JP4573916B2 - トランスフェリン、アルブミン及びポリエチレングリコールの抗腫瘍性の複合体 - Google Patents
トランスフェリン、アルブミン及びポリエチレングリコールの抗腫瘍性の複合体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4573916B2 JP4573916B2 JP51314498A JP51314498A JP4573916B2 JP 4573916 B2 JP4573916 B2 JP 4573916B2 JP 51314498 A JP51314498 A JP 51314498A JP 51314498 A JP51314498 A JP 51314498A JP 4573916 B2 JP4573916 B2 JP 4573916B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- transferrin
- albumin
- group
- maleimide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 0 *C([N+]([O-])O)[N+]([O-])O Chemical compound *C([N+]([O-])O)[N+]([O-])O 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/644—Transferrin, e.g. a lactoferrin or ovotransferrin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
Description
本発明は、適当なキャリアーシステムと細胞増殖抑制性の化合物とからなる、タンパク質とポリマーとの腫瘍抑制性複合体に関する。さらに、本発明は、この様な複合体の製造方法とその使用に関する。
免疫−複合体あるいはタンパク複合体あるいはポリマー複合体は、例えば、抗体、成長因子、ホルモンあるいはペプチド類似構造体、タンパクまたはポリマーの様な適当なキャリア物質と、細胞増殖抑制剤、トキシン類あるいは放射性同位元素などの細胞毒性活性物質の1種または2種以上とからなるコンパウンドである。キャリアー物質は、一般に、好ましくは腫瘍組織中に蓄積するという性質を有しているので、この様にして、キャリアー物質に結合された活性物質も腫瘍組織に蓄積し、選択的な抗腫瘍治療が行われる。化学免疫−複合体は、キャリアー物質と細胞増殖抑制性化合物との複合体であり、そのキャリアーは、一般に、抗体である。
従来技術
現在ガンに対して使用されている細胞増殖抑制剤は、一連の強い全身的な副作用を有しており、腫瘍組織に蓄積しないので、選択的な抗腫瘍治療を可能とする新しい誘導体および配合物が探索されている。この目的で、化学免疫−複合体、すなわち1種の適当なキャリアー物質あるいは細胞増殖抑制剤からなるタンパク類あるいはポリマー類の複合体が開発されつつある。
キャリアー物質として、特に、抗体、成長因子、血清タンパク、ホルモン様構造体あるいはペプチド、あるいはポリマーが考慮されている。これらは、一般に、腫瘍組織中に蓄積することが知られている
本発明は、ヒト血清トランスフェリンと血清アルブミンとをキャリアータンパクとして含む。これらについては、腫瘍組織への蓄積は報告されている(Ward,S.G.Taylor,R.C.:1-54,in Metal-Based Drugs(Gielen,M.F.(Ed.)),Freund Publishing House Ltd,1988;Sinn,H.,Schrenk,H.H.,Friedrich,A.,Schilling,U.and Maier-Borst,W.(1990),Nucl.Med.Biol.,Vol.17(8),819-827)。また、細胞増殖抑制剤のキャリアーとしてのポリエチレングリコール類(PEGs)も報告されている(Topchieva,I.N.(1990),Polym.Sci.USSR 32,833-851;Poly(ethylene glycol)Chemistory:Biotechnical and Biomedical Applications(1992),Ed.J.M.Harris,Plenum Press,New York)。
PEGsは、その生物−適合性、良好な水溶性および合成上の多様性の故に、治療用のポリマー複合体の開発に極めて適している。近年、PEGsは、主に医学上有用なタンパク類および酵素類と複合化されている(Overview in Topchieva,I.N.(1990),Polym.Sci.USSR,32,833-851)。
化学免疫−複合体およびタンパク複合体あるいはポリマーの複合体は、通常キャリアー物質と活性物質との直接カップリングにより、あるいはスペーサーグループ、いわゆるホモ−あるいはヘテロバイファンクショナル試薬の介在により、生成する。現在までのところ、直接カップリング法が主に使用されているが、この方法は、しばしばポリマー性の生成物と必ずしも明確に同定できない複合体とを形成する。最近、特定のバイファンクショナル試薬を用いて得られた数種の化学免疫−複合体が、細胞増殖抑制的に効果的なメディアとして提案されている(欧州特許出願EP 91-117535 911615,欧州特許出願EP 90-109268 900516,PCT国際特許出願WO 90-CA251 900809,英国特許出願GB 83-5104 830224および欧州特許出願EP 89-102370 890210)。さらに、DE 41 22 210 A1からは、トランスフェリンあるいはアルブミンと腫瘍活性化合物との複合体が知られている。この複合体においては、腫瘍活性化合物は、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびカルボジイミドにより活性化され、この様にして得られた混合物は、直接キャリアータンパク質とカップリングされる。
発明の説明
トランスフェリン、アルブミンおよび5000〜200000Daの範囲の質量を有するポリエチレングリコールと、さらにマレインイミドまたはN-ヒドロキシスクシンイミドの化合物により修飾された少なくとも1種の細胞増殖抑制性化合物とからなるトランスフェリン、アルブミンおよびポリエチレングリコール複合体が、細胞抑制性化合物と同等あるいはそれ以上の腫瘍抑制効果を有していることが見出された。
これらのタンパクのあるいはポリマーの複合体を製造するに適した細胞増殖抑制性化合物としては、下記の化合物をマレインイミドあるいはN-ヒドロキシスクシンイミドの化合物により修飾したものが例示される;ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびミトサンドロンなどのアンスラサイクリン類;クロロアムブシルおよびメルファランなどのアルキレート類;メトトレキセート、5-フルオロウラシル、5′-デスオキシ-5-フルオロウリジンおよびチオグアニンなどの代謝拮抗物質;パクリタクセルおよびドセタクセルなどのタクソイド類;トポテカンおよび9-アミノカンプトテシンなどのカンプトテシン類;エトポシド、テニポシドおよびミトポドシドなどのポドフィロトキシン誘導体;ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド類ならびに一般式I、II、IIIまたはIVの化合物;
式中、n=0-6、X=-NH2、-OH、-COOH、-O-CO-R-COR*、-NH-CO-R-COR*(Rは、炭素数1-6の脂肪族炭素鎖あるいは置換もしくは非置換のフェニレン基およびR*H、フェニル、炭素数1-6のアルキルの1種であり、アミン官能基はtert-ブチロキシカルボニル保護基の様な保護基を有している)。製造に際し、細胞増殖抑制性化合物を通常マレインイミド化合物あるいはN-ヒドロキシスクシンイミド化合物と反応させる。これらの化合物は、細胞増殖抑制性化合物と結合するに適した少なくとも1つの基、例えば、アミノ-、ヒドロキシ-、カルボン酸-、カルボン酸クロライド-、スルホン酸-、スルホン酸クロライド-、酸ヒドラジド-あるいはヒドラジノ-、オキシカルボニルクロライド-、アルデヒド-あるいはケト-基を有しているので、細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体あるいはN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体が得られる。これらの誘導体においては、マレインイミド化合物と細胞増殖抑制性化合物との化学的結合は、アミド、エステル、イミン、ヒドラゾン、カルボキシヒドラゾン、オキシカルボニル、アセタールまたはケタール結合により生ずる。一般式I-IVの化合物から得られるマレインイミドまたはN-ヒドロキシスクシンイミドには、次いで、細胞増殖抑制性シス−配位のプラチナユニットが導入される。すなわち、保護基の除去後、テトラクロロプラチネート塩とのあるいはcis-[PtA2B](A=ハロゲン、B=(NH3)2、エチレンジアミン、プロパンジアミン、1,2-ジアミノシクロヘキサン)との反応を経て、対応するPt(II)-錯体が得られる。
下記概要1に示す通り、修飾された細胞増殖抑制性化合物と天然のあるいはチオール化されたトランスフェリンまたはアルブミンとの反応により、あるいは質量5000〜200000のヘテロ-またはホモバイファンクショナルPEGsとの反応により、
概要図1:
タンパクあるいはポリマーの複合体が容易にかつ効率よく製造される。この複合体は、高純度で、オリジナルの細胞増殖抑制性化合物の幾つかと比較して、優れた水溶性を有し、生理的緩衝液中で安定した配合物を形成し、ヒト腫瘍細胞に対して、非結合の細胞増殖抑制性化合物と同等あるいはそれ以上のインビトロ抗増殖効果を発揮する。さらに、複合体は、インビボで同等あるいは改善された抗腫瘍効果を発揮し、改善された耐性を示す。ガン疾患の選択的治療に極めて適したこの様なカップリングにより得られたタンパクまたはポリエチレングリコールの複合体が、本発明の目的物であり、以下に詳述する。
タンパクあるいはポリエチレングリコールの複合体の合成方法は、4段階(工程1から4)でのマレインイミド誘導体との複合体あるいは3段階(工程1、2および4)でのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体との複合化により、行われる。
工程1:マレインイミドあるいはN-ヒドロキシスクシンイミド化合物の合成
工程2:細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体あるいはN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の合成
工程3:キャリアータンパクのチオール化
工程4:工程2で得られた細胞増殖抑制性化合物の天然あるいはチオール化キャリアータンパクに対するあるいは前記概要1に示すPEGsに対するカップリング
工程1:マレインイミドあるいはN-ヒドロキシスクシンイミド化合物の合成
マレインイミド化合物は、通常下記の2つの方法にいずれかにより製造される。
第一の方法においては、無水マレイン酸を脂肪族アミノ化合物H2N-R-Y(Rは、炭素数1〜6の脂肪族C鎖あるいは置換もしくは非置換のベンジル基である;Yは、-OH、-COOH、-SO3H、-CH(OC2H5)2、R*-C=O、R*=フェニルまたは炭素数1〜6のアルキル基である)と反応させて、対応するマレアミノ酸を生成させ、次いで、2当量までのトリエチルアミン(Et3N)と無水トルエン中で水を共沸除去しつつ反応させて、対応するマレインイミド化合物を得る。Y基のそれ以外の修飾は、-COOHあるいは-SO3H基をシュウ酸クロライドまたはチオニルクロライドと反応させて対応する酸塩化物を生成させることにより、ヒドロキシ基をビス(トリクロロメチル)-カーボネートと反応させて対応するオキシカルボニルクロライドを生成させることにより、アセタール基-CH(OC2H5)2を、例えば、p-トルエンスルホン酸、硫酸あるいは酸性シリカゲルなどを使用する酸触媒開裂で対応するアルデヒドを生成させることにより、および酸塩化物をN-(tert-ブトキシカルボニル)-アルコールアミンあるいはN-(tert-ブトキシカルボニル)-アルコールヒドラジンと反応させ、次いでエーテル、テトラヒドロフラン(THF)あるいはジオキサン中でのトリフルオロ酢酸あるいは塩化水素による開裂によりそれぞれ対応するアミノ化合物あるいはヒドラジノ化合物を得る。
第二の方法において、マレイン酸無水物を芳香族アミノ化合物H2N−R−Y[式中、Rは置換又は非置換のフェニレン基であり、Y=−OH,−COOH,−SO3H,R*−C=O(R*=フェニル又は炭素原子数1〜6のアルキル基)]と反応させて、対応するマレアミノ酸を得、続いて酢酸無水物及び無水酢酸ナトリウムと反応させてマレインイミド化合物を得る。基Yのさらなる誘導体化を、−COOH又は−SO3H基を塩化オキサリル又は塩化チオニルと反応させて、対応する酸クロリドを得ることにより、水酸基をビス(トリクロロメチル)−カーボネートと反応させて対応するオキシカルボニルクロリドを得ることにより、LiAl[OC(CH3)3]Hと酸クロリドをTHF中で反応させて対応するアルデヒドを得ることにより、酸クロリドをTHF又は酢酸エチル中でt−ブチルカルバゼート(t-Butylcarbazate)と反応させ、続いてエーテル、THF又はジオキサン中でトリフルオロ酢酸又はHClで開裂させて対応する酸ヒドラジドを得ることにより、及び酸クロリドをN−(tert−ブトキシカルボニル)アルコールアミン又はN−(tert−ブトキシカルボニル)アルコールヒドラジンと反応させ、次いでエーテル、THF又はジオキサン中でトリフルオロ酢酸又はHCLで開裂させ、対応するアミノ又はヒドラジノ化合物を得ることにより行う。
一般式VI及びVIIのマレインイミド化合物は、上記方法にて得られたマレインイミド化合物[式中、Yは−CO−NHNH2又はCOR*であり、n=1〜6、R*=H,フェニル,炭素原子数1〜6のアルキルである。]を、一般式O=CR*−R−Yで表されるカルボニル化合物と、又は一般式Y−R−R*CO−NH−NH2で表される酸ヒドラジドと、無水THF,メタノール又はエタノール中で、必要に応じてトルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、反応させて得られる。基Yのさらなる誘導体化を、COOH−又はSO3H基を、塩化オキサリルと又は塩化チオニルと反応させて、対応する酸クロリドを得ることにより、或いは、ヒドロキシ基をビス−(トリクロロメチル)−カーボネートと反応させて対応するオキシカルボニルクロリドを得ることにより行う。
一般式XI[式中、2つのマレインイミド化合物はジアミノアルカン、ジヒドロキシアルカン、ジヒドラジノアルカン又はカルボン酸ジヒドラジド化合物を示す基Zにより結合しており、その結果2つのマレインイミド化合物は2つのアミド、エステル、イミン、ヒドラゾン又はカルボキシルヒドラゾン結合を介して互いに結合している。]のビスマレインイミド化合物は上記マレインイミド化合物より得られ、アミン結合により結合している化合物の合成は、THF又は酢酸エチル中で、必要に応じてEt3Nを添加して、マレインイミド化合物の酸クロリドをジアミノアルカン化合物NH2-(CH2)n-NH2[n=2〜12]と反応させることにより行い、エステル結合により結合している化合物の合成は、THF又は酢酸エチル中で、必要に応じてEt3Nを添加して、マレインイミド化合物の酸クロリドをジヒドロキシ化合物HO-(CH2)n-OH[n=2〜12]と反応させることにより行い、イミン結合により結合している化合物の合成は、無水THF,メタノール又はエタノール中で、トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、マレインイミド化合物のアルデヒド又はケトンをジアミノアルカン化合物NH2-(CH2)n-NH2[n=2〜12]と反応させることにより行い、ヒドラゾン又はカルボキシルヒドラゾン結合により結合している化合物の合成は、無水THF,メタノール又はエタノール中で、トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、マレインイミド化合物のアルデヒド又はケトンをジヒドラジノアルカン化合物NH2-NH-(CH2)n-NH-NH2又はカルボン酸ジヒドラジン類H2N-NH-CO-(CH2)n-CO-NH-NH2[n=2〜12]と反応させることにより行う。
N−ヒドロキシスクシンイミド化合物は、通常、対応するN−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物得るために、N−ヒドロキシスクシンイミドをY-R-COOH又はY-R-COCl[式中、Rは置換又は非置換のフェニレン基であり、Y=-OH,-NH2,-COO-(CH2)n-OH,-CONH-(CH2)nNHBOC,-NHNHBOC,-COO-(CH2)nNHNHBOC,-SO3H,-SO2-NHNHBOC,-CHO,-COR*,-CO-NHNHBOC、n=1〜6であり、R*=H,フェニル,炭素原子数1〜6のアルキルであり、BOCはtert-ブチルオキシカルボニル保護基である。]と反応させることにより得られる。この場合、Y-R-COOHから開始する反応は、無水溶媒、好ましくはジクロロメタン,アセトニトリル又はTHF中で、ジメチルアミノピリジン(DMAP)及び縮合剤、通常、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)又はN−シクロヘキシル−N’−(2−モルホリノエチル)−カルボジイミド メト−p−トルエンスルホネート(CMC)を添加して行い、対応するスクシンイミドエステル誘導体を得る。例えば塩化オキサリル又は塩化チオニルのような酸ハロゲン化剤による塩素化により得られる酸クロリド Y-R-COClを用いる場合、N−ヒドロキシスクシンイミドとの反応は、好ましくは無水THF,アセトニトリル又は酢酸エチル中で行う。
次いで、BOC保護基をエーテル又はジオキサン中トリフルオロ酢酸又はHClで除去し、対応するアミノ又はヒドラジノ化合物並びに酸ヒドラジドをトリフルオロ酢酸塩又は塩酸塩として得る。基Yのさらなる誘導体化は、水酸基をビス−(トリクロロメチル)カーボネートと反応させて行い、対応するオキシカルボニルクロリドを得る。
一般式IX及びXのN−ヒドロキシスクシンイミド化合物は、上記方法にて得られるヒドロキシスクシンイミド化合物[式中、Yは-CONHNH2又は-COR*であり、nは1〜6であり、R*=H,フェニル,炭素原子数1〜6のアルキルである。]を、一般式O=CR*-R-Yで表されるカルボニル化合物と、又は一般式Y-R-R*CO-NH-NH2で表される酸ヒドラジドと、無水THF,メタノール又はエタノール中で、必要に応じてトルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して反応させることにより得られる。基Yのさらなる誘導体化は、COOH若しくはSO3H基を塩化オキサリルと、又は塩化チオニルと反応させて行い、対応する酸クロリドを得、水酸基をビス(トリクロロメチル)カルボネートと反応させて対応するオキシカルボニルクロリドを得る。
上記マレインイミド及びN−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物の単離は、下記の実施例に詳述されるように、結晶化、シリカゲルカラムクロマトグラフィー又はジオールカラム上での分取HPLC若しくはLPLCのいずれかにより行われる。
工程2:細胞増殖抑制化合物のマレインイミド誘導体又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体
工程1にて得られたマレインイミド及びN−ヒドロキシスクシンイミド化合物との反応に適しているのは、請求項1〜3に記載された細胞増殖抑制性化合物である。これら細胞増殖抑制性化合物は、工程1に記載されたマレインイミド及びN−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物と反応し、細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体及びN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体が得られ、マレインイミド化合物又はN−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物と細胞増殖抑制性物質との間の化学結合は、アミド,エステル,イミン,ヒドラゾン,カルボキシルヒドラゾン,アセタール又はケタール結合を介して起こる。
アンスラサイクリン類,ドキソルビシン,ダウノルビシン,エピルビシン又はイダルビシンの場合、合成の詳細は、対応するアンスラサイクリン−マレインイミド誘導体又は対応するアンスラサイクリン−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド(DMF)又はTHF中にて、必要に応じて第三級塩基、通常Et3Nを添加し、又は必要に応じてDMAP及び縮合剤、通常DCC若しくはCMCを添加する、工程1に挙げられた式V〜Xのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミドの酸又は酸クロリドとの反応によるものであり、カップリングは、アンスラサイクリンのアミノ糖の3’−NH2基を介してアミド結合として生じ、
或いは、溶媒、好ましくはDMF,メタノール又はエタノール中で、必要に応じて酸、通常トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加する、工程1に挙げられたマレインイミドまたはN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンとの反応によるものであり、カップリングは、アンスラサイクリンのアミノ糖の3’−NH2基を介してイミン結合として生じ、
或いは、溶媒、好ましくはDMF、メタノール又はエタノール中で、酸、通常トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加する、工程1に挙げられたマレインイミドまたはN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアミンとの反応によるものであり、カップリングは、アンスラサイクリンのC13−ケト位を介してイミン結合として生じ、
或いは、溶媒、好ましくはDMF,メタノール又はエタノール中で、酸、通常、トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加する工程1に挙げられたマレインイミドまたはN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸ヒドラジドとの反応によるものであり、カップリングは、アンスラサイクリンのC13−ケト位を介してカルボキシル又はスルホニルヒドラゾン結合として生じる。
ミトザンドロン(Mitoxandron)の場合、合成は、詳細には、対応するミトザンドロン−マレインイミド誘導体又はミトザンドロン−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、溶媒、好ましくはDMF又はTHF中で、必要に応じて第3級塩基、通常、Et3Nを添加し、或いは必要に応じてDMAP及び縮合剤、通常、DCC又はCMCを添加する、工程1に挙げられた式V〜XのマレインイミドまたはN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸クロリドとの反応により行われ、カップリングはミトザンドロンの脂肪族HO−基の少なくとも1つを介してエステル結合として生じ、
或いは、溶媒、好ましくはTHF,メタノール又はエタノール中で、必要に応じて酸、通常トリフルオロ酢酸又はトルエン−p−スルホン酸を添加する、工程1に挙げられたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンとの反応により行われ、カップリングは、ミトザンドロンの脂肪族HO−基の少なくとも1つを介してアセタール又はケタール結合として生じる。
クロラムブシル(Chlorambucil)及びメルファランのようなアルキル化剤の場合、合成は、詳細には、クロラムブシル又はメルファランと工程1に挙げられたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のヒドロキシ化合物を、溶媒、好ましくはDMF,ジクロロメタン又はTHF中で、DMAP及び縮合剤、通常DCC又はCMCを添加して反応させ、対応するクロラムブシル又はメルファラン−マレインイミド誘導体或いはクロラムブシル又はメルファラン−ヒドロキシスクシンイミド誘導体をそれぞれ得、カップリングはクロラムブシル又はメルファランのCOOH基を介してエステル結合として生じ、
或いは、クロラムブシル又はメルファランを、それぞれ塩化オキサリル又は塩化チオニルのような酸ハロゲン化試薬と反応させ、対応する酸クロリドを得、次いで酸クロリドとTHF又は酢酸エチル中で、必要に応じて第三級塩基、通常Et3Nを添加し、t−アルキルカルバゼート、通常tert−ブチルカルバゼートと反応させ、
或いは、クロラムブシル又はメルファランを、DMF,THF又は酢酸エチル中でt−アルキルカルバゼートと、通常、DCC又はCMCと反応させ、次いで得られた生成物を、エーテル,THF又はジオキサン中、酸、通常、トリフルオロ酢酸又はHClで開裂させ、対応するクロラムブシル又はメルファランの酸ヒドラジドをそれぞれ得、次いで工程1に挙げられたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンの1種と、溶媒、好ましくはDMF,メタノール又はエタノール中で、酸、通常、トリフルオロ酢酸又はトルエン−p−スルホン酸と反応させ、クロラムブシル又はメルファランの対応するマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミドカルボキシルヒドラゾン誘導体をそれぞれ得る。
5−フルオロウラシルの場合、合成は、詳細には、対応する5−フルオロウラシルのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、工程1に挙げられたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸クロリドと、溶媒、好ましくはTHF中で、必要に応じて第3級塩基、通常Et3Nを添加した反応により行われ、カップリングは、5−フルオロウラシルの1N−又は3N−位を介して酸アミド結合として生じ、
或いは、対応する5−フルオロウラシルのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、工程1に挙げられたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のオキシカルボニルクロリドと、溶媒、好ましくはTHF中で、必要に応じて第3級塩基、通常Et3Nを添加しての反応により行われ、カップリングは、5−フルオロウラシルの1N−又は3N−位を介してオキシカルボニル結合として生じ、
或いは、対応する5−フルオロウラシルのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、5−フルオロウラシルを、工程1に挙げられたホルムアルデヒド、カルボン酸及びスルホン酸と、溶媒、好ましくはジクロロメタン又はTHF中で、必要に応じてDMAP及び縮合剤、通常、DCC又はCMCを添加した反応により行われ、カップリングは5−フルオロウラシルの1N−又は3N−位でカルバモイルオキシメチル結合として生じる。
5’−デスオキシ−5−フルオロウリジンの場合、合成は、詳細には、5’−デスオキシ−5−フルオロウリジンの対応するマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、工程1に挙げられた式V〜Xのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸クロリドと、溶媒、好ましくはTHF中で、必要に応じて第3級塩基、通常、Et3Nを添加して反応を行い、カップリングは5’−デスオキシ−5−フルオロウリジンの2’−HO又は3’−HO基を介してエステル結合として生じ、
或いは、工程1に挙げられたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンと、溶媒、好ましくはTHF,メタノール又はエタノール中で、必要に応じて酸、通常、トリフルオロ酢酸又はトルエン−p−スルホン酸を添加して反応を行い、カップリングは、5’−デスオキシ−5−フルオロウリジンの2’−HO及び/又は3’−HO基を介してアセタール又はケタール結合として生じる。
チオグアニン(thioguanine)の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Et3Nを添加して、工程1に記載された式V〜Xのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸塩化物と反応させ、アミド結合としてチオグアニンのH2N基を介してカップリングが生じ、溶媒、好ましくは、DMF中で、対応するチオグアニンのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体が生じることによって合成が行われるか、
或いは、溶媒、好ましくは、DMF、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トリフルオロ酢酸又はトルエン−p−スルホン酸を添加して、工程1に記載されたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンと反応させ、イミン結合としてチオグアニンのH2N基を介してカップリングが生じて、合成が行われる。
メトトレキセート(methotrexate)の場合には、詳細には、溶媒、好ましくはDMF又はジメチルスルホキシド中で、DMAP及び縮合剤、一般にDCC又はCMCを添加して、工程1に記載されたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のヒドロキシ又はアミノ化合物をメトトレキセートと反応させ、エステル又はアミド結合としてα−COOH基若しくはγ−COOH基を介するか、又は両方のCOOH基を介してカップリングが生じ、それぞれ、対応するメトトレキセート−マレインイミド誘導体又はメトトレキセート−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を生じることにより合成が行われるか、
或いは、溶媒、好ましくはDMF又はジメチルスルホキシド中で、DMAP及び縮合剤、一般にDCC又はCMCを添加して、アルキルカルバゼート、一般にt−ブチルカルバゼートをメトトレキセートと反応させ、続いて、エーテル、THF又はジオキサン中で、酸、一般に、トリフルオロ酢酸又はHClで開裂させて、メトトレキセートのα−COOH基若しくはγ−COOH基、又は両方のCOOH基に酸ヒドラジド基を導入して、対応するメトトレキセートの酸ヒドラジドとし、得られたメトトレキセートの酸ヒドラジド誘導体を、溶媒、好ましくはDMF、メタノール、THF又はエタノール中で、酸、一般に、トリフルオロ酢酸又はトルエン−p−スルホン酸を添加して、工程1に記載されたN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンの一種と反応させて、対応するメトトレキセートのN−ヒドロキシスクシンイミド カルボキシルヒドラゾン誘導体とすることによって、合成が行われる。
タキソイド(taxoides)、パクリタクセル(paclitaxel)及びドセタクセル(docetaxel)の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Et3Nを添加するか、又は必要に応じて、DMAP及び縮合剤、一般にDCC又はCMCを添加し、工程1に記載された一般式V〜Xのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させ、エステル結合としてタキソイドのC7−又はC10−OH基を介して、カップリングが生じ、溶媒、好ましくはDMF又はTHF中で対応するタキソイド−マレインイミド誘導体又はタキソイド−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を生じることによって、合成が行われるか、
又は、溶媒、好ましくはDMF、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加し、工程1に記載されたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアミン又はヒドラジンと反応させ、イミン又はヒドラゾン結合としてタキソイドのC9−ケト位を介してカップリングが生じて、合成が行われるか、
又は、溶媒、好ましくはDMF、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、工程1に記載されたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸ヒドラジドと反応させ、カルボキシル又はスルホニルヒドラゾン結合として、タキソイドのC9−ケト位を介してカップリングが生じて、合成が行われる。
カンプトテシン(camptothecines)、トポテカン(topotecan)又は9−アミノカンプトテシン(9−aminocamptothecine)の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、Et3Nを添加するか、又は必要に応じて、DMAP及び縮合剤、一般にDCC又はCMCを添加し、工程1に記載された式V〜Xのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させて、エステル結合としてトポテカンのC10−OH基を介してカップリングが生じるか、又はアミド結合として9−アミノカンプトテシンのC9−NH2基を介してカップリングが生じ、溶媒、好ましくは、DMF又はTHF中で、対応するトキソイド−マレインイミド誘導体又はトキソイド−ヒドロキシスクシンイミド誘導体が生じることによって合成が行われるか、
又は、溶媒、好ましくは、DMF、メタノール又はエタノール中で、必要に応じて、酸、一般に、トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加し、工程1に記載されたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンを9−アミノカンプトテシンと反応させ、イミン結合としてC9−NH2基を介してカップリングが生じて、合成が行われる。
ポドフィロトキシン(podophyllotoxin)誘導体、エトポシド(etoposide)、テニポシド(teniposide)及びミトポドジド(mitopodozide)の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Et3Nを添加するか、又は必要に応じて、DMAP及び縮合剤、一般にDCC又はCMCを添加して、工程1に記載された式V〜Xのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させて、エステル結合としてポドフィロトキシン誘導体の脂肪族HO−基の一個を介して、カップリングが生じ、溶媒、好ましくはDMF、ジクロロメタン又はTHF中で、対応するタキソイド−マレインイミド誘導体又はタキソイド−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を生じることによって合成が行われる。
ビンカアルカロイド(vinca alkaloids)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンデシン(vindesine)及びビンオレルビン(vinorelbine)の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Et3Nを添加するか、又は必要に応じて、DMAP及び縮合剤、一般にDCC又はCMCを添加して、工程1に記載された一般式V〜Xのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させて、エステル結合として、ビンカアルカロイドの脂肪族HO−基の一個を介して、カップリングが生じ、溶媒、好ましくはDMF、ジクロロメタン又はTHF中で、対応するタキソイド−マレインイミド誘導体又はタキソイド−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を生じることによって合成が行われる。
シス−配位の白金(II)−錯体のマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Et3Nを添加するか、又は必要に応じて、DMAP及び縮合剤、一般にDCC又はCMCを添加して、対応するアミノ化合物H2N−CH2CH2−NH−(CH2)n−X、(H2N−CH2)2CH−(CH2)n−X又はH2N−CH2CH(NH2)−(CH2)n−X(一般式I、II及びIII)(式中、第一級又は第二級アミノ基の一個又は二個は、BOC基で保護されており(ビス−tert−ブチルオキシカルボニル無水物との反応)、Xは−NH2又は−OHである)を、溶媒、好ましくはTHF又は酢酸エチル中で、工程1に記載された一般式V〜Xのマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させ、対応するBOC−保護マレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体とし、次いで、エーテル、THF又はジオキサン中で、トリフルオロ酢酸又はHClにより、BOC基を開裂させて、対応するトリフルオロ酢酸塩又は塩酸塩とし、最終的に、水、塩緩衝液、DMF、DMF/水混合物、THF/水混合物又はDMF/メタノール混合物中で、テトラクロロ−白金酸(II)塩、好ましくは、テトラクロロ白金酸(II)カリウムと反応させて、エステル結合として末端HO基を介すか、又は酸アミド結合として末端H2N基を介してカップリングが生じて、対応する白金(II)−錯体とすることによって合成が行われるか、
又は、対応するアミノ化合物H2N−CH2CH2−NH−(CH2)n−X、(H2N−CH2)2CH−(CH2)n−X又はH2N−CH2CH(NH2)−(CH2)n−X(一般式I、II及びIII)(式中、第一級又は第二級アミノ基の一個又は二個は、BOC基で保護されており(ビス−tert−ブチルオキシカルボニル無水物との反応)、Xは−NH2又は−OHである)を、溶媒、好ましくはTHF又は酢酸エチル中で、必要に応じて、三級塩基、一般に、Et3Nを添加するか、又は必要に応じて、DMAP及び縮合剤、一般にDCC又はCMCを添加して、HOOC−R−COCR*又はClOC−R−COCR*(Rは炭素数1〜6の脂肪族炭素鎖又は飽和若しくは不飽和のフェニレン基であり、R*は、H、フェニル、炭素数1〜6のアルキルである)型化合物と反応させ、更にカルボニル基を有する対応するBOC−保護マレインイミド又はヒドロキシスクシンイミド誘導体とし、次いで、これを、溶媒、好ましくは、DMF、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、工程1に記載されたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアミン、酸ヒドラジド又はヒドラジンと反応させ、対応するイミン、カルボキシルヒドラゾン又はヒドラゾン誘導体とし、次いで、再度、エーテル、THF又はジオキサン中で、トリフルオロ酢酸又はHClにより、BOC基を開裂させて、対応するトリフルオロ酢酸塩又は塩酸塩とし、最終的に、水、塩緩衝液、DMF、DMF/水混合物、THF/水混合物又はDMF/メタノール混合物中で、テトラクロロ−白金酸(II)塩、好ましくは、テトラクロロ白金酸(II)カリウムと反応させて、対応する白金(II)−錯体とすることによって合成が行われるか、
又は、対応するアミノ化合物H2N−CH2CH2−NH−(CH2)n−X、(H2N−CH2)2CH−(CH2)n−X又はH2N−CH2CH(NH2)−(CH2)n−X(一般式I、II及びIII)(式中、第一級又は第二級アミノ基の一個又は二個は、BOC基で保護されており(ビス−tert−ブチルオキシカルボニル無水物との反応)、XはCOOHであるか又はこのカルボニル基は、塩化チオニル又は塩化オキサリル等の酸ハロゲン化剤を用いて酸塩化物に変換されている)を、溶媒、好ましくはTHF又は酢酸エチル中で、必要に応じて、三級塩基、一般に、Et3Nを添加するか、又は必要に応じて、DMAP及び縮合剤、一般にDCC又はCMCを添加して、HOR−COCR*又はH2N−R−COCR*(Rは炭素数1〜6の脂肪族炭素鎖又は飽和若しくは不飽和のフェニレン基であり、R*は、H、フェニル、炭素数1〜6のアルキルである)と反応させ、更にカルボニル基を有する対応するBOC−保護マレインイミド又はヒドロキシスクシンイミド誘導体とし、次いで、これを、溶媒、好ましくは、DMF、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トルエン−p−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、工程1に記載されたマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアミン、酸ヒドラジド又はヒドラジンと反応させて、対応するイミン、カルボキシルヒドラゾン又はヒドラゾン誘導体とし、次いで、再度、エーテル、THF又はジオキサン中で、トリフルオロ酢酸又はHClにより、BOC基を開裂させて、対応するトリフルオロ酢酸塩又は塩酸塩とし、最終的に、水、塩緩衝液、DMF、DMF/水混合物、THF/水混合物又はDMF/メタノール混合物中で、テトラクロロ−白金酸(II)塩、好ましくは、テトラクロロ白金酸(II)カリウムと反応させて、対応する白金(II)−錯体とすることによって合成が行われる。
一般式IV(HOOC)2−CH−(CH2)nXのマロン酸誘導体を有するマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体をシス−配位の白金(II)錯体とする場合には、上記錯体の場合と同様にして合成が行われ、マロン酸誘導体を有するマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を、水酸化物溶液、好ましくはKOH水溶液を添加して、シス−[PtA2B](A=ハロゲン、好ましくはCl又はI、B=(NH3)2、エチレンジアミン、プロパンジアミン、1,2−ジアミノシクロヘキサン)と反応させて、水、塩緩衝液、DMF、DMF/水混合物、THF/水混合物又はDMF/メタノール混合物等の溶媒中で、対応する白金(II)錯体とすることによって、白金(II)錯体が得られる。この反応は、必要に応じて、硝酸銀(AgNO3)又は硫酸銀(Ag2SO4)の存在下に行うことができる。白金錯体は、結晶化、又は溶媒、好ましくは、ジエチルエーテル又はTHFの添加により得られる。
上記したマレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド細胞増殖抑制化合物の分離は、下記実施例に記載するように、それぞれ、結晶化、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、又は逆相(C8又はC18)若しくはジオールカラムによる分離用HPLC又はLPLCにより行われる。
工程3:担体タンパク質のチオール化
スルホヒドリル基(HS基)は、担体タンパク質とチオール化剤、好ましくはイミノチオラン(iminothiolan)の反応により、ヒト血清トランスフェリン及び血清アルブミンに導入される。チオール化は、過剰のチオール化剤(2〜100倍過剰)を含む塩緩衝液、一般に、0.1Mホウ酸ナトリウム、0.15M NaCl、0.001M EDTA−pH=8.0中で生じ、引き続き、0.025Mホウ酸ナトリウム、0.15M NaCl−pH=6.0〜7.5又は0.004Mホスフェート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5等の塩緩衝液を用いてゲル濾過(例えば、登録商標:Sephadex G10又はG25)を行う。ゲル濾過終了後のタンパク質濃度は、280nmでの吸光係数により決定され、一般に、1.0×10-4〜5.0×10-3Mの範囲である。導入されたHS基の数は、412nmでエルマン試薬(Ellmann’s reagent)で決定される。反応条件を変化させることにより、平均して1〜30個のHS基を導入できる。チオール化されたトランスフェリン又はアルブミン溶液は、複合体の合成に直接使用される。
工程4:概要1に示された、細胞増殖抑制性マレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の、天然若しくはチオール化担体蛋白への又はポリエチレングリコールへのカップリング
細胞増殖抑制性マレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド化合物のPEG類へのカップリングのために、HO−、HS−又はH2N基の1又は2個及び5,000〜200,000Daの間の好ましくは20,000〜70,000Daの間の質量を有するPEG類が用いられる。相当する化合物は市販されていない。以下において、1又は2個のSH基を有するポリエチレングリコールはHS−PEG又はHS−PEG−SHと略称し、1又は2個のH2N基を有するPEG類はH2N−PEG又はH2N−PEG−NH2と略称する。
細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体のチオール化担体蛋白への又はHS−PEG、HS−PEG−SH、H2N−PEG又はH2N−PEG−NH2へのカップリング;細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体(工程2参照)は、チオール化トランスフェリン、アルブミン(工程3参照)、HS−PEG、HS−PEG−SH、H2N−PEG又はH2N−PEG−NH2と室温で反応される。反応の間に、0.025Mナトリウムボレート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5又は0.004Mホスフェート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5の様な脱気した塩緩衝液中に存在している、チオール化蛋白、HS−PEG、HS−PEG−SH、H2N−PEG又はH2N−PEG−NH2に、(蛋白又はPEG中の利用できるHS基の数に関して)約1.1〜10倍過剰の細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体を加え、通常DMF、ジメチルスルホキシド、水、エタノール、メタノール、アセトニトリル又はTHF(チオール化試料の容量の約1〜10%)のような溶剤の最小量に溶解した。約5〜120分後、溶液を遠心分離し、形成された蛋白複合体又はPEG複合体を、0.025Mナトリウムボレート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5、0.004Mホスフェート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5若しくは0.1〜0.2M NaHCO3の様な脱気した塩緩衝液中、又はメタノール若しくはTHF中での、引き続くゲル濾過(例えば、セファデックス(登録商標)G10、G25又はLH20)により、過剰の細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体から分離した。マレインイミド誘導体の添加に先立って、チオール化蛋白溶液を塩緩衝液で希釈し、最小量の溶剤に溶解されたマレインイミド誘導体を加え、次いで5〜20分後通常の市販濃縮器で溶液を濃縮し、そして上記の如く蛋白複合体を分離することが、有利であり得る。更に、かくして得られた蛋白複合体又はPEG複合体の溶液は、通常の市販濃縮器で濃縮でき、又は溶剤は高真空下で除去できる。
細胞増殖抑制性N−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の天然担体蛋白への又はHO−PEG、HO−PEG−OH、H2N−PEG又はH2N−PEG−NH2へのカップリング;細胞増殖抑制性N−ヒドロキシスクシンイミド誘導体(工程2参照)は、トランスフェリン、アルブミン、HO−PEG、HO−PEG−OH、H2N−PEG又はH2N−PEG−NH2と室温で反応させる。反応の間に、0.025Mナトリウムボレート、0.15M NaCl−pH6.0〜8.0又は0.004Mホスフェート、0.15M NaCl−pH6.0〜8.0の様な脱気した塩緩衝液中に存在している、蛋白、HO−PEG、HO−PEG−OH、H2N−PEG又はH2N−PEG−NH2に、約1.1〜50倍過剰の細胞増殖抑制性N−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を加え、通常DMF、ジメチルスルホキシド、水、エタノール、メタノール、アセトニトリル又はTHF(チオール化試料の容量の約1〜10%)である溶剤の最小量に溶解する。約5分〜48時間後、溶液を遠心分離し、形成された蛋白複合体又はPEG複合体を、0.025Mナトリウムボレート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5、0.004Mホスフェート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5若しくは0.1〜0.2M NaHCO3の様な脱気した塩緩衝液中、又はメタノール若しくはTHF中での、引き続くゲル濾過(例えば、セファデックス(登録商標)G10、G25又はLH20)により、過剰の細胞増殖抑制性N−ヒドロキシスクシンイミド誘導体から分離した。かくして得られた蛋白複合体又はPEG複合体の溶液は、通常の市販濃縮器で濃縮でき、又は溶剤は高真空下で除去できる。
担体蛋白に又はポリエチレングリコールに結合している細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の数は、細胞増殖抑制性マレインイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の吸収波長(典型的には220と660nmの間)での光学的濃度測定法により及び/又は比色測定法により特定され、クロラムブシルとメルファランの複合体の場合はNBPテストにより特定され(Epstein,J.,Rosenthal,R.W.,Ess.R.J.Anal.Chem.(1955),27,1435-1439)、5−フロオロウラシルと5’−デスオキシ−5−フルオロウリジンの複合体の場合はHabibによるアッセイにより特定され(Habib,S.T.,Talanta(1981),28,685-87)、そしてcis−配位白金(II)アナログの複合体の場合はゴニアス(Gonias)及びピゾ(Pizzo)による測定法(Gonias,S.L.,Pizzo,S.V.,J.Biol.Chem.(1982),258,5764-5769)または原子吸光スペクトル(AAS)により、特定される。
平均で、上記記載の方法により、約1〜30分子の細胞増殖抑制性化合物が蛋白1分子に結合しており、1〜2分子の細胞増殖抑制性化合物がPEG1分子に結合している。蛋白複合体又はPEG複合体の純度は、分析カラムによるHPLC(Bio-RadからのBio-Sil SEC 250(300mm×7.8mm)、移動相:通常0.15M NaCl、0.01M NaH2PO4、5%CH3CN−pH7.0又はMacherey and NagelからのNucleogel(登録商標)aqua-OH 40若しくは60、移動相:通常0.1M NaCl、0.004M NaH2PO4、30%メタノール−pH7.0)により、調べる。そうするとき、トランスフェリン、アルブミン及びポリエチレングリコールの複合体は、>90%の純度を示す。
蛋白複合体又はPEG複合体は、溶液形態では0〜5℃で、凍結形態ではT=−20℃ないし−78℃で、保存することができる。更に、複合体の溶液は、凍結乾燥し、その凍結乾燥物を+5℃〜−78℃で保存することができる。
本発明の目的は、請求項1〜3の1つによる、約2〜30当量の細胞増殖抑制性化合物を積載し.それが蛋白と、例えばトランスフェリン又は腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と、好ましくはトランスフェリンと、請求項3に挙げられているビスマレインイミド化合物の一つを介して、或いは脂肪族又は芳香族ビスマレインイミド化合物を介して、複合体化されたアルブミンからなる化学免疫複合体にもある。そのようにして、通常DMF、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール、アセトニトリル又はTHF(チオール化試料の容量の約1〜10%)の溶剤の最小量に溶解した細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体を用い、アルブミンに導入されたチオール基の約80〜90%が、反応され、そして約5〜60分後、通常DMF、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール、アセトニトリル又はTHF(チオール化試料の容量の約1〜10%)である溶剤の最小量に溶解したビスマレインイミド化合物の1.5〜20倍過剰量が加えられる。約5〜20分後、溶液を遠心分離し、形成された蛋白複合体を、通常、0.025Mナトリウムボレート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5又は0.004Mホスフェート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5の塩緩衝液中での、引き続くゲル濾過(例えば、セファデックス(登録商標)G10又はG25)により、細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体及びビスマレインイミド化合物から分離する。次いで、こうして修飾されたアルブミン複合体は平均で約1.5個のチオール基を含む前記蛋白の一つと反応させられ、そして得られた細胞増殖抑制性化合物を積載したアルブミンと前記蛋白からなる化学免疫複合体を、通常、0.025Mナトリウムボレート、0.15M NaCl−pH6.5〜8.0、0.004Mホスフェート、0.15M NaCl−pH6.5〜8.0の塩緩衝液中での、Superdex−200カラム(会社:ファルマシア)又はヒドロキシアパタイトカラム(会社:ファルマシア又はBio-Rad)により、分離される。
また、先ず、平均で約1.5個のチオール基を含む前記蛋白の一つとビスマレインイミド化合物の1.5〜10倍過剰量とを反応させ、次いで、形成された蛋白複合体を、0.025Mナトリウムボレート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5、0.004Mホスフェート、0.15M NaCl−pH6.0〜7.5又は0.1〜0.2M NaHCO3の脱気された塩緩衝液中での、引き続くゲル濾過(例えば、セファデックス(登録商標)G10又はG25)により、ビスマレインイミド化合物から分離し、次いで、こうして修飾された平均で約1.5当量のビスマレインイミド化合物を含む蛋白複合体を、アルブミンに導入された約80〜90%のチオール基が既に細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体と反応している修飾されたアルブミン複合体と反応させることも可能である。得られた細胞増殖抑制性化合物を積載したアルブミン分子と前記蛋白からなる化学免疫複合体を、0.025Mナトリウムボレート、0.15M NaCl−pH6.0〜8.0、0.004Mホスフェート、0.15M NaCl−pH6.0〜8.0又は0.1〜0.2M NaHCO3の脱気された塩緩衝液中での、Superdex−200カラム(会社:ファルマシア)又はヒドロキシアパタイトカラム(会社:ファルマシア又はBio-Rad)により、分離される。
以下の実施例により、本発明を制限することなく、更に詳しく本発明を説明する。
具体的実施例
工程1:マレインイミド化合物及びN−ヒドロキシスクシンイミド化合物の合成
p−マレインイミドベンゾフェノン
p−アミノベンゾフェノン14.0g(70mmol)をアセトン70mlに溶解し、アセトン40mlに溶解したマレイン酸無水物7.0g(70mmol)を室温下15分間で滴下した。これを室温で3時間撹拌した。次いで、沈殿を濾別し、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥した(収率:93%)。N−(p−アミノベンゾフェニル)−マレイン酸アミド19.3g(65.4mmol)及び無水酢酸ナトリウム2.6g(31.0mmol)を、55℃で、無水酢酸50mlに溶解し、この温度で2時間撹拌した。続いて、60℃で、無水酢酸を水流真空下で除去した。残渣に水300mlを加え、70℃で2時間撹拌した。この時間に沈殿した沈殿物を吸引し、水で洗浄し、溶解し、アセトンから及び再結晶した(収率:94%);融点:150℃;Rf値:0.70(酢酸エステル/ヘキサン 6/1);計算値:C:73.64% H:3.97% N:5.05%、C17H11NO3;実測値:C:73.15% H:3.96% N:5.00%。
p−マレインイミドフェニル酢酸
p−アミノフェニル酢酸25.0g(166.9mmol)をメタノール250mlに懸濁し、加熱しながらその溶液にアセトン500mlを追加した。アセトン100mlにマレイン酸無水物19.25g(166.9mmol)を溶解し、40℃に予め冷却しておいた該溶液に60分間で滴下した。これを室温で60分間撹拌した。次いで、この反応混合物を約300mlまで濃縮し、−20℃に冷却しておいた。沈殿を吸引し、アセトンで洗浄し、高真空下に乾燥した(収率:82%)。N−(4−酢酸フェニル)マレイン酸アミド18.0g(72mmol)をトルエン2.4リットルに懸濁し、加熱還流した。加熱しながら、トリエチルアミン14.7g(20.2ml、144mmol)を加え、続いて加熱して水分離器で2時間還流した。次いで、形成された赤色オイルからそれを蒸留し、真空下溶媒を除去した。黄色残渣を水300mlに溶解し、1M HClでpH=2にした。酸性溶液を酢酸エステルで抽出した(50mlで6回)。合わせた酢酸エステル相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下に除去した。生成物を、酢酸エステル/ヘキサンから再結晶した(収率:51% 黄色結晶);融点:158℃;Rf値:0.45(酢酸エステル/メタノール 2/1);計算値:C:62.34% H:3.92% N:6.09%、C12H9NO4;実測値:C:61.84% H:4.43% N:5.59%。
p−マレインイミドフェニル酢酸クロライド
p−マレインイミドフェニル酢酸1.0g(4.33mmol)をジクロロメタン25mlに懸濁し、2.5倍過剰量のシュウ酸ジクロライド(1.37g、945μl;10.82mmol)で希釈した。反応混合物を30〜40℃に加熱して水分を除去し、15時間撹拌した。次いで、真空下に溶媒を除去し、高真空下に乾燥した。トルエンから結晶化し黄色粉末(収率:59%)を得た;融点:154℃;Rf値:0.29(酢酸エステル/ヘキサン 4/1)
元素分析:計算値:C:58.91% H:3.30% N:5.75% Cl:14.49%
(C12H8NO3Cl);実測値:C:60.61% H:3.64% N:5.13% Cl:13.80%
p−マレインイミドフェニル酢酸ヒドラジド・CF 3 COOH
p−マレインイミドフェニル酢酸クロライド3.5g(14mmol)を、tert−ブチルカルバゼート(2.87g、21.1mmol)と共に、無水テトラヒドロフラン50mlに溶解し、室温で2時間撹拌した。テトラヒドロフランを高真空下に除去し、残渣を酢酸エステル500ml中に取った。酢酸エステル相を、2回各125mlの水と振盪し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶液を留去により濃縮し、溶解し、酢酸エステル/ヘキサンから及び再結晶した。生成物を吸引し、高真空下に乾燥した(収率:90%);融点:152℃で分解;Rf値:0.50(テトラヒドロフラン/ヘキサン 3/1)。p−マレインイミドフェニル酢酸ヒドラジノ−tert-ブチルカルバゼート2.5g(7.25mmol)をトリフルオロ酢酸12mlに溶解し、室温で1時間撹拌した。続いて、トリフルオロ酢酸を高真空下に除去し、残渣をエーテル50mlに懸濁した。沈殿を吸引し、乾燥エーテルで洗浄し、高真空下に乾燥した(収率:82% 黄色粉末);融点:112℃;Rf値:0.06(テトラヒドロフラン/ヘキサン 3/1)。
計算値:C:46.80% H:3.34% N:11.70%
(C14H12N3O5F3) 実測値:C:46.95% H:3.24% N:11.51%。
マレインイミドアセトアルデヒド
アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール91.6g(100ml、689mmol)を酢酸エステル200mlに溶解した。その後、酢酸200mlに溶解したマレイン酸無水物67.5g(689mmol)を撹拌下に滴下し、60分間氷冷した。これを室温で1時間撹拌した。次いで、反応混合物を半量まで濃縮し、−20℃に冷却した。24時間後、得られた沈殿を真空下に吸引し、酢酸エステル及びエーテルで洗浄し、続いて高真空下に乾燥した(収率:90%)。N−(アセトアルデヒド ジエチルアセタール)マレイン酸アミド30.95g(133.8mmol)をトルエン900mlに溶解し、そこにトリエチルアミン14.2g(19.6ml、140.5mmol)を加え、そして反応混合物を水分離器で15時間煮沸した。その後、溶剤を真空下で除去した。残ったシロップをジエチルエーテル350mlに取り、各50mlの水で3回抽出した。エーテル相をNa2SO4で乾燥し、溶剤を真空下に除去し、そして残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製した(酢酸エステル/ヘキサン 1/1 収率:無色シロップ36%);;Rf値:0.49(酢酸エステル/ヘキサン 1/1)
計算値:C:58.15% H:7.49% N:6.17%
(C10H15NO4) 実測値:C:58.10% H:6.98% N:6.35%。
マレインイミドアセトアルデヒド ジエチルアセタール20.1g(94.3mmol)をジクロロメタン350mlに溶解し、撹拌しつつシリカゲル60 40.2gを加えた。30%硫酸4.0gを加え、60時間還流した。次いで、シリカゲルを濾別し、反応溶液を水50mlで4回抽出した。ジクロロメタンを硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発濃縮した。残ったシロップを溶解し、酢酸エステル/ヘキサン(1:10)から再結晶した(収率:15%白色結晶);融点:68〜69℃;Rf値:0.52(THF/ヘキサン 3/1)
計算値:C:51.76% H:3.62% N:10.06%
(C6H5NO3) 実測値:C:51.48% H:4.14% N:9.60%。
2−マレインイミドエチルクロロフォルメート
2−ヒドロキシエチルマレインイミド2.0g(14.2mmol)を無水ジクロロメタン150mlに溶解し、トリホスゲン1.56g(4.8mmol)で希釈した。トリエチルアミン479mg(660μl;4.8mmol)を加えた後、これを室温下72時間撹拌し、次いで溶剤を真空下に除去し、そして残渣をシリカゲルを介したカラムクロマトグラフィーを用いて精製した(展開媒体:酢酸エステル/ヘキサン 2/1 収率:無色固体80%);融点:45℃;Rf値:0.69(酢酸エステル/ヘキサン 2/1); 計算値:C:41.25% H:2.95% N:6.88% Cl:17.41%
(C7H6NO4Cl) 実測値:C:41.11% H:3.00% N:6.88% Cl:16.94%。
ビスマレインイミド化合物の合成:
1,4−ジアミノ−N,N’−ジ−m−マレインイミドベンジル−ブタン
2.36g(10mmol)のマレインイミド安息香酸クロリドと0.44g(5mmol)の1,4−ジアミノブタンとを、それぞれ60mlの酢酸エチルに溶解した。三つ口フラスコに40mlの酢酸エチルを入れた。攪拌しながら室温下で、両溶液を30分間かけて同時に滴下した。滴下中に淡黄色の沈殿が析出した。これを2時間攪拌し、沈殿を吸引してジエチルエーテルで洗浄した。淡黄色の固体を溶解してアセトンから再結晶させ、水で洗浄した後に再びエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥した。淡黄色固体として2.1g(3.9mmol、理論の75%)の生成物が得られた。DC:シリカゲル、THF/ヘキサン 4:1、Rf-値:0.30(THF/ヘキサン 3/1)、Fp.:221℃(分解);C26H22N4O6(486g/mol)計算値:C:64.20%H:4.53% N:11.52% O:19.75%;実測値:C:62.57% H:4.55% N:10.67%
アジピン酸ジヒドラジドとm−マレインイミドアセトフェノンからのジアシルヒドラゾン
1.0g(4.65mmol)のm−マレインイミドアセトフェノンを368mg(2.11mmol)のアジピン酸ジヒドラジドとともに40mlの無水メタノールに溶解した。反応混合物に100μlのトリフルオロ酢酸を添加し、室温で15時間攪拌した。このようにして析出した沈殿を吸引し、それぞれ30mlのメタノール×2とそれぞれ50mlのジエチルエーテル×4で洗浄した。その後、生成物を減圧下で乾燥した。DC:シリカゲル、THF/ヘキサン 4:1、Rf=:0.36、Fp.:240℃(分解);C30H28N6O6(568g/mol)計算値:C:63.38% H:4.93% N:14.79%;実測値:C:63.18% H:4.83% N:15.03%
N−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物の合成
4−アセトフェノンカルボン酸−(N−ヒドロキシスクシンイミド)−エステル
2.2g(1.2mmol)のアセトフェノン−4−カルボン酸と1.52g(1.3mmol)と20mgのDMAPを40mlのテトラヒドロフランに溶解した後に、20mlのTHFに溶解させた2.7gのDCCを、冷却しながら1時間で滴下した。反応混合物を冷却しながら12時間攪拌し、濾過し、減圧下でTHFを除去し、残渣を溶解して酢酸エステル/メタノール 1:1から再結晶した。
Rf=0.71、Fp.:140℃;C13H11NO5(261g/mol);計算値:C:59.77% H:4.21% N:5.36%;実測値:C:60.1% H:4.2% N:5.0%
4−カルボキシルベンゾイルヒドラジド
25g(138.9mmol)のテレフタル酸モノメチルエステルを200mlのTHFに懸濁し加熱還流する。40.5ml(833.4mmol、6eq)のヒドラジン一水和物を分割添加すると、生成物が白色固体として析出する。過剰のTHFを留去し、残渣を水に溶解する。濃HClの添加により、pHを約4に調節する。形成する白色沈殿を吸引し、半濃HClで洗浄する。生成物を減圧下で乾燥し、溶解してメタノール性苛性ソーダ溶液から再結晶する。理論的可能な収量の99.3%に相当する24.84g(138mmol)の生成物が無色針状結晶の形態で得られる。C8H8N2O3(180g/mol);計算値:C:53.33% H:4.44% N:15.55%;実測値:C:52.41% H:4.26% N:14.68%
N−ターシャリーブチルオキシカルボニル−4−カルボキシベンゾイルヒドラジド
20g(0.11mol)の4−カルボキシベンゾイルヒドラジドを200mlのTHFに懸濁し、ビス−tert−ブチルジカーボネート23.98g(0.11mol)のTHF50ml溶液で希釈する。室温で48時間撹拌後、THFを減圧下で除去し、オイル状残渣を400mlの酢酸エチルに取り、それぞれ100mlの水で4回抽出する。有機相をNa2SO4上で乾燥した後、それを半分に濃縮して4℃に冷却する。無色の結晶が形成され、吸引してジエチルエーテルで洗浄する。理論的可能な収量の98.4%に相当する30.3g(0.108mmol)の生成物が得られる。
C13H16N2O5(280g/mol)
計算値: C:55.71% H:5.71% N:10.00%
実測値: C:56.94% H:5.56% N:9.79%
N−ターシャリーブチルオキシカルボニル−4−(N−ヒドロキシスクシンイミドカルボニル)ベンゾイルヒドラジド
4g(14.29mmol)のN−ターシャリーブチルオキシカルボニル−4−カルボキシベンゾイルヒドラジドを3.29g(28.6mmol)のN−ヒドロキシスクシンイミドと17.4mgのDMAPとともに100mlのTHFに溶解し、4℃で3.23g(15.72mmol)のDCC溶液を滴下して希釈する。4℃で12時間攪拌し室温で48時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解しそれぞれ50mlの飽和NaCl溶液で10回抽出する。有機相をNa2SO4上で乾燥した後、それを半分に濃縮して4℃に冷却する。無色の針状晶が形成され、吸引して少量のジエチルエーテルで洗浄する。理論的可能な収量の98.6%に相当する5.3g(14.09mmol)が得られる。C17H18N3O7(376g/mol);計算値:C:54.26% H:4.79% N:11.18%;
実測値:C:52.65% H:5.53% N:10.56%
4−(N−ヒドロキシスクシンイミド)カルボニル)ベンゾイルヒドラジドトリフルオロアセテート
3g(7.98mmol)のN−ターシャリーブチルオキシカルボニル−4−(N−ヒドロキシスクシンイミドカルボニル)ベンゾイルヒドラジドを10mlの無水トリフルオロ酢酸で希釈し室温で2時間攪拌する。激しく攪拌しながら、50mlのジエチルエーテルを添加する。形成した固体を吸引し、ジエチルエーテルで数回洗浄する。減圧下で乾燥した後、理論的可能な収量の96.1%に相当する3.0g(7.67mmol)の生成物が白色粉末として得られる。C14H12N3O7F3(391g/mol);計算値:C:42.97% H:3.07% N:10.74%;
実測値:C:43.49% H:3.42% N:10.74%
工程2:細胞増殖抑制性化合物のマレインイミドおよびヒドロキシスクシンイミド誘導体の合成
クロラムブシルカルボン酸ヒドラジド
クロラムブシル(1.0g;3.29mmol)を50mlの無水CH2Cl2に溶解して塩化オキサリル(431μl;4.8mmol)で希釈し、これを30−40℃で15時間攪拌した。次いで、溶液を蒸発により濃縮し、塩化オキサリルの残渣を高減圧下で除去する。さらに、得られた褐色シロップを20mlの無水CH2Cl2に溶解し、室温で攪拌しながら、20mlのCH2Cl2に溶解したtert−ブチルカルバゼート(457mg;3.45mmol)を1時間で滴下することにより、合成されたオキサリルカルボン酸クロリドを直ちに反応させた。これを36時間攪拌し、不溶部分から濾別し、溶液を減圧下で約3mlに濃縮した。得られたクロラムブシル−tert−ブチルカルバゼートは褐色シロップで、カラムクロマトグラフィー(展開媒体:酢酸エステル/ヘキサン 2/1;Rf-値:0.52)を用いて精製した。収量:700mg(1.67mmol;理論値の51%)。クロラムブシル−tert−ブチルカルバゼート(700mg;1.67mmol)を10mlのテトラヒドロフランに溶解し、室温で攪拌しながら10mlのトリフルオロ酢酸で希釈し、1時間攪拌し、次いで溶媒とトリフルオロ酢酸を高減圧下で除去して淡褐色の固体を形成した。
[4−(4−ビス(2−クロロエチル)アミノフェニル)]酪酸ヒドラジド(トリフルオロ酢酸塩)および4−アセトフェノンカルボン酸−(N−ヒドロキシスクシンイミド)−エステルのカルボキシルヒドラゾン誘導体
クロラムブシルカルボン酸ヒドラジド(トリフルオロ酢酸塩;721mg;1.67mmol)を30mlのテトラヒドロフランに溶解し、室温で攪拌しながら4−アセトフェノンカルボン酸−(N−ヒドロキシスクシンイミド)−エステル(479mg;1.83mmol)で希釈した。20分後、反応溶液を蒸発により濃縮した。残渣を溶解して酢酸エステル/ヘキサンから再結晶した。収量:290mg(0.66mmol;理論の40%)淡黄色結晶;
(C27H31N4O6Cl2,Mr577)
計算値: C:56.2% H:5.4% N:9.7% Cl:12.1%
実測値: C:56.3% H:5.6% N:12.4% Cl:11.7%
N 1 −(2−マレインイミドエチルオキシカルボニル)−5−フルオロウラシル
500mg(3.84mmol)の5−フルオロウラシルを100mlのテトラヒドロフランに溶解し、505mg(696μl;4.99mmol)のトリエチルアミンで希釈した。この溶液に、100mlのテトラヒドロフランに溶解した1016mg(4.99mmol)の2−マレインイミドエチルクロロホルメートを滴下し、これを室温で15時間攪拌した。その後、溶媒を水流減圧下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(LOBARR(登録商標)−カラム;展開媒体:酢酸/ヘキサン 1.5/1;収率61%)を用いて精製した。融点:132℃、Rf-値:0.64(ジオール;酢酸/ヘキサン 2/1)
計算値: C:44.29% H:2.68% N:14.09%,(C11H8N3O6F);
実測値: C:44.29% H:2.68% N:13.58%
N 1 −(m−マレインイミドベンゾイルオキシメチル)−5−フルオロウラシル
1500mg(11.55mmol)の5−フルオロウラシルと2.25ml(25.4mmol)の37%ホルムアルデヒド溶液を2時間攪拌しながら60℃に加熱した。その後、水を高減圧下で除去し、テトラヒドロフラン80ml中のDMAP20mgを添加して残渣を溶解した。この溶液に、50mlのテトラヒドロフランに溶解した3.01g(13.85mmol)のm−マレインイミド安息香酸と2.858g(13.85)のDCCを添加し、その後に室温で15時間攪拌した。沈殿を濾別し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を約20mlの酢酸に取り、不溶分から濾別した。溶液を蒸発により濃縮し、残渣にクロマトグラフを行った(1.シリカゲル(酢酸エステル/ヘキサン 2/1);収率:5% 白色粉末)。融点:分解>250℃;Rf-値:0.32(酢酸/ヘキサン 2/1)
元素分析 計算値: C:55.98% H:2.92% N:12.24%; (C16H10N3O6F)
実測値: C:55.51% H:2.87% N:11.72%
ドキソルビシンとp−マレインイミドフェニル酢酸クロリドとの3’−アミノアミド誘導体
500mg(0.86mmol)の塩酸ドキソルビシンを50mlの無水DMFに溶解し、1013mg(4.30mmol)のp−マレインイミドフェニル酢酸クロリドと719μl(522mg;5.16mmol)のトリエチルアミンとを添加した。溶液を室温で15時間攪拌した。DMFを高減圧下で除去して残渣を5mlのテトラヒドロフランに溶解し、濾過してシリカゲルカラム(テトラヒドロフラン/ヘキサン 3/1)上で精製した。189mgの赤色生成物(29%);Rf-値:0.26(酢酸エチル/ヘキサン 3/1);融点:110℃;
(C39H36N2O14);
計算値: C:61.84% H:4.75% N:3.70%;
実測値: C:61.35% H:5.14% N:3.45%
ドキソルビシンと4−((N−ヒドロキシスクシンイミド)カルボニル)ベンゾイルヒドラジドトリフルオロアセテートのC−13−ベンゾイルヒドラゾン誘導体
0.2mmolの塩酸ドキソルビシンおよび1.0mmolの4−((N−ヒドロキシスクシンイミド)カルボニル)ベンゾイルヒドラジドトリフルオロ酢酸塩を100mlのメタノールに溶解した。この溶液に100μlのCF3COOHを添加し、反応混合物を室温で36時間攪拌した。次いで、溶液を約50mlに濃縮した。アセトニトリルを濁度に達するまで添加し、懸濁液を−20℃で24時間冷却した。生成物を遠心分離手段により集め、溶解してメタノール/アセトニトリルから再結晶した。276mg;Rf-値(逆相、アセトニトリル/0.005M NaH2PO4(pH5.0)=70/30):0.33、融点:>250℃(分解)、(C39H40N4O14Cl)
計算値: C:56.83% H:4.86% N:6.80% Cl:4.31%
実測値: C:57.04% H:5.14% N:6.55% Cl:4.12%
以下の実施例により記載される、シス−配位した白金(II)ユニットを有するマレインイミド誘導体の製造方法:N−(O−(3−マレインイミドベンゾイル)−2−ヒドロキシエチル)−1,2−ジアミノエタン ジクロロ白金(II)−4工程合成
N−(2−ヒドロキシエチル)−N,N’−ビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル−1,2−ジアミノエタン
ジクロロメタン100mlにN−(2−ヒドロキシエチル)−1,2−ジアミノエタン20.8g(200mmol)を溶解した溶液に対し、ジクロロメタン200mlにビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル無水物47.96g(220mmol、0.5eq)を溶解したものを室温下に1時間で滴下した。これを室温で12時間攪拌し、次いでジエチルエーテル100mlで希釈し、水150mlで抽出した。硫酸ナトリウム上で有機相を乾燥させた後、真空下で濃縮した。生成物の精製はカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン(1:1.5),Rf−値:(酢酸エチル/ヘキサン 1:1.5):Rf=0.18)を用いて行った。収量:30g(98.68mmol)、C14H28N2O5(304g/mol)の元素分析;計算値:C:55.26% H:9.21% N:9.21%;実測値:C:55.50% H:9.18% N:9.02%
N−(O−(3−マレインイミドベンゾイル)−2−ヒドロキシエチル)−N,N’−ビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル−1,2−ジアミノエタン
テトラヒドロフラン50ml及びトリエチルアミン4ml(28.9mmol,1.1eq)中のN−(2−ヒドロキシエチル)−N,N’−ビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル−1,2−ジアミノエタン8g(26.3mmol)の溶液に対し、テトラヒドロフラン100mlにマレインイミド安息香酸クロライド6.82g(29mmol,1.1eq)を溶解した溶液を室温下に1時間かけて攪拌しながら滴下する。さらに室温下で8時間攪拌した後、DCに従って、反応を完結する。反応で形成したトリエチルアンモニウムクロライドをろ別する。真空下でテトラヒドロフランと過剰のトリエチルアミンを除去した後、生成したオイルをカラムクロマトグラフィー(シリカゲル:酢酸エチル/ヘキサン(1:1),Rf値:(酢酸エチル/ヘキサン 1:1)=0.2)を用いて精製する。理論可能収量の72.6%に相当する黄色油状生成物の収量:9.6g(19.1mmol)。C25H33N3O8の元素分析(503g/mol);計算値:C:59.64% H:6.56% N:8.35%;実測値:C:60.04% H:6.77% N:8.24%
N−(O−(3−マレインイミドベンゾイル)−2−ヒドロキシエチル)−1,2−ジアミノエタン ジヒドロクロリド
N−(O−(3−マレインイミドベンゾイル)−2−ヒドロキシエチル)−N,N’−ビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル−1,2−ジアミノエタン6g(11.93mmol)を、ジエチルエーテル中の1M HCl溶液60ml(5eq)を室温下で攪拌しながら希釈する。室温で48時間攪拌した後、微細結晶性沈殿をG4ガラスフリットで吸引し、無水エチルで複数回洗浄してHCl残渣を取り除き、真空下で乾燥した。生成物3.0g(7.98mmol)が微粉の黄色固体として得られ、理論可能収量の66.9%に相当する。
C15H19N3O4Cl2(375.9g/mol)の元素分析
計算値:C:47.89%,H:5.05%,N:11.17%,Cl:18.86%;
実測値:C:46.97%,H:5.42%,N:10.03%,Cl:17.63%
N−(O−(3−マレインイミドベンゾイル)−2−ヒドロキシエチル)−1,2−ジアミノエタン ジクロロ白金(II)
K2PtCl4 104mg(0.25mmol)及びN−(O−(3−マレインイミドベンゾイル)−2−ヒドロキシエチル)−1,2−ジアミノエタン ジヒドロクロリド94.2mg(0.25mmol)を各々5mlの20%テトラヒドロフラン/水に溶解させ、少しずつ混合した。当初赤かったK2PtCl4溶液の脱色が進み;淡黄色の沈殿を生成する。最後の添加の約1時間後、沈殿をG4ガラスフリットを用いて吸引することが可能である。少量の水及び20%テトラヒドロフラン/水、最後にジエチルエーテルで連続的に洗浄される。真空下で乾燥した後、生成物106mg(0.18mmol)が微細結晶物質として得られ、理論可能収量の72%に相当する。
C15H17N3O4PtCl2(569g/mol)の元素分析; 計算値:C:31.63%,H:2.99%,N:7.38%,Pt:34.29,Cl:12.46%; 実測値:C:31.19%,H:3.37%,N:6.79%,Pt:32.35%,Cl:12.95%
工程3:担体タンパク質のチオール化
チオール化の方法は次の実施例により詳細に示される:各々、32mgのヒト血清トランスフェリン(98%結晶,Mr80,000)[又はヒト血清アルブミン28.4mg(98%結晶,Mr66500)]を、アルゴン(c(トランスフェリン/アルブミン)=4.0×10-4M)で脱気された1mlの緩衝液(0.1M ホウ酸ナトリウム,0.001M EDTA,0.15M NaCl−pH=8.0)に溶解させ、新たに製造した100μlの4.0×10-2Mイミノチオラン溶液(脱気された緩衝液(0.1Mホウ酸ナトリウム、0.15M NaCl、0.001M EDTA−pH=8.0)1mlにイミノチオラン5.5mgを溶解したもの)で希釈した。60−70分後、0.05M ホウ酸ナトリウム、0.15M NaCl−pH7.5の展開緩衝液を用いたチオール化トランスフェリン又はアルブミンのゲルろ過(カラム1.0cm×10cm,セファデックスG.25)で、過剰のイミノチオランを分離する。ゲルろ過が完了した後のタンパク質濃度は280nm ∈280=92300M-1cm-1,c[トランスフェリン]=2.4×10-4M)又は∈280=35700M-1cm-1,(c[アルブミン]=2.2×10-4M)で測定し、導入されたHS基の数は、412nm ∈412=13600M-1cm-1)(c[HS基]=7.4×10-4M又は7.7×10-4M)においてエルマン試薬で測定した。c[HS基]/c[トランスフェリン]比は3.1であり、c[HS基]/c[アルブミン]比は3.5であった。下記の表は、異なる数のHS基がトランスフェリン又はアルブミンに導入される反応条件を要約する。
かくして単離されたタンパク質サンプルを工程4における下記の反応に直接用いた。
工程4:チオール化担体タンパク質(工程3)又はポリエチレングリコールに対する細胞増殖抑制性化合物の誘導体(工程2)のカップリング:
方法−複合体製造のためのFPLC:P−500 ポンプ、LCC501 コントローラー(Pharmacia)及びLKB 2151 uv−モニター、緩衝液:標準ホウ酸塩:0.025Mホウ酸ナトリウム、0.15M NaCl−pH7.5又はホスフェート緩衝液:0.004M リン酸ナトリウム、0.15M NaCl−pH7.4。複合体のタンパク質濃度はピアス製(Pierce)(USA)のBCA−Protein−Essayで測定した。
ドキソルビシンの3’−アミノアミド誘導体及びp−マレインイミドフェニル酢酸(アミド 1 )とのトランスフェリン複合体
3.5mlのチオール化トランスフェリンサンプル(3.3個のHS基が導入)を標準ホウ酸塩で30mlに希釈し、DMFにアミド1(Mr742.68)を溶解した溶液1ml(DMF1.0mlに1.8mgを溶解)を添加し、混合した。10分後、アミコン(Amicon)製CENTRIPREP(登録商標)-10 コンセントレーター,FRG(4℃で60分及び4500U/分)で溶液を約2.0mlに濃縮した。この濃縮サンプルをSigma 112遠心機で遠心(5分)し、過剰分をセファデックス(登録商標)G−25Fカラム(カラム1.0cm×10cm)に適用し、複合体を分離した(保持容量:3.5−7.0ml)。結合されたドキソルビシン量は、ドキソルビシンのイプシロン値∈495=10650M-1cm-1で測定した。この測定値から、この波長での対応するトランスフェリンの寄与が除かれ、∈[Tf]495=4100M-1cm-1であった。結合されたドキソルビシンの濃度は322μMであり、トランスフェリンの濃度は101μMであった。
[4−(4−ビス(2−クロロエチル)アミノ−フェニル)]ブタン酸ヒドラジド及び4−アセトフェノン カルボン酸−(N−ヒドロキシスクシンイミド)−エステルのカルボキシヒドラゾン誘導体のアルブミン複合体
リン酸緩衝液5mlの2.2mlに溶解したアルブミン66.5mgを、DMFにカルボキシヒドラゾン誘導体を溶解させた溶液0.1ml(DMF 0.1mlに1.2mgを溶解)を混合し、10分後に遠心し、過剰分をセファデックス(登録商標)G−25Fカラム(カラム1.0cm×10cm)に適用し、複合体を分離した(保持容量:3.7−7.1ml)。結合されたクロラムブシル量は、エプシュタイン(Epstein et al.,Anal,Chem,1955,27,1435-1439)に従うテストに基づいて測定した。この方法では280μMであった。
CH 3 O−PEG−SH 20,000(α−メトキシ−ω−チオ−ポリエチレングリコール)及びN−(O−(3−マレインイミドベンゾイル)−2−ヒドロキシエチル)−1,2−ジアミノエタンジクロロ白金(II)からなるポリエチレングリコール複合体
100mgのCH3O−PEG−SH 20,000(0.005mmol)をリン酸緩衝液5mlに溶解し、DMF250μlに溶解したN−(O−(3−マレインイミドベンゾイル)−2−ヒドロキシエチル)−1,2−ジアミノエタンジクロロ白金(II)5.7mg(0.01mmol)と混合した。20分後、反応混合物を遠心し、過剰分をセファデックス(登録商標)G−25Fカラム(カラム2.0cm×15cm)に適用し、複合体を分離した。結合された白金複合体量は、ゴニアス及びピッツォ(Gonias,S.L.,Pizzo,S.V.J.Biol,Chem.1982,258,5764-5789)に従うテストに基づいて測定した。この方法では380μMであった。
HS−PEG−SH 20,000(α.ω−ビス−チオ−ポリエチレングリコール)及びN’−(2−マレインイミドエチルオキシカルボニル)−5−フルオロウラシルからなるポリエチレングリコール複合体
100mgのHS−PEG−SH 20,000(0.005mmol)をリン酸緩衝液5mlに溶解し、DMF250μlに溶解したN’−(2−マレインイミドエチルオキシカルボニル)−5−フルオロウラシル3.0mg(0.01mmol)とを混合する。30分後、反応混合物を遠心し、過剰分をセファデックス(登録商標)G−25Fカラム(カラム2.0cm×15cm)に適用し、複合体を分離した。結合された5−フルオロウラシル量は、∈260=6520M-1cm-1で測定した。この方法では460μMであった。
ドキソルビシン(アミド 1 )で負荷したアルブミン及びトランスフェリンからなる複合体
ヒト血清アルブミン30mgをアルゴンにより脱気された2.0mlの0.1Mホウ酸ナトリウム、0.001M EDTA,0.15M NaCl−pH=8.0に室温(RT)で溶解した。この混合物に対し、250μlの脱気された0.1Mホウ酸ナトリウム、0.001M EDTA,0.15M NaCl−pH=8.0中に溶解したイミノチオラン2.9mgを溶解した溶液183μlを加え、徹底的に混合し、室温で1時間インキュベートした。その後、過剰のイミノチオランをゲルろ過で分離した。タンパク質濃度および遊離SH基の濃度の測定結果は、次の値で示すとおりである;c[アルブミン]=1.44×10-4mol/l,c[SH基]=1.25×10-3mol/l。アルブミン分子当たりのSH基の平均数は、両者の濃度の商から求めて8.7であった。チオール化アルブミン溶液2.0mlをさらなる反応に用いた。ドキソルビシンの3’−アミノアミド誘導体及びp−マレインイミドフェニル酢酸(アミド1)でタンパク質当たり8.7個のSH基の7個を中和するため、まずタンパク質溶液を標準ホウ酸緩衝液で10mlに希釈した。次いで、振とうしながら、DMF1mlにアミド140mgが溶解した溶液40μlを添加し、室温で10分インキュベートした。その後、サンプルを5分間遠心(3,000g,4℃)した。過剰分は、Centricon3000コンセントレーター(登録商標)(会社:アミコン)を用いて約1mlまでに濃縮した(3,000g,3×15分、4℃)。次いで、ヒト血清トランスフェリン25mgを1.2mlの緩衝液(0.1M ホウ酸ナトリウム、0.001M EDTA,0.15M NaCl−pH=8.0)に溶解し、アルゴンで脱気した。この混合物に対し、脱気した緩衝液(0.1M ホウ酸ナトリウム、0.001M EDTA,0.15M NaCl−pH=8.0)250μlにイミノチオラン2.9mgを溶解した溶液15μlを加え、徹底的に混合し、室温で1時間混合し、インキュベートした。その後、過剰のイミノチオランをゲルろ過で分離した。タンパク質濃度および遊離SH基の測定(エルマンによる試験)の結果は、次の値であった:[トランスフェリン]=1.20×10-4mol/l,[SH基]=1.96×10-4mol/l。トランスフェリン分子当たりのSH基の平均数は両者の濃度の商から求めて1.6であった。
このようにチオール化したトランスフェリン溶液1.9mlを、更なる反応のためにまず標準のホウ酸緩衝液で10mlに希釈した。その後、反応混合物に、DMF 200μl中1,4−ジアミノ−N,N’−ジ−m−マレインイミドベンジル−ブタンを10mg含有する溶液72μlを加えた。室温で10分後、濁った混合物を遠心分離した(5分間、3,000g、4℃)。過剰の溶液を注ぎ捨て、容量が600μlになるまでセントリコン3,000コンセントレーター(登録商標)(Centricon 3,000 concentratorR)中で濃縮した。過剰のビスマレインイミドを除去するために、それをセファデックス25(Sephadex 25)で濾過した。このように修飾されたトランスフェリン溶液1,500μlを、ドキソルビシンを負荷した上記アルブミン溶液500μlに加え、徹底的に混合し、室温で15分間インキュベートした。その後、該溶液を容量が150μlになるまでマイクロコン10コンセントレーター(登録商標)(Microcon 10 concentratorR)(会社:アミコン(Amicon))中で濃縮した。濃縮した蛋白質溶液をゲルクロマトグラフィーに通してその成分(モノマー、ダイマー、オリゴマー)に分離した。カラムの寸法:h:40cm、φ:1cm、ループ:100μl、定常相:スーパーデックス200 ファルマシア(Superdex 200 Pharmacia)、移動相:ホウ酸緩衝液pH6.8;4℃においてN2でガス化、流速:1ml/分、検出:測光,λ=280nm、保持容量:オリゴマー:9.5ml−11.5ml、トリマー:11.7ml−12.6ml、ダイマー:12.7ml−14.4ml、モノマー:14.5ml−18.5ml。
導入されたアミド1に関する所望のダイマーの収率は、20−30%であった。
生物学的研究
in vitro及びin vivoでの複合体の有効性の実施例として、本発明中に開示した複合体の活性−又は毒性プロフィールの代表である、下記ドキソルビシン複合体の生物学的データを示す。複合体の有効性は、”コロニー−形成アッセイ”及び標準的な科学的実施に従う細胞培養中でのBrdU(5−ブロモ−2−デスオキシウリジン)の取り込みを用いて決定した。実施例として、以下のドキソルビシン複合体のIC70値(”コロニー−形成アッセイ”−7種の異種移植片):蛋白質=トランスフェリン(T)又はアルブミン(A)を示す。
これら実験条件下、上記に列挙した合成された複合体は、結合していない細胞増殖抑制性の化合物と、同等又はそれ以上の有効性を示した。対応するポリエチレングリコール複合体は、同等の挙動を示した。
更に、上記記載の複合体は、遊離のドキソルビシンに比して、異種移植可能な裸の(naked)−マウスモデル、乳房癌MDA-MB-435及び乳房癌MCF-7において、遊離のドキソルビシンに比較して、総計で明瞭に毒性減少(致死及び体重減量の減少、胃腸領域におけるより少ない副作用)、及び同等又は改善された腫瘍−抑制効果と共に相対的な腫瘍容量における増加の安定化を示し、これは、表中のトランスフェリン複合体T-DOXO-HYDの実施例中に示されている:
動物:Ncr:nu/nu 雌、腫瘍:乳房癌MCF-7皮下注射
治療:日(d)16、日(d)23静脈注射
投与量は使用可能なドキソルビシンの量を参照する。等モルの投与量(8mg/kg)の場合は、T-DOXO-HYDは、ドキソルビシンと比較して致死及び体重減量の減少において有効性を示した。実験中に使用したもっとも高い投与量(12mg/kg)の場合は、ドキソルビシンでの治療においては、非常に高い致死(各々7動物中5及び7動物中7)を示した。この投与量でのトランスフェリン複合体での治療では、全く致死を認めず、抗腫瘍の有効性は優れていた。
Claims (6)
- 細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド基を有するスペーサ分子とからなる誘導体化された細胞増殖抑制性化合物を、平均1〜30個のHS基を有するチオール化されたトランスフェリンもしくはアルブミン又は少なくとも1個のHSもしくはH2N基を有し、5000及び200000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールと、誘導体化された細胞増殖抑制性化合物の1〜30分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールと結合するように、カップリングすることにより、
又は、細胞増殖抑制性化合物とN−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するスペーサ分子とからなる誘導体化された細胞増殖抑制性化合物を、平均1〜30個のHS基を有するチオール化されたトランスフェリンもしくはアルブミン又は少なくとも1個のHOもしくはH2N基を有し、5000及び200000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールと、誘導体化された細胞増殖抑制性化合物の1〜30分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールの1つの分子と結合するように、カップリングすることにより得ることができるか、
或いは、チオール化アルブミンを、細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド基を有するスペーサ分子とからなる2〜30当量の誘導体化された細胞増殖抑制性化合物と付加し、ビスマレインイミド化合物を介して、トランスフェリン又は腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と複合化させることにより得ることができる、トランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体。 - アントラサイクリン類、ナイトロジェンマスタードガス誘導体、プリンもしくはピリミジンアンタゴニスト、葉酸アンタゴニスト、タキソイド類、カンプトテシン類、ポドフィロトキシン誘導体、ビンカアルカロイド又はシス−配位白金(II)−錯体の各々の群からの細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド基を有するスペーサ分子とからなる誘導体化された細胞増殖抑制牲化合物を、平均1〜30個のHS基を有するチオール化されたトランスフェリンもしくはアルブミン又は少なくとも1個のHSもしくはH2N基を有し、5,000及び200,000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールと、誘導体化された細胞増殖抑制性化合物の1〜30分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールの1つの分子と結合するように、カップリングすることにより、
又は、アントラサイクリン類、ナイトロジェンマスタードガス誘導体、プリンもしくはピリミジンアンタゴニスト、葉酸アンタゴニスト、タキソイド類、カンプトテシン類、ポドフィロトキシン誘導体、ビンカアルカロイド又はシス−配位白金(II)−錯体の群からの細胞増殖抑制性化合物とN−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するスペーサ分子とからなる誘導体化された細胞増殖抑制性化合物を、平均1〜30個のHS基を有するチオール化トランスフェリンもしくはアルブミン又は少なくとも1個のHOもしくはH2N基を有し、5,000及び200,000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールと、誘導体化された細胞増殖抑制性化合物の1〜30分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールと結合するように、カップリングすることにより、
或いは、チオール化アルブミンを、アントラサイクリン類、ナイトロジェンマスタードガス誘導体、プリンもしくはピリミジンアンタゴニスト、葉酸アンタゴニスト、タキソイド類、カンプトテシン類、ポドフィロトキシン誘導体、ビンカアルカロイド又はシス−配位白金(II)−錯体の各々の群からの細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド基を有するスペーサ分子とからなる2〜30当量の誘導体化された細胞増殖抑制性化合物に付加し、ビスマレインイミド化合物を介して、トランスフェリン又は腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と複合化させることにより得ることができる、請求項1に記載のトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体。 - a)ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサンドロン、クロラムブシル、メルファラン、5−フルオロウラシル、5’−デスオキシ−5−フルオロウリジン、チオグアニン、メトトレキセート、パクリタクセル(paclitaxel)、ドセタクセル(docetaxel)、トポテカン(topotecane)、9−アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド(teniposide)、ミトポドシド(mitopodoside)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンオレルビン(vinorelbine)又は一般式I,II,IIIもしくはIVの化合物
[式中、nは0〜6、Xは−NH2、−OH、−COOH、−O−CO−R−COR*、−NH−CO−R−COR*を示す。Rは1〜6の炭素原子を有する脂肪族炭素鎖又は置換もしくは非置換のフェニレン基を示す。R*はH、フェニル、1〜6の炭素原子を有するアルキルを示す。アミン官能基は、tert−ブチルオキシカルボニル保護基等の保護基を有している。]で表される化合物を、
一般式V,VIもしくはVII
[式中、Rが1〜6の炭素原子を有する脂肪族炭素鎖を示す場合、Yは−OH、−COOH、−COCl、−CONH−(CH2)n−OH、−COO−(CH2)n−NH2、−COO−(CH2)n−NHNH2、−SO3H、−SO3Cl、−SO2−NHNH2、−O−COCl、−CHO、COR*を示す。nは1〜6、R*はH、フェニル、1〜6の炭素原子を有するアルキルである。Rが置換もしくは非置換のベンジル基又は置換もしくは非置換のフェニレン基を示す場合、Yは−OH、−COOH、−COCl、−CONH−(CH2)n−OH、−COO−(CH2)n−NH2、−COO−(CH2)n−NHNH2、−SO3H、−SO3Cl、−SO2−NHNH2、−O−COCl、−CHO、COR*、−CO−NHNH2を示す。nは1〜6、R*はH、フェニル、1〜6の炭素原予を有するアルキルである。]で表されるマレインイミド化合物と反応させることにより、
又は一般式VIII,IXもしくはX
[式中、Rは置換もしくは非置換のフェニレン基を示す。Yは−OH、−NH2、−NHNH2、−COOH、−COCl、−COO−(CH2)n−OH、−CONH−(CH2)n−NH2、−COO−(CH2)n−NHNH2、−SO3H、−SO3Cl、−SO2−NHNH2、−O−COCl、−CHO、COR*、−CO−NHNH2を示す。nは1〜6、R*はH、フェニル、1〜6の炭素原子を有するアルキルである。]
で表されるN−ヒドロキシスクインイミド化合物と反応させることにより得ることができ、
上記一般式I,II又はIIIの化合物から得られる誘導体においては、保護基を除去し、斯くして得られるアミンをテトラクロロプラチネート塩と反応させて対応するシス−配位白金(II)−錯体を得、上記一般式IVの化合物から得られる誘導体を、シス−[PtA2B](A=ハロゲン、B=(NH3)2、エチレンジアミン、プロパンジアミン、1,2−ジアミノシクロヘキサン)と反応させて対応する白金(II)−錯体を得、その結果、細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド化合物もしくはN−ヒドロキシスクシンイミド化合物との間の化学結合は、それぞれアミド、エステル、イミン、ヒドラゾン、カルボキシルヒドラゾン、オキシカルボニル、アセタール又はケタール結合を通じて生ずる細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体又はN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体が供給され、及びb)斯くして得られるマレインイミド誘導体は、平均1〜30個のHS基を有するチオール化されたトランスフェリンもしくはアルブミンに、又は少なくとも1個のHSもしくはH2N基を有し、5,000及び200,000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールに、工程a)で得られるマレインイミド誘導体の1〜30分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールの1分子に結合するようにカップリングされ、又は、斯くして得られるN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体は、トランスフェリン又はアルブミンに、又は少なくとも1個のHOもしくはH2N基を有し、5,000及び200,000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールに、工程a)で得られるN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の1〜30分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールの1分子に結合するようにカップリングされ、又は、チオール化アルブミンを、工程a)で得られるマレインイミド誘導体の2〜30当量に付加し、一般式XI
[Zは−CO−NH−(CH2)n−NH−CO−、−CO−O−(CH2)n−O−CO−、−C=NH−(CH2)n−NH=C−、−C=N−NH−(CH2)n−NH−N=C、−C=N−NH−CO−(CH2)n−CO−NH−N=C−を示す。nは2〜12を示す。]
で表されるビスマレインイミド化合物を介して、トランスフェリン又は腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と複合体化させることにより得ることができる請求項1又は2に記載のトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体。 - a)ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサンドロン、クロラムブシル、メルファラン、5−フルオロウラシル、5’−デスオキシ−5−フルオロウリジン、チオグアニン、メトトレキセート、パクリタクセル、ドセタクセル、トポテカン、9−アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド、ミトポドシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンまたは一般式I、II、III若しくはIV
[式中、n=0-6、X=-NH2,-OH,-COOH,-O-CO-R-COR*,-NH-CO-R-COR*、Rは1-6の炭素原子を有する脂肪族炭素鎖または置換或いは非置換のフェニレン基であり、R*はH、フェニル、1-6の炭素原子を有するアルキルであり、アミン基はtert-ブトキシカルボニル保護基のような保護基を有している。]の化合物を、一般式V、VIまたはVII
[式中、Rが1-6の炭素原子を有する脂肪族炭素鎖の場合には、Y=-OH,-COOH,-COCl,-CONH-(CH2)n-OH,-COO-(CH2)n-NH2,-COO-(CH2)n-NHNH2,-SO3H,-SO3Cl,-SO2-NHNH2,-O-COCl,-CHO,-COR*である場合n=1-6、R*=H、フェニル、1-6の炭素原子を有するアルキルである。また、Rが置換若しくは非置換のベンジル基または置換若しくは非置換のフェニレン基の場合には、Y=-OH,-C00H,-COCl,-CONH-(CH2)n-OH,-COO-(CH2)n-NH2,-COO-(CH2)n-NHNH2,-SO3H,-SO3Cl,-SO2-NHNH2,-O-COCl,-CHO,-COR*においてn=1-6であって、R*=H、フェニル、1-6の炭素原子を有するアルキルである。]のマレインイミド化合物と反応させるか、または、一般式VIII,IX若しくはX
[式中、Rは置換されたまたは非置換のフェニレン基、Y=-OH,-NH2,-NHNH2,-COOH,-COCl,-COO-(CH2)n-OH,-CONH-(CH2)n-NH2,-COO-(CH2)n-NHNH2,-SO3H,-SO3Cl,-SO2-NHNH2,-O-COCl,-CHO,-COR*,-CO-NHNH2においてn=1-6であって、R*=H、フェニル、1-6の炭素原子を有するアルキルである。]
で表されるN-ヒドロキシスクシンイミド化合物とを反応させ、
上記一般式I、IIまたはIIIの化合物から得られる誘導体においては、保護基を除去し、さらに、この様にして得られるアミンを、テトラクロロ白金塩と反応させて、対応するcis-配位の白金(II)錯体を得、また
上記一般式IVの化合物から得られる誘導体を、cis-[PtA2B](A=ハロゲン、B=(NH3)2,エチレンジアミン、プロパンジアミン、1,2-ジアミノシクロヘキサン)と反応させて、対応する白金(II)錯体を得、その結果、細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体またはN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体が供給され、化学的結合が、アミド、エステル、イミン、ヒドラゾン、カルボキシルヒドラゾン、オキシカルボニル、アセタールまたはケタール結合を通じて、細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド化合物またはN-ヒドロキシスクシンイミド化合物との間に生じ、さらに
b)この様にして得られるマレインイミド誘導体を、平均1〜30個のHS基を有するチオール化されたトランスフェリン若しくはアルブミン、または少なくとも1個のHS若しくはH2N基を有し、且つ5,000〜200,000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールと、工程a)において得られるマレインイミド誘導体の1〜30分子が、トランスフェリン、アルブミンまたはポリエチレングリコールの1分子に結合されるようにカップリングされ、または、この様にして得られるN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体を、トランスフェリンもしくはアルブミンまたは少なくとも1個のHOまたはH2N基を有し、且つ5,000と200,000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールと、工程a)において得られるN-ヒドロキシスクシンイミド誘導体の1〜30分子が、トランスフェリン、アルブミンまたはポリエチレングリコールの1分子と結合されるように、カップリングされ、または、チオール化されたアルブミンを、工程a)において得られるマレインイミド誘導体の2〜30当量に付加し、トランスフェリンまたは一般式XI
[式中、Z=-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-,-CO-O-(CH2)n-O-CO-,-C=NH-(CH2)n-NH=C-,-C=N-NH-(CH2)n-NH-N=C-,-C=N-NH-CO-(CH2)n-CO-NH-N=C-,n=2-12]のビスマレインイミド化合物を介して、腫瘍関連抗原に対しするモノクロナール抗体と複合体化されることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体の製造方法。 - 必要に応じて通常の担体および補助剤と一緒に、請求項1から3のいずれかに記載の化合物を含む薬学的組成物。
- ガン疾患の処置のための請求項1から3のいずれかに記載のトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体を含む薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19636889.8 | 1996-09-11 | ||
DE19636889A DE19636889A1 (de) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel |
PCT/DE1997/002000 WO1998010794A2 (de) | 1996-09-11 | 1997-09-09 | Antineoplastisch wirkende transferrin-, albumin- und polyethylenglykolkonjugate |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001500133A JP2001500133A (ja) | 2001-01-09 |
JP4573916B2 true JP4573916B2 (ja) | 2010-11-04 |
Family
ID=7805245
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP51314498A Expired - Lifetime JP4573916B2 (ja) | 1996-09-11 | 1997-09-09 | トランスフェリン、アルブミン及びポリエチレングリコールの抗腫瘍性の複合体 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6310039B1 (ja) |
EP (2) | EP1447099B1 (ja) |
JP (1) | JP4573916B2 (ja) |
AT (2) | ATE383173T1 (ja) |
AU (1) | AU4548997A (ja) |
CA (1) | CA2265861A1 (ja) |
DE (3) | DE19636889A1 (ja) |
WO (1) | WO1998010794A2 (ja) |
Families Citing this family (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19636889A1 (de) * | 1996-09-11 | 1998-03-12 | Felix Dr Kratz | Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel |
DE19926154A1 (de) * | 1999-06-09 | 2000-12-14 | Ktb Tumorforschungs Gmbh | Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren Arzneimittelzubereitung |
DE19926475A1 (de) * | 1999-06-10 | 2000-12-14 | Ktb Tumorforschungs Gmbh | Träger-Pharmaka-Konjugate |
EP1889639A3 (en) * | 1999-09-07 | 2008-04-09 | ConjuChem Biotechnologies Inc. | Methods and compositions containing succinimide or maleimide derivatives of antineoplastic agents, for producing long lasting antineoplastic agents |
US6706892B1 (en) | 1999-09-07 | 2004-03-16 | Conjuchem, Inc. | Pulmonary delivery for bioconjugation |
CA2383794A1 (en) * | 1999-09-07 | 2001-03-15 | Conjuchem Inc. | Methods and compositions containing succinimide or maleimide derivatives of antineoplastic agents |
US6713454B1 (en) * | 1999-09-13 | 2004-03-30 | Nobex Corporation | Prodrugs of etoposide and etoposide analogs |
DE19955582B4 (de) * | 1999-11-18 | 2004-07-22 | Jandratek Gmbh | Gegenstand mit einer ungeladenen, funktionalisierten Oberfläche umfassend ein Hydrogel, Verfahren zur Herstellung und Verwendung des Gegenstandes sowie Verbindungen zur Herstellung der Oberfläche |
DE19957688A1 (de) * | 1999-11-30 | 2001-06-13 | Deutsches Krebsforsch | Konjugate von cis-Platin(II)-Derivaten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
DE10012120A1 (de) * | 2000-03-13 | 2001-09-27 | Ktb Tumorforschungs Gmbh | Therapeutische und diagnostische Ligandensysteme mit Transportmolekülbindenden Eigenschaften und diese enthaltende Arzneimittel |
JP2004528309A (ja) * | 2001-03-23 | 2004-09-16 | ナプロ バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 癌治療用分子複合体 |
PL367244A1 (en) | 2001-05-15 | 2005-02-21 | Faulk Pharmaceuticals, Inc. | Targeted delivery of drugs for the treatment of viral infections |
WO2002094271A1 (en) * | 2001-05-15 | 2002-11-28 | Faulk Pharmaceuticals, Inc. | Targeted delivery of bioaffecting compounds for the treatment of cancer |
PL373511A1 (en) * | 2001-05-15 | 2005-09-05 | Faulk Pharmaceuticals, Inc. | Substantially homogeneous bio-affecting material having a pre-determined ratio of bioaffecting component to cell targeting component, the method for making such a material and the method of its use |
AU2003226166A1 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-20 | Enzon, Inc. | Polymeric acyl derivatives of indoles |
US6890558B2 (en) * | 2002-05-31 | 2005-05-10 | R.P. Scherer Technologies, Inc. | Oral pharmaceutical composition for soft capsules containing vinorelbine and method of treatment |
EP1539799B1 (en) * | 2002-06-21 | 2013-12-11 | The University of Utah Research Foundation | Crosslinked compounds and methods of making and using thereof |
PT1585548T (pt) * | 2002-12-09 | 2018-10-17 | Abraxis Bioscience Llc | Composições e métodos de administração de agentes farmacológicos |
CN103405405A (zh) | 2002-12-09 | 2013-11-27 | 阿布拉西斯生物科学有限责任公司 | 组合物和传递药剂的方法 |
CA2516056C (en) * | 2003-01-06 | 2012-05-29 | Angiochem Inc. | Aprotinin and analogs as carriers across the blood-brain barrier |
KR100499340B1 (ko) * | 2003-04-29 | 2005-07-04 | 학교법인 이화학당 | 암 조직 선택성과 생분해성을 갖는폴리포스파젠-백금(ⅱ)착물 복합체 항암제 및 그 제조방법 |
US20060216767A1 (en) * | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Saladax Biomedical Inc. | Docetaxel immunoassay |
DE102005021846A1 (de) * | 2005-05-11 | 2006-11-16 | Albupharm Heidelberg Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur Herstellung von Albumin-Konjugaten mit einem Röntgenkontrastmittel als Wirkstoff |
WO2006135740A1 (en) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Pegylated hemoglobin and albumin and uses thereof |
CZ2005558A3 (cs) * | 2005-09-05 | 2007-04-04 | Zentiva, A. S. | Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva |
EP2792670A1 (en) * | 2006-10-03 | 2014-10-22 | Techfields Biochem Co. Ltd | Positively charged water-soluble prodrugs of mustards and related compounds with very high skin penetration rates |
FR2909881A1 (fr) * | 2006-12-14 | 2008-06-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux conjugues, utilisables a des fins therapeutiques, et/ou a titre d'agent de diagnostic et/ou d'imagerie et leur procede de preparation |
CA2687291A1 (en) | 2007-05-16 | 2008-11-20 | Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh | Low-viscous anthracycline formulation |
CN101657462B (zh) * | 2007-05-25 | 2013-06-05 | 上海特化医药科技有限公司 | 卡培他滨的制备方法及其中间体 |
US9365634B2 (en) * | 2007-05-29 | 2016-06-14 | Angiochem Inc. | Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues |
EP2279008B1 (en) | 2008-04-18 | 2019-03-06 | Angiochem Inc. | Pharmaceutical compositions of paclitaxel, paclitaxel analogs or paclitaxel conjugates and related methods of preparation and use |
DE102008047128A1 (de) | 2008-09-15 | 2010-04-15 | Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main | Verwendung von cis-Imidazolinen, insbesondere Nutlinen, zur Behandlung von chemoresistenten Krebserkrankungen |
BRPI0920209A2 (pt) | 2008-10-15 | 2015-12-22 | Angiochem Inc | conjugados de agonistas de glp-1 e usos dos mesmos |
WO2010043049A1 (en) | 2008-10-15 | 2010-04-22 | Angiochem Inc. | Etoposide and doxorubicin conjugates for drug delivery |
MX2011005963A (es) | 2008-12-05 | 2011-09-01 | Angiochem Inc | Conjugados de neurotensina o analogos de neurotensina y sus usos. |
JP2012512185A (ja) | 2008-12-17 | 2012-05-31 | アンジオケム インコーポレーテッド | 膜1型マトリックス金属タンパク質阻害剤およびその使用 |
KR20110126644A (ko) * | 2009-01-31 | 2011-11-23 | 아이쥐에프 온콜로지, 엘엘씨 | 항암 단백질-백금 결합체 |
MX2011011023A (es) | 2009-04-20 | 2012-01-20 | Angiochem Inc | Tratamiento de cancer de ovarios usando un agente anti-cancer conjugado con un analogo de angiopep-2. |
US8524784B2 (en) * | 2009-04-30 | 2013-09-03 | Intezyne Technologies, Incorporated | Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer |
WO2010127271A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Intezyne Technologies, Incorporated | Polymer micelles containing anthracylines for the treatment of cancer |
CN102596993A (zh) | 2009-07-02 | 2012-07-18 | 安吉奥开米公司 | 多聚体肽结合物以及其应用 |
KR101095396B1 (ko) | 2009-09-17 | 2011-12-16 | 성균관대학교산학협력단 | 암 표적지향형 트랜스페린-폴리에틸렌 글리콜이 수식된 트레일, 이의 제조 및 용도 |
US9333189B2 (en) * | 2010-02-03 | 2016-05-10 | Oncbiomune, Inc. | Taxane- and taxoid-protein compositions |
AR077384A1 (es) | 2010-07-05 | 2011-08-24 | Eriochem Sa | Una formulacion farmaceutica inyectable de melfalano. |
WO2012083197A1 (en) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Nektar Therapeutics | Water-soluble polymer conjugates of topotecan |
WO2013010045A1 (en) | 2011-07-12 | 2013-01-17 | Biotime Inc. | Novel methods and formulations for orthopedic cell therapy |
CN103304465B (zh) * | 2012-03-14 | 2016-01-13 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种n-烷基磺酸基马来酰亚胺单体及其制备方法和应用 |
CN103044677A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-04-17 | 上海景宇生物科技有限公司 | 一种异端基遥爪聚乙二醇及其制备方法 |
WO2014141094A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Adamed Sp. Z O.O. | Anticancer conjugate |
FI20130341L (fi) | 2013-11-19 | 2015-05-20 | Safemed Ltd Oy | Huonosti vesiliukoisten lääkeaineiden kuljetus metalli-ioneilla tasapainotetun alfafetoproteiinin mukana |
JP6823055B2 (ja) | 2015-06-15 | 2021-01-27 | アンジオケム インコーポレーテッド | 軟髄膜癌腫症の治療方法 |
WO2017026276A1 (ja) * | 2015-08-07 | 2017-02-16 | 国立大学法人東京工業大学 | ホウ素含有化合物とタンパク質とのコンジュゲートを含む医薬組成物 |
HUE056897T2 (hu) | 2015-12-09 | 2022-03-28 | Univ Wien Med | Monomaleimid-funkcionalizált platinavegyületek rákterápiához |
GB2551979A (en) | 2016-06-30 | 2018-01-10 | Rs Arastirma Egitim Danismanlik Llac Sanayi Ticaret Ltd | Cleavable polymer drug conjugates |
DE102016125666A1 (de) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Michael Denck | HSA-Galenik |
CN110054580A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-07-26 | 苏州百灵威超精细材料有限公司 | 4-(4-n-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼盐酸盐的制备方法 |
CN111138435A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-05-12 | 宜昌博仁凯润药业有限公司 | 一种修饰过的甲氨蝶呤及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59116229A (ja) * | 1982-12-24 | 1984-07-05 | Teijin Ltd | 細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用剤およびその製造法 |
JPS611622A (ja) * | 1984-06-14 | 1986-01-07 | Teijin Ltd | 細胞毒性複合体及びその製造法 |
FR2566271B1 (fr) * | 1984-06-20 | 1986-11-07 | Sanofi Sa | Nouveaux conjugues cytotoxiques utilisables en therapeutique et procede d'obtention |
EP0232693A3 (fr) * | 1985-12-16 | 1988-04-06 | La Region Wallonne | Conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques les contenant |
LU86212A1 (fr) * | 1985-12-16 | 1987-07-24 | Omnichem Sa | Nouveaux conjugues de la vinblastine et de ses derives,procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant |
IN165717B (ja) * | 1986-08-07 | 1989-12-23 | Battelle Memorial Institute | |
US4981979A (en) * | 1987-09-10 | 1991-01-01 | Neorx Corporation | Immunoconjugates joined by thioether bonds having reduced toxicity and improved selectivity |
US5208021A (en) * | 1987-10-05 | 1993-05-04 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Method of preparing diphtheria immunotoxins |
US5135736A (en) | 1988-08-15 | 1992-08-04 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
US5705363A (en) * | 1989-03-02 | 1998-01-06 | The Women's Research Institute | Recombinant production of human interferon τ polypeptides and nucleic acids |
PT93772A (pt) | 1989-04-17 | 1991-01-08 | Searle & Co | Processo para a preparacao de composicoes para o tratamento de neoplasias, contendo um agente anti-neoplastico, por exemplo doxorubicina e um agente protector para reduzir os efeitos secundarios, por exemplo carbetimer |
CA2021942C (en) | 1989-08-10 | 2001-04-10 | Michel Page | Coupling of an anti-tumor to an antibody using glutaraldehyde preactivated anti-tumor agent |
DK608589D0 (da) * | 1989-12-01 | 1989-12-01 | Holm Arne | Kemisk fremgangsmaade |
EP0452179B1 (en) * | 1990-03-28 | 1996-06-12 | Nippon Oil And Fats Company, Limited | Polymer-combined drug for gastric treatment and a method for producing the drug |
JP2626654B2 (ja) * | 1990-03-31 | 1997-07-02 | 科学技術振興事業団 | 標的指向性高分子医薬化合物及びその中間体 |
GB9017024D0 (en) * | 1990-08-03 | 1990-09-19 | Erba Carlo Spa | New linker for bioactive agents |
FI101678B (fi) | 1990-12-31 | 1998-08-14 | Akzo Nv | Happolabiileja kytkentämolekyylejä |
JP3693671B2 (ja) * | 1991-03-15 | 2005-09-07 | アムゲン インコーポレーテッド | ポリペプチドのpeg化 |
DE4122210C2 (de) * | 1991-07-04 | 1999-04-01 | Deutsches Krebsforsch | Konjugate aus tumoraktiver Verbindung und Serumalbumin sowie Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung |
US5622929A (en) * | 1992-01-23 | 1997-04-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Thioether conjugates |
US5294536A (en) * | 1992-04-23 | 1994-03-15 | Pb Diagnostic Systems, Inc. | Conjugates |
US5880131A (en) * | 1993-10-20 | 1999-03-09 | Enzon, Inc. | High molecular weight polymer-based prodrugs |
US5439798A (en) * | 1993-12-17 | 1995-08-08 | Boehringer Mannheim Corporation | Maleimide adduct conjugates of procainamide and NAPA |
AU1140495A (en) | 1994-01-27 | 1995-08-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Method for preparing thioether conjugates |
WO1996039183A1 (en) | 1995-05-31 | 1996-12-12 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for targeted delivery of effector molecules |
JPH08325270A (ja) * | 1995-05-31 | 1996-12-10 | Bristol Myers Squibb Co | β−ラクタマーゼに対するポリマープロドラッグおよびその使用 |
US6218519B1 (en) | 1996-04-12 | 2001-04-17 | Pro-Neuron, Inc. | Compounds and methods for the selective treatment of cancer and bacterial infections |
DE19636889A1 (de) * | 1996-09-11 | 1998-03-12 | Felix Dr Kratz | Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel |
WO1998013059A1 (en) | 1996-09-27 | 1998-04-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Hydrolyzable prodrugs for delivery of anticancer drugs to metastatic cells |
-
1996
- 1996-09-11 DE DE19636889A patent/DE19636889A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-09-09 US US09/254,598 patent/US6310039B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 WO PCT/DE1997/002000 patent/WO1998010794A2/de active IP Right Grant
- 1997-09-09 JP JP51314498A patent/JP4573916B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 AT AT04012346T patent/ATE383173T1/de active
- 1997-09-09 EP EP04012346A patent/EP1447099B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 EP EP97943750A patent/EP0934081B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 DE DE59711710T patent/DE59711710D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 CA CA002265861A patent/CA2265861A1/en not_active Abandoned
- 1997-09-09 AT AT97943750T patent/ATE268608T1/de active
- 1997-09-09 AU AU45489/97A patent/AU4548997A/en not_active Abandoned
- 1997-09-09 DE DE59712911T patent/DE59712911D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-08-20 US US09/931,940 patent/US6709679B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1998010794A3 (de) | 1998-08-06 |
EP1447099A2 (de) | 2004-08-18 |
JP2001500133A (ja) | 2001-01-09 |
EP0934081B1 (de) | 2004-06-09 |
EP1447099A3 (de) | 2005-02-09 |
EP0934081A2 (de) | 1999-08-11 |
US20020019343A1 (en) | 2002-02-14 |
AU4548997A (en) | 1998-04-02 |
EP1447099B1 (de) | 2008-01-09 |
ATE383173T1 (de) | 2008-01-15 |
ATE268608T1 (de) | 2004-06-15 |
US6709679B2 (en) | 2004-03-23 |
CA2265861A1 (en) | 1998-03-19 |
WO1998010794A2 (de) | 1998-03-19 |
DE19636889A1 (de) | 1998-03-12 |
US6310039B1 (en) | 2001-10-30 |
DE59712911D1 (de) | 2008-02-21 |
DE59711710D1 (de) | 2004-07-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4573916B2 (ja) | トランスフェリン、アルブミン及びポリエチレングリコールの抗腫瘍性の複合体 | |
AU2006270566B2 (en) | Method of conjugating therapeutic compounds to cell targeting moieties via metal complexes | |
US6291671B1 (en) | Process for producing drug complexes | |
US6835807B1 (en) | Drug complex and drug delivery system | |
JP6856725B2 (ja) | 細胞内ターゲッティングのための硫酸化デンドリマーを有する治療複合体 | |
US5106951A (en) | Antibody conjugates | |
US6838450B2 (en) | Drug complex | |
US20200345863A1 (en) | Ligand-drug-conjugate comprising a single molecular weight polysarcosine | |
ITMI960458A1 (it) | Polichelanti, loro complessi con ioni metallici, loro preparazione e loro usi | |
US20040192644A1 (en) | DDS compound and method for measurement thereof | |
JP5866301B2 (ja) | 増殖及びタンパク質合成の細胞内ターゲッティングのためのポリアニオン性多価高分子 | |
KR20120101981A (ko) | 신규 접합체, 그의 제조법, 및 그의 치료 용도 | |
EP3072910A1 (en) | Derivative of styrene-maleic acid copolymer | |
US20030103934A1 (en) | Drugs having long-term retention in target tissue | |
JPH0912605A (ja) | シクロデキストリン誘導体、その調製方法、および疎水性分子を有機界面活性システムに組み入れるためのシクロデキストリン誘導体の使用 | |
KR100562895B1 (ko) | 약물의 간세포 표적화를 위한 생물학적 활성 고분자 결합체 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040906 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080408 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080704 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080811 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080924 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090908 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091201 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100118 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100406 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100409 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100720 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100818 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130827 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |