JPH0327397A - 蛋白の分離方法 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Biochemistry (AREA)
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- Electrostatic Separation (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、一般的には有機化合物の分離方法に関する。
さらに詳1−<は、本発明は蛋白の分離方法に関する。
多くの産業分野において蛋白を分離することが望ましい
。例えば研究では、ある成分がある性質又は結果を与え
るか否かを決めるために蛋白を分離することが必要であ
る。他の産業(例えば医薬品、食品、化粧品)では、あ
る製品を供給したり、製品を改良したりするのに、蛋白
の分離が必要である。さらに診断又は治療用に蛋白の分
離が好ましいことがある。しかし蛋白の分離には、多く
の他の理由や必要性がある。
。例えば研究では、ある成分がある性質又は結果を与え
るか否かを決めるために蛋白を分離することが必要であ
る。他の産業(例えば医薬品、食品、化粧品)では、あ
る製品を供給したり、製品を改良したりするのに、蛋白
の分離が必要である。さらに診断又は治療用に蛋白の分
離が好ましいことがある。しかし蛋白の分離には、多く
の他の理由や必要性がある。
蛋白の分離方法には多種類ある。その分離は、分子の大
きさ;溶解度;電荷;吸収性の違い;及び他の分子に対
する生物学的親和性に基づいて実施することができる。
きさ;溶解度;電荷;吸収性の違い;及び他の分子に対
する生物学的親和性に基づいて実施することができる。
このような方法の例としては、イオン交換;ゲル瀘過;
疎水性クロマトグラフィー;及びモノクローナル抗体を
用いる特異的クロマトグラフィーなどがある。イオン交
換では電荷により蛋白を分離し、ゲル濾過では蛋白の分
子量と形により蛋白を分離する。イオン交換クロマトグ
ラフィーで通常使用される2つの物質は、ジエチルアミ
ノエチルセルロース(DEAE−セルロース)とカルボ
キシメチルセルロース(CMーセルロース)である。D
EAE−セルロースはall7. 0で陽性に荷電した
基を含有し、従って陰イオン交換体である。CM−セル
ロースは中性pl+で陰性に荷電した基を含有し、従っ
て陽イオン交換体である。
疎水性クロマトグラフィー;及びモノクローナル抗体を
用いる特異的クロマトグラフィーなどがある。イオン交
換では電荷により蛋白を分離し、ゲル濾過では蛋白の分
子量と形により蛋白を分離する。イオン交換クロマトグ
ラフィーで通常使用される2つの物質は、ジエチルアミ
ノエチルセルロース(DEAE−セルロース)とカルボ
キシメチルセルロース(CMーセルロース)である。D
EAE−セルロースはall7. 0で陽性に荷電した
基を含有し、従って陰イオン交換体である。CM−セル
ロースは中性pl+で陰性に荷電した基を含有し、従っ
て陽イオン交換体である。
もちろん現在利用できる方法により、多くの蛋白を分離
し精製することは可能であるが、現在の方法をいろいろ
組み合わせても必ずしも全ての蛋白が分離できるわけで
はない。従って現在の方法では、蛋白中のいくつかの関
連するアミノ酸残基の性質を区別することができないこ
とがある。例えば、アルギニンとリジンの比率の差に基
づいて蛋白を分離する場合、変性が予想されるような非
常に高い9}1でクロマトグラフ一一する以外の方法を
われわれはまだ知らない。さらに現在利用できる方法で
は、充分精製された製品を得られるように蛋白を分離で
きないこともある。
し精製することは可能であるが、現在の方法をいろいろ
組み合わせても必ずしも全ての蛋白が分離できるわけで
はない。従って現在の方法では、蛋白中のいくつかの関
連するアミノ酸残基の性質を区別することができないこ
とがある。例えば、アルギニンとリジンの比率の差に基
づいて蛋白を分離する場合、変性が予想されるような非
常に高い9}1でクロマトグラフ一一する以外の方法を
われわれはまだ知らない。さらに現在利用できる方法で
は、充分精製された製品を得られるように蛋白を分離で
きないこともある。
従って蛋白の分離のための別の方法が必要である。
発明の要約
本発明は有機化合物、特に蛋白を分離するための新規な
方法を与える。この目的のため本発明は、パイ電子と、
交換体と有機化合物の特異的或分の静電荷相互作用に基
づいて有機化合物(特に蛋白)を分離する方法を与える
。具体的には本発明は、パイ電子と、交換体と蛋白及び
ポリペブチドのアミノ酸残基の静電荷相互作用の組合せ
に基づいて、蛋白を分離する方法を与える。
方法を与える。この目的のため本発明は、パイ電子と、
交換体と有機化合物の特異的或分の静電荷相互作用に基
づいて有機化合物(特に蛋白)を分離する方法を与える
。具体的には本発明は、パイ電子と、交換体と蛋白及び
ポリペブチドのアミノ酸残基の静電荷相互作用の組合せ
に基づいて、蛋白を分離する方法を与える。
本発明の態様において、交換体は陰イオン性である。こ
の交換体は、陽性電荷を有しパイ電子を含有するアミノ
酸残基に基づき蛋白を分離する。
の交換体は、陽性電荷を有しパイ電子を含有するアミノ
酸残基に基づき蛋白を分離する。
好適な態様において、交換体は、アルギニン(及びホモ
アルギニン)のグアニジノ基と、ヒスチジンのイミダゾ
ール基に対して高い親和性を有するリガンド( l I
gand)を含むバルビツール酸塩を含有する。ヒスチ
ジンのpKa値のため、バルビツール酸リガンドは2つ
の異なるpHにおいて蛋白を分離する手段を与える。蛋
白はpi値が8以上では主にアルギニン含量に基づいて
分離し、pll値が約7以下ではアルギニンとヒスチジ
ン含量の合計に基づいて分離することがわかっている。
アルギニン)のグアニジノ基と、ヒスチジンのイミダゾ
ール基に対して高い親和性を有するリガンド( l I
gand)を含むバルビツール酸塩を含有する。ヒスチ
ジンのpKa値のため、バルビツール酸リガンドは2つ
の異なるpHにおいて蛋白を分離する手段を与える。蛋
白はpi値が8以上では主にアルギニン含量に基づいて
分離し、pll値が約7以下ではアルギニンとヒスチジ
ン含量の合計に基づいて分離することがわかっている。
従って陽イオ・ン性蛋白は、2種類の異なる分離方法の
ため、異なるpllレベルでこのマトリックスを利用す
ることができる。
ため、異なるpllレベルでこのマトリックスを利用す
ることができる。
ある態様において、陰イオン性交換体は、電荷の集中し
た又は分散したリガンドを含むことができる。このため
陰イオン性交換体に、さらに分離するための第2の特徴
が与えられる。例えば、パイ電子分布がバルビツール環
に類似しているが、電気陰性原子が少ないため電荷がも
っと集中している場合には、陰イオン性リガンドが選ば
れる。
た又は分散したリガンドを含むことができる。このため
陰イオン性交換体に、さらに分離するための第2の特徴
が与えられる。例えば、パイ電子分布がバルビツール環
に類似しているが、電気陰性原子が少ないため電荷がも
っと集中している場合には、陰イオン性リガンドが選ば
れる。
このようなリガンドの例としては、アミノ基により中性
マトリックスに結合したチラミンがあるであろう。フェ
ノール性水酸基の両側のオルトの位置に電子吸引基を付
加することにより、静電効果にほとんど影響を与えるこ
となくフェノール基のpKaを低下させることができる
。
マトリックスに結合したチラミンがあるであろう。フェ
ノール性水酸基の両側のオルトの位置に電子吸引基を付
加することにより、静電効果にほとんど影響を与えるこ
となくフェノール基のpKaを低下させることができる
。
さらに、陰イオン性交換体は分離のための第3の特徴を
与える。交換体のリーシュ(leash )の長さ又は
構造を変更することにより、陰イオン性交換体により第
3の特徴が与えられる。パイ電子と静電荷反応の組合せ
では反応の場が限定されるため、リーシュ(leash
)の長さを変えると、蛋白中の個々のアミノ酸に対す
る近付きやすさが変わる。
与える。交換体のリーシュ(leash )の長さ又は
構造を変更することにより、陰イオン性交換体により第
3の特徴が与えられる。パイ電子と静電荷反応の組合せ
では反応の場が限定されるため、リーシュ(leash
)の長さを変えると、蛋白中の個々のアミノ酸に対す
る近付きやすさが変わる。
ある態様においては、陰イオン性交換体はパラニトロフ
ェノールを含む。
ェノールを含む。
本発明の別の態様においては、交換体は陽イオン性であ
り、陰性に荷電しパイ電子を持つアミノ酸残基を有する
蛋白を分離するために働く。具体的には陽イオン交換体
は、カルボキシル残基とグルタミン酸残基に対して予想
される単純な静電気的親和性以外に、チロシン残基に対
する親和性に基づいて蛋白を分離する。この交換体の1
例は、N(β−グアニジノエチル)カルバミルメチルー
セルロース(G E CM−セルロース)である。陽イ
オン交換体と同様に、GECM−セルロースよりもチロ
シン残基に対しては親和性が同等か又は高く、アスパラ
ギン酸とグルタミン酸に対してはより親和性が低い、パ
イ電子の拡大した電気陰性原子のより分散した、陽性に
荷電したマトリックスにより、2番目の特徴が導入され
る。このようなリガンドの例としては、N(β−ビグア
ニジノエチル)一又はN(β−イソメラミノエチル)カ
ルバミルメチルーセルロースがある。
り、陰性に荷電しパイ電子を持つアミノ酸残基を有する
蛋白を分離するために働く。具体的には陽イオン交換体
は、カルボキシル残基とグルタミン酸残基に対して予想
される単純な静電気的親和性以外に、チロシン残基に対
する親和性に基づいて蛋白を分離する。この交換体の1
例は、N(β−グアニジノエチル)カルバミルメチルー
セルロース(G E CM−セルロース)である。陽イ
オン交換体と同様に、GECM−セルロースよりもチロ
シン残基に対しては親和性が同等か又は高く、アスパラ
ギン酸とグルタミン酸に対してはより親和性が低い、パ
イ電子の拡大した電気陰性原子のより分散した、陽性に
荷電したマトリックスにより、2番目の特徴が導入され
る。このようなリガンドの例としては、N(β−ビグア
ニジノエチル)一又はN(β−イソメラミノエチル)カ
ルバミルメチルーセルロースがある。
ある態様において、陰イオン性交換体はリーシュ(le
ash)の長さ及び/又は構造を変えることにより第3
の特徴が与えられる。
ash)の長さ及び/又は構造を変えることにより第3
の特徴が与えられる。
ある態様において、構造
(式中、Rはアルカンである)を有する陰イオン性交換
体が与えられる。ある態様においてRはメチルである。
体が与えられる。ある態様においてRはメチルである。
本発明の交換体は、蛋白を分離するためのカラムに使用
できる。ある態様において、本発明のりガンドは、特に
:セルロース;アガロース;デキストラン;アクリルア
ミド;スポセル(supocel) ;シリカゲル;ポ
リスチレン;デンブン;およびガラスを含むマトリック
スに結合している。
できる。ある態様において、本発明のりガンドは、特に
:セルロース;アガロース;デキストラン;アクリルア
ミド;スポセル(supocel) ;シリカゲル;ポ
リスチレン;デンブン;およびガラスを含むマトリック
スに結合している。
本発明の別の特徴や利点は、好適な態様の詳細な説明や
図面から明らかであろう。
図面から明らかであろう。
図面の簡単な説明
第1図はセファロースマトリックスに共有結合したバル
ビツール酸塩の滴定のグラフである。
ビツール酸塩の滴定のグラフである。
第2図は、CM−セルロース又はDEAE−セルロース
を用いて対になった蛋白をクロマトグラフイーした結果
である。
を用いて対になった蛋白をクロマトグラフイーした結果
である。
第3図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。
第4図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。
第5図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。
第6図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セフ7ロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。
明のバルビツール酸塩誘導体セフ7ロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。
第7図は、ブタエラスターゼのウシキモトリブシノーゲ
ンからの分離を示す。
ンからの分離を示す。
第8図は、フルオレスカミン(1’luorescam
lne )との反応でアミノ基を検出した、ptl8.
5と6.5でのクロマトグラフィーの結果を示す。
lne )との反応でアミノ基を検出した、ptl8.
5と6.5でのクロマトグラフィーの結果を示す。
第9図は、GECM−セルロースに通したチラミンとチ
ロシンの溶出パターンを示す。
ロシンの溶出パターンを示す。
第10図は、DEAE−セルロースとGECM一セルロ
ースに通したフエニル酢酸のfa出パターンを示す。
ースに通したフエニル酢酸のfa出パターンを示す。
第11図は、DEAE−セルロースとGECMセルロー
スに通したN−アセチルチラミンの溶出パターンを示す
。
スに通したN−アセチルチラミンの溶出パターンを示す
。
第12図は、DE−52、CM−52、及びGECM−
セルロースのマトリックスに通したキモトリプシノーゲ
ンーA1リボヌクレアーゼ、ウシ血清アルブミン、及び
オバルブミンの溶出パターンを示す。
セルロースのマトリックスに通したキモトリプシノーゲ
ンーA1リボヌクレアーゼ、ウシ血清アルブミン、及び
オバルブミンの溶出パターンを示す。
第13図は、DEAE−セルロースとGECMーセルロ
ースに通したりボヌクレアーゼとキモトリブシノーゲン
ーAの混合物の溶出パターンを示す。
ースに通したりボヌクレアーゼとキモトリブシノーゲン
ーAの混合物の溶出パターンを示す。
好適な態様の詳細な説明
本発明は有機化合物の分離のための新規な技術を与える
。さらに詳しくは、本発明は蛋白精製のための新規な技
術を与える。この技術は、パイ電子と、交換体と蛋白と
ポリベブチドの特異的アミノ酸残基の静電荷相互作用の
組合せに基づき、蛋白を分離する方法に基づく。具体的
には本発明は、蛋白の側鎖のパイ電子と静電荷に基づく
アミノ酸残基による蛋白の分離を目的とする。これらの
アミノ酸としては、陽性電荷を有するアルギニンとヒス
チジン、そして陰性電荷を有するチロシンがある。本発
明は好適な態様において、アスパラ酸とグルタミン酸残
基に基づいて蛋白を分離する。
。さらに詳しくは、本発明は蛋白精製のための新規な技
術を与える。この技術は、パイ電子と、交換体と蛋白と
ポリベブチドの特異的アミノ酸残基の静電荷相互作用の
組合せに基づき、蛋白を分離する方法に基づく。具体的
には本発明は、蛋白の側鎖のパイ電子と静電荷に基づく
アミノ酸残基による蛋白の分離を目的とする。これらの
アミノ酸としては、陽性電荷を有するアルギニンとヒス
チジン、そして陰性電荷を有するチロシンがある。本発
明は好適な態様において、アスパラ酸とグルタミン酸残
基に基づいて蛋白を分離する。
本発明は、陽イオン性又は陰イオン性であり得る交換体
を与える。以下に詳細に記載するように、リガンド上の
電荷を変化又は集中させることにより、交換体に蛋白分
離のための第2の特徴を与えることができる。リーシュ
(leash )の長さ、及び/またはリーシュ(le
ash)の成分を変えることにより、蛋白分離のための
第3の特徴を与えることができる。
を与える。以下に詳細に記載するように、リガンド上の
電荷を変化又は集中させることにより、交換体に蛋白分
離のための第2の特徴を与えることができる。リーシュ
(leash )の長さ、及び/またはリーシュ(le
ash)の成分を変えることにより、蛋白分離のための
第3の特徴を与えることができる。
本発明者は、アミノ酸残基の側鎖のパイ電子と静電荷に
基づき、蛋白中のアミノ酸により、蛋白を分離する方法
を見いだした。本発明の方法に従い、本発明はパイ電子
と静電荷に基づき少なくとも4セットのアミノ酸残基を
分離できる。アスパラギン酸とグルタミン酸は対になっ
て分離されることに注意すべきである。従って、本発明
は、パイ電子を有し、有効なpHにおいて荷電している
すべてのアミノ酸残基を分離できる。本発明は、従来可
能であった以上の蛋白を分離する一群の技術を与える。
基づき、蛋白中のアミノ酸により、蛋白を分離する方法
を見いだした。本発明の方法に従い、本発明はパイ電子
と静電荷に基づき少なくとも4セットのアミノ酸残基を
分離できる。アスパラギン酸とグルタミン酸は対になっ
て分離されることに注意すべきである。従って、本発明
は、パイ電子を有し、有効なpHにおいて荷電している
すべてのアミノ酸残基を分離できる。本発明は、従来可
能であった以上の蛋白を分離する一群の技術を与える。
本発明の1つの態様において、交換体、即ちリガンドは
バルビツール環である。バルビツール酸塩は、炭素−5
に結合した基を除くと、平面構造をしている。電気陰性
原子が大量にあるため、3炭索原子、3酸素原子、及び
2窒素原子を有するパイ電子系の存在下で陰性電荷が相
当量分布している。しかし平面構造のグアニジウムイオ
ンは、真の陽性電荷が分散しているかなりのパイ電子系
を有している。以下にその構造をしめず二〇 合成したバルビツール酸塩含有マトリックスは、アルギ
ニン(及びホモアルギニン)のグアニジノ基とヒスチジ
ンのイミダゾール基に対して、一般的に高い親和性を有
する。バルビツール酸塩含有マトリックスを用いて、主
にpll値約8以上ではアルギニン含量に基づき、pH
1約6.8以下ではアルギニンとヒスチジンの合計量に
基づき、蛋白を分離することができる。従って陽イオン
性蛋白は、2つの異なる分離のために2つの異なるpl
l値で、このマトリックスを利用することができる。こ
れに対して、ほとんどの陰イオン性蛋白は、pH8で結
合するようなかなりの又は充分な数のアルギニンがなけ
れば、おそらく低pHでのみ結合及び分離+i5能であ
ろう。
バルビツール環である。バルビツール酸塩は、炭素−5
に結合した基を除くと、平面構造をしている。電気陰性
原子が大量にあるため、3炭索原子、3酸素原子、及び
2窒素原子を有するパイ電子系の存在下で陰性電荷が相
当量分布している。しかし平面構造のグアニジウムイオ
ンは、真の陽性電荷が分散しているかなりのパイ電子系
を有している。以下にその構造をしめず二〇 合成したバルビツール酸塩含有マトリックスは、アルギ
ニン(及びホモアルギニン)のグアニジノ基とヒスチジ
ンのイミダゾール基に対して、一般的に高い親和性を有
する。バルビツール酸塩含有マトリックスを用いて、主
にpll値約8以上ではアルギニン含量に基づき、pH
1約6.8以下ではアルギニンとヒスチジンの合計量に
基づき、蛋白を分離することができる。従って陽イオン
性蛋白は、2つの異なる分離のために2つの異なるpl
l値で、このマトリックスを利用することができる。こ
れに対して、ほとんどの陰イオン性蛋白は、pH8で結
合するようなかなりの又は充分な数のアルギニンがなけ
れば、おそらく低pHでのみ結合及び分離+i5能であ
ろう。
バルビツール酸塩は、リガンドが結合していない状態で
pKa値は約7.9である。アルキル基の1つではなく
炭素−5の上にプロトンを有するバルビツール酸塩は、
4.04と4.97の間のpKaを持っているはずであ
る。これによりこの種のマトリックスの酸性911の応
用範囲が実質的に拡大する。ある蛋白は低pll値でし
か分離できないから、これは重要なことである。チオバ
ルビッール酸塩などの関連リガンドを使用することもで
きる。
pKa値は約7.9である。アルキル基の1つではなく
炭素−5の上にプロトンを有するバルビツール酸塩は、
4.04と4.97の間のpKaを持っているはずであ
る。これによりこの種のマトリックスの酸性911の応
用範囲が実質的に拡大する。ある蛋白は低pll値でし
か分離できないから、これは重要なことである。チオバ
ルビッール酸塩などの関連リガンドを使用することもで
きる。
他の関連した構造は、ピリミジン、プリン、そしてヒダ
ントイン及びその誘導体である。
ントイン及びその誘導体である。
例として、バルビツール酸塩マトリックスを利用する実
験操作を以下に示すが、これは本発明を限定するもので
はない。
験操作を以下に示すが、これは本発明を限定するもので
はない。
以下の化学薬品と組底物を使用した。ウシキモトリプシ
ノーゲン、a−キモトリブシン、リボヌクレアーゼ、a
−ラクトアルブミン及び血清アルプミン及びオバルブミ
ン、アグマチン、ヒスタミン、そしてブタエラスターゼ
はシグマ(Slgma )社より入手した。アリルジエ
チルエチルマロネート、尿素、臭化シアン、N−アセチ
ルエチレンジアミン、そしてO−メチルイソ尿素は、ア
ルドリッチ(^Idrleh )社より入手した。アジ
化ナトリウムとバルビツールはフィッシャーサイエンテ
ィフィック(Plsher Sclentle )社よ
り入手した。
ノーゲン、a−キモトリブシン、リボヌクレアーゼ、a
−ラクトアルブミン及び血清アルプミン及びオバルブミ
ン、アグマチン、ヒスタミン、そしてブタエラスターゼ
はシグマ(Slgma )社より入手した。アリルジエ
チルエチルマロネート、尿素、臭化シアン、N−アセチ
ルエチレンジアミン、そしてO−メチルイソ尿素は、ア
ルドリッチ(^Idrleh )社より入手した。アジ
化ナトリウムとバルビツールはフィッシャーサイエンテ
ィフィック(Plsher Sclentle )社よ
り入手した。
セ770−ス4Bはファルマシア(Phar+*acl
a )社より入手した。塩酸グアニジンはシュワルツ/
マン( Shvarz/ Mann)社より入手した。
a )社より入手した。塩酸グアニジンはシュワルツ/
マン( Shvarz/ Mann)社より入手した。
膨潤済みの微粒CM−セルロース及びDEAE−セルロ
ース(ワットマンCM一及びDE−52)は、エイチ・
リープエンジェルアンドカンパニー(H. Reeve
Angel and Company)社より入手し
た。フルオレスカミン(4−フェニルースピロ[フラン
−2(3H) 、1’ −フタラン] 3, 3’
−ジオン)は、ホフマンラロッシュ(HofTman−
LaRoche )社より入手した。以下に示す他の全
ての化学薬品は、人手できる最高のグレードであった。
ース(ワットマンCM一及びDE−52)は、エイチ・
リープエンジェルアンドカンパニー(H. Reeve
Angel and Company)社より入手し
た。フルオレスカミン(4−フェニルースピロ[フラン
−2(3H) 、1’ −フタラン] 3, 3’
−ジオン)は、ホフマンラロッシュ(HofTman−
LaRoche )社より入手した。以下に示す他の全
ての化学薬品は、人手できる最高のグレードであった。
蛋白のグアニジン化には標準的な方法を採用した。N−
アセチルーエチレンジアミンをO−メチルイソ尿素と反
応させ、2−アセトアミドエチルグアニジンを合成した
。5−エチル−5− (3−アミノプロピル)バルビツ
ール酸塩酸塩は以下のようにして合成した: Br O パーキンエルマ− FT R−800分光iをJTl
いてNMRスペクトルを求めた。全ての新規化合物のプ
ロトンNMRの分析結果は満足できるものであった。プ
レコートした薄層シリカゲルプレート(ワットマンMK
−6F)上で1−ブタノール:酢酸エチル:酢酸:水(
1 : 1 : 1 : 1)で展開してクロマトグラ
フイーすると、各バルビツール酸化合物は単一のスポッ
トを示した。
アセチルーエチレンジアミンをO−メチルイソ尿素と反
応させ、2−アセトアミドエチルグアニジンを合成した
。5−エチル−5− (3−アミノプロピル)バルビツ
ール酸塩酸塩は以下のようにして合成した: Br O パーキンエルマ− FT R−800分光iをJTl
いてNMRスペクトルを求めた。全ての新規化合物のプ
ロトンNMRの分析結果は満足できるものであった。プ
レコートした薄層シリカゲルプレート(ワットマンMK
−6F)上で1−ブタノール:酢酸エチル:酢酸:水(
1 : 1 : 1 : 1)で展開してクロマトグラ
フイーすると、各バルビツール酸化合物は単一のスポッ
トを示した。
ジエチルエチルアリルマロネートの合成氷の上で冷却し
た125mlの無水エタノール中12.2gの金属ナト
リウム(0.53モル)の溶液に、100srのジエチ
ルアリルマロネート(0.53モル)を加えた。少し発
熱反応が起き氷の上で冷却した後、若干過剰量のア・リ
ルブロマイド(77g,0.64モル)を加えた。激し
い発熱反応が約1分間続いた後、沈澱物が生成した。
た125mlの無水エタノール中12.2gの金属ナト
リウム(0.53モル)の溶液に、100srのジエチ
ルアリルマロネート(0.53モル)を加えた。少し発
熱反応が起き氷の上で冷却した後、若干過剰量のア・リ
ルブロマイド(77g,0.64モル)を加えた。激し
い発熱反応が約1分間続いた後、沈澱物が生成した。
次に1=100のフェノタレイン:エタノール溶液(W
/V)で試験して中性になるまで、反応混合液を約2時
間加熱沸騰させた。次にアルコールを蒸留して除去し、
固形残渣を得た。
/V)で試験して中性になるまで、反応混合液を約2時
間加熱沸騰させた。次にアルコールを蒸留して除去し、
固形残渣を得た。
残渣に水を加えると、油状の上層と下の水層が形或され
た。油層を分離し、水層のジエチルエーテル抽出液50
0mlと合わせた。合わせた溶液を最初に水で次に飽和
食塩水で洗浄した後、固体硫酸マグネシウムで約10分
間処理して残存している水を除去した。濾過した後この
無水溶液を蒸発させて95−100℃/5mmHgで蒸
留してジエチルエチルアリルマロネートを得た。
た。油層を分離し、水層のジエチルエーテル抽出液50
0mlと合わせた。合わせた溶液を最初に水で次に飽和
食塩水で洗浄した後、固体硫酸マグネシウムで約10分
間処理して残存している水を除去した。濾過した後この
無水溶液を蒸発させて95−100℃/5mmHgで蒸
留してジエチルエチルアリルマロネートを得た。
5−エチル−5−アリルバルビッール酸の合或無水エタ
ノール170ml中の金属ナトリウム(7.75g,0
.329モル)の溶液に尿素(19.76g,0.33
モル)を溶解した。この溶液に等モルのジエチルエチル
アリルマロネーート゛(75g,0.329モル〉を加
え、合わせた溶液を5時間以上加熱沸騰させた。溶液を
23℃に冷却し、濃塩酸で中和し濾過した。次に濾液を
蒸発させて得られたシロップに水200mlを加え水酸
化ナトリウムでアルカリ性にした。次に溶液をエーテル
で抽出し反応しなかったジエチルエチルアリルマロネー
トを除去した。水層を氷上で冷却し冷濃塩酸で酸性にし
た。バルビッール酸誘導体を分離した:これは濾過し最
小量のエタノールに溶解した。微小の結晶が形成するま
で水を加え、溶液を23℃で一晩放置した。濾過して結
晶を除き、冷水で洗浄し、空気乾燥した。融点は157
−159℃であった。
ノール170ml中の金属ナトリウム(7.75g,0
.329モル)の溶液に尿素(19.76g,0.33
モル)を溶解した。この溶液に等モルのジエチルエチル
アリルマロネーート゛(75g,0.329モル〉を加
え、合わせた溶液を5時間以上加熱沸騰させた。溶液を
23℃に冷却し、濃塩酸で中和し濾過した。次に濾液を
蒸発させて得られたシロップに水200mlを加え水酸
化ナトリウムでアルカリ性にした。次に溶液をエーテル
で抽出し反応しなかったジエチルエチルアリルマロネー
トを除去した。水層を氷上で冷却し冷濃塩酸で酸性にし
た。バルビッール酸誘導体を分離した:これは濾過し最
小量のエタノールに溶解した。微小の結晶が形成するま
で水を加え、溶液を23℃で一晩放置した。濾過して結
晶を除き、冷水で洗浄し、空気乾燥した。融点は157
−159℃であった。
トルエン8 0 0 ml中40.の5−エチル−5一
アリルバルビツール酸の懸濁液を撹拌し、GEサンラン
プ(275ワット、110−125ボルト)を約90分
間照財した。次に照射を続けながら、気体HBrを45
分間通し、さらに45分間撹拌した。次に反応フラスコ
を開けて、過剰のHBrを蒸発させた。溶液を冷却し濾
過した。得られた沈澱物をトルエンで洗浄した後、乾燥
し、最小量の熱アセトンに溶解した。少量の沈澱物が生
成するまで石油エーテル(80−68℃)を加えた:フ
ラスコを23℃で一晩放置した。結晶を濾過し、石浦エ
ーテルで洗浄し、空気乾燥した。融点は138−140
℃であった。
アリルバルビツール酸の懸濁液を撹拌し、GEサンラン
プ(275ワット、110−125ボルト)を約90分
間照財した。次に照射を続けながら、気体HBrを45
分間通し、さらに45分間撹拌した。次に反応フラスコ
を開けて、過剰のHBrを蒸発させた。溶液を冷却し濾
過した。得られた沈澱物をトルエンで洗浄した後、乾燥
し、最小量の熱アセトンに溶解した。少量の沈澱物が生
成するまで石油エーテル(80−68℃)を加えた:フ
ラスコを23℃で一晩放置した。結晶を濾過し、石浦エ
ーテルで洗浄し、空気乾燥した。融点は138−140
℃であった。
350mlのアセトン中30.の5−エチル−5一(3
−プロモブロビル)バルビッール酸と13gのアジ化ナ
トリウムの溶液に240mlの水を加え、約18時間還
流した。次に溶液を氷上で冷却し、濾過し、空気乾燥し
、最小量の95%熱エタノールに溶解した。冷却後結晶
が現れ、これを濾過し、空気乾燥した。融点は182−
184℃であった。
−プロモブロビル)バルビッール酸と13gのアジ化ナ
トリウムの溶液に240mlの水を加え、約18時間還
流した。次に溶液を氷上で冷却し、濾過し、空気乾燥し
、最小量の95%熱エタノールに溶解した。冷却後結晶
が現れ、これを濾過し、空気乾燥した。融点は182−
184℃であった。
180mlの水酢酸中の5−エチル−5− (3−アジ
ドプ口ビル)バルビッール酸(20g)の懸濁液を、2
gの二酸化白金を含有する40mlのジメチオキセクン
と混合し、パー( Parr)シェーカー型水素添加化
装置で室温で約5時間水素添加化した。この溶液を濾過
し蒸発させて油状物質とした。この油を無水エタノール
に溶解し、約0−10℃で塩化水素ガスで飽和させた。
ドプ口ビル)バルビッール酸(20g)の懸濁液を、2
gの二酸化白金を含有する40mlのジメチオキセクン
と混合し、パー( Parr)シェーカー型水素添加化
装置で室温で約5時間水素添加化した。この溶液を濾過
し蒸発させて油状物質とした。この油を無水エタノール
に溶解し、約0−10℃で塩化水素ガスで飽和させた。
この溶液を蒸発して濃縮した後、クロロホルムを加える
と塩酸塩化合物が析出した。この物質を最小量のメタノ
ールに再溶解し、クロロホルムを加えて再結晶させた。
と塩酸塩化合物が析出した。この物質を最小量のメタノ
ールに再溶解し、クロロホルムを加えて再結晶させた。
融点は224−226℃であった。
ピー◆クアトレカサス(Cuatreeasas. P
)とシー●ビー・アンフィンセン(Anf’lnsen
. C.B.)、(1971年)メソッズインエンザイ
モロジ−(Methods in Enzysolog
y ) 、第22巻、345一377頁の方法に従い、
セファロース−481ml当り300■の臭化シアンを
用いpllio.5でセファロース−4Bを活性化した
。O.IM炭酸水素ナトリウム、pll9中の活性化ゲ
ルlml当り20■のバルビツール酸塩誘導体を添加し
、4℃で一晩シェーカーの中に置いた。次にゲルを23
℃で2時間、0.2Mのグリシン中に約2時間置いて、
置換されていない活性基を保護した。次にゲルを結合緩
衝液とO.IMの酢酸ナトリウム、p■4(それぞれ0
.5MのNaC,Qを含有)で洗浄した。最後の洗浄は
結合緩衝液で行った。
)とシー●ビー・アンフィンセン(Anf’lnsen
. C.B.)、(1971年)メソッズインエンザイ
モロジ−(Methods in Enzysolog
y ) 、第22巻、345一377頁の方法に従い、
セファロース−481ml当り300■の臭化シアンを
用いpllio.5でセファロース−4Bを活性化した
。O.IM炭酸水素ナトリウム、pll9中の活性化ゲ
ルlml当り20■のバルビツール酸塩誘導体を添加し
、4℃で一晩シェーカーの中に置いた。次にゲルを23
℃で2時間、0.2Mのグリシン中に約2時間置いて、
置換されていない活性基を保護した。次にゲルを結合緩
衝液とO.IMの酢酸ナトリウム、p■4(それぞれ0
.5MのNaC,Qを含有)で洗浄した。最後の洗浄は
結合緩衝液で行った。
以下に述べる本実験のクロマトグラフィーはすべて、0
.8X9c+aのカラムで実施した。使用した緩衝液は
、特に明記していない場合は、5IIMリン酸ナトリウ
ム(pH8.0又はpll6. 8)である。
.8X9c+aのカラムで実施した。使用した緩衝液は
、特に明記していない場合は、5IIMリン酸ナトリウ
ム(pH8.0又はpll6. 8)である。
流速1ml/分で2mlの両分を集めた。最初の緩衝液
で各カラムを流した後、出発緩衝液50mlと0.5M
又は1MのNaClを含有する同じ緩衝液50mlでリ
ニアーグラジエント全作成して溶出した。アミノ酸組成
の分析にはJEOL 5AHアナライザーを使用し、
蛋白試料を真空中110℃で6M HCRで約22時
間加水分解した。
で各カラムを流した後、出発緩衝液50mlと0.5M
又は1MのNaClを含有する同じ緩衝液50mlでリ
ニアーグラジエント全作成して溶出した。アミノ酸組成
の分析にはJEOL 5AHアナライザーを使用し、
蛋白試料を真空中110℃で6M HCRで約22時
間加水分解した。
第1図はセファロースマトリックスに共有結合したバル
ビツール酸塩の広範囲の滴定曲線を示す。
ビツール酸塩の広範囲の滴定曲線を示す。
アミノ基でセファロース6Bに結合した5−エチル−5
−(3−アミノプ口ピル)バルビツール酸(連続線、黒
丸)と、セファロース6B(破線、白丸)の滴定曲線を
比較してある。各マトリックスの20mlを0.2Mの
NaOHで滴定した。炭素−5にアルキル基が2個結合
したバルビツール酸塩のpKaの範囲は、7.45から
7.99である。しかし他の荷電基に見られるように、
マトリックスのpKa範囲は拡大している。1つのアル
キル基の代わりにプロトンが炭素−5に結合している場
合、pKa4.04から4.94が記録されている;こ
れは炭素−5上の水素がもっとも酸性の強いプロトンか
もしれないことを示している。
−(3−アミノプ口ピル)バルビツール酸(連続線、黒
丸)と、セファロース6B(破線、白丸)の滴定曲線を
比較してある。各マトリックスの20mlを0.2Mの
NaOHで滴定した。炭素−5にアルキル基が2個結合
したバルビツール酸塩のpKaの範囲は、7.45から
7.99である。しかし他の荷電基に見られるように、
マトリックスのpKa範囲は拡大している。1つのアル
キル基の代わりにプロトンが炭素−5に結合している場
合、pKa4.04から4.94が記録されている;こ
れは炭素−5上の水素がもっとも酸性の強いプロトンか
もしれないことを示している。
第2図はCM−セルロース又はDEAE−セルロースを
用いて対になった蛋白をクロマトグラフイーした結果を
示す。パネルAからDにおいて、蛋白は充分にグアニジ
ン化した誘導体として流した。2種類の陰イオン性蛋白
と陽イオン性蛋白を選んだ。使用した蛋白は以下の通り
である:αーラクトアルブミン(バネルA);リボヌク
レアーゼ(パネルB);キモトリプシノーゲン(バネル
C);およびウシ血清アルブミン(パネルD)。
用いて対になった蛋白をクロマトグラフイーした結果を
示す。パネルAからDにおいて、蛋白は充分にグアニジ
ン化した誘導体として流した。2種類の陰イオン性蛋白
と陽イオン性蛋白を選んだ。使用した蛋白は以下の通り
である:αーラクトアルブミン(バネルA);リボヌク
レアーゼ(パネルB);キモトリプシノーゲン(バネル
C);およびウシ血清アルブミン(パネルD)。
パネルAとDでは、DEAE−セルロースを使用し、パ
ネルBとCでは、CM−セルロースを使用した。
ネルBとCでは、CM−セルロースを使用した。
図に示すように各蛋白対は、ひとつのピークとして現れ
た。図には示されていないが、おのおのについて0.5
MのNaClで溶出を続けたが、280n一に吸収を示
す物質はなにも現れなかった。
た。図には示されていないが、おのおのについて0.5
MのNaClで溶出を続けたが、280n一に吸収を示
す物質はなにも現れなかった。
パネルBとCの結果は、グアニジノ基は第一アミノ基と
比較するとカルボキシレートに対する親和性は高くない
ことを、もう一度強調している。
比較するとカルボキシレートに対する親和性は高くない
ことを、もう一度強調している。
パネルEは、ウシキモトリプシノーゲンとブタエラスタ
ーゼ(リジン:アルギニン比はそれぞれ14:2と3:
12である)の混合液のCM−セルロースによる溶出を
示す。アルギニンとリジン含量に大きな差があるにもか
かわらず、2つの蛋白は同じ位置に溶出しており、アミ
ノ基及びグアニジノ基によるカルボキシレート基に対す
る親和性に大きな差がないことを示している。
ーゼ(リジン:アルギニン比はそれぞれ14:2と3:
12である)の混合液のCM−セルロースによる溶出を
示す。アルギニンとリジン含量に大きな差があるにもか
かわらず、2つの蛋白は同じ位置に溶出しており、アミ
ノ基及びグアニジノ基によるカルボキシレート基に対す
る親和性に大きな差がないことを示している。
第3図から第6図は、本発明のバルビッール酸塩誘導セ
ファロースマトリックスに通すと、天然の蛋白からグア
ニジン化蛋白が充分分離できることを示している。第3
図は天然のα−ラクトアルブミン(パネルAとC)とグ
アニジン化a−ラクトアルブミン(バネルBとC)をp
l16. 8でセファロース−4Bのバルビツール酸塩
誘導体でクロマトグラフイーした図である。第4図は天
然のりボヌクレアーゼ(バネルAとC)とグアニジン化
リボヌクレアーゼ(パネルBとC)をp118でセファ
ロース−4Bのバルビツール酸塩誘導体でクロマトグラ
フイーした図である。第5図は天然のキモトリプシノー
ゲン(パネルAとC)とグアニジン化キモトリプシノー
ゲン(パネルBとC)をpH8でセファロースー4Bの
バルビツール酸塩誘導体でクロマトグラフイーした図で
ある。第6図は天然のウシ血清アルブミン(パネルAと
C)とグアニジン化ウシ血清アルブミン(パネルBとC
)をpl+6. 8でセファロース−4Bのバルビツー
ル酸塩誘導体でクロマトグラフイーした図である。
ファロースマトリックスに通すと、天然の蛋白からグア
ニジン化蛋白が充分分離できることを示している。第3
図は天然のα−ラクトアルブミン(パネルAとC)とグ
アニジン化a−ラクトアルブミン(バネルBとC)をp
l16. 8でセファロース−4Bのバルビツール酸塩
誘導体でクロマトグラフイーした図である。第4図は天
然のりボヌクレアーゼ(バネルAとC)とグアニジン化
リボヌクレアーゼ(パネルBとC)をp118でセファ
ロース−4Bのバルビツール酸塩誘導体でクロマトグラ
フイーした図である。第5図は天然のキモトリプシノー
ゲン(パネルAとC)とグアニジン化キモトリプシノー
ゲン(パネルBとC)をpH8でセファロースー4Bの
バルビツール酸塩誘導体でクロマトグラフイーした図で
ある。第6図は天然のウシ血清アルブミン(パネルAと
C)とグアニジン化ウシ血清アルブミン(パネルBとC
)をpl+6. 8でセファロース−4Bのバルビツー
ル酸塩誘導体でクロマトグラフイーした図である。
表1は、これらの図のクロマトグラフィー成分のアミノ
酸分析の結果を示す。
酸分析の結果を示す。
表1は、キモトリンとオバルブミンの天然の成分とグア
ニジン化或分を使用した2つの分析結果である(溶出プ
ロフィールは示されていない)。
ニジン化或分を使用した2つの分析結果である(溶出プ
ロフィールは示されていない)。
それぞれの場合でクロマトグラフィーのピーク画分は、
成分が完全に分離されていることを示している。各天然
の蛋白はカラムに結合し、それぞれの場合でグアニジン
化誘導体の方が親和性が高い。
成分が完全に分離されていることを示している。各天然
の蛋白はカラムに結合し、それぞれの場合でグアニジン
化誘導体の方が親和性が高い。
マトリックスは陰性に荷電しているが、マトリックスは
ウシ血清アルプミン、α−ラクトアルブミン、そしてオ
バルブミン(これらの等電点はそれぞれ4.8、5.1
、そして4.7である)のような陰イオン性の蛋白を結
合する;これらの蛋白はCM−セルロースに結合しない
。
ウシ血清アルプミン、α−ラクトアルブミン、そしてオ
バルブミン(これらの等電点はそれぞれ4.8、5.1
、そして4.7である)のような陰イオン性の蛋白を結
合する;これらの蛋白はCM−セルロースに結合しない
。
第7図(表1参照)はウシキモトリプシノーゲンからの
ブタエラスターゼの完全な分離を示している。これに関
連して、天然のキモトリプシノーゲン(パネルAとC)
と天然のエラスターゼ(パネルBとC)のpH8でのセ
ファロース−4Bをバルビツール酸塩誘導体でクロマト
グラフイーした図を示してある。第2図の知見とは対照
的に、アルギニン含量の高いエラスターゼが有意に遅れ
て出てきている。この2つの蛋白は同定度の分子量と等
電点を有している。これらの結果は、エラスターゼのア
ルギニン含量の高さがこの蛋白の高い親和性に関係があ
ることを示している。この3種類の陰イオン性蛋白の例
では、天然の成分はpll8.0で結合を示さず91{
6. 8で結合した。pH6.8ではヒスチジン残基が
かなりプロトン化しており、再びパイ電子と静電効果の
組合せによりマトリックスとの相互作用が起きたのであ
ろう。
ブタエラスターゼの完全な分離を示している。これに関
連して、天然のキモトリプシノーゲン(パネルAとC)
と天然のエラスターゼ(パネルBとC)のpH8でのセ
ファロース−4Bをバルビツール酸塩誘導体でクロマト
グラフイーした図を示してある。第2図の知見とは対照
的に、アルギニン含量の高いエラスターゼが有意に遅れ
て出てきている。この2つの蛋白は同定度の分子量と等
電点を有している。これらの結果は、エラスターゼのア
ルギニン含量の高さがこの蛋白の高い親和性に関係があ
ることを示している。この3種類の陰イオン性蛋白の例
では、天然の成分はpll8.0で結合を示さず91{
6. 8で結合した。pH6.8ではヒスチジン残基が
かなりプロトン化しており、再びパイ電子と静電効果の
組合せによりマトリックスとの相互作用が起きたのであ
ろう。
この面の解析にはモデル化合物の結合の研究が必要であ
った。共通のすべてのアミノ酸の混合物、又はヒスチジ
ン又はアルギニンのみの場合は結合しなかった。従って
、結合は単純な静電気的なものではなかった。もしパイ
電子を介して結合したならば、バルビツール酸基はアミ
ノ酸のα一カルボキシル基の近くになければならない。
った。共通のすべてのアミノ酸の混合物、又はヒスチジ
ン又はアルギニンのみの場合は結合しなかった。従って
、結合は単純な静電気的なものではなかった。もしパイ
電子を介して結合したならば、バルビツール酸基はアミ
ノ酸のα一カルボキシル基の近くになければならない。
その結果として起きる静電気的反発がパイ電子が近付く
のを妨害するであろう。これを確認するためにアグマチ
ン(agaatlne)とヒスタミン(hLstaml
ne )(それぞれアルギニンとヒスチジンの脱カルボ
キシル化産物)、及び1,6−ジアミノヘキサン(リジ
ンの脱力ルボキシル化産物)を別々に実験した。
のを妨害するであろう。これを確認するためにアグマチ
ン(agaatlne)とヒスタミン(hLstaml
ne )(それぞれアルギニンとヒスチジンの脱カルボ
キシル化産物)、及び1,6−ジアミノヘキサン(リジ
ンの脱力ルボキシル化産物)を別々に実験した。
第8図は、all8. 5 (上の列)とpll6.
5 (下の列)で1mM}リスクラロイド中の1.
6−ジアミノヘキサン(左のパネル)、アグマチン(ま
ん中のパネル)、ヒスタミン(右のパネル)をセファロ
ースー4Bのバルビツール酸塩誘導体に通したクロマト
グラフィーの結果である;各実験で1.5から2.5m
gのアミンを使用した。いずれの場合もヘキサンジアミ
ンは結合せず、このマトリックスとの静電気的引力は小
さいことを示していた。アグマチンはいずれの98でも
結合するが、ヒスタミンはPH6.5でのみ結合する。
5 (下の列)で1mM}リスクラロイド中の1.
6−ジアミノヘキサン(左のパネル)、アグマチン(ま
ん中のパネル)、ヒスタミン(右のパネル)をセファロ
ースー4Bのバルビツール酸塩誘導体に通したクロマト
グラフィーの結果である;各実験で1.5から2.5m
gのアミンを使用した。いずれの場合もヘキサンジアミ
ンは結合せず、このマトリックスとの静電気的引力は小
さいことを示していた。アグマチンはいずれの98でも
結合するが、ヒスタミンはPH6.5でのみ結合する。
アミノ基の効果が小さいことを確認するために、2−ア
セトアミドエチルーグアニジンをp}%6.5で同じカ
ラムに通し、その溶出をサカグチ反応で定量した。その
結果アグマチンと同じ結果が得られた。後者の場合結合
は実質的にグアニジノ基に限定されていた。
セトアミドエチルーグアニジンをp}%6.5で同じカ
ラムに通し、その溶出をサカグチ反応で定量した。その
結果アグマチンと同じ結果が得られた。後者の場合結合
は実質的にグアニジノ基に限定されていた。
O−メチルイソ尿素との反応は蛋白の化学修飾のさらに
特異的なもののひとつである。膵臓リボヌクレアーゼの
ように活性部位にリジンがない場合は、リジン残基のホ
モアルギニンへの変換に限定されるため、蛋白の活性へ
の影響は中程度である。従ってバルビツール酸一セファ
ロースにより結合が増加したのは、グアニジノ基に由来
すると考えるのが妥当であろう。
特異的なもののひとつである。膵臓リボヌクレアーゼの
ように活性部位にリジンがない場合は、リジン残基のホ
モアルギニンへの変換に限定されるため、蛋白の活性へ
の影響は中程度である。従ってバルビツール酸一セファ
ロースにより結合が増加したのは、グアニジノ基に由来
すると考えるのが妥当であろう。
上記の実験結果は、異なる蛋白中のホモアルギニンやア
ルギニン残基のグアニジノ基とヒスチジン残基のイミダ
ゾール基に対し、不溶性マトリックス上のバルビツール
酸塩陰イオンの選択的親和性を示している。バルビツー
ル酸塩の残基に対する親和性は、パイ電子と静電気効果
が組合わさっていることを示している。
ルギニン残基のグアニジノ基とヒスチジン残基のイミダ
ゾール基に対し、不溶性マトリックス上のバルビツール
酸塩陰イオンの選択的親和性を示している。バルビツー
ル酸塩の残基に対する親和性は、パイ電子と静電気効果
が組合わさっていることを示している。
本研究が或功するか否かは、ホモアルギニンとアルギニ
ンのグアニジノ基とヒスチジンのイミダゾール基の表面
露出度に依存している。アルギニンは蛋白の表面中で最
も親水性が強く、これが蛋白骨格からある距離にあると
いうことは、バルビッール酸基が接近して容易に重なる
(stacking)構造を取り易く、単なる静電気的
結合の場合よりももっと限定された構造になるであろう
。これに対してヒスチジン残基は埋め込まれていること
もあるし、完全に又は部分的に露出していることもある
。この特徴がマトリックスへの近付き易さを決定するで
あろう。本発明のマトリックスはまた、バルビツール酸
環の炭素−5に結合しているアルキル基のため、疎水性
相互作用で蛋白に結合する場合もある。しかしここで研
究した蛋白の親和性の差は、主にパイ電子と静電気的相
互作用に起因する。
ンのグアニジノ基とヒスチジンのイミダゾール基の表面
露出度に依存している。アルギニンは蛋白の表面中で最
も親水性が強く、これが蛋白骨格からある距離にあると
いうことは、バルビッール酸基が接近して容易に重なる
(stacking)構造を取り易く、単なる静電気的
結合の場合よりももっと限定された構造になるであろう
。これに対してヒスチジン残基は埋め込まれていること
もあるし、完全に又は部分的に露出していることもある
。この特徴がマトリックスへの近付き易さを決定するで
あろう。本発明のマトリックスはまた、バルビツール酸
環の炭素−5に結合しているアルキル基のため、疎水性
相互作用で蛋白に結合する場合もある。しかしここで研
究した蛋白の親和性の差は、主にパイ電子と静電気的相
互作用に起因する。
本発明の態様に従えば、天然の陽イオン性蛋白は本発明
のバルビツール酸塩マトリックスにより2つの方法で分
離可能である。pl1約8以上では、アルギニン含量の
差により分離され、p11約7以下では、アルギニンと
ヒスチジン含量の差の合計により分離される。アルギニ
ン含量が高くない場合、陰イオン性蛋白は主に後者を基
礎にして分離される。最後にα一カルボキシル基の反発
作用のため、C一末端アルギニン及びヒスチジン残基の
結合への寄与はほとんどないであろう。
のバルビツール酸塩マトリックスにより2つの方法で分
離可能である。pl1約8以上では、アルギニン含量の
差により分離され、p11約7以下では、アルギニンと
ヒスチジン含量の差の合計により分離される。アルギニ
ン含量が高くない場合、陰イオン性蛋白は主に後者を基
礎にして分離される。最後にα一カルボキシル基の反発
作用のため、C一末端アルギニン及びヒスチジン残基の
結合への寄与はほとんどないであろう。
本発明はパイ電子と静電気的相互作用に基づく、本発明
の陰イオン性交換体に第2の特徴を与える.この点に関
し、バルビツール酸環は数個の電気陰性原子が広く分散
した荷電状態にあるため、アミノ基と単なる静電気的相
互作用をするには弱い基であることに注意すべきである
。本発明の態様に従えば、パイ電子分布が似ており、電
気陰性原子が少ないため電荷が集中しているような陰イ
オン性リガンドが選択される。このような陰イオン性リ
ガンドの例としては、アミノ基により中性マトリックス
に結合したチラミンがある。フェノール性水産基の両側
のオルトの位置に電子吸引性基を加えることにより、静
電気効果に影響を与えることなく、フェノール基のpK
aは低下させることができる。例えばジブロモチラミン
では、フェノール基のpKaは当然約6.8である。し
かし、他の電子吸引性基が利用でき、陰イオン性リガン
ドとして、例えばジフルオロチラミン、ジクロロチラミ
ン、ジョードチラミン、及びジニトロチラミンがある。
の陰イオン性交換体に第2の特徴を与える.この点に関
し、バルビツール酸環は数個の電気陰性原子が広く分散
した荷電状態にあるため、アミノ基と単なる静電気的相
互作用をするには弱い基であることに注意すべきである
。本発明の態様に従えば、パイ電子分布が似ており、電
気陰性原子が少ないため電荷が集中しているような陰イ
オン性リガンドが選択される。このような陰イオン性リ
ガンドの例としては、アミノ基により中性マトリックス
に結合したチラミンがある。フェノール性水産基の両側
のオルトの位置に電子吸引性基を加えることにより、静
電気効果に影響を与えることなく、フェノール基のpK
aは低下させることができる。例えばジブロモチラミン
では、フェノール基のpKaは当然約6.8である。し
かし、他の電子吸引性基が利用でき、陰イオン性リガン
ドとして、例えばジフルオロチラミン、ジクロロチラミ
ン、ジョードチラミン、及びジニトロチラミンがある。
さらに集中した電荷を利用してこの陰イオン性交換体に
第2の特徴を与えることができる。第2の特徴により蛋
白がさらに分離できる。
第2の特徴を与えることができる。第2の特徴により蛋
白がさらに分離できる。
本発明は、本発明の陰イオン性交換体に第3の特徴を与
える手段を与える。リガンドのリーシュ(leash)
の長さと成分により、蛋白をさらに分離し区別すること
ができるという点で、第3の特徴が与えられる。陰イオ
ン性交換体マトリックスに対するヒスチジンとアルギニ
ン残基の結合は重なり(stack1ng)相互作用の
ため、その相互作用の配置は非常に限定される。さらに
アミノ酸残基(特にヒスチジン残基)は蛋白の表面に対
する近付,き易さが異なるため、アミノ酸残基のリガン
ドヘの近付き易さは異なる。従って単純な陰イオン性交
換クロマトグラフィーとは異なり、リガンドとマトリッ
クスをつなぐリーシュ(leash )の長さは重要で
ある。リーシュ(leash )の長さを変えて、クロ
マトグラフィーの異なる溶出パターンが得られる。残基
のリガンドへの近付き易さを変えて分離をすることもで
きる。
える手段を与える。リガンドのリーシュ(leash)
の長さと成分により、蛋白をさらに分離し区別すること
ができるという点で、第3の特徴が与えられる。陰イオ
ン性交換体マトリックスに対するヒスチジンとアルギニ
ン残基の結合は重なり(stack1ng)相互作用の
ため、その相互作用の配置は非常に限定される。さらに
アミノ酸残基(特にヒスチジン残基)は蛋白の表面に対
する近付,き易さが異なるため、アミノ酸残基のリガン
ドヘの近付き易さは異なる。従って単純な陰イオン性交
換クロマトグラフィーとは異なり、リガンドとマトリッ
クスをつなぐリーシュ(leash )の長さは重要で
ある。リーシュ(leash )の長さを変えて、クロ
マトグラフィーの異なる溶出パターンが得られる。残基
のリガンドへの近付き易さを変えて分離をすることもで
きる。
ある態様では、陰イオン性交換体はバラニトロフェノー
ルを含有する。この態様では交換体は以下の構造を有す
る: R (式中、Rは任意のリーシュ(leash )である)
。
ルを含有する。この態様では交換体は以下の構造を有す
る: R (式中、Rは任意のリーシュ(leash )である)
。
前述したように、本発明の方法のある態様では、アルギ
ニンとヒスチジン含量に越づいて陰イオン性交換体を使
用して蛋白を分離しており、分離のための3f!I類の
特徴を与える。本発明はまた、陰性電荷とパイ電子を有
するアミノ酸残基の分離を可能にする陽イオン交換体を
与える。この点において陽イオン性マトリックスは、チ
ロシン残基と、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基に
基づき蛋白の分離を可能にする。
ニンとヒスチジン含量に越づいて陰イオン性交換体を使
用して蛋白を分離しており、分離のための3f!I類の
特徴を与える。本発明はまた、陰性電荷とパイ電子を有
するアミノ酸残基の分離を可能にする陽イオン交換体を
与える。この点において陽イオン性マトリックスは、チ
ロシン残基と、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基に
基づき蛋白の分離を可能にする。
本発明のある態様においては、陽イオン交換体は、アス
パラギン酸とグルタミン酸のカルボキシル残基に対して
予想される単純な静電気的親和性以外に、チロシン残基
に対する親和性に基づいて蛋白を分離するための、パイ
電子を有する陽イオン性マトリックス、例えば(β−グ
アニジノエチル)カルバミルメチルーセルロースが合成
される。
パラギン酸とグルタミン酸のカルボキシル残基に対して
予想される単純な静電気的親和性以外に、チロシン残基
に対する親和性に基づいて蛋白を分離するための、パイ
電子を有する陽イオン性マトリックス、例えば(β−グ
アニジノエチル)カルバミルメチルーセルロースが合成
される。
フェノール基のpKaは9.5と10の間であるにもか
かわらず、マトリックスの親和性は充分強く、pH8で
N−アセチラミンを結合する。このpl1では陰イオン
性及び陽イオン性蛋白ともに結合する。
かわらず、マトリックスの親和性は充分強く、pH8で
N−アセチラミンを結合する。このpl1では陰イオン
性及び陽イオン性蛋白ともに結合する。
バルビツール酸塩マトリックスに関する前述の原理に従
えば、電気陰性原子が大きく分散した拡大したパイ電子
を有する陽性に荷電したマトリックスは、GECM−セ
ルロースより、チロシン残基に対して同等又は高い親和
性を有し、アスパラギン酸とグルタミン酸残基に対し親
和性が弱いはずである。これらのマトリックスの例とし
ては、N(β−ビグアニジノエチル)カルバミルメチル
ーセルロースとN(β−イソラミノエチル)カルバミル
メチルーセルロースがある。
えば、電気陰性原子が大きく分散した拡大したパイ電子
を有する陽性に荷電したマトリックスは、GECM−セ
ルロースより、チロシン残基に対して同等又は高い親和
性を有し、アスパラギン酸とグルタミン酸残基に対し親
和性が弱いはずである。これらのマトリックスの例とし
ては、N(β−ビグアニジノエチル)カルバミルメチル
ーセルロースとN(β−イソラミノエチル)カルバミル
メチルーセルロースがある。
例としてパイ電子を有する陽イオン性マトリックスを用
いる実験方法を示すが、これが本発明を限定するもので
はない。
いる実験方法を示すが、これが本発明を限定するもので
はない。
以下に示す実験は、パイ電子を有する陽イオン性マトリ
ックスはチロシン(高pl1で陰イオン性である戊分)
と相互作用することを証明している。
ックスはチロシン(高pl1で陰イオン性である戊分)
と相互作用することを証明している。
具体的には以下の実験は、パイ電子を有する陽イオン性
マトリックスはチロシン残基のフェノレート陰イオンに
対し特別な親和性を有することを証明している。この目
的のためグアニジン含有マトリックスを合威した。
マトリックスはチロシン残基のフェノレート陰イオンに
対し特別な親和性を有することを証明している。この目
的のためグアニジン含有マトリックスを合威した。
以下の化学薬品と成分を使用した。ウシキモトリブシノ
ーゲン、リボヌクレアーゼ、オバルブミン、ウシ血清ア
ルブミン及びビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリ
ス(ヒドロキシメチル)メタンはシグマ(Sigma
)社より入手した。塩酸チラミン、1・−(3−ジメチ
ルアミノプロピル)一3−エチルーカルポジイミド、N
−アセチルエチレンジアミンは、アルドリッチ(Ald
rleh )社より人手した。無水酢酸はマリンクロッ
ト(Mal Iinckrodt)社より人手した。チ
ロシンとフェニレエチルアミンはカルビオケム(Cal
blochem)社より入手した。膨潤済みの微粒CM
−セルロース及びDEAE−セルロース(ワットマンC
M−及びDE−52)は、エイチ・リーブエンジェル(
ll. Reeve Angel)社より人手した。ダ
ウエックス−50 4X,200から400メッシュ
はバイオラッド(BLoRad)社よーり入手した。フ
ェニル酢酸はイーストマン(Eastsan )社より
人手した。
ーゲン、リボヌクレアーゼ、オバルブミン、ウシ血清ア
ルブミン及びビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリ
ス(ヒドロキシメチル)メタンはシグマ(Sigma
)社より入手した。塩酸チラミン、1・−(3−ジメチ
ルアミノプロピル)一3−エチルーカルポジイミド、N
−アセチルエチレンジアミンは、アルドリッチ(Ald
rleh )社より人手した。無水酢酸はマリンクロッ
ト(Mal Iinckrodt)社より人手した。チ
ロシンとフェニレエチルアミンはカルビオケム(Cal
blochem)社より入手した。膨潤済みの微粒CM
−セルロース及びDEAE−セルロース(ワットマンC
M−及びDE−52)は、エイチ・リーブエンジェル(
ll. Reeve Angel)社より人手した。ダ
ウエックス−50 4X,200から400メッシュ
はバイオラッド(BLoRad)社よーり入手した。フ
ェニル酢酸はイーストマン(Eastsan )社より
人手した。
使用した他の全ての化学薬品は、入手できる最高のグレ
ードであった。
ードであった。
N(β−グアニジノエチル)カルバミルメチル−セルロ
ースは以下のように合成した:O CH CNHCH2CH2NH2 アミノエチルグアニジンの合成 N−アセチルエチレンジアミン(15g)に23℃で5
日間、80mlの水p1{10.5中のメチルイソ尿素
(47g)を混合させた。ニンヒドリンのスポット試験
を行った。スポット試験が陽性の場合は、無水酢酸を加
えて残存するすべてのアミノ基を保護した。次にこの溶
液をダウエックスー50カラム(6X15cm)に通し
た。水で一定時間流してから、N(β−グアニジノ)ア
セトアミドエタンを6Mの塩酸で溶出し、サカグチ反応
により試料の定性スポット試験を行った。陽性の画分を
還流装置の中で約16時間加熱した。
ースは以下のように合成した:O CH CNHCH2CH2NH2 アミノエチルグアニジンの合成 N−アセチルエチレンジアミン(15g)に23℃で5
日間、80mlの水p1{10.5中のメチルイソ尿素
(47g)を混合させた。ニンヒドリンのスポット試験
を行った。スポット試験が陽性の場合は、無水酢酸を加
えて残存するすべてのアミノ基を保護した。次にこの溶
液をダウエックスー50カラム(6X15cm)に通し
た。水で一定時間流してから、N(β−グアニジノ)ア
セトアミドエタンを6Mの塩酸で溶出し、サカグチ反応
により試料の定性スポット試験を行った。陽性の画分を
還流装置の中で約16時間加熱した。
生成物(アミノエチルグアニジン)を蒸発乾固させ水に
溶解し、IOM NaOHで中和し、CM−セルロー
ス力ラムに通し、水で一定時間流した後IMNacNで
溶出した。生成物を含む画分二ンヒドリン反応とサカグ
チ反応が一致し、この画分を集めて加熱して蒸発乾固し
た。残渣を熱アルコールに入れてアミノエチルグアニジ
ンを溶解させた。濾液を冷却し23℃で一晩放置すると
、アミノエチルグアニジンの結晶が得られた。
溶解し、IOM NaOHで中和し、CM−セルロー
ス力ラムに通し、水で一定時間流した後IMNacNで
溶出した。生成物を含む画分二ンヒドリン反応とサカグ
チ反応が一致し、この画分を集めて加熱して蒸発乾固し
た。残渣を熱アルコールに入れてアミノエチルグアニジ
ンを溶解させた。濾液を冷却し23℃で一晩放置すると
、アミノエチルグアニジンの結晶が得られた。
GECM−セルロースの合成
CM−セルロース(1 0 g)を水で洗浄し、水20
ml中8.75gのアミノエチルグアニジンと充分混合
させた。カルボジイミド( 9 . 6 gIi)を
水10mlに溶解した。LM HCRとIMNaOH
でそれぞれpI1を5.5に調節した。次に希HCfi
でpHを連続的に5.5に維持しながら、カルボジイミ
ドを3回に分けて加えた。23℃でシェーカー中で一晩
反応させた後、マトリックスを水で洗浄した。
ml中8.75gのアミノエチルグアニジンと充分混合
させた。カルボジイミド( 9 . 6 gIi)を
水10mlに溶解した。LM HCRとIMNaOH
でそれぞれpI1を5.5に調節した。次に希HCfi
でpHを連続的に5.5に維持しながら、カルボジイミ
ドを3回に分けて加えた。23℃でシェーカー中で一晩
反応させた後、マトリックスを水で洗浄した。
フエニルエチルアミン、P−メトキシフエニルエチルア
ミン、チラミン及びトリプタミンを無水酢酸でアセチル
化して、N−アセチル化生戊物を得た。チラミン生成物
の場合、当量の2Mヒドロキシルアミンpl+7.
5と10分間反応させ、〇一アセチル基を除去した。全
ての生成物をセファデックスG−25カラム(1、5X
35CIl1)に通すと、芳香族化合物は遅れて溶出し
、それらを陰イオン性交換クロマトグラフィーにかけた
。各生成物約1から5mgを各実験で使用した。
ミン、チラミン及びトリプタミンを無水酢酸でアセチル
化して、N−アセチル化生戊物を得た。チラミン生成物
の場合、当量の2Mヒドロキシルアミンpl+7.
5と10分間反応させ、〇一アセチル基を除去した。全
ての生成物をセファデックスG−25カラム(1、5X
35CIl1)に通すと、芳香族化合物は遅れて溶出し
、それらを陰イオン性交換クロマトグラフィーにかけた
。各生成物約1から5mgを各実験で使用した。
以下の実験では、セルロース誘導体を使用するすべての
クロマトグラフィーは23℃で0.8X9cmのカラム
中で行った;緩衝液は特に明示していない場合は5II
Mトリスー塩酸であった。流速1ml/分で2mlの両
分を集めた。最初の緩衝液で一定時間流した後、出発緩
衝液30mlとIMNaCl)を含有する同じ緩衝液3
0mlで作ったりニアーグラジアントで各カラムを溶出
した。各蛋白約1から5■を各実験で使用した。図13
でリボヌクレアーゼとキモトリプシノーゲンを区別する
ため、リボヌクレアーゼにはトリブトファンがなくキモ
トリブシノーゲンにはこれが7個あることを利用した。
クロマトグラフィーは23℃で0.8X9cmのカラム
中で行った;緩衝液は特に明示していない場合は5II
Mトリスー塩酸であった。流速1ml/分で2mlの両
分を集めた。最初の緩衝液で一定時間流した後、出発緩
衝液30mlとIMNaCl)を含有する同じ緩衝液3
0mlで作ったりニアーグラジアントで各カラムを溶出
した。各蛋白約1から5■を各実験で使用した。図13
でリボヌクレアーゼとキモトリプシノーゲンを区別する
ため、リボヌクレアーゼにはトリブトファンがなくキモ
トリブシノーゲンにはこれが7個あることを利用した。
即ち、298旧と2 8 0 no+の吸光度の比が小
さい場合はりボヌクレアーゼが存在することを示してお
り、この比が大きい場合はキモトリプシノーゲンの存在
を示していた。
さい場合はりボヌクレアーゼが存在することを示してお
り、この比が大きい場合はキモトリプシノーゲンの存在
を示していた。
グアニジン含有マトリックスによる以前の実験では、0
−メイチルイソ尿素との反応により、アミノエチルセル
ロースがグアニジノ誘導体に変換されていた。この実験
では未反応のアミノ酸が少し残っており、実験結果の解
釈が混乱するため、混乱を避けるためGECM−セルロ
ースを合成した。
−メイチルイソ尿素との反応により、アミノエチルセル
ロースがグアニジノ誘導体に変換されていた。この実験
では未反応のアミノ酸が少し残っており、実験結果の解
釈が混乱するため、混乱を避けるためGECM−セルロ
ースを合成した。
図9はpll8におけるGECM−セルロースからのチ
ラミン(上のパネル)とチロシン(下のパネル)の溶出
パターンを示している。図に示すようにチラミンは結合
が弱く、塩グラジエントをかける前に完全に溶出してお
り、チロシンは強い結合を示している。フエニル酢酸は
DEAE−セルロースとGECM−セルロースに対して
同程度に結合している(第10図参照,DEAE−セル
ロース(上のパネル)モしてGECM−セルロース(下
のパネル))。さらに後者のマトリックスに対する結合
はチロシンに似ており、完全にカルボキシル基による結
合が大体同じであることを示している。
ラミン(上のパネル)とチロシン(下のパネル)の溶出
パターンを示している。図に示すようにチラミンは結合
が弱く、塩グラジエントをかける前に完全に溶出してお
り、チロシンは強い結合を示している。フエニル酢酸は
DEAE−セルロースとGECM−セルロースに対して
同程度に結合している(第10図参照,DEAE−セル
ロース(上のパネル)モしてGECM−セルロース(下
のパネル))。さらに後者のマトリックスに対する結合
はチロシンに似ており、完全にカルボキシル基による結
合が大体同じであることを示している。
これらの結果に基づき、グアニジウム基とフェノール基
の静電気的及びパイ電子の相互作用が組合わさった可能
性は低いと結論できるであろう。
の静電気的及びパイ電子の相互作用が組合わさった可能
性は低いと結論できるであろう。
しかしバルビツール酸塩含有マトリックスとイミダゾー
ル基やグアニジニウム基との相互作用に関するは前述の
実験は、ヒスチジンとアルギニンのα一カルボキシル基
は、バルビツール酸塩アニオンによる重なり相互作用を
充分に強く妨害することを示していた。α一カルボキシ
ル基のないモデル化合物を使用するとこの影響は避けら
れる。
ル基やグアニジニウム基との相互作用に関するは前述の
実験は、ヒスチジンとアルギニンのα一カルボキシル基
は、バルビツール酸塩アニオンによる重なり相互作用を
充分に強く妨害することを示していた。α一カルボキシ
ル基のないモデル化合物を使用するとこの影響は避けら
れる。
従って、チロシンのα−アミノ基とチラミンの関連アミ
ノ基は、グアニジウムイオンのフェノール基との重なり
相互作用を坊害するかもしれないということが考えられ
た。従って、N−アセチルアミンを用いてさらに実験し
た。第1■図はNーアセチルアミンをDEAE−セルロ
ース(バネルA)とGECM−セルロース(バネルBか
らE)でクロマトグラフイーした結果を示す(p!1は
各パネル内の数字で示してある)。パネルDとEの緩衝
液は5dビスートリスであった。図に示すようにpl+
8ではDEAE−セルロースとの結合は見られないが、
これはこのpI1ではフェノール基は完全にプロトン化
しているため予測されることである。
ノ基は、グアニジウムイオンのフェノール基との重なり
相互作用を坊害するかもしれないということが考えられ
た。従って、N−アセチルアミンを用いてさらに実験し
た。第1■図はNーアセチルアミンをDEAE−セルロ
ース(バネルA)とGECM−セルロース(バネルBか
らE)でクロマトグラフイーした結果を示す(p!1は
各パネル内の数字で示してある)。パネルDとEの緩衝
液は5dビスートリスであった。図に示すようにpl+
8ではDEAE−セルロースとの結合は見られないが、
これはこのpI1ではフェノール基は完全にプロトン化
しているため予測されることである。
これに対してこのpllではGECM−セルロースとは
かなり結合している。pn1oでは結合は強く、pl1
7では普通であり、pH6. 5では結合しておらず
、9H依存性を示している。この結合がフェノール基に
由来することは、2−(フェニル)アセトアミドエタン
も2−(4−メトキシフェニル)アセトアミドエタンも
全く結合したかったことを証明して確認した。フェノー
ル基のpKa値の下約1.5pHではN−アセチルアミ
ンはまだ強く結合しているため、pH8で強く結合して
いることはフェノレートアニオンの強い親和性を示して
いる。
かなり結合している。pn1oでは結合は強く、pl1
7では普通であり、pH6. 5では結合しておらず
、9H依存性を示している。この結合がフェノール基に
由来することは、2−(フェニル)アセトアミドエタン
も2−(4−メトキシフェニル)アセトアミドエタンも
全く結合したかったことを証明して確認した。フェノー
ル基のpKa値の下約1.5pHではN−アセチルアミ
ンはまだ強く結合しているため、pH8で強く結合して
いることはフェノレートアニオンの強い親和性を示して
いる。
さらにアセチル化トリブタミンも結合しないことを証明
した。
した。
この情報を用いて2つの陰イオン性蛋白と2つの陽イオ
ン性蛋白を分析した。第12図は、キモトリプシノーゲ
ンーA(aの列)、リボヌクレアーゼ(bの列)、ウシ
血清アルプミン(Cの列)、及びオバルプミン(dの列
)を、指示されたセルロースマトリックスに通したクロ
マトグラフィーを示す。図に示すように、これらの蛋白
はpH8でCM−セルロース又はDEAE−セルロース
に対して適当な親和性を示した。しかしこのpllでは
4つの蛋白全てがGECM−セルロースに結合する。
ン性蛋白を分析した。第12図は、キモトリプシノーゲ
ンーA(aの列)、リボヌクレアーゼ(bの列)、ウシ
血清アルプミン(Cの列)、及びオバルプミン(dの列
)を、指示されたセルロースマトリックスに通したクロ
マトグラフィーを示す。図に示すように、これらの蛋白
はpH8でCM−セルロース又はDEAE−セルロース
に対して適当な親和性を示した。しかしこのpllでは
4つの蛋白全てがGECM−セルロースに結合する。
第13図は、リボヌクレアーゼとキモトリプシノーゲン
ーAの混合物をCM−セルロース(上のパネル)とGE
CM−セルロース(下のパネル)でクロマトグラフイー
したものである。図に示すように、CM−セルロースと
DEAE−セルロースのいずれもリボヌクレアーゼとキ
モトリプシノーゲンに結合する。しかし、GECM−セ
ルロース(陽イオン性マトリックス)のみがこの2つの
陽イオン性蛋白を分離させ、リボヌクレアーゼがキモト
リブシノーゲンの前に溶出した。従ってこのマトリック
スはp118で、表面の酸性残基及びチロシン残基の合
計に基づき蛋白を分離した。αーアミノ基の反発作用の
ため、N一末端チロシンはおそらく蛋白結合にほとんど
寄与しないであろう。
ーAの混合物をCM−セルロース(上のパネル)とGE
CM−セルロース(下のパネル)でクロマトグラフイー
したものである。図に示すように、CM−セルロースと
DEAE−セルロースのいずれもリボヌクレアーゼとキ
モトリプシノーゲンに結合する。しかし、GECM−セ
ルロース(陽イオン性マトリックス)のみがこの2つの
陽イオン性蛋白を分離させ、リボヌクレアーゼがキモト
リブシノーゲンの前に溶出した。従ってこのマトリック
スはp118で、表面の酸性残基及びチロシン残基の合
計に基づき蛋白を分離した。αーアミノ基の反発作用の
ため、N一末端チロシンはおそらく蛋白結合にほとんど
寄与しないであろう。
従って、本発明はまた、チロシンアミノ酸残基に基づく
蛋白の分離を可能にする陰イオン交換体を与える。この
交換体はまた、GECM−セルロ−スよりもアスパラギ
ン酸残基やグルタミン酸残基に対する親和性は小さい。
蛋白の分離を可能にする陰イオン交換体を与える。この
交換体はまた、GECM−セルロ−スよりもアスパラギ
ン酸残基やグルタミン酸残基に対する親和性は小さい。
陰イオン性交換体と同様に、陽イオン性交換体もチロシ
ンの交換体に対する相互作用の配置の点で、別の特徴を
与える。相互作用の配置は非常に限定されているため、
そしてこれらの残基は蛋白の表面への近付き易さの程度
が異なるため(特にチロシンの場合)、リガンドに対す
る近付き易さも異なる。再びリーシュ(leash )
の長さを変えて、異なる溶出パターンと分離が得られる
。
ンの交換体に対する相互作用の配置の点で、別の特徴を
与える。相互作用の配置は非常に限定されているため、
そしてこれらの残基は蛋白の表面への近付き易さの程度
が異なるため(特にチロシンの場合)、リガンドに対す
る近付き易さも異なる。再びリーシュ(leash )
の長さを変えて、異なる溶出パターンと分離が得られる
。
アミノ基をアミジノ基で置換することによりまた別の陽
イオン性交換体が与えられる。この交換体の式は以下の
通りである: 好ましくは交換体は以下のように作成する二〇 (式中、Rはアルカン、好ましくは小さいアルカンであ
る)。好適な態様では、Rはメチルである。
イオン性交換体が与えられる。この交換体の式は以下の
通りである: 好ましくは交換体は以下のように作成する二〇 (式中、Rはアルカン、好ましくは小さいアルカンであ
る)。好適な態様では、Rはメチルである。
これはDEAEよりも強くアスパラギン酸残基やグルタ
ミン酸残基を結合するはずであり、従って陽イオン性蛋
白も結合するであろう。関連構造はイミダゾール含有基
であろう。
ミン酸残基を結合するはずであり、従って陽イオン性蛋
白も結合するであろう。関連構造はイミダゾール含有基
であろう。
例として、CM−セルロースやDEAE−セルロースの
技術に比較して交換体の例を示す。
技術に比較して交換体の例を示す。
C M Lys=Arg Ly
s−Arg−Hlsバルビツール酸塩 ^rg>>>L
ys Arg=H1s>〉>LysD H T
Arg ) Lys Arg=H1s >
LysD E A E Glu−^SpGlu
−AspG E C M c+u−ASp−’
I’yr Glu−As9B G E CM
Tyr>Gtu=AspA A E C M
Tyr>>Glu>Asp Tyr>>Glu=
Asp前述したようにリーシュ(leash )の長さ
を変えてさらに分離することができる。
s−Arg−Hlsバルビツール酸塩 ^rg>>>L
ys Arg=H1s>〉>LysD H T
Arg ) Lys Arg=H1s >
LysD E A E Glu−^SpGlu
−AspG E C M c+u−ASp−’
I’yr Glu−As9B G E CM
Tyr>Gtu=AspA A E C M
Tyr>>Glu>Asp Tyr>>Glu=
Asp前述したようにリーシュ(leash )の長さ
を変えてさらに分離することができる。
使用に際しては、陽イオン性交換体又は陰イオン性交換
体は蛋白を分離するためのカラムとして使用できる。
体は蛋白を分離するためのカラムとして使用できる。
ここに記載した好適な態様に対して、変更や改良が可能
であることは、当業者には明かである。
であることは、当業者には明かである。
その様な変更や改良は本発明の範囲内にあり、本発明の
利点を低下させるものではない。従ってそのような変更
や改良は本明細書の請求の範囲に含まれる。
利点を低下させるものではない。従ってそのような変更
や改良は本明細書の請求の範囲に含まれる。
第1図はセフ7ロースマトリックスに共有結合したバル
ビツール酸塩の滴定のグラフである。 第2図は、CM−セルロース又はDEAE−セルロース
を用いて対になった蛋白をクロマトグラフイーした結果
を示すグラフである。 第3図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第4図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第5図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第6図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第7図は、ブタエラスターゼのウシキモトリブシノーゲ
ンからの分離を示すグラフである。 第8図は、フルオレスカミン(rluorescaij
ne )との反応でアミノ基を検出した、pH8.5と
6.5でのクロマトグラフィーの結果を示すグラフであ
る。 第9図は、GECM−セルロースに通したチランとチロ
シンの溶出パターンを示すグラフである。 第10図は、DEAE−セルロースとGECMーセルロ
ースに通したフエニル酢酸の溶出パターンを示すグラフ
である。 第11図は、DEAE−セルロースとGECM一セルロ
ースに通したN−アセチルチラミンの溶出パターンを示
すグラフである。 第12図は、DE−52、CM−52、及びGECM−
セルロースのマトリックスに通したキモトリプシノーゲ
ンーA1リボヌクレアーゼ、ウシ血清アルブミン、及び
オバルブミンの溶出パターンを示すグラフである。 第13図は、DEAE−セルロースとGECM一セルロ
ースに通したりボヌクレアーゼとキモトリプシノーゲン
ーAの混合物の溶出パターンを示すグラフである。
ビツール酸塩の滴定のグラフである。 第2図は、CM−セルロース又はDEAE−セルロース
を用いて対になった蛋白をクロマトグラフイーした結果
を示すグラフである。 第3図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第4図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第5図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第6図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第7図は、ブタエラスターゼのウシキモトリブシノーゲ
ンからの分離を示すグラフである。 第8図は、フルオレスカミン(rluorescaij
ne )との反応でアミノ基を検出した、pH8.5と
6.5でのクロマトグラフィーの結果を示すグラフであ
る。 第9図は、GECM−セルロースに通したチランとチロ
シンの溶出パターンを示すグラフである。 第10図は、DEAE−セルロースとGECMーセルロ
ースに通したフエニル酢酸の溶出パターンを示すグラフ
である。 第11図は、DEAE−セルロースとGECM一セルロ
ースに通したN−アセチルチラミンの溶出パターンを示
すグラフである。 第12図は、DE−52、CM−52、及びGECM−
セルロースのマトリックスに通したキモトリプシノーゲ
ンーA1リボヌクレアーゼ、ウシ血清アルブミン、及び
オバルブミンの溶出パターンを示すグラフである。 第13図は、DEAE−セルロースとGECM一セルロ
ースに通したりボヌクレアーゼとキモトリプシノーゲン
ーAの混合物の溶出パターンを示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)パイ電子と、交換体と有機化合物の特異的アミノ
酸残基の静電荷相互作用に基づく、有機化合物の分離方
法。 (2)交換体は陰イオン性である、特許請求の範囲第1
項に記載の方法。 (3)交換体はバルビツール酸基を含む、特許請求の範
囲第2項に記載の方法。 (4)交換体はチオバルビツール酸塩を含む、特許請求
の範囲第2項に記載の方法。 (5)交換体は、バルビツール酸環に比較して集中した
陰性電荷を有する化合物を含む、特許請求の範囲第2項
に記載の方法。 (6)交換体は、ジフルオロチラミン、ジクロロチラミ
ン、ジョードチラミン、及びジブロモチラミンよりなる
群から選ばれる化合物を含む、特許請求の範囲第2項に
記載の方法。 (7)交換体はリーシュ(leash)によりマトリッ
クスに結合しており、有機化合物をさらに分離するため
にリーシュ(leash)の長さは変えられる、特許請
求の範囲第2項に記載の方法。 (8)交換体はパラニトロフェニルを含む、特許請求の
範囲第2項に記載の方法。 (9)交換体は陽イオン性である、特許請求の範囲第1
項に記載の方法。 (10)交換体はN(β−グアニジノエチル)カルバミ
ルメチルを含む、特許請求の範囲第9項に記載の方法。 (11)交換体はN(β−ビグアニジノエチル)−カル
バミルメチルを含む、特許請求の範囲第9項に記載の方
法。 (12)交換体はN(β−イソメラミノエチル)カルバ
ミルメチルを含む、特許請求の範囲第9項に記載の方法
。 (13)交換体はリーシュ(leash)によりマトリ
ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
めにリーシュ(leash)の長さは変えられる、特許
請求の範囲第9項に記載の方法。 (14)交換体は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rはアルカンである)の化合物を含む、特許請
求の範囲第9項に記載の方法。 (15)Rはメチルである、特許請求の範囲第14項に
記載の方法。 (16)アミノ酸残基は、アルギニン;リジン;チロシ
ン;及びグルタミン酸とアルパラギン酸よりなる群から
選ばれる、特許請求の範囲第1項に記載の方法。 (17)パイ電子と、交換体と蛋白の特異的アミノ酸残
基の静電荷相互作用に基づく、蛋白の分離方法。 (18)交換体は陰イオン性である、特許請求の範囲第
17項に記載の方法。 (19)交換体はバルビツール酸基を含む、特許請求の
範囲第18項に記載の方法。 (20)交換体は、バルビツール酸環に比較して集中し
た陰性電荷を有する化合物を含む、特許請求の範囲第1
8項に記載の方法。 (21)交換体は、ジフルオロチラミン、ジクロロチラ
ミン、ジョードチラミン、及びジブロモチラミンよりな
る群から選ばれる化合物を含む、特許請求の範囲第18
項に記載の方法。 (22)交換体はリーシュ(leash)によりマトリ
ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
めにリーシュ(leash)の長さは変えられる、特許
請求の範囲第18項に記載の方法。 (23)構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rは任意のリーシュ(leash)である)を
有する化合物を含む、特許請求の範囲第18項に記載の
方法。 (24)交換体は陽イオン性である、特許請求の範囲第
17項に記載の方法。 (25)交換体はN(β−グアニジノエチル)カルバミ
ルメチルを含む、特許請求の範囲第24項に記載の方法
。 (26)交換体はN(β−ビグアニジノエチル)カルバ
ミルメチルを含む、特許請求の範囲第24項に記載の方
法。 (27)交換体はN(β−イソメラミノエチル)カルバ
ミルメチルを含む、特許請求の範囲第24項に記載の方
法。 (28)交換体はリーシュ(leash)によりマトリ
ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
めにリーシュ(leash)の長さは変えられる、特許
請求の範囲第24項に記載の方法。 (29)アミノ酸残基は、アルギニン;リジン;チロシ
ン;及びグルタミン酸とアルパラギン酸よりなる群から
選ばれる、特許請求の範囲第17項に記載の方法。 (30)交換体は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rはアルカンである)の化合物を含む、特許請
求の範囲第24項に記載の方法。(31)Rはメチルで
ある、特許請求の範囲第30項に記載の方法。 (32)交換体は、セルロース;アガロース;デキスト
ラン;アクリルアミド;スポセル(supocel);
シリカゲル;ポリスチレン;デンプン;およびガラスよ
りなる群から選ばれるマトリックス中に位置している、
特許請求の範囲第17項に記載の方法。 (33)交換体はチオバルビツール酸塩である、特許請
求の範囲第18項に記載の方法。(34)蛋白の分離方
法において、パイ電子と、蛋白のアルギニン残基と交換
体の静電荷相互作用に基づき蛋白を分離する陰イオン性
マトリックス中に蛋白を通す段階よりなる、上記方法。 (35)交換体はバルビツール酸環を含む、特許請求の
範囲第34項に記載の方法。 (36)交換体は、チオバルビツール酸塩を含む、特許
請求の範囲第34項に記載の方法。 (37)交換体は、構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rは任意のリーシュ(leash)である)を
有する化合物を含む、特許請求の範囲第34項に記載の
方法。 (38)pH6.8以下において分離はまたリジン残基
にも基づいている、特許請求の範囲第34項に記載の方
法。 (39)交換体は、ジフルオロチラミン、ジクロロチラ
ミン、ジョードチラミン、及びジブロモチラミンよりな
る群から選ばれる化合物を含む、特許請求の範囲第34
項に記載の方法。 (40)集中した電荷を有する交換体を用いる段階を含
む、特許請求の範囲第34項に記載の方法。 (41)交換体に結合しているリーシュ(leash)
の長さを変える段階を含む、特許請求の範囲第34項に
記載の方法。 (42)蛋白の分離方法において、パイ電子と、蛋白の
チロシン残基と交換体の静電荷相互作用に基づき蛋白を
分離する陽イオン性マトリックス中に蛋白を通す段階よ
りなる、上記方法。 (43)交換体はN(β−グアニジノエチル)カルバミ
ルメチルを含む、特許請求の範囲第42項に記載の方法
。 (44)交換体はN(β−ビグアニジノエチル)カルバ
ミルメチルを含む、特許請求の範囲第42項に記載の方
法。 (45)交換体はN(β−イソメラミノエチル)カルバ
ミルメチルを含む、特許請求の範囲第42項に記載の方
法。 (46)交換体は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rはアルカンである)の化合物を含む、特許請
求の範囲第42項に記載の方法。(47)Rはメチルで
ある、特許請求の範囲第46項に記載の方法。 (48)交換体に固定されているリーシュ(leash
)の長さを変える段階を含む、特許請求の範囲第42項
に記載の方法。 (49)蛋白を分離するためのマトリックスにおいて、
パイ電子と、交換体と特異的アミノ酸残基の静電荷相互
作用に基づき蛋白を分離する交換体を含む、上記マトリ
ックス。 (50)交換体は陰イオン性である、特許請求の範囲第
49項に記載のマトリックス。 (51)交換体はバルビツール酸基を含む、特許請求の
範囲第50項に記載のマトリックス。 (52)交換体はチオバルビツール酸塩を含む、特許請
求の範囲第50項に記載のマトリックス。 (53)交換体は、バルビツール酸環に比較して集中し
た陰性電荷を有する化合物を含む、特許請求の範囲第5
0項に記載のマトリックス。 (54)交換体は、ジフルオロチラミン、ジクロロチラ
ミン、ジョードチラミン、及びジブロモチラミンよりな
る群から選ばれる化合物を含む、特許請求の範囲第50
項に記載のマトリックス。 (55)交換体はリーシュ(leash)によりマトリ
ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
めにリーシュ(leash)の長さは変えられる、特許
請求の範囲第50項に記載のマトリックス。 (56)交換体は、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rは任意のリーシュ(leash)である)の
化合物を含む、特許請求の範囲第50項に記載の方法。 (57)交換体は陽イオン性である、特許請求の範囲第
49項に記載のマトリックス。 (58)交換体はN(β−グアニジノエチル)カルバミ
ルメチルを含む、特許請求の範囲第57項に記載のマト
リックス。 (59)交換体はN(β−ビグアニジノエチル)カルバ
ミルメチルを含む、特許請求の範囲第57項に記載のマ
トリックス。 (80)交換体はN(β−イソメラミノエチル)カルバ
ミルメチルを含む、特許請求の範囲第57項に記載のマ
トリックス。 (61)交換体はリーシュ(leash)によりマトリ
ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
めにリーシュ(leash)の長さは変えられる、特許
請求の範囲第57項に記載のマトリックス。 (62)交換体は、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rはアルカンである)の化合物を含む、特許請
求の範囲第57項に記載のマトリックス。 (63)Rはメチルである、特許請求の範囲第62項に
記載の方法。 (64)バルビツール環を含む、蛋白を分離する交換体
を含む、蛋白を分離するためのマトリックス。 (65)蛋白を分離する交換体を含む、蛋白を分離する
ためのマトリックスにおいて、交換体はジフルオロチラ
ミン、ジクロロチラミン、ジョードチラミン、及びジブ
ロモチラミンよりなる群から選ばれる化合物を含む、上
記マトリックス。 (66)交換体はジブロモチラミンである、特許請求の
範囲第65項に記載のマトリックス。 (67)式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rは任意のリーシュ(leash)である)の
化合物を含む、蛋白を分離するためのマトリックス。 (68)蛋白を分離する交換体を含む、蛋白を分離する
ためのマトリックスにおいて、交換体はN(β−グアニ
ジノエチル)カルバミルメチル、N(β−ビグアニジノ
エチル)カルバミルメチル、N(β−イソメラミノノエ
チル)、及び式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rはアルカンである)の化合物よりなる群から
選ばれる、上記マトリックス。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/276,924 US5086167A (en) | 1988-11-28 | 1988-11-28 | Method of separating proteins |
US416299 | 1989-10-03 | ||
US07/416,299 US5110914A (en) | 1988-11-28 | 1989-10-03 | Method of separating proteins |
US276924 | 1994-07-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0327397A true JPH0327397A (ja) | 1991-02-05 |
Family
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Family Applications (1)
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EP (1) | EP0371746A3 (ja) |
JP (1) | JPH0327397A (ja) |
CA (1) | CA2004093A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6474229B2 (en) | 2000-04-18 | 2002-11-05 | Ando Electric Co., Ltd. | Marking device and marking method |
JP2016524013A (ja) * | 2013-06-17 | 2016-08-12 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | グアニジノ官能性モノマーを調製する方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6344946A (ja) * | 1986-05-13 | 1988-02-25 | パ−デユ−・リサ−チ・フアウンデ−シヨン | カチオン交換性材料 |
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1989
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- 1989-11-28 EP EP19890312327 patent/EP0371746A3/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6344946A (ja) * | 1986-05-13 | 1988-02-25 | パ−デユ−・リサ−チ・フアウンデ−シヨン | カチオン交換性材料 |
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JP2016524013A (ja) * | 2013-06-17 | 2016-08-12 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | グアニジノ官能性モノマーを調製する方法 |
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EP0371746A3 (en) | 1991-09-18 |
CA2004093A1 (en) | 1990-05-28 |
US5110914A (en) | 1992-05-05 |
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