiologicamente compatibili. 2. Composti di formula generale:

nella quale L è un residuo (o backbone) organico recante m gruppi amminici primari, con m variabile tra 1 e 1000, F è un residuo -(CH2)q-T-K, dove T è un legame semplice o una catena alchienica, eventualmente interrotta da uno o più eteroatomi scelti fra 0, N, S ed eventualmente sostituita con gruppi carbonilici, tiocarbonilici, ammidici, esterei, tioureici, tioammidici o residui aromatici, detta catena essendo legata covalentemente ad un atomo di C,0,N,P di un residuo K, K è un chelante lineare o ciclico poliamminopolicarbossilico o poliamminopolifosfonico o poliamminopolifosforico, o poliammino polifosfinico, o un suo chelato metallico,o un suo sale, q è un numero intero compreso tra 1 e 10, p è un numero compreso tra 0 e m-1, z è un numero compreso tra 0 e m-1, x è un numero compreso tra lem, con la condizione che p+x+z = m, e in cui gli ioni metallici chelati sono ioni paramagnetici o radioisotopi bi- o trivalenti. 3. Composti secondo la rivendicazione 2,nei quali: L è scelto nel gruppo costituito da: spermidina, spermina, 4,9-diossadodecandiammina, 3,6-diossaottandiammina, etanolammina e omologhi, fosfatidiletanolammina e loro derivati, sfingosina,alchilammine, alchilendiammine, dietilentriammina, trietiientetrammina, tris-(2-amminoetil)ammina, geffamina, N-glucosammina, lisina e derivati,ornitina, glieina, acido amminobutirrico, acido amminocaproico, taurina e loro derivati, insulina, chimotripsinogeno A, mioglobina,albumina, citocromo c, polilisine ramificate e lineari, poliornitine ramificate e lineari, amminozuccheri, polipeptidi, ormoni, fattori di crescita, anticorpi - T è un legame semplice oppure una catena alchilenica, contenente un gruppo estereo, ammidico o carbonilammino, legata covalentemente a un atomo di azoto o di carbonio di un residuo K, - K è il residuo di un acido poliamminopolicarbossilico scelto nel gruppo costituito da: EDTA, DTPA, BOPTA, EOB-DTPA, DOTA, loro derivati e loro chelati metallici o loro sali; gli ioni metallici chelati sono selezionati fra gli ioni bi- o trivalenti degli elementi aventi numero atomico variabile fra 20 e

5. Composti secondo le rivendicazioni 2-4, nei quali F è un residuo chetante di formula (I)

oppure di formula (XI) *

8. Composti secondo le rivendicazioni 3 e 6,nei quali F è un residuo di formula (III) oppure di formula (IV) e L è scelto nel gruppo costituito da insulina, mioglobina, citocromo c, chimotripsinogeno, polilisina. 9. Procedimento per la preparazione dei composti della rivendicazione 1 che comprende la funzionalizzazione mediante alchilazione riduttiva di uno o più gruppi amminici primari del residuo organico con una aldeide legata a un residuo chelante,o un suo chelato,o un suo sale,mediante una catena alchilenica come definita nella rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'aldeide è in eccesso molare da 5 a 40 volte il numero di gruppi amminici primari. 10. Procedimento per la preparazione dei composti della rivendicazione 1 che comprende la alchilazione di uno o più gruppi amminici primari del residuo organico con un alogenuro di alchile legato a un residuo chelante, o un suo chelato, o un suo sale, mediante una catena alchilenica come definita nella rivendicazione 1. 11. Procedimento per la preparazione dei composti delle rivendicazioni 2-6, che comprende la reazione di un composto chelante di formula (VII)

dove K, T, q sono come sopra descritti, o un suo chelato, o un suo sale, con un composto poliamminico di formula (Vili)

dove p+z+x=m e L,p, z,x e m sono come sopra descritti, in un mezzo di reazione, in condizioni di alchilazione riduttiva, caratterizzato dal fatto che il composto di formula (VII) è in eccesso molare da 5 a 40 volte il numero m dei gruppi amminici primari, e si opera in presenza di un agente riducente specifico del legame imminico, ma non dell'aldeide, detto riducente essendo in eccesso di 5-60 volte rispetto ai gruppi amminici primari di partenza. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 11,nel quale detto mezzo di reazione è scelto fra un tampone acquoso, a pH compreso fra 5 e 10, alcoli a basso peso molecolare, un solvente aprotico dipolare, eventualmente in miscela con detto tampone acquoso. 13. Procedimento la rivendicazione 11 o 12,nel quale la temperatura di reazione è compresa fra -5 e 60 “C per un tempo compreso tra 2 e 170 h. 14. Procedimento secondo le rivendicazioni 11-13,nel quale: si impiega un chelato di formula (VII),o un suo sale, in un eccesso molare rispetto ai gruppi amminici iniziali di 20-35 volte; il mezzo di reazione è un tampone acquoso a pH compreso tra 7-9, oppure metanolo,oppure una miscela dei due; l'agente riducente è sodiocianoboroidruro; la temperatura varia tra 15-30°C; la durata della reazione va da 10-72 h. 15. Procedimento secondo le rivendicazioni 11-13, nel quale la reazione di alchilazione riduttiva avviene tra un chelante di formula (VII) e un residuo poliamminico L, seguita dalla successiva formazione del relativo complesso metallico e/o di un suo sale. 16. Procedimento per la preparazione degli intermedi di formula (la)

nella quale A corrisponde ad un legame semplice oppure ad un gruppo -(CH2)S3⁄4-dove s è un numero intero compreso tra 1 e 5 e 3⁄4 è un legame semplice oppure è uguale a CONH, NHCO, NHCSNH, C6H4NHCSNH, C00,0C0,0, S, B corrisponde a -D-(CH2)j_-, in cui t è un numero intero compreso tra 1 e 9 e D è uguale ad un legame semplice,oppure è uguale a -0-, -NH-, e R fra loro uguali o diversi sono

e dei loro chelati metallici,o loro sali, che comprende i seguenti passaggi: preparazione della aldeide protetta X-A-B-Y in cui A e B sono definiti come in precedenza,X è un grippo uscente scelto nel gruppo costituito da alogeni, OTs, OMs, OTf e Y è la funzione aldeidica protetta con un grippo protettivo labile in ambiente acido,quale un derivato dell'1,3-diossolano e dell'l,3-diossano; reazione tra il TAZA e il gruppo X di detta aldeide protetta a dare il corrispondente prodotto di condensazione 1:1; condensazione con l'acido α-R-bromoacetico, in cui R è definito come in precedenza, e contemporanea deprotezione della funzione aldeidica; eventuale formazione del conplesso metallico desiderato e/o del suo sale tramite reazione del chelante di formula (Ia) ottenuto nel passaggio precedente, con un metallo sotto forma di sale o di ossido e in presenza o meno della quantità di base o di acido necessaria all'ottenimento di un sale neutro. 17. Procedimento per la preparazione di intermedi di formula (Ila) B R

che comprende i seguenti passaggi: preparazione dell'aldeide protetta X-B-Y, dove X rappresenta un gruppo uscente, Y è la funzione aldeidica protetta e B è definito come in precedenza; trasformazione di X in ammina a dare il sintone H2N-B-Y; condensazione fra la dianidride dell'R derivato dell'acido dietilentriammino pentaacetico con il sintone aldeidico preparato precedentemente; sblocco della aldeide protetta; eventuale formazione del complesso. 18. Composizioni farmaceutiche e/o diagnostiche comprendenti come principio attivo almeno uno dei composti delle rivendicazioni 1-8, o un suo sale fisiologicamente compatibile. 19. Uso dei composti delle rivendicazioni 1-8, sotto forma di chelati o loro sali, fisiologicamente compatibili per la preparazione di composizioni farmaceutiche da utilizzarsi in radioterapia. 20. Uso dei composti delle rivendicazioni 1-8, sotto forma di chelati o loro sali fisiologicamente compatibili per la preparazione di mezzi di contrasto per imaging NMR. 21. Uso dei conposti delle rivendicazioni 1-8 per la preparazione di mezzi di contrasto per scintigrafia. 22. Composti di formula (la<”>):

nella quale A corrisponde ad un legame semplice oppure ad un grippo -(CH2)SRI-dove s è un numero intero compreso tra 1 e 5 e

t è un numero intero compreso tra 1 e 9 e D è uguale ad un legame semplice,oppure è uguale a -0-, -NH-, R fra loro uguali o diversi sono H o C

e dei loro chelati metallici,o loro sali, per uso come intermedi per la preparazione di composti delle rivendicazioni 5-8. 23. Composti di formula (Ila)

in cui: B corrisponde a -D-(CH2 ) t in cui t è un numero intero compreso tra 1 e 9 e D è uguale ad un legame semplice,oppure è uguale a -0-, -NH-; R fra loro uguali o diversi sono H o CH3 o CH2-0-BZ o -CH2- -OEt; e dei loro chelati metallici,o loro sali, per uso come intermedi per la preparazione di composti delle rivendicazioni 5-8.