DE69520561T2

DE69520561T2 - Phenylborsaurekomplexe

Info

Publication number: DE69520561T2
Application number: DE69520561T
Authority: DE
Inventors: L. Stolowitz
Original assignee: Prolinx Inc
Current assignee: Cambrex Bio Science Rockland Inc
Priority date: 1994-01-28
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2001-09-13
Anticipated expiration: 2015-01-28
Also published as: DK0741734T3; AU702017B2; JPH09508389A; PL315911A1; ATE200292T1; AU1732495A; CA2181252A1; ES2158085T3; SK98996A3; EP0741734A1; CZ220196A3; DE69520561D1; WO1995020591A1; PT741734E; EP0741734B1; GR3036119T3; RU2202555C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biokonjugatherstellung und insbesondere eine Klasse an Phenylborsäurekomplexen, die zur Konjugation der biologischen Makromoleküle brauchbar sind, und ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Komplexe.
Biokonjugation ist ein beschreibender Ausdruck für die Verbindung von zwei oder mehr unterschiedlichen molekularen Einheiten durch chemische oder biologische Mittel, worin zumindest eine der molekularen Einheiten ein biologisches Makromolekül ist. Dies umfaßt die Konjugation von Proteinen, Peptiden, Polysacchariden, Lektinen, Hormonen, Nukleinsäuren, Liposomen und Zellen miteinander oder mit einer anderen Moleküleinheit, die brauchbare Eigenschaften hinzufügt, einschließlich Radionuklide, Toxine, Haptene, Inhibitoren, Fluorophore, Liganden usw. Die Immobilisierung von biologischen Makromolekülen wird auch als spezieller Fall einer Biokonjugation betrachtet, worin das Makromolekül, entweder reversibel oder irreversibel, an einen unlöslichen Träger konjugiert wird. Die Biokonjugation wird in der biochemischen, immunochemischen und molekularbiologischen Forschung ausgiebig verwendet. Die Anwendungen der Biokonjugation sind vielfältig und umfassen Affinitätschromatographie, Affinitätscytochemie, Histochemie, pathologische Sondendetektion, Diagnose, Signalamplifizierung, Immungssay, Hybridomtechnologie, Blottingtechnologie, Bioaffmitätssensoren, Gensondendetektion, quervernetzende Reagenzien, Affinitätszierfindung, Affinitätspertubation, Arzneimittelabgabe, fusogene Reagenzien, immobilisierende Reagenzien, selektives Auffinden, selektive Eliminierung, Flußcytometrie und cytologische Sondendetektion. Die Systeme des Stands der Technik zur Herstellung von Biokonjugaten sind unter anderem Avidin-Biotin- und Digoxigenin-anti-Digoxigeninsysteme.
Von Phenylborsäuren ist bekannt, daß sie mit einer großen Vielzahl an polaren Molekülen wechselwirken, die die erforderlichen Funktionalitäten aufweisen. Von Komplexen mit unterschiedlicher Stabilität, die 1,2-Diole, 1,3-Diole, 1,2-Hydroxysäuren, 1,3-Hydroxysäuren, 1,2-Hydroxylamine, 1,3-Hydroxylamine, 1,2-Diketone und 1,3- Diketone umfassen, ist bekannt, daß sie mit entweder neutraler Phenylborsäure oder mit dem Phenylboratanion gebildet werden. Immobilisierte Phenylborsäure kann wie in der Chromatographie zur selektiven Retention von biologischen Materialien, die die erforderlichen Funktionalitäten aufweisen, aus komplexen Proben verwendet werden. Viele wichtige biologische Moleküle, einschließlich Kohlenhydrate, Katecholamine, Prostaglandine, Ribonukleoside und Steroide enthalten die erforderlichen Funktionalitäten und können daher auf diese Weise isoliert werden.
Die US 4 496 722 A beschreibt Zusammensetzungen, die eine organische Borsäure und eine oder mehrere Reportergruppen enthalten. Es findet sich keine Beschreibung eines Phenylborsäurerests, der an einen komplexierenden Phenylborsäurerest gebunden ist, wie dies in der vorliegenden Erfindung beansprucht ist.
Die Phenylborsäure ist, wie die Borsäure, eine Lewissäure und ionisiert nicht durch direkte Deprotonierung, sondern durch Hydratation unter Bildung des tetraedrischen Phenylboratanions (pK3 = 8,86). Phenylborsäure ist eine dreimal stärkere Säure als Borsäure. Die Ionisierung der Phenylborsäure ist ein wichtiger Faktor in der Komplexierung, da bei der Ionisierung Bor von der trigonalen Koodination (mit mittleren Bindungswinkeln von 120º und mittleren Bindungslängen von 1,37 Å) zum tetraedrisch koordinierten Anion (mittlere Bindungswinkel von 109º und mittlere Bindungslängen von 1,48 Å) wechselt. Die Entwicklung von Systemen, die Phenylborsäuren mit pKa Werten unter dem von (3-Aminophenyl)borsäure (pKa 8,75) (das verbreitetste im Handel erhältliche Derivat) aufweisen wäre erwünscht, da es die Retention einer Vielzahl von Biomolekülen unter physiologischen Bedingungen (pH 7,2) ermöglichen würde und hierbei die Breite der zur Analyse durch das Verfahren geeigneten Verbindungen erweitern würde. Repräsentative Phenylborsäuren mit einem niedrigeren pKa als (3-Aminophenyl)borsäure umfassen die folgenden:
Von Verbindungen mit cis oder koaxialen 1,2-Diol- und 1,3-Diolfunktionalitäten und insbesondere von Kohlenhydraten ist derzeit bekannt, daß sie mit dem immobilisierten Phenylboratanion unter Bildung von cyclischen Estern nur unter alkalischen wäßrigen Bedingungen komplexieren. Von der Ansäuerung der 1,2-Diol- und 1,3- Diolkomplexe ist bekannt, daß sie die Diol-enthaltende Einheit freisetzt, vermutlich durch die Hydrolyse des cyclischen Esters, die durch den Ringstamm induziert wird, in Assoziation mit einem fünfgliedrigen cyclischen Borsäureester, wobei das trigonal koordinierte Bor beteiligt ist. Von coplanaren aromatischen 1,3-Diolen, wie 1,8- Dihydroxynaphthalin, ist bekannt, daß sie aufgrund ihrer hydrolytischen Stabilität der sechsgliedrigen cyclischen Borsäureester sogar unter sauren Bedingungen komplexieren. Von substituierten Phenolen, die angehängte 1,3- Hydroxylamid-, 1,3-Hydroxyamidin- und 1,3-Hydroxyoximreste aufweisen, ist bekannt, daß sie unter alkalischen wäßrigen Bedingungen reversibel mit Boratpuffer auf eine analoge Weise zu der komplexieren, die von der Komplexierung der Phenylborsäuren bekannt ist.
Trotz des wesentlichen Forschungsaufwands in die Biokonjugation und der beträchtlichen Investitionsmenge in diesem Feld wurde die Selektivität der Phenylborsäure hierfür nicht ausgenutzt, um die Konjugation von biologischen Makromolekülen miteinander oder mit anderen molekularen Einheiten zu ermöglichen, die brauchbare Eigenschaften hinzufügen. Darüberhinaus ist die Verwendung von immobilisierten komplexierenden Resten neu die selektiv mit Phenylborsäureresten komplexieren können. Diese Verwendung ist von besonderem Interesse, wenn beispielsweise der Phenylborsäurerest an ein biologisches Makromolekül, wie einen Antikörper, gebunden ist, der dann an den komplexierenden Rest durch Ausnutzung der Selektivität des Phenylborsäurerests für den komplexierenden Rest gebunden werden kann.
Wie hierin verwendet haben die folgenden Ausdrücke die folgenden Bedeutungen:
Bioaktive Einheiten bezieht sich auf eine Verbindung, die vorzugsweise aber nicht nur ausgewählt ist aus Proteinen, Peptiden, Polysacchariden, Hormonen, Nukleinsäuren, Liposomen, Zellen, Arzneimitteln, Radionukliden. Toxinen, Haptenen, Inhibitoren, Fluorophore, Liganden und Antibiotika (beispielsweise monoklonale Antikörper mit einer Spezifität für Epitope auf bestimmten Zellpopulationen, beispielsweise bestimmte hämatopoetische Zellpopulationen, speziell anti-CD 34 Antikörper). Die bioaktive Einheit kann auch ein Festphasenträger sein, wie dies im folgenden definiert ist. Im allgemeinen sind bioaktive Einheiten allgemein die Einheiten, die die biologische Aktivität oder die Detektionsmöglichkeiten in Biokonjugatkomplexen vermitteln. Wenn die bioaktive Einheit an einen erfindungsgemäßen Semikonjugat- oder Biokonjugatkomplex gekuppelt wird (entspricht beispielsweise "BAS, BAS', BAS* oder BAS*"' in den folgenden Formeln I-X, XIII, XV, XX und XXI), beispielsweise nach einer Umsetzung mit einem elektrophilen oder nukleophilen reaktiven Rest (entspricht beispielsweise "R" in den folgenden Formeln XI, XII, XIV, XVI oder XVII) kann sie wahlweise ferner einen Rest des vorher erwähnten elektrophilen oder nuldeophilen reaktiven Rests umfassen.
Festphasenträger bezieht sich auf eine feste, unlösliche Oberfläche oder ein Partikel, welche zur Bindung an ein Phenylborsäurekomplexierungsreagenz oder Phenylborsäurereagenz wie dies hierin später definiert ist geeignet sind (beispielsweise Metall- oder Plastikkugeln, wahlweise beschichtet mit Kohlenhydrat oder Protein, um die Bindung an Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien oder Phenylborsäurereagenzien, wie sie hierin später definiert sind, zu erleichtern), beispielsweise geeignet zur Verwendung in einem Isolierungs- oder Reinigungssystem oder einem Testsystem, beispielsweise einem System, das einen monoklonalen Antikörper gebunden an einen Festphasenträger in Form eines Biokonjugatkomplexes aufweist, wie dies hierin später definiert ist.
Phenylborsäurekomplexierungsreagenz bezieht sich auf ein Reagenz, das sich aus einem Phenylborsäurekomplexierungsrest und einem reaktiven Rest zusammensetzt, der zum Anhängen eines Phenylborsäurekomplexierungsrests an eine bioaktive Einheit oder einen Festphasenträger geeignet ist.
Phenylboräurereagenz bezieht sich auf ein Reagenz, das sich aus einem Phenylborsäurerest und einem reaktiven Rest zusammensetzt, der zum Anhängen eines Phenylborsäurerests an eine bioaktive Einheit geeignet ist. Phenylborsäurequervernetzungsreagenz bezieht sich auf ein Reagenz, das sich aus zwei Phenylborsäureresten zusammensetzt, die durch einen Spacer getrennt sind.
Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugat bezieht sich auf eine bioaktive Einheit oder einen Festphasenträger mit einem angehängten Phenylborsäurekomplexierungsrest, der aus der Umsetzung der bioaktiven Einheit oder des Festphasenträgers mit einem Phenylborsäurekomplexierungsreagenz stammt.
Phenylborsäuresemikonjugat bezieht sich auf eine bioaktive Einheit, die einen angehängten Phenylborsäurerest aufweist, der aus der Umsetzung einer bioaktiven Einheit mit einem Phenylborsäurereagenz stammt.
Biokonjugatkomplex bezieht sich auf ein Biokonjugat, das zwei bioaktive Einheiten (die gleich oder verschieden sein können) oder eine bioaktive Einheit und einen Festphasenträger verbindet, worin die Bindung zumindest ein Boratom umfaßt, beispielsweise zumindest einen Phenylborsäurekomplex, wie das Produkt, das bei der Umsetzung eines Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugats mit einem Phenylborsäuresemikonjugat gebildet wird, oder das Produkt, das durch die Umsetzung eines Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugats mit einem Phenylborsäurequervernetzungsreagenz gebildet wird.
Im allgemeinen haben die erfindungsgemäßen Biokonjugatkomplexe die Formeln I bis X, wie dies im folgenden gezeigt ist, beispielsweise die allgemeine Formel A
BAS-L-Bc-L'-(Bc'-L")nBAS' (A)
worin BAS und BAS' für bioaktive Einheiten stehen (die gleich oder verschieden sein können), L, L' und L" für Linker stehen (die gleich oder verschieden sein können, beispielsweise den Gruppen Z, Z', Z*, Z*', Y und Y* in den Formeln I bis X entsprechen), Bc und Bc' für Phenylborsäurekomplexe (die gleich oder verschieden sein können) der Formel D-E oder der Formel E-D stehen, worin D für einen Phenylborsäurerest steht (der vorzugsweise von einem Derivat oder Analogon der Phenylborsäure stammt) und E für einen Phenylborsäurekomplexierungsrest steht (der vorzugsweise von einem Salicylsäureanalogon stammt), und n für 0 oder 1 steht. Wenn BAS ein Festphasenträger ist, dann steht Bc vorzugsweise für E-D und/oder n für 1 und/oder BAS' für einen Antikörper.
Die vorliegende Erfindung liefert daher eine neue Klasse an Biokonjugatkomplexen, die von Phenylborsäurekomplexen stammen, und ein Verfahren zur Herstellung solcher Biokonjugatkomplexe. In der vorliegenden Erfindung werden anstelle der Avidin-Biotin- und Digoxigenin-anti-Digoxigeninsysteme Phenylborsäurekomplexe verwendet, um die chemische Konjugation von bioaktiven Einheiten ohne der Verwendung von dazwischengeschalteten biologischen Makromolekülen zu erleichtern. Die Biokonjugatkomplexe, die zwei bioaktive Einheiten verbinden, worin das Bor mit einem Stickstoff komplexiert wird, das selbst über einen Spacerrest an eine bioaktive Einheit gebunden ist, sind beispielsweise in den Formeln I bis VI gezeigt:

Formel I

Die Biokonjugatkomplexe der Formel I sind die, worin die Gruppe Q ausgewählt ist aus einem von O, S. NH, N-Alkyl, N-Aryl und NCH&sub2;-Aryl, worin Aryl für einen Kohlenwasserstoff steht mit einer Länge von beispielsweise 1 bis 4 Kohlenstoffen, beispielsweise bis zu 6 Kohlenstoffen, worin die Ketten verzweigt sein können, und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen, worin die Gruppe Y ausgewählt ist aus O, NH, CH&sub2;, Alkyl und Aryl, worin Alkyl für einen Kohlenwasserstoff mit einer Länge von beispielsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatomen steht und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen, worin die Gruppen Z und Z* (die gleich oder verschieden sind) einen Spacer enthalten, der aus Alkylketten und Polyetherketten (beispielsweise Polyethylenglycol) mit einer Länge von 1 bis 16 Kohlenstoffäquivalenten ausgewählt ist, worin die Kette wahlweise ein oder mehrere Zwischenproduktamid- und/oder -disulfidbindungen enthalten kann und worin BAS und BAS* gleiche oder unterschiedliche bioaktive Einheiten sind.
Die Biokonjugatkomplexe der Formel I sind vorzugsweise die, worin die Gruppe Q ausgewählt ist aus O, NH und NC&sub6;H&sub5;, worin die Gruppe Y für O und CH&sub2; steht, worin die Gruppen Z und Z* unabhängig ausgewählt sind aus (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 5 steht, und (CH&sub2;CH&sub2;O)n', worin n' für 2 bis 4 steht, und/oder worin BAS und BAS* zwei unterschiedliche bioaktive Einheiten sind, worin beispielsweise die eine ein Festphasenträger und die andere ein Antikörper ist.
Die Biokojugatkomplexe der Formeln II und III sind die, worin die Gruppen Q und Q' unabhängig ausgewählt sind aus O, S, NH, N-Alkyl, N-Aryl und NCH&sub2;-Aryl, worin Alkyl für einen Kohlenwasserstoff steht mit einer Länge von beispielsweise 1 bis 4 Kohlenstoffen, beispielsweise bis zu 6 Kohlenstoffen, worin die Ketten verzweigt sein können, und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen, worin die Gruppen Y und Y' unabhängig ausgewählt sind aus O, NH, CH&sub2;, Alkyl und Aryl, worin Alkyl für einen Kohlenwasserstoff mit einer Länge von beispielsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatomen steht und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen, worin jedes von Z, 2' und Z* für einen Spacer steht, der aus Alkylketten und Polyetherketten (beispielsweise Polyethylenglycol) mit einer Länge von 1 bis 16 Kohlenstoffäquivalenten besteht, worin die Kette wahlweise ein oder mehrere Zwischenproduktamid- und/oder -disulfidbindungen enthalten kann, worin die Gruppe Z* an zwei Phenylborsäurereste angehängt ist und worin BAS und BAS' gleiche oder unterschiedliche bioaktive Einheiten sind. Vorzugsweise gilt, wenn BAS und BAS' gleich sind, dann sind Q und Q', Y und Y' und Z und 2' auch gleich.
Die Biokonjugatkomplexe der Formeln II und III sind vorzugsweise die, worin die Gruppen Q und Q' ausgewählt sind aus O, NH und NC&sub4;H&sub5;, worin die Gruppen Y und Y' ausgewählt sind aus O und CH&sub2;, worin Z, Z' und Z* gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus (CR&sub2;)n, worin n für 1 bis 5 steht, und (CH&sub2;CH&sub2;O)n', worin n' für 2 bis 4 steht, und/oder worin die BAS Gruppen entweder die gleiche bioaktive Einheit sind oder eine BAS Gruppe für einen Festphasenträger steht, während die andere BAS Gruppe für eine bioaktive Einheit steht, der kein Festphasenträger ist, beispielsweise ein Antikörper.
Biokonjugatkomplexe der Formel IV sind die, worin die Gruppe X ausgewählt ist aus H, CH&sub3; und C&sub6;H&sub5;, worin die Gruppe Y ausgewählt ist aus O, NH, CH&sub2;, Alkyl und Aryl, worin Alkyl für einen Kohlenwasserstoffrest mit einer Länge von beispielsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder bis zu 6 Kohlenstoffatomen steht und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen, worin die Gruppen Z und Z*, die gleich oder verschieden sein können, einen Spacer enthalten, der aus Alkylketten und Polyetherketten (beispielsweise Polyethylenglycol) mit einer Länge von 1 bis 16 Kohlenstoffäquivalenten ausgewählt ist, worin die Kette wahlweise ein oder mehrere Zwischenproduktamid- und/oder - disulfidbindungen enthalten kann und worin die Gruppen BAS und BAS* gleiche oder unterschiedliche bioaktive Einheiten sind.
Die Biokonjugatkomplexe der Formel IV sind vorzugsweise die, worin die Gruppe X unter anderem ausgewählt ist aus H und C&sub6;H&sub5;, worin die Gruppe Y vorzugsweise unter anderem aus O und CH&sub2; ausgewählt ist, worin die Gruppen Z und Z* gleich oder verschieden sein können und vorzugsweise unter anderem ausgewählt sind aus (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 5 steht, und (CH&sub2;CH&sub2;O)n', worin n' für 2 bis 4 steht, und/oder worin die Gruppen BAS und BAS* unterschiedliche bioaktive Einheiten sind, worin beispielsweise eine ein Festphasenträger und die andere eine andere bioaktive Einheit ist, die kein Festphasenträger ist, beispielsweise ein Antikörper.
Die Biokojugatkomplexe der Formeln V und VI sind die, worin die Gruppen X und X' unabhängig ausgewählt sind aus H, CH&sub3; und C&sub6;H&sub5;, worin die Gruppen Y und Y' unabhängig ausgewählt sind aus O, NH, CH&sub2;, Alkyl und Aryl, worin Alkyl für einen Kohlenwasserstoffrest mit einer Länge von beispielsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder bis zu 6 Kohlenstoffatomen steht und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen, worin jede der Gruppen Z, Z' und Z* für einen Spacer steht, der unabhängig aus Alkylketten und Polyetherketten (beispielsweise Polyethylenglycol) mit einer Länge von 1 bis 16 Kohlenstoffäquivalenten ausgewählt ist, worin die Kette wahlweise ein oder mehrere Zwischenproduktamid- und/oder -disulfidbindungen enthalten kann, worin die Gruppe Z* an zwei Phenylborsäurereste angehängt ist und worin die Gruppen BAS und BAS' gleiche oder unterschiedliche bioaktive Einheiten sind. Vorzugsweise gilt, wenn BAS und BAS' gleich sind, dann sind Z und 2', Y und Y' und X und X' auch gleich.
Die Biokonjugatkomplexe der Formeln V und VI sind vorzugsweise die, worin die Gruppen X und X' unabhängig ausgewählt sind aus H und C&sub6;H&sub5;, worin die Gruppen Y und Y' unabhängig ausgewählt sind aus O und CH&sub2;, worin die Gruppen Z, 2' und Z* unabhängig ausgewählt sind aus (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 5 steht, und (CH&sub2;CH&sub2;O)n-, worin n' für 2 bis 4 steht, und/oder worin die Gruppen BAS und BAS' entweder gleich sind oder eine für einen Festphasenträger steht, während die andere für eine bioaktive Einheit steht, die kein Festphasenträger ist, beispielsweise ein Antikörper.
Die erfindungsgemäßen Biokonjugatkomplexe umfassen auch die Komplexe, worin mindestens eine der bioaktiven Einheiten an den Benzolring des Phenylborsäurekomplexierungsrests gebunden ist, wie beispielsweise in den Formeln VII bis X.
Die Biokonjugate der Formel VII sind die, worin die Gruppe W ausgewählt ist aus O, NH, N-Alkyl, NC&sub6;H&sub5;, N-Aryl, NCH&sub2;-Aryl, NCH&sub2;CH&sub2;OH, NCOCH&sub2;CH&sub2;OH, NOH, NO-Alkyl und NOCH&sub2;-Aryl, worin Alkyl für einen Kohlenwasserstoffrest steht mit einer Länge von beispielsweise 1 bis 4 Kohlenstoffen, beispielsweise bis zu 6 Kohlenstoffen, worin die Ketten verzweigt sein können, und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen, worin die Gruppe Q ausgewählt ist aus O, 5, NH, N-Alkyl, N-Aryl und NCH&sub2;-Aryl, worin Alkyl und Aryl wie vorher definiert sind, worin die Gruppen Z und Z* gleich oder verschieden sind und einen Spacer enthalten, der aus Alkylketten und Polyetherketten (beispielsweise Polyethylenglycol) mit einer Länge von 1 bis 16 Kohlenstoffäquivalenten ausgewählt ist, worin die Kette wahlweise ein oder mehrere Zwischenproduktamid- und/oder -disulfidbindungen enthalten kann und worin die Gruppen BAS und BAS* gleiche oder unterschiedliche bioaktive Einheiten sind.
Die Biokonjugatkomplexe der Formel VII sind vorzugsweise die, worin die Gruppe W ausgewählt ist aus O, NH, NCH&sub3;, NC&sub6;H&sub5;, NCH&sub2;CH&sub2;OH, NCOCH&sub2;CH&sub2;OH, NOH und NOCH&sub3;, worin die Gruppe Q für O steht, worin die Gruppen Z und Z* unabhängig ausgewählt sind aus (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 5 steht, und (CH&sub2;CH&sub2;O)n', worin n' für 2 bis 4 steht, und/oder worin BAS und BAS* zwei unterschiedliche bioaktive Einheiten sind, worin beispielsweise die eine ein Festphasenträger ist und die andere eine andere bioaktive Einheit als ein Festphasenträger ist, beispielsweise ein Antikörper.
Die Biokonjugatkomplexe der Formel VIII sind die, worin die Gruppe W ausgewählt ist aus O, NH, N- Alkyl, NC&sub6;H&sub5;, N-Aryl, NCH&sub2;-Aryl, NCH&sub2;CH&sub2;OH, NCOCH&sub2;CH&sub2;OH, NOH, NO-Alkyl und NOCH&sub2;-Aryl, worin Alkyl für einen Kohlenwasserstoffrest steht mit einer Länge von beispielsweise 1 bis 4 Kohlenstoffen, beispielsweise bis zu 6 Kohlenstoffen, worin die Ketten verzweigt sein können, und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen, worin die Gruppe Q ausgewählt ist aus O, S, NH, N-Alkyl, N-Aryl und NCH&sub2;-Aryl, worin Alkyl und Aryl wie vorher definiert sind, worin die Gruppen Z, Z* und Z*' gleich oder verschieden sind und einen Spacer enthalten, der aus Alkylketten und Polyetherketten (beispielsweise Polyethylenglycol) mit einer Länge von 1 bis 16 Kohlenstoffäquivalenten ausgewählt ist, worin die Kette wahlweise ein oder mehrere Zwischenproduktamid- und/oder -disulfidbindungen enthalten kann und worin die Gruppe Z an zwei Phenylborsäurekomplexierungsreste angehängt ist und worin die Gruppen BAS* und BAS*' gleiche oder unterschiedliche bioaktive Einheiten sind.
Die Biokonjugatkomplexe der Formel VIII sind vorzugsweise die, worin die Gruppe W ausgewählt ist aus O, NH, NCH&sub3;, NC&sub6;H&sub5;, NCH&sub2;CH&sub2;OH, NCOCH&sub2;CH&sub2;OH, NOH und NOCH&sub3;, worin die Gruppe Q vorzugsweise für O steht, worin die Gruppen Z, Z* und Z*' gleich oder verschieden sind und vorzugsweise ausgewählt sind aus (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 5 steht, und (CH&sub2;CH&sub2;O)n, worin n' für 2 bis 4 steht, und/oder worin BAS* und BAS*' entweder gleich sind oder eine ein Festphasenträger und die andere eine andere bioaktive Einheit als ein Festphasenträger ist, beispielsweise ein Antikörper.
Die Biokonjugatkomplexe der Formeln DC und X sind die, worin die Gruppen W und W' unabhängig ausgewählt sind aus O, NH, N-Alkyl, NC&sub6;H&sub5;, N-Aryl, NCH&sub2;-Aryl, NCH&sub2;CH&sub2;OH, NCOCH&sub2;CH&sub2;OH, NOH, NO-Alkyl und NOCH&sub2;-Aryl, worin Alkyl für einen Kohlenwasserstoffrest steht mit einer Länge von beispielsweise 1 bis 4 Kohlenstoffen, beispielsweise bis zu 6 Kohlenstoffen, worin die Ketten verzweigt sein können, und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen, worin die Gruppen Q und Q' unabhängig ausgewählt sind aus O, S, NH, N-Alkyl, N-Aryl und NCH&sub2;-Aryl, worin Alkyl und Aryl wie vorher definiert sind, worin die Gruppen Z, Z' und Z* für Spacer stehen, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkylketten und Polyetherketten (beispielsweise Polyethylenglycol) mit einer Länge von 1 bis 16 Kohlenstoffäquivalenten, worin die Kette wahlweise ein oder mehrere Zwischenproduktamid- und -disulfidbindungen enthalten kann und worin die Gruppe Z* an zwei Phenylborsäurereste angehängt ist und worin die Gruppen BAS und BAS' gleiche oder unterschiedliche bioaktive Einheiten sind. Wenn BAS und BAS' gleich sind, sind vorzugsweise W und W', Q und Q' und Z und 2' ebenfalls gleich.
Die Biokonjugatkomplexe der Formel IX und X sind vorzugsweise die, worin die Gruppen W und W' unabhängig ausgewählt sind aus O, NH, NCH&sub3;, NC&sub6;H&sub5;, NCH&sub2;CH&sub2;OH, NCOCH&sub2;CH&sub2;OH, NOH und NOCH&sub3;, worin die Gruppe Q vorzugsweise für O steht, worin die Gruppen Z, 2' und Z* gleich oder verschieden sind und vorzugsweise ausgewählt sind aus (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 5 steht, und (CH&sub2;CH&sub2;O)n, worin n' für 2 bis 4 steht, und/oder worin BAS und BAS' entweder für die gleiche bioaktive Einheit stehen oder eine für einen Festphasenträger steht und die andere für eine andere bioaktive Einheit als einen Festphasenträger steht, beispielsweise ein Antikörper. Die Biokonjugatkomplexe mit einem einzelnen Phenylborsäurekomplex, wie beispielsweise in den Formeln I, IV und VII, werden vorzugsweise zur Konjugation von zwei unterschiedlichen bioaktiven Einheiten verwendet, beispielsweise um ein Enzym und einen Antikörper für die Verwendung in einem ELISA Test hiermit zu konjugieren, um eine Nukleinsäuresonde mit einem Fluorophor zu konjugieren, um die Detektion einer Genomsequenz zu erleichtern und um ein Toxin mit einem monoklonalen Antikörper zur Verwendung bei der gezielten Arzneimittelabgabe zu konjugieren. Beispielsweise können solche Biokonjugatkomplexe zur Konjugation eines Antikörpers (beispielsweise eines monoklonalen Antikörpers, der zur selektiven Bindung an ein Epitop einer hämatopoetischen Zelle fähig ist, beispielsweise ein anti-CD 34 Antikörper) an eine feste Phase verwendet werden (beispielsweise ein Kügelchen aus Metall oder Plastik, das wahlweise mit einer organischen Substanz beschichtet ist, beispielsweise einem Kohlenhydrat oder Protein), worin beispielsweise der Antikörper BAS ist und die feste Oberfläche BAS* ist oder worin der Antikörper BAS* ist und die feste Oberfläche BAS ist.
Biokonjugatkomplexe mit zwei Phenylborsäurekomplexen, wie beispielsweise in den Formeln II, III, V, VI, VIII, IX und X, werden vorzugsweise zur Konjugation von identischen bioaktiven Einheiten durch Quervernetzung von bioaktiven Einheiten mit anhängenden Phenylborsäure- oder Phenylborsäurekomplexierungsresten zu makromolekularen Aggregaten verwendet. Aggregate dieses Typs, die Enzyme enthalten, sind zur Erhöhung der Detektionsgrenzen in ELISA und verwandten Tests brauchbar, indem sie die wirksame Konzentration des Enzyms, das für die Umwandlung des farblosen Substrats in das detektierbare Produkt verfügbar ist, beträchtlich erhöhen. Ähnlich können Fluorophor markierte Proteine mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten auf diese Weise aggregiert werden, um ihre sichtbare oder spektrophotometrische Detektion zu verbessern. Die Aggregate mit überschüssigen anhängenden Phenylborsäureresten können mit anderen bioaktiven Einheiten mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten (Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugaten) konjugiert werden. Dieser allgemeine Ansatz ist zur Herstellung von Sandwichtyptests analog, die das Avidin-Biotinsystem umfassen. Phenylborsäurequervernetzungsreagenzien können auch verwendet werden, nämlich durch Umsetzung in großem Überschuß und der anschließenden Entfernung des überschüssigen Reagenzes, um bioaktive Einheiten mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten (Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugaten) in bioaktive Einheiten mit anhängenden Phenylborsäureresten (Phenylborsäuresemikonjugaten) umzuwandeln und umgekehrt. Normalerweise ist ein Spacerrest vorhanden, der die bioaktive Einheit mit dem Phenyl des Phenylborsäurerests verbindet (beispielsweise Z* oder Z*' in Formel I, VII oder VIII oder Z* in XIV oder XV). Jedoch können in manchen Fällen die bioaktiven Einheiten eine Konfiguration aufweisen, die die direkte Bindung an das Phenyl über einen elektrophilen oder nukleophilen Rest (R) in Formel XIV ohne den Bedarf für einen Spacer erlaubt. Daher betrifft und umfaßt die Erfindung ferner Verbindungen der Formel I, VII, VIII, XIV oder XV, worin Z* oder Z*' nicht vorhanden ist.
Die Biokonjugatkomplexe der Formel I bis X werden entweder in gepufferten wäßrigen Lösungen, organischen Lösemitteln und wäßrigen Lösungen, die organische Lösemittel enthalten, hergestellt. Der Komplex bildet sich innerhalb weniger Minuten bei Raumtemperatur. Die Herstellung des Biokonjugatkomplexes ist gegenüber signifikanten Veränderungen in der Ionenstärke, Temperatur und dem Vorkommen von chaotropen Mitteln (Proteindenaturienmgsmittel) unempfindlich, die mit den Systemen des Stands der Technik nicht kompatibel sind, worin die Struktur eines biologischen Makromoleküls erhalten bleiben muß, um die erforderlichen Bindungseigenschaften zu erhalten. In den meisten Fällen sind die Zwänge, die die Bildung von Biokonjugatkomplexen durch das hierin beschriebene System begleiten, auf die Auswahl eines geeigneten pH und irgendwelche zusätzlichen Beschränkungen limitiert, die durch die Bedingungen hervorgerufen werden, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der bioaktiven Einheiten erforderlich sind.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner Reagenzien, die zur Modifizierung einer bioaktiven Einheit zum Zweck der Einarbeitung des Phenylborsäurekomplexierungsrests zur anschließenden Konjugation mit einer unterschiedlichen bioaktiven Einheit geeignet sind, die anhängende Phenylborsäurereste aufweist, beispielsweise zur Herstellung eines Biokonjugats der Formel VII, VIII, IX oder X:
worin die Gruppen Q, Z und Z* wie für eine der Formeln VII, VIII, IX oder X definiert sind, worin die Gruppe W* ausgewählt ist aus H, OH, NH&sub2;, NHCH&sub3;, NHOH und NHOCH&sub3;, worin die Gruppe Q ausgewählt ist aus O, S und NH und/oder Z und Z* für Spacer stehen, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkyl- und Polyethylenglycolketten mit einer Länge von 1 bis 16 Kohlenstoffäquivalenten, worin die Kette die Zwischenproduktamid- und
- disulfiidbindungen enthalten kann. Die Gruppe R in Formel XI ist ein reaktiver elektrophiler oder nukleophiler Rest, der zur Umsetzung des Phenylborsäurekomplexienungsreagenzes mit einer bioaktiven Einheit geeignet ist.
Die Reagenzien der Formeln XI und XII sind vorzugsweise die, worin die Gruppe W* ausgewählt ist aus OH, NHOH und NHOCH&sub3; und/oder die Gruppe Q für O steht. Die Gruppen Z und Z* sind bevorzugt ausgewähltes (CH&sub2;)n, worin n für 1 bis 5 steht, oder (CH&sub2;CH&sub2;O)n, worin n für 2 bis 4 steht.
Die Reagenzien der Formel Xl sind vorzugsweise die, worin die Gruppe R unter anderem ausgewählt ist aus Resten wie Amino, Hydrazid, N-Hydroxysuccinimidylester, N-Hydroxysulfosuccinimidylester, Isothiocyanat, Bromacetamid, Iodacetamid, Maleimid und Thiol. Die Umsetzung eines Reagenzes der allgemeinen Formel XI mit einer bioaktiven Einheit ergibt ein Semikonjugat mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten (einer oder mehrere) der Formel XIII, worin das als BAS bezeichnete Symbol für die bioaktive Einheit steht, die Gruppe W* wie oben definiert ist und die Gruppen Q und Z wie vorher für Formel VII definiert sind.
Ähnlich können Phenylborsäurereagenzien [beispielsweise die der Formel XIV
worin Z* für einen wie für eine der Formeln I, IV, VII oder VIII definierten Spacer steht und R für einen reaktiven elektrophilen oder nukleophlen Rest steht, wie er für die Formel XI definiert ist] an die bioaktive Einheit unter Bildung eines Semikonjugats mit anhängenden Phenylborsäureresten (einer oder mehrere) der Formel XV angehängt sein
worin das als BAS* dargestellte Symbol für eine bioaktive Einheit steht, beispielsweise gleich oder unterschiedlich zu der als BAS bezeichneten bioaktiven Einheit, und die Gruppe Z* wie für Formel VII definiert ist.
Es wird hier erwähnt, daß die Semikonjugate der Formel XV und andere hierin beschriebene Phenylborsäurereagenzien und Semikonjugate entweder das tetraedrische Phenylboratanion unter alkalischen Bedingungen oder die trigonale Phenylborsäure unter neutralen oder sauren Bedingungen enthalten, beispielsweise
und beide Formen sollen durch die vorliegende Erfindung umfaßt werden.
Phenylborsäurequervernetzungsmittel der Formel XVI
worin Z* für einen Linker steht, wie er in einer der Formeln II, V oder IX definiert ist, oder der Formel XVII
worin Z* für einen Linker steht, wie er in einer der Formeln III, VI oder X definiert ist, werden ebenfalls geliefert.
Ein Semikonjugat der Formel XIII, hergestellt aus der bioaktiven Einheit BAS und mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten, kann mit einem Semikonjugat der Formel XV, das aus einer zweiten bioaktiven Einheit BAS* hergestellt wurde und anhängende Phenylborsäurereste aufweist, unter Bildung eines Biokonjugats der Formel VII hergestellt werden. Auf diese Weise körnen biologische Makromoleküle miteinander oder mit anderen Funktionalitäten konjugiert werden, die brauchbare Eigenschaften bereitstellen.
Ähnlich kann ein Reagenz der Formel XII mit einem Semikonjugat der Formel XIV, das aus einer bioaktiven Einheit BAS* hergestellt wurde, unter Bildung eines Biokonjugats der Formel VIII hergestellt werden. Auf diese Weise können zwei oder mehr identische bioaktive Einheiten BAS* miteinander konjugiert werden. Dieses Verfahren kann zur Herstellung von Enzymaggregaten verwendet werden, die für eine hochempfindliche Detektion während einem ELISA brauchbar sind.
Die Biokonjugate werden in gepufferten wäßrigen oder wäßrig/organischen Lösungen hergestellt. Die Biokonjugate werden innerhalb weniger Minuten bei Raumtemperatur hergestellt. Die Stabilität eines gegebenen Biokonjugats bei einem gegebenen pH wird durch die Substituentengruppen W und Q bestimmt. Die Biokonjugate der Formeln VII und VIII, worin beide Gruppen W und Q für O stehen, sind in sauren wäßrigen Lösungen mit einem ungefähren pH von weniger als 4, 5 stabil. Biokonjugate der Formeln VII und VIII, worin die Gruppe W aus NH und NCH&sub3; ausgewählt ist und die Gruppe Q aus O oder S ausgewählt ist, sind in gepufferten alkalischen wäßrigen Lösungen über einen ungefähren pH Bereich von 8,5 bis 11,5 stabil. Ähnlich sind Biokonjugate der Formeln VII und VIII, worin beide Gruppen W und Q Btr NH stehen, in gepufferten alkalischen wäßrigen Lösungen über einen ungefähren pH Bereich von 8,5 bis 11,5 stabil. Biokonjugate der Formeln VII und VIII, worin die Gruppe W ausgewählt ist aus NOH und NOCH&sub3; und die Gruppe Q aus O oder S ausgewählt ist, sind in gepufferten wäßrigen Lösungen über den ungefähren breiten pH Bereich von 2,5 bis 11,5 stabil.
Die Biokonjugatreaktion (Phenylborsäurekomplexierung) ist gegenüber signifikanten Variationen in Ionenstärke, Temperatur, dem Vorkommen von organischen Lösemitteln und dem Vorkommen von chaotropen Mitteln (Proteindenaturierungsmittel) unempfindlich, die mit den Systemen des Stands der Technik inkompatibel sind, bei denen die Struktur eines biologischen Makromoleküls zur Aufrechterhaltung der erforderlichen Bindungseigenschaften erhalten bleiben muß. In den meisten Fällen sind die Zwänge, die die Bildung von Biokonjugatkomplexen durch das hierin beschriebene System begleiten, auf die limitiert, die durch die Bedingungen hervorgerufen werden, welche zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der bioaktiven Einheiten erförderlich sind.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung Phenylborsäurereagenzien, beispielsweise Reagenzien, die zur Modifizierung einer bioaktiven Einheit zum Zweck der Einarbeitung eines Phenylborsäurekomplexierungsrests geeignet sind, beispielsweise bei der Herstellung eines Biokonjugatkomplexes der Formel I, II, III, IV, V oder VI, wie Reagenzien, die aus einer der allgemeinen Formeln XVIII oder Formel XIX ausgewählt sind.
Für die Formel XVIII sind X, Y und Z wie für die Formel IV, V oder VI definiert. Vorzugsweise sind die Reagenzien der Formel XVIII die, worin X ausgewählt ist aus H, CH&sub3; und C415 und/oder worin Y aus O und CH&sub2; ausgewählt ist. Für die Formel XIX sind Q, Y und Z wie für die Formeln I, II oder III definiert. Vorzugsweise sind Reagenzien der Formel XIX die, worin die Gruppe Y ausgewählt ist aus O oder CH&sub2; und/oder Q für O steht. In beiden Formeln XVIII und XIX steht die Gruppe R für einen reaktiven elektrophilen oder nukleophilen Rest, der für die Umsetzung des Phenylborsäurekomplexierungsrests mit einer bioaktiven Einheit geeignet ist.
Von den Reagenzien der allgemeinen Formel XVIII sind die am meisten bevorzugt, worin die Gruppe X aus H oder CH&sub3; ausgewählt ist und die Gruppe Y für O steht. Von den Reagenzien der allgemeinen Formel XVI sind die bevorzugt, worin die Gruppe Y für O steht. In beiden Formeln XVIII und XIX ist die Gruppe Z vorzugsweise ausgewählt aus einer Alkylkette oder Polyetherkette (beispielsweise Polyethylenglycol) mit einer Länge von 1 bis 16 Kohlenstoffliquivalenten, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten und die Zwischenproduktamid und/oder -disulfidfuinktionalitäten enthalten kann und vorzugsweise (CH&sub2;)n ist, worin n für 2 bis 6 steht oder (CH&sub2;CH&sub2;O)n ist, worin n für 2 bis 4 steht. In beiden Formeln XVIII und XIX ist die Gruppe R vorzugsweise unter anderem ausgewählt aus Resten wie Hydrazid, Isothiocyanat, N-Hydroxysuccinimidylester, N-Hydroxysulfosuccinimidylester, Imidatester, 2,2,2-Trifluorethansulfonyl, Bromacetamid, Iodacetamid, Maleimid und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditester.
Die Reagenzien der Formeln XVIII oder XIX werden mit einer bioaktiven Einheit BAS (oder BAS*) oder unter Bildung des jeweiligen entsprechenden Semikonjugats der Formel XX und XXI umgesetzt:
worin X, Y und Z wie für die Formel XVIII definiert sind
worin Y, Z und Q wie für Formel XIX definiert sind.
Die Erfindung beschreibt daher:
1. Wie vorher definierte Biokonjugatkomplexe, beispielsweise einer der Formeln I bis X, 2. Wie vorher definiertes Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugat, beispielsweise eines der Formeln XIII, XX und XXI,
3. Wie vorher definierte Phenylborsäuresemikonjugate der Formel XV,
4. Wie vorher definierte Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien, beispielsweise eines der Formeln XI, XVIII und XIX
5. Wie vorher definierte Phenylborsäurereagenzien, beispielsweise der Formel XIV, und
6. Wie vorher definierte Phenylborsäurequervernetzungsmittel, beispielsweise der Formeln XII, XVI und XVII.
Die Erfindung liefert ferner die Verwendung der vorangehenden Verbindungen in einer der vorher aufgeführten Anwendungen zur Biokonjugation, insbesondere in einem Antikörper-basierenden Test- oder Reinigungssystem, und die Verwendung der vorherigen Semikonjugate, Quervernetzungmittel und Reagenzien (beispielsweise der Formeln XI bis XXI) zur Herstellung von Biokonjugatkomplexen (beispielsweise der Formeln I bis X).
In einer bestimmten Ausführungsform liefert die Erfindung einen Kit oder ein System zur Isolierung oder Reinigung von Zellen, beispielsweise hämatopoetischen Zellen, beispielsweise CD34&spplus; Zellen, welche einen Biokonjugatkomplex (gemäß einer der Formeln I bis X) enthält, der eine erste und eine zweite bioaktive Einheit verbindet, worin die erste bioaktive Einheit ein Festphasenträger ist, beispielsweise ein Kügelchen aus Metall oder Plastik (wahlweise beschichtet mit einem Kohlenhydrat, Protein oder anderem organischen Material zur Erleichterung der Reaktivität und der Bindung an ein erfindungsgemäßes Reagenz, beispielsweise an R in den Formeln XI, XIV, XVIII oder XIX) und die zweite bioaktive Einheit ein Antikörper ist, beispielsweise ein Antikörper der zur Erkennung und Bindung eines Epitops fähig ist, das in einer bestimmten Zellpopulation vorkommt, beispielsweise CD 34+ Zellen, und liefert ferner auch ein Verfahren zur Isolierung oder Reinigung von beschriebenen Zellen, das umfaßt die Schritte des Zusammenbringens eines Mediums, das die gewünschten Zellen enthält, mit einem solchen erfindungsgemäßen Biokonjugatkomplex mit einer zweiten wie beschriebenen bioaktiven Einheit, die für die gewünschte Zellpopulation selektiv ist, die Abtrennung der so aus dem Medium selektierten Zellen und wahlweise die Abtrennung der ausgewählten Zellen vom Biokonjugatkomplex.
Die Biokonjugatkomplexe der Formeln I, IV oder VII werden durch ein Dreischrittverfahren hergestellt, worin:
(1) Ein Phenylborsäurekomplexierungsreagenz, beispielsweise der Formel XI, XVIII oder XIX, das vorzugsweise von Salicylsäure, Aminosalicylsäure oder Dithiosalicylsäure stammt, mit einer bioaktiven Einheit unter Bildung eines Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugats kondensiert wird,
(2) Ein Phenylborsäurereagenz, das beispielsweise von einer Verbindung stammt, die vorzugsweise unter anderem ausgewählt ist aus (3-Aminophenyl)borsäure und (4-Carboxyphenyl)borsäure, beispielsweise der Formel XIV mit einer bioaktiven Einheit unter Bildung eines Phenylborsäuresemikonjugats kondensiert wird, (3) Das Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugat, das wie oben in (1) beschrieben hergestellt wurde, und das Phenylborsäuresemikonjugat, das wie oben in (2) beschrieben hergestellt wurde, miteinander unter Bildung eines Biokonjugatkomplexes umgesetzt werden, beispielsweise der Formel I, IV oder VII.
Die Biokonjugatkomplexe der Formeln II, V oder IX werden durch ein Zweischrittverfahren hergestellt, worin:
(1) Ein Phenylborsäurekomplexierungsreagenz der Formel XI, XVIII oder XIX mit einer bioaktiven Einheit unter Bildung von Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugaten kondensiert wird,
(2) Die Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugate, die wie oben in (1) beschrieben hergestellt wurden, mit einem Phenylborsäurequervernetzungsreagenz umgesetzt werden, das vorzugsweise von (3-Aminophenyl)borsäure abgeleitet ist, beispielsweise der Formel XVI.
Biokonjugatkomplexe der Formeln III, VI oder X werden in einem Zweischrittverfahren hergestellt, worin:
(1) Ein Phenylborsäurekomplexierungsreagenz der Formeln XI, XVIII oder XIX mit einer bioaktiven Einheit unter Bildung von Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugaten umgesetzt wird,
(2) Die Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugate, die wie oben in (1) beschrieben hergestellt wurden, mit einem Phenylborsäurequervernetzungsreagenz umgesetzt werden, das vorzugsweise von (4-Carboxyphenyl)borsäure abgeleitet ist, beispielsweise der Formel XVII, um den gewünschten Komplex zu erhalten.
Die Biokonjugatkomplexe der Formel VIII werden durch ein Zweischrittverfahren hergestellt, worin:
(1) Das Phenylborsäurereagenz der Formel XIV mit einer bioaktiven Einheit unter Bildung des Semikonjugats der Formel XV umgesetzt wird,
(2) Das Semikonjugat der Formel XV mit einem Phenylborsäurequervemetzungsmittel der Formel XII umgesetzt wird, das vorzugsweise von Salicylsäure, Aminosalicylsäure oder Dithiosalicylsäure abgeleitet ist, um den gewünschten Komplex zu erhalten.
Die Reagenzien der Formel XIV leiten sich von Phenylborsäurederivaten und Analoga ab, beispielsweise Verbindungen die unter anderem vorzugsweise ausgewählt sind aus (3-Aminophenyl)borsäure, (4-Carboxyphenyl)- borsäure und N-(6-Nitro-3-dihydroxyborylphenyl)succinamsäure, (3-Isothiocyanatophenyl)borsäure, (5-Carboxy-3- isothiocynatophenyl)borsäure, (3-Iodacetamidophenyl)borsäure, (3-Maleimidophenyl)borsäure, (3-Dihydroxyborylphenyl)succinamsäuresuccinimidylester und (3-Dihydroxyborylphenyl)succinamsäurehydrazid, die im Handel erhältlich sind oder gemäß der beschriebenen Verfahren oder analog zu den beschriebenen Verfahren synthetisiert werden können, beispielsweise in K. E. Linder, M. D. Wen, D. P. Nowotnik, M. F. Malley, J. Z. Gougoutas, A. D. Nunn und W. C. Eckelman, (1991), Bioconjugate Chem., 2, 160-170 und K. E. Linder, M. D. Wen, D. P. Nowotnik, K. Ramalingam, RM. Sharkey, F. Yost, R. K. Narra, A. D. Nunn und W. C. Eckelman (1991) Bioconjugate Chem. 2, 407- 415.
Die Phenylborsäurereagenzien der Formel XVI werden durch die Kondensation von (3-Aminophenyl)- borsäure mit einer aktivierten Dicarbonsäure, die vorzugsweise unter anderem ausgewählt ist aus Succinylchlorid, Adipoylchlorid, Adipinsäurediisobutylcarbonat, Suberoylchlorid, 3,3'-Dithiopropionylchlorid und 3,6,9-Trioxa- undecandioylchlorid und 3,6,9-Trioxaundecandionsäurediisobutylcarbonat, gemäß der in T. J. Buniett, H. C. Peebles und J. H. Hageman (1980) Biochem. Biophys. Research Commun., 96, 1S7-162 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Phenylborsäurereagenzien der Formel XVII werden durch Aktivierung von (4-Carboxyphenyl)borsäure mit N,N-Dicyclohexylcarbodiiniid gefolgt von einer Kondensation mit einem Diantin hergestellt, unter anderem vorzugsweise ausgewählt aus 1,4-Butandiamin, 1,6-Hexandiamin und 2,2'-Dithiodiaminoethan (H&sub2;NCH&sub2;CH&sub2;SSCH&sub2;CH&sub2;NH&sub2;).
Die Biokonjugatkomplexe werden in gepufferten wäßrigen Lösungen hergestellt, unter anderem vorzugsweise ausgewählt aus Acetat-, Citrat-, Phosphat- und Carbonatpuffer. Die Borat- und Trispuffer sollten aufgrund ihres Potentials für die Komplexierung jeweils mit Phenylborsäurekomplexierungsresten und Phenylborsäureresten vermieden werden. Der Biokonjugatkomplex wird innerhalb von 1 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur gebildet. Die Reaktion ist gegenüber Variationen in der Ionenstärke über einen Bereich von 0,01 bis 2 mol/l insensitiv. Die Stabilität des Komplexes erhöht sich mit zunehmender Temperatur, die nur durch die Volatilität des Puffers beschränkt wird. Der Zusatz von organischen Lösemitteln einschließlich Acetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Butanol, N,N-Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid dient zur weiteren Stabilisierung von Biokonjugaten. Chaotrope Mittel (Proteindenaturierungsmittel) einschließlich Harnstoff, Guanidinhydrochlorid und Formamid dienen auch zur weiteren Stabilisierung der Bionkonjugate, falls die bioaktive Einheit gegenüber ihrer Anwesenheit tolerant ist. Die Biokonjugatkomplexe können durch Entsalzen, Dialyse, Größenausschlußchromatographie und Elektrophorese gereinigt werden. Die Biokonjugatkomplexe sind gegenüber der Entfernung von Wasser stabil und können für die Lagerung lyophilisiert werden.
Die Ionisierung der Phenylborsäure ist insofern ein wichtiger Faktor bei der Biokonjugatkomplexbildung, als bei der Ionisierung das Bor von der trigonalen Koordination (mit mittleren Bindungswinkeln von 120º und mittleren Bindungslängen von 1,37 Å) zum tetraedrisch koordinierten Anion wechselt (mit mittleren Bindungswinkeln von 109º und mittleren Bindungslängen von 1,48 Å). Phenylborsäuren variieren im pKa zwischen etwa 5,2 und 9,2. Die Biokonjugatkomplexe der allgemeinen Formeln I, III, IV, VI, VII, VIII und X leiten sich von (4- Carboxyphenyl)borsäure mit ungefähren pKa Werten im Bereich von 6,5 bis 7,5 ab. Biokonjugatkomplexe der allgemeinen Formeln I, II, IV, V, VI, VII und IX, die sich von 3-Aminophenylborsäure ableiten, haben ungefähre pKa Werte im Bereich von 8,0 bis 9,0. Komplexe der Formeln I, II, IV, V, VII und IX leiten sich von (3-Amino-2- nitrophenyl)borsäure, (3-Amino-5-nitrophenyl)borsäure oder (3-Amino-6-nitrophenyl)borsäure mit mittleren pKa Werten ab. Als allgemeine Regel liegt der pKa des Komplexes der allgemeinen Formeln I bis X etwa eine pH Einheit unter der von Phenylborsäure, aus der der Komplex hergestellt wurde.
Die Biokonjugatkomplexe der Formeln I, II und III (worin beispielsweise Q und Q' vorzugsweise aus O, 5 und NH ausgewählt sind und/oder worin Y und Y' vorzugsweise aus O oder NH ausgewählt sind), worin der Phenylborsäurerest von (3-Aminophenyl)borsäure stammt, sind in gepufferten alkalischen wäßrigen Lösungen über den ungefähren pH Bereich von 8,5 bis 11,5 stabil. Ähnlich sind die Biokonjugatkomplexe der allgemeinen Formeln IV, V und VI (worin beispielsweise die Gruppen X und X' vorzugsweise ausgewählt sind aus H, CH&sub2; oder C&sub6;H&sub5; und/oder worin die Gruppen Y und Y' vorzugsweise ausgewählt sind aus O oder NH), worin der Phenylborsäurerest sich von (3-Aminophenyl)borsäure ableitet, in gepufferten alkalischen wäßrigen Lösungen über den ungefähren pH Bereich von 8,5 bis 11,5 stabil. Dieser breite Bereich der pH Stabilität kommt aus der Anforderung, daß nur das Phenylboratanion einen stabilen Komplex ergibt. Trotzdem ist der Komplex über pH 11,5 aufgrund der basenkatalysierten Hydrolyse instabil. Die Biokonjugatkomplexe, die eine Stabilität nur unter alkalischen Bedingungen zeigen, sind für die reversible Konjugation brauchbar, wobei der Biokonjugatkomplex durch die geeignete Einstellung des pH dissozüert werden kann.
Die Biokonjugatkomplexe der Formeln I, II und III (worin beispielsweise die Gruppen Q, Q', Y und Y' vorzugsweise für O stehen), worin der Phenylborsäurerest entweder von (3-Aminophenyl)borsäure und (4- Carboxyphenyl)borsäure stammt, stellen einen Spezialfall dar, worin die Komplexe in gepufferten wäßrigen Lösungen über den breiten ungefähren pH Bereich von 2,5 bis 11,5 stabil sind. Dieser weite Bereich der pH Stabilität dürfte aus der Gegenwart eines coplanaren 1,3-Diol-komplexierenden Rests resultieren, der mit der Enolform des 2- Hydroxybenzohydroxamsäurerests assoziiert ist. Alternativ dazu kann die pH Stabilität aus dem gering wirksamen pKa der Phenylborsäure im Komplex resultieren, der aus der Umsetzung eines Hydroxamsäureanions (CONOH) mit der Phenylborsäure unter Bildung einer kovalenten Bindung resultiert, die die äußere Hülle des Boratoms ausfüllt. Die Biokonjugatkomplexe dieses Typs bilden sich in einer im wesentlichen irreversiblen Art, da sie nur durch die Einstellung des pH über pH 11,5 oder unter 2,5 oder durch kompetitive Dissoziation mit Boratpuffer dissozüert werden können.
Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugate, worin die bioaktive Einheit ein Protein ist, können bezüglich der Anzahl an anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten charakterisiert werden, die pro Molekül eingearbeitet sind (Substitutionsgrad). Die Semikonjugate können mit einem Überschuß an fluoreszierendem Phenylborsäurereagenz in einer gepufferten wäßrigen Lösung mit einem geeigneten pH unter Bildung eines Biokonjugatkomplexes der Formel I, IV oder VII, wie sie vorher definiert wurden, worin BAS* für einen Fluoreszenzrest steht, behandelt werden. Ähnlich können Phenylborsäuresemikonjugate durch die Umsetzung mit einem Überschuß an fluoreszierendem Phenylborsäurekomplexierungsreagenz in einer gepufferten wäßrigen Lösung mit geeignetem pH unter Bildung von Biokonjugatkomplexen der Formeln I, IV oder VII hergestellt werden, worin BAS* für einen Fluoreszenzrest steht.
Geeignete Fluoreszenzreste werden unter anderem vorzugsweise ausgewählt aus Fluoreszein, Rhodamin X, Tetramethylrhodamin, Texas Red, Phycoerythrin und Allophycocyanin. Nach der Entfernung des überschüssigen Reagenzes durch Entsalzen, Dialyse oder Größenausschlußchromatographie wird der Biokonjugatkomplex einer spektrophotometrischen Analyse unterzogen und die Anzahl an Phenylborsäurekomplexierungsresten oder Phenylborsäureresten wird durch den Vergleich des Verhältnisses der Absorption bei 280 nm, die die Gesamtprotinkonzentration anzeigt, mit der Absorption bei einer Wellenlänge berechnet, die für den Fluorophor charakterisitisch ist (λmax). Semikonjugate, die von anderen hochmolekularen bioaktiven Einheiten stammen, welche zur Reinigung durch Entsalzen, Dialyse oder Größenausschlußchroamtographie geeignet sind, können auf analoge Weise charakterisiert werden.

Beispiel I: Herstellung eines aminreaktiven Reagenzes der Formel XIV, nämlich N-(3-Dihdroxybonrlphenyl)succinamsäuresuccinimidylester

Bernsteinsäureanhydrid (5,00 g, 0,05 mol) und (3-Aminophenyl)borsäure (7,75 g, 0,05 mol) werden in wasserfreiem Pyridin (40 ml) gelöst und dann über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Wasser (20 ml) wird zugegeben und die entstehende Lösung kann für 1 Stunde stehen. Das Produkt wird dann in einem Rotationsverdampfer bei 85-90ºC konzentriert. Die entstehende wäßrige Lösung wird in einer Trockeneis-Aceton- Aufschlämmung eingefroren und über Nacht lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird in Wasser (50 ml) gelöst und mit konzentrierter HCl auf etwa pH 1,0 angesäuert. Die angesäuerte Lösung wird dann für eine Stunde in einem Eisbad gekühlt und der Niederschlag wird durch Filtration gewonnen. Der Niederschlag wird aus siedendem Wasser umkristallisiert (200 ml) und über Nacht im Vakuum über NaOH Pellets unter Bildung von 8,60 g (70% Ausbeute) an N-(3-Dihydroxyborylphenyl)succinamsäure getrocknet. Homogen gemäß DC (CHCl&sub3; / CH&sub3;OH / CH&sub3;COOH, 60 : 35 : 5), Rf = 0,5. Schmelzpunkt 186-188ºC. Die Struktur wird durch ¹H NMR Spektrometrie bei 300 MHz in d&sub6;- DMSO bestätigt.
N-(3-Dihydroxyborylphenyl)succinamsäure (16,0 g, 0,063 mol) wird in trockenem DMF (80 ml) gelöst.
Zur Lösung wird N,N-Dicyclohexylcarbodiixnid (14,3 g, 0,069 mol) gefolgt von N-Hydroxysuccinimid (8,05 g, 0,070 mol) gegeben. Die Reaktion wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. N,N-Dicyclohexylharnstoff wird aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird mit Ethylacetat extrahiert (200 ml). Der Extrakt wird mit Wasser (3 · 400 ml) und gesättigtem NaCl (400 ml) gewaschen. Die Wasserwaschlösung wird mit Ethylacetat rückextrahiert (200 ml), die Extrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und auf einem Rotationsverdampfer unter Bildung von 12,5 g (57% Ausbeute) an N-(3-Dihydroxyborylphenyl)succinamsäuresuccinimidylester konzentriert. Die Reinheit wird durch DC (CHCl&sub3; / CH&sub3;OH / CH&sub3;COOH, 85 : 10 : 5) mit 98% bestimmt, Rf = 0,7. Die Struktur wird durch ¹H NMR Spektroskopie bei 300 MHz in d&sub6;-DMSO bestätigt.

Beispiel II: Anwendungen eines aminreaktiven Reagenzes der allgemeinen Formel XIV

Proteine können mit aminreaktiven Phenylborsäurereagenzien der Formel XIV durch die Umsetzung mit den Seitenketten-s-Aminogruppen der Lysinreste unter Bildung von Semikonjugaten mit anhängenden Phenylborsäureresten modifiziert werden, die kovalent durch stabile Amidbindungen an das Protein gebunden sind. N,N- Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid sind die Lösemittel der Wahl. Milde alkalische wäßrige Puffer im pH Bereich von 7, 8 bis 8, 8 und vorzugsweise 100 mM Bicarbonatpuffer pH 8,2 sollten verwendet werden, um sicherzustellen, daß die Aminogruppe nicht protoniert ist, wobei die Hydrolyse des N-Hydroxysuccinimidylesters minimiert wird. Aktivierte N-Hydroxysuccirumidylester wechselwirken mit den Phenylborsäuren in alkalischen wäßrigen Lösungen, was zu einer signifikanten Verringerung ihrer Reaktivität führt. Um diese Beschränkung zu überwinden sollten wäßrige Reaktionen, die N-(3-Dihydroxyborylphenyl)succinamsäuresuccinimidylester enthalten, nur in Gegenwart eines mindestens zehnfachen molaren Überschusses eines Phenylborsäurekomplexierungsliganden ausgeführt werden. Verbindungen, die diesbezüglich brauchbar sind, umfassen Mannit und Katechol. Phenylboratkomplexe, die vorübergehend für diesen Zweck hergestellt wurden, können leicht bei der Neutralisation der Lösung dissozüeren. Puffer, die primäre Amine enthalten, wie Tris und Glycin, müssen aufgrund ihrer potentiellen Reaktivität vermieden werden. Die Festphasenträger mit anhängenden primären Aminresten, einschließlich Blotmembranen und Mikrotiterplatten können durch Umsetzung mit Phenylborsäurereagenzien der Formel XIV unter Bildung von Festphasenträgern mit anhängenden Phenylborsäureresten funktionalisiert werden.

Beispiel III: Herstellung eines Tlüol-reaktiven Rea~enzes der allgemeinen Formel XIV, nämlich (3-Maleimidophenyl)borsäure

Ethylacetat (400 ml) wird in einem Eisbad auf etwa 0ºC abgekühlt. Maleimid (7,76 g) wird zum gekühlten Lösemittel unter Rühren gefolgt von N-Ethylmorpholin (10,19 ml) zugegeben. Methylchlorformiat (6,26 ml) wird tropfenweise aus einem Zugabetrichter mit einer geeigneten Geschwindigkeit zugegeben, um die Temperatur der Reaktion unter 3ºC zu halten. Nach vollständiger Zugabe wird die Umsetzung für weitere 30 Minuten gerührt, wobei die Temperatur unter 3ºC gehalten wird. Das entstehende Gemisch wird durch eine Nutsche filtriert und der Niederschlag wird mit einem kleinen Volumen Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung werden vereinigt und dann mit eiskaltem Wasser (100 ml) gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und dann auf einem Rotationsverdampfer konzentriert. Das Produkt wird in einem Gemisch aus Ethylacetat und Isopropylether (40 : 60 V/V, 75 ml) in einem Wasserbad bei 60ºC gelöst und kann dann bei Raumtemperatur umkristallisieren. Die Kristalle des N-Methoxycarbonylmaleimids werden mit Isopropylether (2 · 20 ml) gewaschen und dann über Nacht im Vakuum getrocknet.
(3-Aminophenyl)borsäure (1,26 g, 0,01 mol) wird in gesättigtem NaHCO&sub3; (50 ml) durch kurzes Erhitzen des Gemisches auf einer heißen Platte gelöst. Die Lösung wird in einem Eisbad auf etwa 0ºC abgekühlt und N- Methoxycarbonylmaleimid (1,55 g, 0,01 mol) wird unter starkem Rühren zugegeben. Nach 10 Minuten wird die Lösung mit Wasser (200 ml) verdünnt und dann bei Raumtemperatur für 30 bis 40 Minuten gerührt. Der pH wird durch die Zugabe von 1 M H&sub2;SO&sub4; auf etwa 5, 5 eingestellt und der Niederschlag wird durch Filtration gewonnen. Der Niederschlag wird mit 1 M H&sub2;SO&sub4; (2 · 50 ml) gewaschen und dann über Nacht im Vakuum über NaOH Pellets unter Bildung von 1,39 g (64% Ausbeute) an (3-Maleimidophenyl)borsäure getrocknet. Die Struktur wird durch eine 'H NMR Spektrometrie bei 300 MHz in d&sub6; DMSO bestätigt.

Beispiel IV: Anwendungen eines Tlüol-reaktiven Reagenzes der allgemeinen Formel XIV

Proteine, die Disulfidbindungen (Cystinreste) oder Cysteinreste enthalten, können durch thiolreaktive Phenylborsäurereagenzien der Formel XIV modifiziert werden. Die Disulfidbindungen werden zuerst, falls erforderlich, durch Umsetzung mit 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreit, in einem alkalischen wäßrigen Puffer reduziert. Der Überschuß an Reduktionsmittel wird durch Dialyse oder Entsalzung entfernt und das Protein wird mit (3-Maleimidophenyl)borsäure in 25 bis 100 mM Phosphatpuffer pH 7,0 bis 7,5 für 1 Stunde bei 4ºC unter Bildung eines Semikonjugats mit anhängenden Phenylborsäureresten umgesetzt, die kovalent an das Protein gebunden sind. Die Proteine, denen Thiolreste fehlen, können durch Umsetzung mit einem thioleinführenden Reagenz funktionalisiert und dann wie oben beschrieben modifiziert werden. Die thioleinführenden Reagenzien, die für diesen Zweck brauchbar sind, umfassen N-Hydroxysuccinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, N-Hydroxysuccinimidyl-S-acetylthioacetat und 2-Iminothiolan.

Beispiel V: Herstellun eines aldehydreaktiven Reagenzes der allgemeinen Formel XIV, nämlich N-(3-Dihydroxyborvlyhenyl)succinamsäurehydrazid

Methanol (10 ml) wird in einem Eisbad bei etwa 0ºC gekühlt und Thionylchlorid (1 ml) wird langsam zugegeben. Zur entstehenden gerührten Lösung wird N-(3-Dihydroxyborylphenyl)succinamsäure (1,25 g, 0,005 mol) gegeben, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, und die Reaktion wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in einem Rotationsverdampfer unter Bildung eines weißen kristallinen Materials konzentriert, das zweimal aus Methanol (2 · 10 ml) verdampft wird, um restliches Thionylchlorid zu entfernen. Das Produkt wird in Methanol (5 ml) gelöst und Hydrazinhydrat (1 ml) wird zugegeben. Die entstehende Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es bildet sich innerhalb weniger Stunden ein Niederschlag. Der Niederschlag wird durch Filtration gewonnen, mit kaltem Methanol gewaschen und über Nacht im Vakuum über NaOH Pellets unter Bildung von 1,11 g (88% Ausbeute) an N-(3-Dihydroxyborylphenyl)succinamsäurehydrazid getrocknet. Die Struktur wird durch 1H NMR Spektrometrie bei 300 MHz in 4 DMSO bestätigt.

Beispiel VI: Anwendung eines aldehydreaktiven Reagenzes der allgemeinen Formel XIV

Glycoproteine und insbesondere Antikörper, können mit einem aldehydreaktiven Phenylborsäurehydrazidreagenz nach der Behandlung des Proteins mit 5 bis 20 mM Natriummetaperiodat (NaIOa) in 0,1 bis 0,5 M Natriumacetatpuffer bei pH 5 bis 6, der bis zu 0,2 M Natriumchlorid enthält, bei 0ºC für 30 Minuten bis 4 Stunden konjugiert werden. Das überschüssige Periodat wird durch Entsalzen entfernt und das aktivierte Protein mit anhängenden nebeneinanderliegenden Aldehydresten, die von der Periodatoxidation der Kohlenhydratreste mit 1,2-Diolresten stammen, wird mit dem Hydrazidreagenz für 1 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Bildung eines Semikonjugats mit anhängenden Phenylborsäureresten kondensiert, die an das Protein über eine Bindung vom Typ Schiffsche Base (ein Imin) kovalent gebunden sind. Die Stabilität der Bindung an das Protein kann, falls dies gewünscht wird, durch milde Natriumcyanoborhydridreduktion der Schiffschen Base zum entsprechenden Alkylamin erhöht werden Es ist wichtig zu erwähnen, daß die Periodatoxidation eines Glycoproteins das Protein zur Umsetzung mit einem Reagenz vom Hydrazidtyp vorbereitet, während gleichzeitig die meisten natürlich vorkommenden Phenylborsäurekomplexierungsreste (koaxiale 1,2-Diole) mit den Glycoproteinen assoziiert sind.

Beispiel VI Synthese der Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien der allgemeinen Formel XI

Die Reagenzien der allgemeinen Formel XI, worin die Gruppe W* ausgewählt ist aus NHZ, NHCH&sub3; oder NHOH und worin die Gruppe Q für O steht, leiten sich entweder von 4-Aminosalicylsäure oder 5-Aminosalicylsäure ab. Die 4- oder 5-Aminosalicylsäure wird zuerst unter Bildung von jeweils entweder Methyl-4-aminosalicylat oder Methyl-5-aminosalicylat verestert. Der Ester wird neutralisiert und dann durch Umsetzung mit einem Amin, das aus Ammoniak, Methylamin oder Hydroxylamin ausgewählt ist, unter Bildung des 4- oder 5-Aminosalicylamids der Formel XXII amidiert:
worin R' für H steht, W* ausgewählt ist aus NH&sub2;, NHCH&sub3; und NHOH und Q für O steht. Die Verbindung wird als nächstes mit einer aktivierten Carbonsäure, unter anderem vorzugsweise ausgewählt aus Bernsteinsäureanhydrid, Methylsuccinylchlorid, Maleinsäureanhydrid, N-Methoxycarbonylmaleimid, 3-Brompropionylchlorid, 3-Iodpropionylchlorid, Iodacetylchlorid, Bromacetylchlorid und Chloracetylchlorid, unter Bildung des entsprechenden 4- oder 5-Amidosalicylamids kondensiert, worin Q für O steht, W* für NHz, NHCH&sub3; oder NHOH steht und R für ein Amid der Formel Z"-CO- steht, worin Z" steht für CH&sub2;CH&sub2;COOH, CH&sub2;CH&sub2;COOCH&sub3;, CH=CHCOOH, CH&sub2;CH&sub2;Br, CH&sub2;CH&sub2;I, CH&sub2;I, CH&sub2;Br und CH&sub2;Cl.
Die Verbindungen, worin Z" ausgewählt ist aus CH&sub2;I oder CH&sub2;Br sind als thiolreaktive Reagenzien brauchbar, die zum Anhängen eines Phenylborsäurekomplexierungsrests an eine bioaktive Einheit mit anhängenden Thiolgruppen geeignet sind. Die Verbindungen, worin Z" für CH=CHCOOH steht, können weiter durch Ringschluß unter Bildung eines thiolreaktiven Maleimidreagenzes funktionalisiert werden, das zum Anhängen eines Phenylborsäurekomplexierungsrests an eine bioaktive Einheit mit anhängenden Thiolgruppen geeignet ist. Wenn Z" für CH&sub2;CH&sub2;COOCH&sub3; steht, kann die Verbindung durch die Umsetzung mit Hydrazinhydrat unter Bildung eines Hydrazidreagenzes weiter flinktionalisiert werden, worin Z" für CH&sub2;CH&sub2;CONHNH&sub2; steht, das zum Anhängen eines Phenylborsäurekomplexierungsrests an eine bioaktive Einheit mit anhängenden Aldehydgruppen geeignet ist (welche aus der Periodatoxidation der Kohlenhydratreste herrühren). Wenn Z" ausgewählt ist aus CH&sub2;CH&sub2;Br oder CH&sub2;CH&sub2;I kann es weiter durch die Umsetzung mit Kaliumthiolacetat unter Bildung eines Zwischenprodukts funktionalisiert werden, das nach einer Schutzgruppenabspaltung die Thiol-enthaltende Verbindung ergibt, worin Z" für CH&sub2;CH&sub2;SH steht. Die Thiol-enthaltende Verbindung kann durch die Umsetzung mit einem Reagenz, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus 2, 2'-Dithiodipyridin, 4,4'-Dithiodipyridin und 2,2'-Dithiodi-(3-nitropyridin) unter Bildung eines aktivierten Disulfid-enthaltenden Reagenzes aktiviert werden, das zum Anhängen eines Phenylborsäurekomplexierungsrests an eine bioaktive Einheit mit anhängenden Thiolgruppen durch eine spaltbare Disulfidbindung geeignet ist.
Wenn W* in Formel XXII ausgewählt ist aus NH&sub2; oder NHCH&sub3; und die Gruppe Z" für CH&sub2;CH&sub2;COOH steht, ist eine weitere Funktionalisierung durch die Umsetzung mit Dicyclohexylcarbodiiniid (DCC) und einem Reagenz, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder N-Hydroxysulfosuccinimid (SNHS) unter Bildung eines aktivierten Esterreagenzes möglich, das zum Anhängen eines Phenylborsäurekomplexieurngsrests an eine bioaktive Einheit mit anhängenden Amingruppen geeignet ist. Aktivierte Ester der Formel XXII, worin W* ausgewählt ist aus NH&sub2; und NHCH&sub3;, und worin Z" für CH&sub2;CH&sub2;CO-NHS steht, sind als synthetische Zwischenprodukte zur Herstellung von Reagenzien der Formel XI brauchbar, worin die Gruppe Z aus einer Alkylkette oder einer Polyethylenglycolkette mit einer Länge von mindestens 6 Kol> lenstoffäquivalenten besteht.
Wenn W* für NHOH steht, können solche Verbindungen nicht routinemäßig zur Herstellung von Reagenzien mit aktivierten Estereinheiten aufgrund von Problemen verwendet werden, die auftreten, wenn die Carbonsäuregruppe in Gegenwart sowohl von NHS als auch der Benzohydroxamsäuregruppe aktiviert wird, die mit dem Phenylborsäurekomplexierungsrest assoziiert ist. Dies stellt eine Beschränkung aufgrund der Bekanntheit der N- Hydroxysuccinimidreagenzien und der Tatsache dar, daß nur Reagenzien der Formel XI, worin W* ausgewählt ist aus NHOH oder NHOCH&sub3;, stabile Komplexe über einen weiten pH Bereich bilden. Um diese Beschränkung zu überwinden wird eine alternative Syntheseroute verwendet, um die aktivierten Esterreagenzien der Formel XI herzustellen, worin die Gruppe W* für NHOCH&sub3; steht und Q für O steht. 4-Aminosalicylsäure oder 5-Aminosalicylsäure wird mit Methylsuccinylchlorid unter Bildung einer Verbindung der Formel XXII kondensiert, worin die Gruppe W* für OH steht und worin die Gruppe Z" für CH&sub2;CH&sub2;COOCH&sub3; steht. Die anschließende Umsetzung mit N,N- Carbonyldiimidazol (CDI) gefolgt von der Zugabe von Methoxylaminhydrochlorid ergibt eine Verbindung, worin W* für NHOCH&sub3; und Z' für CH&sub2;CH&sub2;COOCH&sub3; steht. Die alkalische Hydrolyse der Carbonsäureestergruppe ergibt eine Verbindung mit einer freien Carbonsäuregruppe. Die anschließende Aktivierung der Carbonsäuregruppe durch die Umsetzung mit DCC und einem Reagenz, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus NHS oder SNHS ergibt ein aktiviertes Esterreagenz, worin W* für NHOCH&sub3; steht und Z" für Succinimidoxy steht, das zum Anhängen eines Phenylborsäurekomplexierungsrests an eine bioaktive Einheit mit anhängenden Amingruppen geeignet ist. Solche N-Hydroxysuccinimidylester sind als synthetische Zwischenprodukte zur Herstellung von Reagenzien der Formel XI brauchbar, worin die Gruppe Z aus einer Alkylkette oder Polyethylenglycolkette mit einer Länge von mindestens 6 Kohlenstoffäquivalenten besteht.
Die N-Hydroxysuccinimidylester können weiter durch die Umsetzung mit einem Reagenz funktionalisiert werden, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus 6-Aminohexansäure, 4-Aminobutansäure, N-tert- Butoxycarbonyl-1,6-diaminohexan (N-Boc-1,6-Diaminohexan) und N-Boc-1,4-Diaminobutan unter Bildung, erforderlichenfalls nach Entfernung der Boc-Schutzgruppe, einer Verbindung mit einem verlängerten Spacer und entweder einer terminalen Carbonsäuregruppe oder einer terminalen Amingruppe. Die vorher erwähnten Reagenzien mit anhängenden Carbonsäuregruppen sind zur Herstellung von NHS-Ester, SNHS-Ester und Hydrazid-enthaltenden Reagenzien mit längeren Spacern brauchbar, die zur Überwindung der sterischen Behinderung brauchbar sind, welche bekanntermaßen mit biologischen Makromolekülen mit hohem Molekulargewicht assoziiert ist. Ähnlich sind die vorher erwähnten Reagenzien mit anhängenden Amingruppen zur Herstellung von Iodacetamid-, Maleimid- und aktiviertes Disulfid-enthaltenden Gruppen mit langen Spacern brauchbar. Zusätzlich sind die vorher erwähnten Reagenzien entweder mit anhängenden Carbonsäuregruppen oder anhängenden Amingruppen brauchbare Synthesezwischenprodukte zur Herstellung von Festphasenträgern.

Beispiel VII: Synthese von Phenylborsäurekomplexierunnsreagenzien der Formel XII

Die Reagenzien der Formel XII, worin die Gruppe W* ausgewählt ist aus NH&sub2;, NHCH&sub3; und NHOH und worin die Gruppe Q für O steht, leiten sich von 4- oder 5-Aminosalicylsäure auf eine Weise ab, die zu der analog ist, welche zur Herstellung von Reagenzien der Formel XI verwendet wurde. Das 4- oder 5-Aminosalicylamid, das wie vorher beschrieben hergestellt wurde, wird mit einer aktivierten Dicarbonsäure, die unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus Succinylchlorid, Adipoylchlorid, Adipinsäurediisobutylcarbonat, Suberoylchlorid, 3,3'- Dithiopropionylchlorid, 3,6,9-Trioxaundecandioylchlorid und 3,6,9-Trioxaundecandionsäurediisobutylcarbonat unter Bildung einer Verbindung der Formel XII kondensiert, worin die Gruppe W* ausgewählt ist aus NIl2, NHCH&sub3; oder NHOH, worin die Gruppe Q für O steht und worin die Gruppe Z* unter anderem jeweils ausgewählt ist aus (CH&sub2;)&sub2;, (CH&sub2;)&sub4;, (CH&sub2;)a, (CH&sub2;)&sub2;SS(CH&sub2;)&sub2; und CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)&sub2;OCH&sub2;.
Die Reagenzien der Formel XII, worin die Gruppe W* für NHOCH&sub3; steht und worin die Gruppe Q für O steht, werden durch einen alternativen Syntheseweg auf eine analoge Weise zur Herstellung der Reagenzien der Formel XI hergestellt, worin die Gruppe W* für NHOCH&sub3; steht. Entweder 4- oder 5-Aminosalicylsäure wird mit einer aktivierten Dicarbonsäure, die vorzugsweise unter anderem ausgewählt ist aus Succinylchlorid, Adipoylchlorid, Adipinsäurediisobutylcarbonat, Suberoylchlorid, 3,3'-Dithiopropionylchlorid und 3,6,9-Trioxaundecandioylchlorid und 3,6,9-Trioxaundecandionsäurediisobutylcarbonat unter Bildung einer Verbindung der Formel XII kondensiert, worin die Gruppe W* für OH steht, worin die Gruppe Q für O steht und worin die Gruppe Z* unter anderem jeweils ausgewählt ist aus (CH&sub2;)&sub2;, (CH&sub2;)&sub4;, (CH&sub2;)&sub6;, (CH&sub2;)&sub2;SS(CH&sub2;)n und CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)2OCH&sub2;.
Die anschließende Umsetzung einer Verbindung der Formel XII, worin W* für OH steht, worin Q für O steht und worin Z* unter anderem ausgewählt ist aus (CH&sub2;)&sub2;, (CH&sub2;)&sub4;, (CH&sub2;)&sub6;, (CH&sub2;)&sub2;SS(CH&sub2;)&sub2; und CH(OCH&sub2;CH&sub2;)&sub2;OCH&sub2; mit CDI gefolgt von der Zugabe von Methoxylaminhydrochlorid ergibt eine Verbindung, worin die Gruppe W* für NHOCH&sub3; steht und worin die Gruppen Q und Z* wie vorher definiert sind.

Beispiel VIII: Herstellung von 4-Amino-2-hydroxybenzohydroxamsäure

Absolutes Methanol (100 ml) und frisch konzentrierte H&sub2;SO&sub4; werden vorsichtig in einem 250 ml Rundbodenkolben unter kontinuierlichem Rühren (exotherm) vereinigt. 4-Aminosaücylsäure (10,0 g, 65,4 mmol) wird unter Bildung einer dunklen Lösung zugegeben, die unter Rückfluß für 6 Stunden erhitzt wird. Das Produkt kann sich abkühlen und wird dann in einem Rotationsverdampfer auf etwa die Hälfte des ursprünglichen Volumens konzentriert. Zu diesem Zeitpunkt tritt ein fester Niederschlag auf. Das Konzentrat wird in 400 ml Wasser gegossen und die entstehende Suspension wird auf einen pH von etwa 3 titriert, durch stufenweise Zugabe von 5 N NaOH auf pH 6,5, wonach eine Zugabe von festem Na&sub2;CO&sub3; unter Bildung von CO&sub2; Gas erfolgt. Das Konzentrat wird auf Eis gekühlt und der entstehende Niederschlag wird durch Filtration gewonnen. Das Filtrat wird mit kaltem Wasser gewaschen und dann im Vakuum über NaOH Pellets unter Bildung von 9,6 g (88% Ausbeute) an Methyl-4-aminosalicylat als helles lavendelblaues Pulver getrocknet (Smp. 115-117ºC). Die Struktur wird durch ¹H NMR Spektrometrie in d&sub6;- Aceton bestätigt.
NaOH (4,0 g) in 16 ml Wasser wird sorgfältig zu Hydroxylaminhydrochlorid (2,8 g, 40 mmol) und 20 g Eis gegeben. Nach der Lösung wird Na&sub2;SO&sub3; (0,4 g) gefolgt von Methyl-4-aminosalicylat (3,35 g, 20 mmol) zugegeben. Die entstehende Lösung wird für bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei der Verlauf der Reaktion alle paar Stunden durch Umkehrphasen HPLC verfolgt wird. Die entstehende Lösung wird auf Eis gekühlt und durch die Zugabe von 25% H&sub2;SO&sub4; angesäuert. Es bildet sich als erstes ein Niederschlag bei etwa pH 6. Der pH wird schließlich auf etwa 4 eingestellt und der hellbraune Niederschlag wird durch Filtration gewonnen. Das Produkt wird über P&sub2;O&sub5; im Vakuum unter Bildung von 3,0 g (89% Ausbeute) an 4-Amino-2-hydroxybenzohydroxamsäure getrocknet (Smp. 180-181ºC). Die Struktur wird durch ¹H NMR Spektrometrie in d&sub6;-DMSO bestätigt.
4-Amino-2-hydroxybenzohydroxamsäure ist ein synthetisches Schlüsselzwischenprodukt bei der Herstellung der Reagenzien sowohl der allgemeinen Formel I als auch II, worin die Gruppe X für NHOH steht und worin die Gruppe Y für O steht. Reagenzien mit dem 2-Hydroxybenzohydroxamsäurerest können Biokonjugate bilden, die in gepufferten wäßrigen Lösungen über den ungefähren pH Bereich von 2,5 bis 11,5 stabil sind.

Beispiel IX: Herstellung eines aldehydreaktiven Phenylborsäurekomplexierun sreagenzes der Formel XI

Zu einer eisgekühlten, gerührten Lösung aus 4-Amino-2-hydroxybenzohydroxamsäure (8,4 g, 0,05 mol), die wie oben beschrieben hergestellt wurde, in 150 ml Wasser, das NaHCO&sub3; (7,0 g, 0,02 mol) enthält, wird 3-Carbomethoxypropionylchlorid (9,0 g, 0,06 mol) tropfenweise über 15 Minuten gegeben. Nach dem Rühren bei 0-5ºC für 1 h wird die Lösung mit kalter 6 N HCl angesäuert. Der Niederschlag wird gewonnen und im Vakuum über NaOH Pellets unter Bildung von 13,5 g (96% Ausbeute) an roher N-4-(3-Carbomethoxypropionamido)-2-hydroxybenzohydroxamsäure, getrocknet, die ohne weitere Reinigung verwendet wird.
Zu einer Lösung aus N-4-(3-Carbomethoxypropionamido)-2-hydroxybenzohydroxamsäure (10 g, 0,035 mol) in 50 ml Methanol wird Hydrazinhydrat (12 ml) gegeben. Die Reaktion kann über Nacht bei Raumtemperatur ablaufen und das Produkt wird filtriert und mit Ether gewaschen. Das Produkt wird zweimal aus Dimethylformamid unter Bildung von 7,3 g (78% Ausbeute) an N-4-(3-Hydrazidopropionamido)-2-hydroxybenzohydroxamsäure unkristallisiert.

Beispiel X: Anwendung eines aldehydreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes

Glycoproteine und insbesondere Antikörper, können mit einem aldehydreaktiven Phenylborsäurekomplexierungshydrazidreagenz nach der Behandlung des Proteins mit 5 bis 20 mM Natriummetaperiodat (NaIO&sub4;) in 0,1 bis 0,5 M Natriumacetatpuffer bei pH 5 bis 6, der bis zu 0,2 M Natriumchlorid enthält, bei 0ºC für 30 Minuten bis 4 Stunden konjugiert werden. Das überschüssige Periodat wird durch Dialyse und Entsalzen entfernt und das aktivierte Protein mit anhängenden nebeneinanderliegenden Aldehydresten, die von der Periodatoxidation der Kohlenhydratreste mit benachbarten koaxialen 1,2-Diolresten stammen, wird mit dem Hydrazidreagenz für 1 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Bildung eines Semikonjugats mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten kondensiert, die an das Protein über eine Bindung vom Typ Schiffsche Base (ein Imin) kovalent gebunden sind. Die Stabilität der Bindung an das Protein kann, falls dies gewünscht wird, durch milde Natriumcyanoborhydridreduktion der Schiffschen Base zum entsprechenden Alkylamin erhöht werden. Es ist wichtig zu erwähnen, daß die Natriummetaperiodatoxidation eines Glycoproteins das Protein zur Umsetzung mit einem Reagenz vom Hydrazidtyp vorbereitet, während gleichzeitig die meisten natürlich vorkommenden Phenylborsäurekomplexierungsreste (koaxiale 1,2- Diole) mit den Glycoproteinen assoziiert sind.

Beispiel XI Herstellung eines thiolreaktiven Phenylborsäurekomulexierungsreagenzes der Formel XI

Zu einer eisgekühlten, gerührten Lösung aus 5-Aminosalicylamid (10,0 g, 0,073 mol) in 300 ml Wasser, das NaHCO&sub3; (42,0 g, 0,5 mol) enthält, wird Iodacetylchlorid (18,4 g, 0,09 mol) tropfenweise über 15 Minuten gegeben. Nach dem Rühren bei 0-5ºC für 1 h wird die Lösung mit kalter 6 N HCl angesäuert. Der Niederschlag wird gewonnen und im Vakuum über NaOH Pellets unter Bildung von 21,3 g (96% Ausbeute) an rohem 5- (Iodacetamido)salicylamid getrocknet.
Beispiel XII· Anwendung eines thiolreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes Proteine, die Disulfldbindungen (Cystinreste) oder Cysteinreste enthalten, können mit einem thiolreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenz, wie 5-(Iodacetamido)salicylamid, modifiziert werden. Die Disulfldbindungen werden zuerst, falls erforderlich, durch Umsetzung mit 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreit, in einer alkalischen wäßrigen Lösung reduziert, die sorgfältig entgast wurde. Der Überschuß an Reduktionsmittel wird durch Dialyse oder Entsalzung entfernt und das Protein wird mit Alkylierungsmittel in neutralen wäßrigen Lösungen für 1 Stunde bei 4ºC unter Bildung eines Semikonjugats mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten umgesetzt, die kovalent an das Protein gebunden sind. Nach der vollständigen Reaktion kann das überschüssige Reagenz durch Entsalzen entfernt werden.

Beispiel XIII Herstellung eines aminreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes der Formel XI

Zu einer eisgekühlten, gerührten Lösung aus 4-Aminosalicylsäure (7,7 g, 0,05 mol), die wie oben beschrieben hergestellt wurde, in 150 ml Wasser, das NaHCO&sub3; (7,0 g, 0,02 mol) enthält, wird 3-Carbomethoxypropionylchlorid (9,0 g, 0,06 mol) tropfenweise über 15 Minuten gegeben. Nach dem Rühren bei 0-5ºC für 1 h wird die Lösung mit kalter 6 N HCL angesäuert. Der Niederschlag wird gewonnen und im Vakuum über NaOH Pellets unter Bildung von 11,9 g (89% Ausbeute) an roher N-4-(3-Carbomethoxypropionamido)salicylsäure getrocknet, die ohne weitere Reinigung verwendet wird.
Zu einer stark gerührten Lösung aus N-4-(3-Carbomethoxypropionamido)salicylsäure (10,0 g, 0,036 mol) in 50 ml Tetrahydrofuran werden schrittweise 1, 1-Carbonyldiimidazol (5,84 g, 0,036 mol) und Methoxylaminhydrochlorid (3,0 g, 0,036 mol) gegeben. Das Gefäß ist mit einem Trockenrohr ausgestattet und die Reaktion wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur stark gerührt. Imidazoliumhydrochlorid, das sich während des Reaktionsverlaufs abtrennt, wird durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird auf einem Rotationsverdampfer unter Bildung eines bernsteinfarbenen Öls konzentriert, das in 10 ml warmem Tetrahydrofuran gelöst und dann zu 150 ml 2 N H&sub2;SO&sub4; gegeben wird. Der Niederschlag wird durch Filtration gewonnen und mit 2 N 112504 gewaschen, mit Wasser gewaschen und dann über Nacht im Vakuum über NaOH Pellets unter Bildung von 10,0 g (94% Ausbeute) an N-4-(3- Carbomethoxypropionamido)-2-hydroxy-O-methylbenzohydroxamsäure getrocknet. N-4-(3-Carbomethoxypropionamido)-2-hydroxy-O-methylbenzohydroxamsäure (7,4 g, 0,025 mol) wird in 25 ml 0,2 N methanolischem LiOH gelöst. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Methanol wird auf einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wird in 150 ml Wasser gelöst. Einer Ansäuerung der Lösung auf etwa pH 2 mit 2 N H&sub2;SO&sub4; folgt eine Extraktion in 100 ml Ether. Einer zweiten Extraktion in Ether folgt die Trocknung der vereinigten Etherextrakte über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4;. Das Produkt wird auf einem Rotationsverdampfer konzentriert und dann über Nacht im Vakuum über P&sub2;O&sub5; unter Bildung von 6,28 g (89% Ausbeute) an N-4- Succinamido-2-hydroxy-O-methylbenzohydroxamsäure konzentriert.
N-4-Succinamido-2-hydroxy-O-methylbenzohydroxamsäure (5,65 g, 0,02 mol) wird in 50 ml heißem Dimethylformamid gelöst und kann sich auf Raumtemperatw abkühlen. Zw gerührten Lösung wird N- Hydroxysuccinimid (2,3 g, 0,02 mol) gefolgt von einer frisch hergestellten Lösung aus Dicyclohexylcarbodiimid (4,1 g, 0,02 mol) in 10 ml Dimethylformamid gegeben. Die entstehende Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatw gerührt. Dicyclohexylharnstoff wird aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird auf einem Rotationsverdampfer auf ein minimales Volumen konzentriert. Der Rückstand wird mit Ether gefällt und der Niederschlag wird durch Filtration gewonnen, mit Ether gewaschen, mit 2-Propanol gewaschen und dann kurz im Vakuum über P&sub2;O&sub5; unter Bildung von 5,6 g (74% Ausbeute) an N-4-Succinamido-2-hydroxy-O-methylbenzohydroxamsäuresuccinimidylester getrocknet. Das Produkt wird in einem Gefrierschrank bei -15ºC gelagert.

Beispiel XIV: Anwendung eines aminreaktiven Phenylborsäurekomolexierungsreagenzes

Proteine können mit aminreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien dwch die Umsetzung mit den Seitenketten-s-Aminogruppen der Lysinreste unter Bildung von Semikonjugaten mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten modifiziert werden, die kovalent durch stabile Amidbindungen an das Protein gebunden sind. Milde alkalische Puffer im pH Bereich von 7, 8 bis 8, 8 sollten verwendet werden, um sicherzustellen, daß die Aminogruppe nicht protoniert ist, wobei die Hydrolyse des NHS Esters minimiert wird. Puffer, die primäre Amine enthalten, wie Tris und Glycin, müssen vermieden werden, um eine Kreuzreaktivität zu vermeiden. Die Festphasenträger mit anhängenden primären Aminresten können auf analoge Weise dwch Umsetzung mit Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien unter Bildung von Festphasenträgern mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten funktionalisiert werden.

Beispiel XV: Herstellung eines Phenylborsäurekomplexierunusreagenzes der Formel XII

4-Amino-2-hydroxybenzohydroxamsäure (6,4 g, 0,038 mol) wird in 50 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Triethylamin (5,3 ml, 0,038 mol) wird gefolgt von der tropfenweisen Zugabe einer Lösung aus 3,6,9- Trioxaundecandioylchlorid (5,0 g, 0,019 mol) in 50 ml trockenem Dichlormethan über einen Zeitraum von 2 Stunden zugegeben. Triethylammoniumhydrochlorid wird dwch Filtration entfernt und das Filtrat wird mit Wasser (2 · 100 ml), gesättigtem NaHCO&sub3; (2 · 100 ml) und gesättigtem NaCl (100 ml) gewaschen und über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösemittel wird auf einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wird aus Methanol (100 ml) unter Bildung von 6,0 g (61% Ausbeute) an farblosen Kristallen umkristallisiert. Die Struktur wird dwch ¹H NMR Spektrometrie in 4 DMSO bestätigt.

Beispiel XVI: Anwendung eines Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes der Formel XII

Proteine, die mit Phenylborsäure konjugiert werden, können durch die Wirkung von Reagenzien der Formel XII quervernetzt werden. Dieses Verfahren ist besonders zur Herstellung von Proteinaggregaten brauchbar, die zur Modifizierung der Eigenschaften bezüglich Proteinstabilität und Proteinlöslichkeit brauchbar sind. Zusätzlich sind Enzymaggregate, die durch Quervernetzung hergestellt wurden, zur Amplifizierung der Empfindlichkeit des ELISA brauchbar. Dieses Prinzip wird im Avidin-Biotin-System durch die Verwendung von Avidin-Biotin Komplexen (ABC Komplexe genannt) ausgenutzt, worin das biotinylierte Enzym zuerst unter Bildung eines hochmolekularen Komplexes mit Avidin (durch Quervernetzung) verwendet wird, bevor der Komplex in einem ELISA zur hochempfindlichen Detektion eines biotinylierten Antikörpers eingeführt wird.

Beispiel XVII Allgemeine Synthese der Phenylborsäurekomplexierungsreanenzien der Formel XVIII

Die Reagenzien der Formel XVIII, worin beispielsweise X ausgewählt ist aus H, CH&sub3; und CJ-15, und worin Y für O steht, werden durch Kondensation von N-Hydroxyphthalimid mit einer Verbindung der allgemeinen Formel R&sub1;-Z-R&sub2; hergestellt, worin R&sub1; aus Br, Cl und I ausgewählt ist und vorzugsweise für Br steht, und worin R&sub2; aus Br, Cl, I, CO&sub2;H und CO&sub2;CH&sub3; ausgewählt ist und vorzugsweise aus Br, CO&sub2;H und CO&sub2;CH&sub3; ausgewählt ist und worin Z wie für XVIII definiert ist, beispielsweise ein Spacer, der aus einer Alkylkette oder einer Polyetherkette mit einer Länge von 2 bis 12 Kohlenstoffäquivalenten ausgewählt ist und Zwischenproduktamidfunktionalitäten enthalten kann und vorzugsweise für (CH&sub2;)º steht, worin n für 2 bis 6 steht, oder (CH&sub2;CH&sub2;O)n, worin n für 2 bis 4 steht.
(a) In der Initialreaktion wird eine Verbindung der allgemeinen Formel R&sub1;-Z-R&sub2; in Dimethylformamid mit einem Äquivalent N-Hydroxyphthalimid bei 40ºC bis 100ºC erhitzt, bis eine Lösung erhalten wird. Die Lösung kann sich dann auf Raumtemperatur abkühlen, wonach ein Äquivalent Triethylamin zugegeben wird, was eine dunkelrote Farbe hervorruft, die mit dem N-Hydroxyphthalimidanion assoziiert ist. Die Lösung wird bei Raumtemperatur für ein bis vier Tage gerührt, wobei der Fortschritt der Reaktion durch Dünnschichtchromatographie (DC) verfolgt wird. Nach Vervollständigung der Umsetzung wird Wasser zugegeben, um die Ausfällung des Produkts zu bewirken, das mit Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet wird, um ein Produkt zu erhalten, worin R&sub1; für Phthalimido steht und R&sub2; wie vorher definiert ist. Das Produkt, worin R&sub2; aus Br, Cl und I ausgewählt ist, wird mit einem Reagenz umgesetzt, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus C&sub6;H&sub4;(CO)&sub2;NK, CH&sub3;COONa und CH&sub3;COSK. Die Bedingungen variieren in Abhängigkeit der Auswahl des gewünschten Produkts, umfassen aber im allgemeinen die Zugabe von 1, l Äquivalenten von entweder C&sub6;H&sub4;(CO)&sub2;NK, CH&sub3;COONa oder CH&sub3;COSK durch Kochen am Rückfluß in einem polaren Lösemittel ausgewählt aus Essigsäure, Dimethylformamid, Methanol oder Ethanol für 1 bis 24 Stunden.
(b) Das Produkt von (a) wird dann einer säurekatalysierten Hydrolyse der Phthalimidgruppe so unterzogen, daß R&sub1; zu NH&sub2; wird und R&sub2; zu R&sub2;Ac acyliert wird, worin R&sub2;Ac ausgewählt ist aus N(CO)&sub2;C&sub6;H&sub4;, OCOCH&sub3; und SCOCH&sub3; und worin Z wie vorher definiert ist. Die säurekatalysierte Hydrolyse der Phthalimidgruppe ergibt, wenn R&sub2; für CO&sub2;CH&sub3; steht, ein Produkt, worin R&sub2; ausgewählt ist aus CO&sub2;H oder CO&sub2;CH&sub3; und worin Z wie vorher definiert ist. Die Phthalimidgruppe wird durch kurzes Erhitzen am Rückfluß für 15 bis 60 Minuten entweder in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure, konzentrierter Chlorwasserstoffsäure in Essigsäure, 30% Bromwasserstoffsäure oder 48% Bromwasserstoffsäure entfernt. In jedem Fall wird das Phthalsäurenebenprodukt aus der entstehenden Lösung abfiltriert, nachdem man sie auf Raumtemperatur abgekühlt hat. Das Volumen wird verringert und das Produkt entweder mit NaOH, NaHCO&sub3; oder Na&sub2;CO&sub3; neutralisiert. Die Extraktion in Ether oder Ethylacetat und die anschließende Konzentrierung im Vakuum ergibt das Produkt.
(c) Das Produkt von (b) wird dann mit einem Reagenz kondensiert, das aus Salicylaldehyd, 2-Hydroxyacetophenon und 2-Hydroxydiphenylketon ausgewählt ist, um die entsprechenden Carbonimidoylprodukte an R&sub1; zu erhalten. Die Kondensation der Produkte mit einem Reagenz ausgewählt aus Salicylaldehyd, 2-Hydroxyacetophenon und 2-Hydroxydiphenylketon wird durch Kochen am Rückfluß in Methanol oder 90% Ethanol bei 60ºC für 4 bis 12 Stunden erreicht, wobei der Fortschritt der Reaktion durch DC verfolgt wird. Das Produkt wird im Vakuum konzentriert und dann über Nacht in einem Exsikkator getrocknet.
(d) Die Produkte von (c) werden durch basenkatalysierte Hydrolyse in warmen K&sub2;CO&sub3; oder NaOH ihr 8 bis 24 Stunden unter Bildung von Produkten der allgemeinen Formel PS von den Schutzgruppen befreit, worin R&sub3; und Q wie vorher definiert sind. Das Produkt wird mit HCl angesäuert, in Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Schutzgruppe wird durch die Umsetzung mit Hydrazinhydrat in Ethanol am Rückfluß für 12 bis 48 Stunden entfernt. Das ausgefallene Phthalhydrazid wird aus der Lösung filtriert, die Lösung wird konzentriert, das Produkt wird in Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
(e) Das Endprodukt wird durch Aktivierung der Amino-, Hydroxyl-, Thiol- oder Carbonsäuregruppen hergestellt, die am Produkt vorhanden sind. Die Aminogruppen können durch die Umsetzung mit einem Reagenz aktiviert werden, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus Bromessigsäureanhydrid, Iodessigsäureanhydrid und Maleinsäureanhydrid. Die Hydroxygruppen können durch Umsetzung mit einem Reagenz aktiviert werden, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid, Pentafluorbenzolsulfonylchlorid, Toluolsulfonylchlorid und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit. Die Thiolgruppen können durch die Umsetzung mit einem Reagenz aktiviert werden, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus 2-Thiopyridon, 4-Thiopyridon und 3-Nitro-2-mercaptopyridin. Die Carbonsäuregruppen können durch die Umsetzung mit einem Reagenz, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid in Gegenwart eines Reagenzes aktiviert werden, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus N-Hydroxysuccinimid und N-Hydroxysulfosuccinimid. Alternativ dazu können Carbonsäuregruppen mit einem Alkohol verestert werden, vorzugsweise ausgewählt aus Methanol und Ethanol und dann durch die Umsetzung mit einem Reagenz weiter funktionalisiert werden, das aus Hydrazinhydrat und Hydroxylamin ausgewählt ist.
Die Produkte der allgemeinen Formel XVIII, worin X aus H, CH&sub3; oder C&sub6;H&sub5; ausgewählt ist und worin Y für CH&sub2; steht, werden wie vorher beschrieben durch Ersetzen von Kaliumphthalimid durch N-Hydroxyphthalimid im anfänglichen Schritt der Synthese hergestellt.

Beispiel XVIII: Allgemeine Synthese der Phenylborsäurekomplexierunusreagenzien der Formel XIX

(a) Reagenzien der allgemeinen Formel XIX, worin Y für O steht, werden auf eine Weise hergestellt, die zu der oben beschriebenen analog ist, wobei die Synthese exakt so durch die Schritte (a) und (b) läuft, wie dies im vorangehenden Beispiel beschrieben ist. Das Produkt von Schritt (b) des vorangehenden Beispiels wird dann mit einem Reagenz, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus 2-Acetoxybenzoylchlorid und 2-Benzyloxybenzoylchlorid unter Bildung des entsprechenden Amids kondensiert. Die Kondensation der Produkte mit einem Reagenz, das vorzugsweise ausgewählt ist aus 2-Acetoxybenzoylchlorid oder 2-Benzoyloxybenzoylchlorid, wird durch Rühren in Dichlormethan, das ein Äquivalent Triethylamin enthält, für 1 Stunde bei Raumtemperatur erreicht, wobei der Fortschritt der Reaktion durch DC verfolgt wird. Triethylammoniumhydrochlorid wird aus der Lösung filtriert. Das Filtrat wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
(b) Die Produkte des vorangehenden Schritts werden durch eine basenkatalysierte Hydrolyse in warmen wäßrigen K&sub2;CO&sub3; oder NaOH für 8 bis 24 Stunden von den Schutzguppen befreit (beispielsweise an R&sub2; deacyliert). Das Produkt wird mit HCl angesäuert, in Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Falls eine Acetoxyschutzgruppe verwendet wurde, um die phenolische Hydroxylgruppe während der Herstellung der Produkte zu schützen, würde sie hier auch entfernt werden, was das Erfordernis für den folgenden Syntheseschritt ausschließt. Die Schutzgruppe wird durch die Umsetzung mit Hydrazinhydrat (N&sub2;H&sub2; · X H&sub2;O) in Ethanol am Rückfluß für 12 bis 48 Stunden entfernt. Das ausgefallene Phthahydrazid wird aus der Lösung filtriert, diese wird konzentriert, das Produkt in Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
(c) Die Produkte von Schritt (b) werden ferner von den Schutzgruppen befreit, erforderlichenfalls durch die Entfernung der Benzyloxyschutzgruppe dwch katalytische Hydrierung. Die katalytische Hydrierung läuft über einen Palladium-Kohle Katalysator in wasserfreiem absolutem Ethanol für 2 bis 12 Stunden. Der Katalysator wird dwch Filtration entfernt und das Produkt wird im Vakuum konzentriert.
(d) Das Endprodukt wird dwch die Aktivierung der Amino-, Hydroxyl-, Thiol- oder Carbonsäuregruppen hergestellt, die am Produkt vorhanden sind. Die Aminogruppen können dwch die Umsetzung mit einem Reagenz aktiviert werden, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus Bromessigsäureanhydrid, Iodessigsäureanhydrid und Maleinsäureanhydrid. Die Hydroxygruppen können dwch Umsetzung mit einem Reagenz aktiviert werden, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid, Pentafluorbenzolsulfonylchlorid, Toluolsulfonylchlorid und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit. Die Thiolgruppen können dwch die Umsetzung mit einem Reagenz aktiviert werden, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus 2-Thiopyridon, 4-Thiopyridon und 3-Nitro-2-mercaptopyridin. Die Carbonsäuregruppen können durch die Umsetzung mit einem Reagenz, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus Dicyclohexylcarbodiimid und 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid in Gegenwart eines Reagenzes aktiviert werden, das unter anderem vorzugsweise ausgewählt ist aus N-Hydroxysuccinimid und N-Hydroxysulfosuccinimid. Alternativ dazu können Carbonsäuregruppen mit einem Alkohol verestert werden, vorzugsweise ausgewählt aus Methanol und Ethanol und dann dwch die Umsetzung mit einem Reagenz weiter funktionalisiert werden, das vorzugsweise aus Hydrazinhydrat und Hydroxylamin ausgewählt ist. Falls die Aktivierung des Endprodukts mit dem Vorkommen einer phenolischen Hydroxylgruppe inkompatibel ist, dann können die Produkte zuerst aktiviert und die Benzyloxyschutzgruppe anschließend entfernt werden, vorausgesetzt die aktivierte Form ist gegenüber der katalytischen Hydrierung stabil. Die Produkte der allgemeinen Formel XII, worin die Gruppe Z für CH&sub2; steht, werden wie vorher beschrieben durch den Austausch von Kaliumphthalimid gegen N-Hydroxyphthalimid im anfänglichen Schritt der Synthese hergestellt.

Beispiel XIX: Herstellung eines aldehydreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes der allgemeinen Formel XVIII

Im anfänglichen Schritt der Synthese wird Methyl-6-bromhexanoat mit N-Hydroxyphthalimid dwch Rühren in Dimethylformamid für 24 Stunden kondensiert, das ein Äquivalent Triethylamin enthält. Das Produkt wird durch Gießen in Wasser ausgefällt, durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen, in einem Vakuumexsikkator getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet.
Im zweiten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Rohprodukt kurz in einem Gemisch aus Essigsäure und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure am Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen wird die ausgefallene Phthalsäure aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird konzentriert und wiederholt mit kleinen Volumina Wasser gemeinsam eingedampft, um die Spuren an Säwe zu entfernen. Schließlich wird das Aminooxyhydrochloridprodukt mit NaHCO&sub3; neutralisiert, in Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
- Im dritten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Aminooxyprodukt mit einem Äquivalent 2-Hydroxybenzaldehyd durch Kochen am Rückfluß für 6 Stunden in 90% Ethanol kondensiert und dann unter Bildung des Aldoxims im Vakuum konzentriert.
Schließlich wird das erhaltene Aldoximprodukt mit überschüssigem Hydrazinhydrat durch Rühren über Nacht in Methanol behandelt. Das ausgefallene Hydrazidaldoximprodukt wird in einem Eisbad gekühlt, aus der Lösung filtriert, in Methanol rückgelöst und dann im Vakuum konzentriert.

Beispiel XX: Anwendung eines aldehydreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes

Glycoproteine und insbesondere monoklonale Antikörper, können mit einem aldehydreaktiven Phenylborsäurekomplexierungshydrazidreagenz nach der Behandlung des Proteins mit Natriummetaperiodat in einer alkalischen wäßrigen Lösung für 1 bis 12 Stunden konjugiert werden. Das überschüssige Periodat wird durch Dialyse oder Entsalzen entfernt und das aktivierte Protein mit anhängenden nebeneinanderliegenden Aldehydresten, die von der Periodatoxidation der Kohlenhydratreste mit benachbarten koaxialen 1,2-Diolresten stammen, wird mit dem Hydrazidreagenz für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Bildung eines Semikonjugats mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten kondensiert, die an das Protein über eine Bindung vom Typ Schiffsche Base kovalent gebunden sind. Die Stabilität der Bindung an das Protein kann durch NaCNBH&sub3; Reduktion der Schiffschen Base zum entsprechenden Amin erhöht werden. Es ist wichtig zu erwähnen, daß die Natriummetaperiodatoxidation eines Glycoproteins das Protein zur Umsetzung mit einem Reagenz vom Hydrazidtyp vorbereitet, während gleichzeitig die meisten natürlich vorkommenden Phenylborsäurekomplexierungsreste (koaxiale 1,2-Diole) mit den Glycoproteinen assoziiert sind.

Beispiel XXI: Herstellung eines thiolreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes der allgemeinen Formel XIX

Im anfänglichen Schritt der Synthese wird 1,2-Bis-(2-iodethoxy)ethan mit N-Hydroxyphthalimid durch Kochen am Rückfluß in Dimethylformamid für 3 Tage kondensiert, das ein Äquivalent Triethylamin enthält. Das Produkt wird durch Gießen in Wasser ausgefällt, durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen, in einem Vakuumexsikkator getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet.
Im zweiten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Rohprodukt in absolutem Ethanol mit einem Überschuß an Kaliumthioacetat behandelt und die entstehende gelbe Suspension wird für 1 Stunde am Rückfluß erhitzt. Das Gemisch wird abgekühlt, filtriert und im Vakuum konzentriert und die Aufschlämmung wird zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt. Die vereinigten Ethylacetatphasen werden mit gesättigter wäßriger NaHCO&sub3; Lösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
Im dritten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Produkt kurz in einem Gemisch aus Essigsäure und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure am Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen wird die ausgefallene Phthalsäure aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird konzentriert und wiederholt mit kleinen Volumina Wasser gemeinsam eingedampft, um die Spuren an Säure zu entfernen. Schließlich wird das Aminooxyhydrochloridprodukt mit NaH- CO&sub3; neutralisiert, in Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Im vierten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Aminooxyprodukt mit einem Äquivalent 2-Acetoxybenzoylchlorid durch Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur in Dichlormethan kondensiert, worin ein Äquivalent Triethylamin enthalten ist, wobei der Fortschritt der Reaktion durch DC verfolgt wird. Triethylammoniumhydrochlorid wird aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
Im fünften Schritt der Synthese wird das oben erhaltene 2-Acetoxybenzohydroxamsäureprodukt in absolutem Methanol sorgfältig mit Stickstoff entgast und mit einem Äquivalent wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; behandelt und die entstehende gelbe Suspension wird für 12 Stunden stark gerührt. Die Suspension wird filtriert und im Vakuum konzentriert. Schließlich wird das Mercapto-2-hydroxybenzohydroxamsäureprodukt mit einer Lösung aus (Methoxycarbonyl)sulfenylchlorid in trockenem, entgastem Methanol durch Rühren bei 0ºC für 1 Stunde behandelt und das Methanol wird im Vakuum entfernt. Das Produkt wird erneut in entgastem Methanol gelöst und mit 1 Äquivalent 3- Nitro-2-mercaptopyridin druch Rühren bei Raumtemperatur für 1 bis 12 Stunden behandelt. Das Gemisch wird zur Entfernung des nicht reagierten 3-Nitro-2-mercaptopyridins filtriert und das Produkt wird im Vakuum konzentriert.

Beispiel XXII: Anwendung eines thiolreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes

Die Disulfidbrücken enthaltenden Proteine können mit einem thiolreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenz konjugiert werden. Die Disulfidbindungen werden zuerst durch Umsetzung mit 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreit, in einer alkalischen wäßrigen Lösung reduziert, die sorgfältig entgast wurde. Der Überschuß an Reduktionsmittel wird durch Dialyse oder Entsalzung entfernt und das Protein wird mit dem thiolreaktiven Reagenz in einer sorgfältig entgasten alkalischen wäßrigen Lösung unter Stickstoff über Nacht bei 4ºC unter Bildung eines Semikonjugats mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten umgesetzt, die kovalent über Disulfidbindungen an das Protein gebunden sind. Nach Vervollständigung der Reaktion wird das überschüssige Reagenz durch Entsalzen oder durch Thiolaustauschchromatographie entfernt. Die Phenylborsäurekomplexierungsreste können vom Semikonjugat durch die Reduktion der Disulfidbindung entfernt werden, wie dies oben beschrieben ist. Auf diese Weise können Biokonjugate, die aus thiolreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien hergestellte Semikonjugate enthalten, gespalten werden.

Beispiel XXIII: Herstellung eines aminreaktiven Phenylborsäurekomplexieurungsreagenzes der allgemeinen Formel XIX

Im anfänglichen Schritt der Synthese wird 2-[2-(2-Chlorethoxy)ethoxy]ethanol mit N-Hydroxyphthalimid durch Kochen am Rückfluß in Dimethylformamid für 2 Tage kondensiert, das ein Äquivalent Triethylamin enthält. Das Produkt wird durch Gießen in Wasser ausgefällt, durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen, in einem Vakuumexsikkator getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet.
Im zweiten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Rohprodukt kurz in einem Gemisch aus Essigsäure und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure am Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen wird die ausgefallene Phthalsäure aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird konzentriert und dann wiederholt mit kleinen Volumina Wasser gemeinsam eingedampft, um die Spuren an Säure zu entfernen. Schließlich wird das Aminooxyhydrochloridprodukt mit NaHCO&sub3; neutralisiert, in Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
Im dritten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Hydroxyaminooxyprodukt mit einem Äquivalent 2-Benzyloxybenzoylchlorid durch Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur in Dichlormethan kondensiert, worin ein Äquivalent Triethylamin enthalten ist, wobei der Fortschritt der Reaktion durch DC verfolgt wird. Triethylammoniumhydrochlorid wird aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
Im vierten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Hydroxy-2-benzyloxybenzohydroxamsäureprodukt mit einem Äquivalent 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid durch Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur in Acetonitril kondensiert, das ein Äquivalent Triethylamin enthält. Triethylammoniumhydrochlorid wird aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
Schließlich wird die Benzyloxyschutzgruppe durch katalytische Hydrierung über Palladium-Kohle für 8 Stunden in wasserfreiem absolutem Ethanol entfernt. Der Katalysator wird durch Filtration entfernt und das Produkt wird im Vakuum konzentriert.

Beispiel XXIV: Anwendung eines aminreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes

Proteine können mit aminreaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien durch die Umsetzung mit den Seitenkettenaminogruppen der Lysinreste unter Bildung eines Semikonjugats mit anhängenden Phenylborsäurekomplexierungsresten modifiziert werden, die kovalent durch stabile Sulfonamidbindungen an das Protein gebunden sind. Alkalische wäßrige Puffer sollten verwendet werden, um sicherzustellen, daß die Aminogruppe nicht protoniert ist. Puffer, die primäre Amine enthalten, wie Tris und Glycin, müssen vermieden werden, um eine Kreuzreaktivität zu vermeinden. Die Festphasenträger mit anhängenden primären Aminresten können auf analoge Weise durch Umsetzung mit Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien unter Bildung von Festphasenträgern mit anhängenden Phenylborsäurekomplexienungsresten funktionalisiert werden.

Beispiel XXV: Herstellung eines reaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes mit synthetischem Oligonukleotid der allgemeinen Formel XIX

Im anfänglichen Schritt der Synthese wird 2-[2-(2-Chlorethoxy)ethoxy]ethanol mit N-Hydroxyphthalimid durch Kochen am Rückfluß in Dimethylformamid für 2 Tage kondensiert, das ein Äquivalent Triethylamin enthält. Das Produkt wird durch Gießen in Wasser ausgefällt, durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen, in einem Vakuumexsikkator getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet.
Im zweiten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Rohprodukt kurz in einem Gemisch aus Essigsäure und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure am Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen wird die ausgefallene Phthalsäure aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird konzentriert und dann wiederholt mit kleinen Volumina Wasser gemeinsam eingedampft, um die Spuren an Säure zu entfernen. Schließlich wird das Aminooxyhydrochloridprodukt mit NaHCO&sub3; neutralisiert, in Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
Im dritten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Hydroxyaminooxyprodukt mit einem Äquivalent 2-Acetoxybenzoylchlorid durch Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur in Dichlormethan kondensiert, worin ein Äquivalent Triethylamin enthalten ist, wobei der Fortschritt der Reaktion durch DC verfolgt wird. Triethylammoniumhydrochlorid wird aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
Im vierten Schritt der Synthese wird das oben erhaltene Hydroxy-2-acetoxybenzohydroxamsäureprodukt mit einem Äquivalent 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit durch Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur in Acetonitril kondensiert, das ein Äquivalent Triethylamin enthält. Triethylammoniumhydrochlorid wird aus der Lösung filtriert und das Filtrat wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert.
Im finften Schritt der Synthese wird die oben erhaltene 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit-2- acetoxybenzohydroxamsäure in Acetonitril gelöst und in das angeschlossene Reservoir eines automatisierten Oligonukleotidsynthesegeräts gegeben. Das Produkt wird mit dem freien 5'-OH Ende eines immobilisierten synthetischen Oligonukleotids kondensiert, wobei es einer Synthese durch Pyridin-katalysierte Umsetzung mit dem 2-Cyanoethyl- N,N-diisopropylphosphoramiditreagenz in Acetonitril unterzogen wird. Die Festphasensynthese wird auf diese Weise beendet. Im letzten Schritt der Synthese wird das Produkt vom Glasfestphasenträger durch Ammoniolyse über Nacht mit konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 50 bis 60ºC abgespalten. Die Ammoniolyse entfernt das Produkt vom Festphasenträger und entfernt auch alle Acylschutzgruppen einschließlich der Acetoxygruppe, die mit der 2- Acetoxybenzohydroxamsäurefunktionalität assoziiert ist. Das Produkt wird durch die Entfernung des Ammoniaks in einer Speedvac konzentriert und dann durch Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gereinigt.

Beispiel XXVI: Anwendung eines reaktiven Phenylborsäurekomplexierungsreagenzes mit synthetischem Oligonukleotid

Synthetische Oligonukleotide können mit 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditphenylborsäurekomplexierungsreagenzien während der letzten Stufe einer automatisierten Festphasenoligonukleotidsynthese unter Bildung von synthetischen Oligonuldeotiden konjugiert werden, die 5'-anhängende Phenylborsäurekomplexierungsreste aufweisen.

Claims

1. Biokonjugatkomplexe der Formel A

BAS-L-Bc-L'-(Bc'-L")n-BAS' (A)

worin BAS und BAS' für bioaktive Einheiten stehen (die gleich oder verschieden sein können), L, L' und L" für Linker stehen (die gleich oder verschieden sein können), Bc und Bc' ihr Phenylborsäurekomplexe (die gleich oder verschieden sein können) der Formel D-E oder der Formel E-D stehen, worin D für einen Phenylborsäurerest steht und E für einen Phenylborsäurekomplexierungsrest steht, worin der Phenylborsäurekomplexierungsrest einen an das Bor des Phenylborsäurekomplexierungsrests gebundenen Stickstoff umfaßt und n für 0 oder I steht.

2. Biokonjugatkomplexe nach Anspruch 1, die aus den Formeln I bis X ausgewählt sind

worin

Q und Q' unabhängig ausgewählt sind aus O, S. NR. N-Alkyl, N-Aryl und NCH&sub2;-Aryl,

Y und Y' unabhängig ausgewählt sind aus O, NR. N-Alkyl, Alkyl und Aryl,

Z, Z', Z* und Z*' für Spacer stehen, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkyl und Polyetherketten mit einer Länge

von 1 bis 16 Kohlenstoffäquivalenten, worin die Kette Zwischenamide und Disulfidbindungen enthalten kann, BAS, BAS', BAS* und BAS*' für bioaktive Einheiten stehen, die gleich oder verschieden sein können, X und X' unabhängig ausgewählt sind aus H, CH&sub3; und C&sub6;H&sub5;,

W und W' unabhängig ausgewählt sind aus O, NH, N-Alkyl, NC&sub6;H&sub5;, N-Aryl, NCH&sub2;-Aryl, NCH&sub2;CH&sub2;OH, NCOCH&sub2;CH&sub2;OH, NOH, NO-Alkyl und NOCH&sub2;-Aryl,

worin, falls nichts anderes angegeben ist, Alkyl für einen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu sechs Kohlenstoffen steht und Aryl ausgewählt ist aus einem aromatischen Ring, einem substituierten aromatischen Ring und fusionierten aromatischen Ringen.

3. Verwendung von Phenylborsäuresemikonjugaten der Formel XV

worin Z* und BAS* wie in Anspruch 2 definiert sind, zur Herstellung von Biokonjugatkomplexen nach Anspruch 1 oder 2.

4. Phenylborsäurekomplexierungssemikonjugat, ausgewählt aus der Formel XIII, XX und XXI

worin Q, X, Y, Z und BAS wie in Anspruch 2 definiert sind und W* ausgewählt ist aus H, OH, NHz, NHCH&sub3;, NHOH und NHOCH&sub3;.

5. Verwendung von Phenylborsaurereagenzien der Formel XIV

worin Z* wie in Anspruch 2 definiert ist und R für einen elektrophilen oder nukleophilen Rest steht, der zur Reaktion mit einer bioaktiven Einheit geeignet ist zur Herstellung von biologischen Konjugaten gemäß Anspruch 1 oder 2.

6. Phenylborsäurekomplexierungsreagenzien, die ausgewählt sind aus den Formeln XI, XVIII und XIX

worin Q, X, Y und Z wie in Anspruch 2 definiert sind, W* wie in Anspruch 4 definiert ist und R für einen elektrophilen oder nukleophilen Rest steht, der zur Reaktion mit einer bioaktiven Einheit geeignet ist.

7. Phenylborsäurequervernetzungsreagenzien der Formel XII

worin Q und Z* wie in Anspruch 2 definiert sind und W* wie in Anspruch 4 definiert ist.

8. Verwendung von Phenylborsäurequervernetzungsreagenzien der Formel XVI oder XVII

worin Z* wie in Anspruch 2 definiert ist zur Herstellung von Biokonjugatkomplexen nach Anspruch 1 oder 2.

9. Biokonjugatkomplexe oder Semikonjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin zumindest eine der bioaktiven Einheiten ein Antikörper ist.

10. Kit oder System zur Isolierung einer gewünschten Zellpopulation, umfassend ein Biokonjugat oder Semikonjugat nach Anspruch 9.

11. Verfahren zur Isolierung einer gewünschten Zellpopulation, das die Schritte des Zusammenbringens eines Zellen enthaltenden Mediums mit einem Biokonjugatkomplex nach Anspruch 9, worin der Antikörper ein Epitop erkennt und bindet, das für die gewünschte Zellpopulation charakteristisch ist, und des Abtrennens der Zellen vom Medium umfaßt.

12. Biokonjugatkomplexe nach Anspruch 1, worin E von einem Analogon der Salicylsäure abgeleitet ist.