JPH0327397A - 蛋白の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、一般的には有機化合物の分離方法に関する。

さらに詳１−＜は、本発明は蛋白の分離方法に関する。

多くの産業分野において蛋白を分離することが望ましい
。例えば研究では、ある成分がある性質又は結果を与え
るか否かを決めるために蛋白を分離することが必要であ
る。他の産業（例えば医薬品、食品、化粧品）では、あ
る製品を供給したり、製品を改良したりするのに、蛋白
の分離が必要である。さらに診断又は治療用に蛋白の分
離が好ましいことがある。しかし蛋白の分離には、多く
の他の理由や必要性がある。

蛋白の分離方法には多種類ある。その分離は、分子の大
きさ；溶解度；電荷；吸収性の違い；及び他の分子に対
する生物学的親和性に基づいて実施することができる。

このような方法の例としては、イオン交換；ゲル瀘過；
疎水性クロマトグラフィー；及びモノクローナル抗体を
用いる特異的クロマトグラフィーなどがある。イオン交
換では電荷により蛋白を分離し、ゲル濾過では蛋白の分
子量と形により蛋白を分離する。イオン交換クロマトグ
ラフィーで通常使用される２つの物質は、ジエチルアミ
ノエチルセルロース（ＤＥＡＥ−セルロース）とカルボ
キシメチルセルロース（ＣＭーセルロース）である。Ｄ
ＥＡＥ−セルロースはａｌｌ７．　０で陽性に荷電した
基を含有し、従って陰イオン交換体である。ＣＭ−セル
ロースは中性ｐｌ＋で陰性に荷電した基を含有し、従っ
て陽イオン交換体である。

もちろん現在利用できる方法により、多くの蛋白を分離
し精製することは可能であるが、現在の方法をいろいろ
組み合わせても必ずしも全ての蛋白が分離できるわけで
はない。従って現在の方法では、蛋白中のいくつかの関
連するアミノ酸残基の性質を区別することができないこ
とがある。例えば、アルギニンとリジンの比率の差に基
づいて蛋白を分離する場合、変性が予想されるような非
常に高い９｝１でクロマトグラフ一一する以外の方法を
われわれはまだ知らない。さらに現在利用できる方法で
は、充分精製された製品を得られるように蛋白を分離で
きないこともある。

従って蛋白の分離のための別の方法が必要である。

発明の要約 本発明は有機化合物、特に蛋白を分離するための新規な
方法を与える。この目的のため本発明は、パイ電子と、
交換体と有機化合物の特異的或分の静電荷相互作用に基
づいて有機化合物（特に蛋白）を分離する方法を与える
。具体的には本発明は、パイ電子と、交換体と蛋白及び
ポリペブチドのアミノ酸残基の静電荷相互作用の組合せ
に基づいて、蛋白を分離する方法を与える。

本発明の態様において、交換体は陰イオン性である。こ
の交換体は、陽性電荷を有しパイ電子を含有するアミノ
酸残基に基づき蛋白を分離する。

好適な態様において、交換体は、アルギニン（及びホモ
アルギニン）のグアニジノ基と、ヒスチジンのイミダゾ
ール基に対して高い親和性を有するリガンド（　ｌ　Ｉ
ｇａｎｄ）を含むバルビツール酸塩を含有する。ヒスチ
ジンのｐＫａ値のため、バルビツール酸リガンドは２つ
の異なるｐＨにおいて蛋白を分離する手段を与える。蛋
白はｐｉ値が８以上では主にアルギニン含量に基づいて
分離し、ｐｌｌ値が約７以下ではアルギニンとヒスチジ
ン含量の合計に基づいて分離することがわかっている。

従って陽イオ・ン性蛋白は、２種類の異なる分離方法の
ため、異なるｐｌｌレベルでこのマトリックスを利用す
ることができる。

ある態様において、陰イオン性交換体は、電荷の集中し
た又は分散したリガンドを含むことができる。このため
陰イオン性交換体に、さらに分離するための第２の特徴
が与えられる。例えば、パイ電子分布がバルビツール環
に類似しているが、電気陰性原子が少ないため電荷がも
っと集中している場合には、陰イオン性リガンドが選ば
れる。

このようなリガンドの例としては、アミノ基により中性
マトリックスに結合したチラミンがあるであろう。フェ
ノール性水酸基の両側のオルトの位置に電子吸引基を付
加することにより、静電効果にほとんど影響を与えるこ
となくフェノール基のｐＫａを低下させることができる
。

さらに、陰イオン性交換体は分離のための第３の特徴を
与える。交換体のリーシュ（ｌｅａｓｈ　）の長さ又は
構造を変更することにより、陰イオン性交換体により第
３の特徴が与えられる。パイ電子と静電荷反応の組合せ
では反応の場が限定されるため、リーシュ（ｌｅａｓｈ
　）の長さを変えると、蛋白中の個々のアミノ酸に対す
る近付きやすさが変わる。

ある態様においては、陰イオン性交換体はパラニトロフ
ェノールを含む。

本発明の別の態様においては、交換体は陽イオン性であ
り、陰性に荷電しパイ電子を持つアミノ酸残基を有する
蛋白を分離するために働く。具体的には陽イオン交換体
は、カルボキシル残基とグルタミン酸残基に対して予想
される単純な静電気的親和性以外に、チロシン残基に対
する親和性に基づいて蛋白を分離する。この交換体の１
例は、Ｎ（β−グアニジノエチル）カルバミルメチルー
セルロース（Ｇ　Ｅ　ＣＭ−セルロース）である。陽イ
オン交換体と同様に、ＧＥＣＭ−セルロースよりもチロ
シン残基に対しては親和性が同等か又は高く、アスパラ
ギン酸とグルタミン酸に対してはより親和性が低い、パ
イ電子の拡大した電気陰性原子のより分散した、陽性に
荷電したマトリックスにより、２番目の特徴が導入され
る。このようなリガンドの例としては、Ｎ（β−ビグア
ニジノエチル）一又はＮ（β−イソメラミノエチル）カ
ルバミルメチルーセルロースがある。

ある態様において、陰イオン性交換体はリーシュ（ｌｅ
ａｓｈ）の長さ及び／又は構造を変えることにより第３
の特徴が与えられる。

ある態様において、構造 （式中、Ｒはアルカンである）を有する陰イオン性交換
体が与えられる。ある態様においてＲはメチルである。

本発明の交換体は、蛋白を分離するためのカラムに使用
できる。ある態様において、本発明のりガンドは、特に
：セルロース；アガロース；デキストラン；アクリルア
ミド；スポセル（ｓｕｐｏｃｅｌ）　；シリカゲル；ポ
リスチレン；デンブン；およびガラスを含むマトリック
スに結合している。

本発明の別の特徴や利点は、好適な態様の詳細な説明や
図面から明らかであろう。

図面の簡単な説明 第１図はセファロースマトリックスに共有結合したバル
ビツール酸塩の滴定のグラフである。

第２図は、ＣＭ−セルロース又はＤＥＡＥ−セルロース
を用いて対になった蛋白をクロマトグラフイーした結果
である。

第３図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。

第４図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。

第５図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。

第６図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セフ７ロースマトリックス
に通して分離した結果を示す。

第７図は、ブタエラスターゼのウシキモトリブシノーゲ
ンからの分離を示す。

第８図は、フルオレスカミン（１’ｌｕｏｒｅｓｃａｍ
ｌｎｅ　）との反応でアミノ基を検出した、ｐｔｌ８．
　　５と６．５でのクロマトグラフィーの結果を示す。

第９図は、ＧＥＣＭ−セルロースに通したチラミンとチ
ロシンの溶出パターンを示す。

第１０図は、ＤＥＡＥ−セルロースとＧＥＣＭ一セルロ
ースに通したフエニル酢酸のｆａ出パターンを示す。

第１１図は、ＤＥＡＥ−セルロースとＧＥＣＭセルロー
スに通したＮ−アセチルチラミンの溶出パターンを示す
。

第１２図は、ＤＥ−５２、ＣＭ−５２、及びＧＥＣＭ−
セルロースのマトリックスに通したキモトリプシノーゲ
ンーＡ１リボヌクレアーゼ、ウシ血清アルブミン、及び
オバルブミンの溶出パターンを示す。

第１３図は、ＤＥＡＥ−セルロースとＧＥＣＭーセルロ
ースに通したりボヌクレアーゼとキモトリブシノーゲン
ーＡの混合物の溶出パターンを示す。

好適な態様の詳細な説明 本発明は有機化合物の分離のための新規な技術を与える
。さらに詳しくは、本発明は蛋白精製のための新規な技
術を与える。この技術は、パイ電子と、交換体と蛋白と
ポリベブチドの特異的アミノ酸残基の静電荷相互作用の
組合せに基づき、蛋白を分離する方法に基づく。具体的
には本発明は、蛋白の側鎖のパイ電子と静電荷に基づく
アミノ酸残基による蛋白の分離を目的とする。これらの
アミノ酸としては、陽性電荷を有するアルギニンとヒス
チジン、そして陰性電荷を有するチロシンがある。本発
明は好適な態様において、アスパラ酸とグルタミン酸残
基に基づいて蛋白を分離する。

本発明は、陽イオン性又は陰イオン性であり得る交換体
を与える。以下に詳細に記載するように、リガンド上の
電荷を変化又は集中させることにより、交換体に蛋白分
離のための第２の特徴を与えることができる。リーシュ
（ｌｅａｓｈ　）の長さ、及び／またはリーシュ（ｌｅ
ａｓｈ）の成分を変えることにより、蛋白分離のための
第３の特徴を与えることができる。

本発明者は、アミノ酸残基の側鎖のパイ電子と静電荷に
基づき、蛋白中のアミノ酸により、蛋白を分離する方法
を見いだした。本発明の方法に従い、本発明はパイ電子
と静電荷に基づき少なくとも４セットのアミノ酸残基を
分離できる。アスパラギン酸とグルタミン酸は対になっ
て分離されることに注意すべきである。従って、本発明
は、パイ電子を有し、有効なｐＨにおいて荷電している
すべてのアミノ酸残基を分離できる。本発明は、従来可
能であった以上の蛋白を分離する一群の技術を与える。

本発明の１つの態様において、交換体、即ちリガンドは
バルビツール環である。バルビツール酸塩は、炭素−５
に結合した基を除くと、平面構造をしている。電気陰性
原子が大量にあるため、３炭索原子、３酸素原子、及び
２窒素原子を有するパイ電子系の存在下で陰性電荷が相
当量分布している。しかし平面構造のグアニジウムイオ
ンは、真の陽性電荷が分散しているかなりのパイ電子系
を有している。以下にその構造をしめず二〇 合成したバルビツール酸塩含有マトリックスは、アルギ
ニン（及びホモアルギニン）のグアニジノ基とヒスチジ
ンのイミダゾール基に対して、一般的に高い親和性を有
する。バルビツール酸塩含有マトリックスを用いて、主
にｐｌｌ値約８以上ではアルギニン含量に基づき、ｐＨ
１約６．８以下ではアルギニンとヒスチジンの合計量に
基づき、蛋白を分離することができる。従って陽イオン
性蛋白は、２つの異なる分離のために２つの異なるｐｌ
ｌ値で、このマトリックスを利用することができる。こ
れに対して、ほとんどの陰イオン性蛋白は、ｐＨ８で結
合するようなかなりの又は充分な数のアルギニンがなけ
れば、おそらく低ｐＨでのみ結合及び分離＋ｉ５能であ
ろう。

バルビツール酸塩は、リガンドが結合していない状態で
ｐＫａ値は約７．９である。アルキル基の１つではなく
炭素−５の上にプロトンを有するバルビツール酸塩は、
４．０４と４．９７の間のｐＫａを持っているはずであ
る。これによりこの種のマトリックスの酸性９１１の応
用範囲が実質的に拡大する。ある蛋白は低ｐｌｌ値でし
か分離できないから、これは重要なことである。チオバ
ルビッール酸塩などの関連リガンドを使用することもで
きる。

他の関連した構造は、ピリミジン、プリン、そしてヒダ
ントイン及びその誘導体である。

例として、バルビツール酸塩マトリックスを利用する実
験操作を以下に示すが、これは本発明を限定するもので
はない。

以下の化学薬品と組底物を使用した。ウシキモトリプシ
ノーゲン、ａ−キモトリブシン、リボヌクレアーゼ、ａ
−ラクトアルブミン及び血清アルプミン及びオバルブミ
ン、アグマチン、ヒスタミン、そしてブタエラスターゼ
はシグマ（Ｓｌｇｍａ　）社より入手した。アリルジエ
チルエチルマロネート、尿素、臭化シアン、Ｎ−アセチ
ルエチレンジアミン、そしてＯ−メチルイソ尿素は、ア
ルドリッチ（＾Ｉｄｒｌｅｈ　）社より入手した。アジ
化ナトリウムとバルビツールはフィッシャーサイエンテ
ィフィック（Ｐｌｓｈｅｒ　Ｓｃｌｅｎｔｌｅ　）社よ
り入手した。

セ７７０−ス４Ｂはファルマシア（Ｐｈａｒ＋＊ａｃｌ
ａ　）社より入手した。塩酸グアニジンはシュワルツ／
マン（　Ｓｈｖａｒｚ／　Ｍａｎｎ）社より入手した。

膨潤済みの微粒ＣＭ−セルロース及びＤＥＡＥ−セルロ
ース（ワットマンＣＭ一及びＤＥ−５２）は、エイチ・
リープエンジェルアンドカンパニー（Ｈ．　Ｒｅｅｖｅ
　Ａｎｇｅｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）社より入手し
た。フルオレスカミン（４−フェニルースピロ［フラン
−２（３Ｈ）　、１’　−フタラン］　３，　　３’　
−ジオン）は、ホフマンラロッシュ（ＨｏｆＴｍａｎ−
ＬａＲｏｃｈｅ　）社より入手した。以下に示す他の全
ての化学薬品は、人手できる最高のグレードであった。

蛋白のグアニジン化には標準的な方法を採用した。Ｎ−
アセチルーエチレンジアミンをＯ−メチルイソ尿素と反
応させ、２−アセトアミドエチルグアニジンを合成した
。５−エチル−５−　（３−アミノプロピル）バルビツ
ール酸塩酸塩は以下のようにして合成した： Ｂｒ Ｏ パーキンエルマ−　ＦＴ　　Ｒ−８００分光ｉをＪＴｌ
いてＮＭＲスペクトルを求めた。全ての新規化合物のプ
ロトンＮＭＲの分析結果は満足できるものであった。プ
レコートした薄層シリカゲルプレート（ワットマンＭＫ
−６Ｆ）上で１−ブタノール：酢酸エチル：酢酸：水（
１　：　１　：　１　：　１）で展開してクロマトグラ
フイーすると、各バルビツール酸化合物は単一のスポッ
トを示した。

ジエチルエチルアリルマロネートの合成氷の上で冷却し
た１２５ｍｌの無水エタノール中１２．２ｇの金属ナト
リウム（０．５３モル）の溶液に、１００ｓｒのジエチ
ルアリルマロネート（０．５３モル）を加えた。少し発
熱反応が起き氷の上で冷却した後、若干過剰量のア・リ
ルブロマイド（７７ｇ，０．６４モル）を加えた。激し
い発熱反応が約１分間続いた後、沈澱物が生成した。

次に１＝１００のフェノタレイン：エタノール溶液（Ｗ
／Ｖ）で試験して中性になるまで、反応混合液を約２時
間加熱沸騰させた。次にアルコールを蒸留して除去し、
固形残渣を得た。

残渣に水を加えると、油状の上層と下の水層が形或され
た。油層を分離し、水層のジエチルエーテル抽出液５０
０ｍｌと合わせた。合わせた溶液を最初に水で次に飽和
食塩水で洗浄した後、固体硫酸マグネシウムで約１０分
間処理して残存している水を除去した。濾過した後この
無水溶液を蒸発させて９５−１００℃／５ｍｍＨｇで蒸
留してジエチルエチルアリルマロネートを得た。

５−エチル−５−アリルバルビッール酸の合或無水エタ
ノール１７０ｍｌ中の金属ナトリウム（７．７５ｇ，０
．３２９モル）の溶液に尿素（１９．７６ｇ，０．３３
モル）を溶解した。この溶液に等モルのジエチルエチル
アリルマロネーート゛（７５ｇ，０．３２９モル〉を加
え、合わせた溶液を５時間以上加熱沸騰させた。溶液を
２３℃に冷却し、濃塩酸で中和し濾過した。次に濾液を
蒸発させて得られたシロップに水２００ｍｌを加え水酸
化ナトリウムでアルカリ性にした。次に溶液をエーテル
で抽出し反応しなかったジエチルエチルアリルマロネー
トを除去した。水層を氷上で冷却し冷濃塩酸で酸性にし
た。バルビッール酸誘導体を分離した：これは濾過し最
小量のエタノールに溶解した。微小の結晶が形成するま
で水を加え、溶液を２３℃で一晩放置した。濾過して結
晶を除き、冷水で洗浄し、空気乾燥した。融点は１５７
−１５９℃であった。

トルエン８　０　０　ｍｌ中４０．の５−エチル−５一
アリルバルビツール酸の懸濁液を撹拌し、ＧＥサンラン
プ（２７５ワット、１１０−１２５ボルト）を約９０分
間照財した。次に照射を続けながら、気体ＨＢｒを４５
分間通し、さらに４５分間撹拌した。次に反応フラスコ
を開けて、過剰のＨＢｒを蒸発させた。溶液を冷却し濾
過した。得られた沈澱物をトルエンで洗浄した後、乾燥
し、最小量の熱アセトンに溶解した。少量の沈澱物が生
成するまで石油エーテル（８０−６８℃）を加えた：フ
ラスコを２３℃で一晩放置した。結晶を濾過し、石浦エ
ーテルで洗浄し、空気乾燥した。融点は１３８−１４０
℃であった。

３５０ｍｌのアセトン中３０．の５−エチル−５一（３
−プロモブロビル）バルビッール酸と１３ｇのアジ化ナ
トリウムの溶液に２４０ｍｌの水を加え、約１８時間還
流した。次に溶液を氷上で冷却し、濾過し、空気乾燥し
、最小量の９５％熱エタノールに溶解した。冷却後結晶
が現れ、これを濾過し、空気乾燥した。融点は１８２−
１８４℃であった。

１８０ｍｌの水酢酸中の５−エチル−５−　（３−アジ
ドプ口ビル）バルビッール酸（２０ｇ）の懸濁液を、２
ｇの二酸化白金を含有する４０ｍｌのジメチオキセクン
と混合し、パー（　Ｐａｒｒ）シェーカー型水素添加化
装置で室温で約５時間水素添加化した。この溶液を濾過
し蒸発させて油状物質とした。この油を無水エタノール
に溶解し、約０−１０℃で塩化水素ガスで飽和させた。

この溶液を蒸発して濃縮した後、クロロホルムを加える
と塩酸塩化合物が析出した。この物質を最小量のメタノ
ールに再溶解し、クロロホルムを加えて再結晶させた。

融点は２２４−２２６℃であった。

ピー◆クアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｅａｓａｓ．　Ｐ
）とシー●ビー・アンフィンセン（Ａｎｆ’ｌｎｓｅｎ
．　Ｃ．Ｂ．）、（１９７１年）メソッズインエンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇ
ｙ　）　、第２２巻、３４５一３７７頁の方法に従い、
セファロース−４８１ｍｌ当り３００■の臭化シアンを
用いｐｌｌｉｏ．５でセファロース−４Ｂを活性化した
。Ｏ．ＩＭ炭酸水素ナトリウム、ｐｌｌ９中の活性化ゲ
ルｌｍｌ当り２０■のバルビツール酸塩誘導体を添加し
、４℃で一晩シェーカーの中に置いた。次にゲルを２３
℃で２時間、０．２Ｍのグリシン中に約２時間置いて、
置換されていない活性基を保護した。次にゲルを結合緩
衝液とＯ．ＩＭの酢酸ナトリウム、ｐ■４（それぞれ０
．５ＭのＮａＣ，Ｑを含有）で洗浄した。最後の洗浄は
結合緩衝液で行った。

以下に述べる本実験のクロマトグラフィーはすべて、０
．８Ｘ９ｃ＋ａのカラムで実施した。使用した緩衝液は
、特に明記していない場合は、５ＩＩＭリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ８．０又はｐｌｌ６．　８）である。

流速１ｍｌ／分で２ｍｌの両分を集めた。最初の緩衝液
で各カラムを流した後、出発緩衝液５０ｍｌと０．５Ｍ
又は１ＭのＮａＣｌを含有する同じ緩衝液５０ｍｌでリ
ニアーグラジエント全作成して溶出した。アミノ酸組成
の分析にはＪＥＯＬ　　５ＡＨアナライザーを使用し、
蛋白試料を真空中１１０℃で６Ｍ　　ＨＣＲで約２２時
間加水分解した。

第１図はセファロースマトリックスに共有結合したバル
ビツール酸塩の広範囲の滴定曲線を示す。

アミノ基でセファロース６Ｂに結合した５−エチル−５
−（３−アミノプ口ピル）バルビツール酸（連続線、黒
丸）と、セファロース６Ｂ（破線、白丸）の滴定曲線を
比較してある。各マトリックスの２０ｍｌを０．２Ｍの
ＮａＯＨで滴定した。炭素−５にアルキル基が２個結合
したバルビツール酸塩のｐＫａの範囲は、７．４５から
７．９９である。しかし他の荷電基に見られるように、
マトリックスのｐＫａ範囲は拡大している。１つのアル
キル基の代わりにプロトンが炭素−５に結合している場
合、ｐＫａ４．０４から４．９４が記録されている；こ
れは炭素−５上の水素がもっとも酸性の強いプロトンか
もしれないことを示している。

第２図はＣＭ−セルロース又はＤＥＡＥ−セルロースを
用いて対になった蛋白をクロマトグラフイーした結果を
示す。パネルＡからＤにおいて、蛋白は充分にグアニジ
ン化した誘導体として流した。２種類の陰イオン性蛋白
と陽イオン性蛋白を選んだ。使用した蛋白は以下の通り
である：αーラクトアルブミン（バネルＡ）；リボヌク
レアーゼ（パネルＢ）；キモトリプシノーゲン（バネル
Ｃ）；およびウシ血清アルブミン（パネルＤ）。

パネルＡとＤでは、ＤＥＡＥ−セルロースを使用し、パ
ネルＢとＣでは、ＣＭ−セルロースを使用した。

図に示すように各蛋白対は、ひとつのピークとして現れ
た。図には示されていないが、おのおのについて０．５
ＭのＮａＣｌで溶出を続けたが、２８０ｎ一に吸収を示
す物質はなにも現れなかった。

パネルＢとＣの結果は、グアニジノ基は第一アミノ基と
比較するとカルボキシレートに対する親和性は高くない
ことを、もう一度強調している。

パネルＥは、ウシキモトリプシノーゲンとブタエラスタ
ーゼ（リジン：アルギニン比はそれぞれ１４：２と３：
１２である）の混合液のＣＭ−セルロースによる溶出を
示す。アルギニンとリジン含量に大きな差があるにもか
かわらず、２つの蛋白は同じ位置に溶出しており、アミ
ノ基及びグアニジノ基によるカルボキシレート基に対す
る親和性に大きな差がないことを示している。

第３図から第６図は、本発明のバルビッール酸塩誘導セ
ファロースマトリックスに通すと、天然の蛋白からグア
ニジン化蛋白が充分分離できることを示している。第３
図は天然のα−ラクトアルブミン（パネルＡとＣ）とグ
アニジン化ａ−ラクトアルブミン（バネルＢとＣ）をｐ
ｌ１６．　８でセファロース−４Ｂのバルビツール酸塩
誘導体でクロマトグラフイーした図である。第４図は天
然のりボヌクレアーゼ（バネルＡとＣ）とグアニジン化
リボヌクレアーゼ（パネルＢとＣ）をｐ１１８でセファ
ロース−４Ｂのバルビツール酸塩誘導体でクロマトグラ
フイーした図である。第５図は天然のキモトリプシノー
ゲン（パネルＡとＣ）とグアニジン化キモトリプシノー
ゲン（パネルＢとＣ）をｐＨ８でセファロースー４Ｂの
バルビツール酸塩誘導体でクロマトグラフイーした図で
ある。第６図は天然のウシ血清アルブミン（パネルＡと
Ｃ）とグアニジン化ウシ血清アルブミン（パネルＢとＣ
）をｐｌ＋６．　８でセファロース−４Ｂのバルビツー
ル酸塩誘導体でクロマトグラフイーした図である。

表１は、これらの図のクロマトグラフィー成分のアミノ
酸分析の結果を示す。

表１は、キモトリンとオバルブミンの天然の成分とグア
ニジン化或分を使用した２つの分析結果である（溶出プ
ロフィールは示されていない）。

それぞれの場合でクロマトグラフィーのピーク画分は、
成分が完全に分離されていることを示している。各天然
の蛋白はカラムに結合し、それぞれの場合でグアニジン
化誘導体の方が親和性が高い。

マトリックスは陰性に荷電しているが、マトリックスは
ウシ血清アルプミン、α−ラクトアルブミン、そしてオ
バルブミン（これらの等電点はそれぞれ４．８、５．１
、そして４．７である）のような陰イオン性の蛋白を結
合する；これらの蛋白はＣＭ−セルロースに結合しない
。

第７図（表１参照）はウシキモトリプシノーゲンからの
ブタエラスターゼの完全な分離を示している。これに関
連して、天然のキモトリプシノーゲン（パネルＡとＣ）
と天然のエラスターゼ（パネルＢとＣ）のｐＨ８でのセ
ファロース−４Ｂをバルビツール酸塩誘導体でクロマト
グラフイーした図を示してある。第２図の知見とは対照
的に、アルギニン含量の高いエラスターゼが有意に遅れ
て出てきている。この２つの蛋白は同定度の分子量と等
電点を有している。これらの結果は、エラスターゼのア
ルギニン含量の高さがこの蛋白の高い親和性に関係があ
ることを示している。この３種類の陰イオン性蛋白の例
では、天然の成分はｐｌｌ８．０で結合を示さず９１｛
６．　８で結合した。ｐＨ６．８ではヒスチジン残基が
かなりプロトン化しており、再びパイ電子と静電効果の
組合せによりマトリックスとの相互作用が起きたのであ
ろう。

この面の解析にはモデル化合物の結合の研究が必要であ
った。共通のすべてのアミノ酸の混合物、又はヒスチジ
ン又はアルギニンのみの場合は結合しなかった。従って
、結合は単純な静電気的なものではなかった。もしパイ
電子を介して結合したならば、バルビツール酸基はアミ
ノ酸のα一カルボキシル基の近くになければならない。

その結果として起きる静電気的反発がパイ電子が近付く
のを妨害するであろう。これを確認するためにアグマチ
ン（ａｇａａｔｌｎｅ）とヒスタミン（ｈＬｓｔａｍｌ
ｎｅ　）（それぞれアルギニンとヒスチジンの脱カルボ
キシル化産物）、及び１，６−ジアミノヘキサン（リジ
ンの脱力ルボキシル化産物）を別々に実験した。

第８図は、ａｌｌ８．　　５　（上の列）とｐｌｌ６．
　　５　（下の列）で１ｍＭ｝リスクラロイド中の１．
６−ジアミノヘキサン（左のパネル）、アグマチン（ま
ん中のパネル）、ヒスタミン（右のパネル）をセファロ
ースー４Ｂのバルビツール酸塩誘導体に通したクロマト
グラフィーの結果である；各実験で１．５から２．５ｍ
ｇのアミンを使用した。いずれの場合もヘキサンジアミ
ンは結合せず、このマトリックスとの静電気的引力は小
さいことを示していた。アグマチンはいずれの９８でも
結合するが、ヒスタミンはＰＨ６．５でのみ結合する。

アミノ基の効果が小さいことを確認するために、２−ア
セトアミドエチルーグアニジンをｐ｝％６．５で同じカ
ラムに通し、その溶出をサカグチ反応で定量した。その
結果アグマチンと同じ結果が得られた。後者の場合結合
は実質的にグアニジノ基に限定されていた。

Ｏ−メチルイソ尿素との反応は蛋白の化学修飾のさらに
特異的なもののひとつである。膵臓リボヌクレアーゼの
ように活性部位にリジンがない場合は、リジン残基のホ
モアルギニンへの変換に限定されるため、蛋白の活性へ
の影響は中程度である。従ってバルビツール酸一セファ
ロースにより結合が増加したのは、グアニジノ基に由来
すると考えるのが妥当であろう。

上記の実験結果は、異なる蛋白中のホモアルギニンやア
ルギニン残基のグアニジノ基とヒスチジン残基のイミダ
ゾール基に対し、不溶性マトリックス上のバルビツール
酸塩陰イオンの選択的親和性を示している。バルビツー
ル酸塩の残基に対する親和性は、パイ電子と静電気効果
が組合わさっていることを示している。

本研究が或功するか否かは、ホモアルギニンとアルギニ
ンのグアニジノ基とヒスチジンのイミダゾール基の表面
露出度に依存している。アルギニンは蛋白の表面中で最
も親水性が強く、これが蛋白骨格からある距離にあると
いうことは、バルビッール酸基が接近して容易に重なる
（ｓｔａｃｋｉｎｇ）構造を取り易く、単なる静電気的
結合の場合よりももっと限定された構造になるであろう
。これに対してヒスチジン残基は埋め込まれていること
もあるし、完全に又は部分的に露出していることもある
。この特徴がマトリックスへの近付き易さを決定するで
あろう。本発明のマトリックスはまた、バルビツール酸
環の炭素−５に結合しているアルキル基のため、疎水性
相互作用で蛋白に結合する場合もある。しかしここで研
究した蛋白の親和性の差は、主にパイ電子と静電気的相
互作用に起因する。

本発明の態様に従えば、天然の陽イオン性蛋白は本発明
のバルビツール酸塩マトリックスにより２つの方法で分
離可能である。ｐｌ１約８以上では、アルギニン含量の
差により分離され、ｐ１１約７以下では、アルギニンと
ヒスチジン含量の差の合計により分離される。アルギニ
ン含量が高くない場合、陰イオン性蛋白は主に後者を基
礎にして分離される。最後にα一カルボキシル基の反発
作用のため、Ｃ一末端アルギニン及びヒスチジン残基の
結合への寄与はほとんどないであろう。

本発明はパイ電子と静電気的相互作用に基づく、本発明
の陰イオン性交換体に第２の特徴を与える．この点に関
し、バルビツール酸環は数個の電気陰性原子が広く分散
した荷電状態にあるため、アミノ基と単なる静電気的相
互作用をするには弱い基であることに注意すべきである
。本発明の態様に従えば、パイ電子分布が似ており、電
気陰性原子が少ないため電荷が集中しているような陰イ
オン性リガンドが選択される。このような陰イオン性リ
ガンドの例としては、アミノ基により中性マトリックス
に結合したチラミンがある。フェノール性水産基の両側
のオルトの位置に電子吸引性基を加えることにより、静
電気効果に影響を与えることなく、フェノール基のｐＫ
ａは低下させることができる。例えばジブロモチラミン
では、フェノール基のｐＫａは当然約６．８である。し
かし、他の電子吸引性基が利用でき、陰イオン性リガン
ドとして、例えばジフルオロチラミン、ジクロロチラミ
ン、ジョードチラミン、及びジニトロチラミンがある。

さらに集中した電荷を利用してこの陰イオン性交換体に
第２の特徴を与えることができる。第２の特徴により蛋
白がさらに分離できる。

本発明は、本発明の陰イオン性交換体に第３の特徴を与
える手段を与える。リガンドのリーシュ（ｌｅａｓｈ）
の長さと成分により、蛋白をさらに分離し区別すること
ができるという点で、第３の特徴が与えられる。陰イオ
ン性交換体マトリックスに対するヒスチジンとアルギニ
ン残基の結合は重なり（ｓｔａｃｋ１ｎｇ）相互作用の
ため、その相互作用の配置は非常に限定される。さらに
アミノ酸残基（特にヒスチジン残基）は蛋白の表面に対
する近付，き易さが異なるため、アミノ酸残基のリガン
ドヘの近付き易さは異なる。従って単純な陰イオン性交
換クロマトグラフィーとは異なり、リガンドとマトリッ
クスをつなぐリーシュ（ｌｅａｓｈ　）の長さは重要で
ある。リーシュ（ｌｅａｓｈ　）の長さを変えて、クロ
マトグラフィーの異なる溶出パターンが得られる。残基
のリガンドへの近付き易さを変えて分離をすることもで
きる。

ある態様では、陰イオン性交換体はバラニトロフェノー
ルを含有する。この態様では交換体は以下の構造を有す
る： Ｒ （式中、Ｒは任意のリーシュ（ｌｅａｓｈ　）である）
。

前述したように、本発明の方法のある態様では、アルギ
ニンとヒスチジン含量に越づいて陰イオン性交換体を使
用して蛋白を分離しており、分離のための３ｆ！Ｉ類の
特徴を与える。本発明はまた、陰性電荷とパイ電子を有
するアミノ酸残基の分離を可能にする陽イオン交換体を
与える。この点において陽イオン性マトリックスは、チ
ロシン残基と、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基に
基づき蛋白の分離を可能にする。

本発明のある態様においては、陽イオン交換体は、アス
パラギン酸とグルタミン酸のカルボキシル残基に対して
予想される単純な静電気的親和性以外に、チロシン残基
に対する親和性に基づいて蛋白を分離するための、パイ
電子を有する陽イオン性マトリックス、例えば（β−グ
アニジノエチル）カルバミルメチルーセルロースが合成
される。

フェノール基のｐＫａは９．５と１０の間であるにもか
かわらず、マトリックスの親和性は充分強く、ｐＨ８で
Ｎ−アセチラミンを結合する。このｐｌ１では陰イオン
性及び陽イオン性蛋白ともに結合する。

バルビツール酸塩マトリックスに関する前述の原理に従
えば、電気陰性原子が大きく分散した拡大したパイ電子
を有する陽性に荷電したマトリックスは、ＧＥＣＭ−セ
ルロースより、チロシン残基に対して同等又は高い親和
性を有し、アスパラギン酸とグルタミン酸残基に対し親
和性が弱いはずである。これらのマトリックスの例とし
ては、Ｎ（β−ビグアニジノエチル）カルバミルメチル
ーセルロースとＮ（β−イソラミノエチル）カルバミル
メチルーセルロースがある。

例としてパイ電子を有する陽イオン性マトリックスを用
いる実験方法を示すが、これが本発明を限定するもので
はない。

以下に示す実験は、パイ電子を有する陽イオン性マトリ
ックスはチロシン（高ｐｌ１で陰イオン性である戊分）
と相互作用することを証明している。

具体的には以下の実験は、パイ電子を有する陽イオン性
マトリックスはチロシン残基のフェノレート陰イオンに
対し特別な親和性を有することを証明している。この目
的のためグアニジン含有マトリックスを合威した。

以下の化学薬品と成分を使用した。ウシキモトリブシノ
ーゲン、リボヌクレアーゼ、オバルブミン、ウシ血清ア
ルブミン及びビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリ
ス（ヒドロキシメチル）メタンはシグマ（Ｓｉｇｍａ　
）社より入手した。塩酸チラミン、１・−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）一３−エチルーカルポジイミド、Ｎ
−アセチルエチレンジアミンは、アルドリッチ（Ａｌｄ
ｒｌｅｈ　）社より人手した。無水酢酸はマリンクロッ
ト（Ｍａｌ　Ｉｉｎｃｋｒｏｄｔ）社より人手した。チ
ロシンとフェニレエチルアミンはカルビオケム（Ｃａｌ
ｂｌｏｃｈｅｍ）社より入手した。膨潤済みの微粒ＣＭ
−セルロース及びＤＥＡＥ−セルロース（ワットマンＣ
Ｍ−及びＤＥ−５２）は、エイチ・リーブエンジェル（
ｌｌ．　Ｒｅｅｖｅ　Ａｎｇｅｌ）社より人手した。ダ
ウエックス−５０　　４Ｘ，２００から４００メッシュ
はバイオラッド（ＢＬｏＲａｄ）社よーり入手した。フ
ェニル酢酸はイーストマン（Ｅａｓｔｓａｎ　）社より
人手した。

使用した他の全ての化学薬品は、入手できる最高のグレ
ードであった。

Ｎ（β−グアニジノエチル）カルバミルメチル−セルロ
ースは以下のように合成した：Ｏ ＣＨ　ＣＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２ アミノエチルグアニジンの合成 Ｎ−アセチルエチレンジアミン（１５ｇ）に２３℃で５
日間、８０ｍｌの水ｐ１｛１０．５中のメチルイソ尿素
（４７ｇ）を混合させた。ニンヒドリンのスポット試験
を行った。スポット試験が陽性の場合は、無水酢酸を加
えて残存するすべてのアミノ基を保護した。次にこの溶
液をダウエックスー５０カラム（６Ｘ１５ｃｍ）に通し
た。水で一定時間流してから、Ｎ（β−グアニジノ）ア
セトアミドエタンを６Ｍの塩酸で溶出し、サカグチ反応
により試料の定性スポット試験を行った。陽性の画分を
還流装置の中で約１６時間加熱した。

生成物（アミノエチルグアニジン）を蒸発乾固させ水に
溶解し、ＩＯＭ　　ＮａＯＨで中和し、ＣＭ−セルロー
ス力ラムに通し、水で一定時間流した後ＩＭＮａｃＮで
溶出した。生成物を含む画分二ンヒドリン反応とサカグ
チ反応が一致し、この画分を集めて加熱して蒸発乾固し
た。残渣を熱アルコールに入れてアミノエチルグアニジ
ンを溶解させた。濾液を冷却し２３℃で一晩放置すると
、アミノエチルグアニジンの結晶が得られた。

ＧＥＣＭ−セルロースの合成 ＣＭ−セルロース（１　０　ｇ）を水で洗浄し、水２０
ｍｌ中８．７５ｇのアミノエチルグアニジンと充分混合
させた。カルボジイミド（　９　．　　６　ｇＩｉ）を
水１０ｍｌに溶解した。ＬＭ　　ＨＣＲとＩＭＮａＯＨ
でそれぞれｐＩ１を５．５に調節した。次に希ＨＣｆｉ
でｐＨを連続的に５．５に維持しながら、カルボジイミ
ドを３回に分けて加えた。２３℃でシェーカー中で一晩
反応させた後、マトリックスを水で洗浄した。

フエニルエチルアミン、Ｐ−メトキシフエニルエチルア
ミン、チラミン及びトリプタミンを無水酢酸でアセチル
化して、Ｎ−アセチル化生戊物を得た。チラミン生成物
の場合、当量の２Ｍヒドロキシルアミンｐｌ＋７．　　
５と１０分間反応させ、〇一アセチル基を除去した。全
ての生成物をセファデックスＧ−２５カラム（１、５Ｘ
３５ＣＩｌ１）に通すと、芳香族化合物は遅れて溶出し
、それらを陰イオン性交換クロマトグラフィーにかけた
。各生成物約１から５ｍｇを各実験で使用した。

以下の実験では、セルロース誘導体を使用するすべての
クロマトグラフィーは２３℃で０．８Ｘ９ｃｍのカラム
中で行った；緩衝液は特に明示していない場合は５ＩＩ
Ｍトリスー塩酸であった。流速１ｍｌ／分で２ｍｌの両
分を集めた。最初の緩衝液で一定時間流した後、出発緩
衝液３０ｍｌとＩＭＮａＣｌ）を含有する同じ緩衝液３
０ｍｌで作ったりニアーグラジアントで各カラムを溶出
した。各蛋白約１から５■を各実験で使用した。図１３
でリボヌクレアーゼとキモトリプシノーゲンを区別する
ため、リボヌクレアーゼにはトリブトファンがなくキモ
トリブシノーゲンにはこれが７個あることを利用した。

即ち、２９８旧と２　８　０　ｎｏ＋の吸光度の比が小
さい場合はりボヌクレアーゼが存在することを示してお
り、この比が大きい場合はキモトリプシノーゲンの存在
を示していた。

グアニジン含有マトリックスによる以前の実験では、０
−メイチルイソ尿素との反応により、アミノエチルセル
ロースがグアニジノ誘導体に変換されていた。この実験
では未反応のアミノ酸が少し残っており、実験結果の解
釈が混乱するため、混乱を避けるためＧＥＣＭ−セルロ
ースを合成した。

図９はｐｌｌ８におけるＧＥＣＭ−セルロースからのチ
ラミン（上のパネル）とチロシン（下のパネル）の溶出
パターンを示している。図に示すようにチラミンは結合
が弱く、塩グラジエントをかける前に完全に溶出してお
り、チロシンは強い結合を示している。フエニル酢酸は
ＤＥＡＥ−セルロースとＧＥＣＭ−セルロースに対して
同程度に結合している（第１０図参照，ＤＥＡＥ−セル
ロース（上のパネル）モしてＧＥＣＭ−セルロース（下
のパネル））。さらに後者のマトリックスに対する結合
はチロシンに似ており、完全にカルボキシル基による結
合が大体同じであることを示している。

これらの結果に基づき、グアニジウム基とフェノール基
の静電気的及びパイ電子の相互作用が組合わさった可能
性は低いと結論できるであろう。

しかしバルビツール酸塩含有マトリックスとイミダゾー
ル基やグアニジニウム基との相互作用に関するは前述の
実験は、ヒスチジンとアルギニンのα一カルボキシル基
は、バルビツール酸塩アニオンによる重なり相互作用を
充分に強く妨害することを示していた。α一カルボキシ
ル基のないモデル化合物を使用するとこの影響は避けら
れる。

従って、チロシンのα−アミノ基とチラミンの関連アミ
ノ基は、グアニジウムイオンのフェノール基との重なり
相互作用を坊害するかもしれないということが考えられ
た。従って、Ｎ−アセチルアミンを用いてさらに実験し
た。第１■図はＮーアセチルアミンをＤＥＡＥ−セルロ
ース（バネルＡ）とＧＥＣＭ−セルロース（バネルＢか
らＥ）でクロマトグラフイーした結果を示す（ｐ！１は
各パネル内の数字で示してある）。パネルＤとＥの緩衝
液は５ｄビスートリスであった。図に示すようにｐｌ＋
８ではＤＥＡＥ−セルロースとの結合は見られないが、
これはこのｐＩ１ではフェノール基は完全にプロトン化
しているため予測されることである。

これに対してこのｐｌｌではＧＥＣＭ−セルロースとは
かなり結合している。ｐｎ１ｏでは結合は強く、ｐｌ１
７では普通であり、ｐＨ６．　　５では結合しておらず
、９Ｈ依存性を示している。この結合がフェノール基に
由来することは、２−（フェニル）アセトアミドエタン
も２−（４−メトキシフェニル）アセトアミドエタンも
全く結合したかったことを証明して確認した。フェノー
ル基のｐＫａ値の下約１．５ｐＨではＮ−アセチルアミ
ンはまだ強く結合しているため、ｐＨ８で強く結合して
いることはフェノレートアニオンの強い親和性を示して
いる。

さらにアセチル化トリブタミンも結合しないことを証明
した。

この情報を用いて２つの陰イオン性蛋白と２つの陽イオ
ン性蛋白を分析した。第１２図は、キモトリプシノーゲ
ンーＡ（ａの列）、リボヌクレアーゼ（ｂの列）、ウシ
血清アルプミン（Ｃの列）、及びオバルプミン（ｄの列
）を、指示されたセルロースマトリックスに通したクロ
マトグラフィーを示す。図に示すように、これらの蛋白
はｐＨ８でＣＭ−セルロース又はＤＥＡＥ−セルロース
に対して適当な親和性を示した。しかしこのｐｌｌでは
４つの蛋白全てがＧＥＣＭ−セルロースに結合する。

第１３図は、リボヌクレアーゼとキモトリプシノーゲン
ーＡの混合物をＣＭ−セルロース（上のパネル）とＧＥ
ＣＭ−セルロース（下のパネル）でクロマトグラフイー
したものである。図に示すように、ＣＭ−セルロースと
ＤＥＡＥ−セルロースのいずれもリボヌクレアーゼとキ
モトリプシノーゲンに結合する。しかし、ＧＥＣＭ−セ
ルロース（陽イオン性マトリックス）のみがこの２つの
陽イオン性蛋白を分離させ、リボヌクレアーゼがキモト
リブシノーゲンの前に溶出した。従ってこのマトリック
スはｐ１１８で、表面の酸性残基及びチロシン残基の合
計に基づき蛋白を分離した。αーアミノ基の反発作用の
ため、Ｎ一末端チロシンはおそらく蛋白結合にほとんど
寄与しないであろう。

従って、本発明はまた、チロシンアミノ酸残基に基づく
蛋白の分離を可能にする陰イオン交換体を与える。この
交換体はまた、ＧＥＣＭ−セルロ−スよりもアスパラギ
ン酸残基やグルタミン酸残基に対する親和性は小さい。

陰イオン性交換体と同様に、陽イオン性交換体もチロシ
ンの交換体に対する相互作用の配置の点で、別の特徴を
与える。相互作用の配置は非常に限定されているため、
そしてこれらの残基は蛋白の表面への近付き易さの程度
が異なるため（特にチロシンの場合）、リガンドに対す
る近付き易さも異なる。再びリーシュ（ｌｅａｓｈ　）
の長さを変えて、異なる溶出パターンと分離が得られる
。

アミノ基をアミジノ基で置換することによりまた別の陽
イオン性交換体が与えられる。この交換体の式は以下の
通りである： 好ましくは交換体は以下のように作成する二〇 （式中、Ｒはアルカン、好ましくは小さいアルカンであ
る）。好適な態様では、Ｒはメチルである。

これはＤＥＡＥよりも強くアスパラギン酸残基やグルタ
ミン酸残基を結合するはずであり、従って陽イオン性蛋
白も結合するであろう。関連構造はイミダゾール含有基
であろう。

例として、ＣＭ−セルロースやＤＥＡＥ−セルロースの
技術に比較して交換体の例を示す。

Ｃ　Ｍ　　　　　　　　　Ｌｙｓ＝Ａｒｇ　　　　Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ｈｌｓバルビツール酸塩　＾ｒｇ＞＞＞Ｌ
ｙｓ　　Ａｒｇ＝Ｈ１ｓ＞〉＞ＬｙｓＤ　Ｈ　Ｔ　　　
　　　　Ａｒｇ　）　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ＝Ｈ１ｓ　＞　
ＬｙｓＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　　　　　Ｇｌｕ−＾ＳｐＧｌｕ
−ＡｓｐＧ　Ｅ　Ｃ　Ｍ　　　　　ｃ＋ｕ−ＡＳｐ−’
Ｉ’ｙｒ　　　　Ｇｌｕ−Ａｓ９Ｂ　Ｇ　Ｅ　ＣＭ　　
　　Ｔｙｒ＞Ｇｔｕ＝ＡｓｐＡ　Ａ　Ｅ　Ｃ　Ｍ　　　
　Ｔｙｒ＞＞Ｇｌｕ＞Ａｓｐ　　　Ｔｙｒ＞＞Ｇｌｕ＝
Ａｓｐ前述したようにリーシュ（ｌｅａｓｈ　）の長さ
を変えてさらに分離することができる。

使用に際しては、陽イオン性交換体又は陰イオン性交換
体は蛋白を分離するためのカラムとして使用できる。

ここに記載した好適な態様に対して、変更や改良が可能
であることは、当業者には明かである。

その様な変更や改良は本発明の範囲内にあり、本発明の
利点を低下させるものではない。従ってそのような変更
や改良は本明細書の請求の範囲に含まれる。

【図面の簡単な説明】

第１図はセフ７ロースマトリックスに共有結合したバル
ビツール酸塩の滴定のグラフである。 第２図は、ＣＭ−セルロース又はＤＥＡＥ−セルロース
を用いて対になった蛋白をクロマトグラフイーした結果
を示すグラフである。 第３図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第４図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第５図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第６図は、天然の蛋白とグアニジン化した蛋白を、本発
明のバルビツール酸塩誘導体セファロースマトリックス
に通して分離した結果を示すグラフである。 第７図は、ブタエラスターゼのウシキモトリブシノーゲ
ンからの分離を示すグラフである。 第８図は、フルオレスカミン（ｒｌｕｏｒｅｓｃａｉｊ
ｎｅ　）との反応でアミノ基を検出した、ｐＨ８．５と
６．５でのクロマトグラフィーの結果を示すグラフであ
る。 第９図は、ＧＥＣＭ−セルロースに通したチランとチロ
シンの溶出パターンを示すグラフである。 第１０図は、ＤＥＡＥ−セルロースとＧＥＣＭーセルロ
ースに通したフエニル酢酸の溶出パターンを示すグラフ
である。 第１１図は、ＤＥＡＥ−セルロースとＧＥＣＭ一セルロ
ースに通したＮ−アセチルチラミンの溶出パターンを示
すグラフである。 第１２図は、ＤＥ−５２、ＣＭ−５２、及びＧＥＣＭ−
セルロースのマトリックスに通したキモトリプシノーゲ
ンーＡ１リボヌクレアーゼ、ウシ血清アルブミン、及び
オバルブミンの溶出パターンを示すグラフである。 第１３図は、ＤＥＡＥ−セルロースとＧＥＣＭ一セルロ
ースに通したりボヌクレアーゼとキモトリプシノーゲン
ーＡの混合物の溶出パターンを示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）パイ電子と、交換体と有機化合物の特異的アミノ
   酸残基の静電荷相互作用に基づく、有機化合物の分離方
   法。 （２）交換体は陰イオン性である、特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 （３）交換体はバルビツール酸基を含む、特許請求の範
   囲第２項に記載の方法。 （４）交換体はチオバルビツール酸塩を含む、特許請求
   の範囲第２項に記載の方法。 （５）交換体は、バルビツール酸環に比較して集中した
   陰性電荷を有する化合物を含む、特許請求の範囲第２項
   に記載の方法。 （６）交換体は、ジフルオロチラミン、ジクロロチラミ
   ン、ジョードチラミン、及びジブロモチラミンよりなる
   群から選ばれる化合物を含む、特許請求の範囲第２項に
   記載の方法。 （７）交換体はリーシュ（ｌｅａｓｈ）によりマトリッ
   クスに結合しており、有機化合物をさらに分離するため
   にリーシュ（ｌｅａｓｈ）の長さは変えられる、特許請
   求の範囲第２項に記載の方法。 （８）交換体はパラニトロフェニルを含む、特許請求の
   範囲第２項に記載の方法。 （９）交換体は陽イオン性である、特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 （１０）交換体はＮ（β−グアニジノエチル）カルバミ
   ルメチルを含む、特許請求の範囲第９項に記載の方法。 （１１）交換体はＮ（β−ビグアニジノエチル）−カル
   バミルメチルを含む、特許請求の範囲第９項に記載の方
   法。 （１２）交換体はＮ（β−イソメラミノエチル）カルバ
   ミルメチルを含む、特許請求の範囲第９項に記載の方法
   。 （１３）交換体はリーシュ（ｌｅａｓｈ）によりマトリ
   ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
   めにリーシュ（ｌｅａｓｈ）の長さは変えられる、特許
   請求の範囲第９項に記載の方法。 （１４）交換体は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはアルカンである）の化合物を含む、特許請
   求の範囲第９項に記載の方法。 （１５）Ｒはメチルである、特許請求の範囲第１４項に
   記載の方法。 （１６）アミノ酸残基は、アルギニン；リジン；チロシ
   ン；及びグルタミン酸とアルパラギン酸よりなる群から
   選ばれる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （１７）パイ電子と、交換体と蛋白の特異的アミノ酸残
   基の静電荷相互作用に基づく、蛋白の分離方法。 （１８）交換体は陰イオン性である、特許請求の範囲第
   １７項に記載の方法。 （１９）交換体はバルビツール酸基を含む、特許請求の
   範囲第１８項に記載の方法。 （２０）交換体は、バルビツール酸環に比較して集中し
   た陰性電荷を有する化合物を含む、特許請求の範囲第１
   ８項に記載の方法。 （２１）交換体は、ジフルオロチラミン、ジクロロチラ
   ミン、ジョードチラミン、及びジブロモチラミンよりな
   る群から選ばれる化合物を含む、特許請求の範囲第１８
   項に記載の方法。 （２２）交換体はリーシュ（ｌｅａｓｈ）によりマトリ
   ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
   めにリーシュ（ｌｅａｓｈ）の長さは変えられる、特許
   請求の範囲第１８項に記載の方法。 （２３）構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは任意のリーシュ（ｌｅａｓｈ）である）を
   有する化合物を含む、特許請求の範囲第１８項に記載の
   方法。 （２４）交換体は陽イオン性である、特許請求の範囲第
   １７項に記載の方法。 （２５）交換体はＮ（β−グアニジノエチル）カルバミ
   ルメチルを含む、特許請求の範囲第２４項に記載の方法
   。 （２６）交換体はＮ（β−ビグアニジノエチル）カルバ
   ミルメチルを含む、特許請求の範囲第２４項に記載の方
   法。 （２７）交換体はＮ（β−イソメラミノエチル）カルバ
   ミルメチルを含む、特許請求の範囲第２４項に記載の方
   法。 （２８）交換体はリーシュ（ｌｅａｓｈ）によりマトリ
   ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
   めにリーシュ（ｌｅａｓｈ）の長さは変えられる、特許
   請求の範囲第２４項に記載の方法。 （２９）アミノ酸残基は、アルギニン；リジン；チロシ
   ン；及びグルタミン酸とアルパラギン酸よりなる群から
   選ばれる、特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 （３０）交換体は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはアルカンである）の化合物を含む、特許請
   求の範囲第２４項に記載の方法。（３１）Ｒはメチルで
   ある、特許請求の範囲第３０項に記載の方法。 （３２）交換体は、セルロース；アガロース；デキスト
   ラン；アクリルアミド；スポセル（ｓｕｐｏｃｅｌ）；
   シリカゲル；ポリスチレン；デンプン；およびガラスよ
   りなる群から選ばれるマトリックス中に位置している、
   特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 （３３）交換体はチオバルビツール酸塩である、特許請
   求の範囲第１８項に記載の方法。（３４）蛋白の分離方
   法において、パイ電子と、蛋白のアルギニン残基と交換
   体の静電荷相互作用に基づき蛋白を分離する陰イオン性
   マトリックス中に蛋白を通す段階よりなる、上記方法。 （３５）交換体はバルビツール酸環を含む、特許請求の
   範囲第３４項に記載の方法。 （３６）交換体は、チオバルビツール酸塩を含む、特許
   請求の範囲第３４項に記載の方法。 （３７）交換体は、構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは任意のリーシュ（ｌｅａｓｈ）である）を
   有する化合物を含む、特許請求の範囲第３４項に記載の
   方法。 （３８）ｐＨ６．８以下において分離はまたリジン残基
   にも基づいている、特許請求の範囲第３４項に記載の方
   法。 （３９）交換体は、ジフルオロチラミン、ジクロロチラ
   ミン、ジョードチラミン、及びジブロモチラミンよりな
   る群から選ばれる化合物を含む、特許請求の範囲第３４
   項に記載の方法。 （４０）集中した電荷を有する交換体を用いる段階を含
   む、特許請求の範囲第３４項に記載の方法。 （４１）交換体に結合しているリーシュ（ｌｅａｓｈ）
   の長さを変える段階を含む、特許請求の範囲第３４項に
   記載の方法。 （４２）蛋白の分離方法において、パイ電子と、蛋白の
   チロシン残基と交換体の静電荷相互作用に基づき蛋白を
   分離する陽イオン性マトリックス中に蛋白を通す段階よ
   りなる、上記方法。 （４３）交換体はＮ（β−グアニジノエチル）カルバミ
   ルメチルを含む、特許請求の範囲第４２項に記載の方法
   。 （４４）交換体はＮ（β−ビグアニジノエチル）カルバ
   ミルメチルを含む、特許請求の範囲第４２項に記載の方
   法。 （４５）交換体はＮ（β−イソメラミノエチル）カルバ
   ミルメチルを含む、特許請求の範囲第４２項に記載の方
   法。 （４６）交換体は式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはアルカンである）の化合物を含む、特許請
   求の範囲第４２項に記載の方法。（４７）Ｒはメチルで
   ある、特許請求の範囲第４６項に記載の方法。 （４８）交換体に固定されているリーシュ（ｌｅａｓｈ
   ）の長さを変える段階を含む、特許請求の範囲第４２項
   に記載の方法。 （４９）蛋白を分離するためのマトリックスにおいて、
   パイ電子と、交換体と特異的アミノ酸残基の静電荷相互
   作用に基づき蛋白を分離する交換体を含む、上記マトリ
   ックス。 （５０）交換体は陰イオン性である、特許請求の範囲第
   ４９項に記載のマトリックス。 （５１）交換体はバルビツール酸基を含む、特許請求の
   範囲第５０項に記載のマトリックス。 （５２）交換体はチオバルビツール酸塩を含む、特許請
   求の範囲第５０項に記載のマトリックス。 （５３）交換体は、バルビツール酸環に比較して集中し
   た陰性電荷を有する化合物を含む、特許請求の範囲第５
   ０項に記載のマトリックス。 （５４）交換体は、ジフルオロチラミン、ジクロロチラ
   ミン、ジョードチラミン、及びジブロモチラミンよりな
   る群から選ばれる化合物を含む、特許請求の範囲第５０
   項に記載のマトリックス。 （５５）交換体はリーシュ（ｌｅａｓｈ）によりマトリ
   ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
   めにリーシュ（ｌｅａｓｈ）の長さは変えられる、特許
   請求の範囲第５０項に記載のマトリックス。 （５６）交換体は、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは任意のリーシュ（ｌｅａｓｈ）である）の
   化合物を含む、特許請求の範囲第５０項に記載の方法。 （５７）交換体は陽イオン性である、特許請求の範囲第
   ４９項に記載のマトリックス。 （５８）交換体はＮ（β−グアニジノエチル）カルバミ
   ルメチルを含む、特許請求の範囲第５７項に記載のマト
   リックス。 （５９）交換体はＮ（β−ビグアニジノエチル）カルバ
   ミルメチルを含む、特許請求の範囲第５７項に記載のマ
   トリックス。 （８０）交換体はＮ（β−イソメラミノエチル）カルバ
   ミルメチルを含む、特許請求の範囲第５７項に記載のマ
   トリックス。 （６１）交換体はリーシュ（ｌｅａｓｈ）によりマトリ
   ックスに結合しており、有機化合物をさらに分離するた
   めにリーシュ（ｌｅａｓｈ）の長さは変えられる、特許
   請求の範囲第５７項に記載のマトリックス。 （６２）交換体は、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはアルカンである）の化合物を含む、特許請
   求の範囲第５７項に記載のマトリックス。 （６３）Ｒはメチルである、特許請求の範囲第６２項に
   記載の方法。 （６４）バルビツール環を含む、蛋白を分離する交換体
   を含む、蛋白を分離するためのマトリックス。 （６５）蛋白を分離する交換体を含む、蛋白を分離する
   ためのマトリックスにおいて、交換体はジフルオロチラ
   ミン、ジクロロチラミン、ジョードチラミン、及びジブ
   ロモチラミンよりなる群から選ばれる化合物を含む、上
   記マトリックス。 （６６）交換体はジブロモチラミンである、特許請求の
   範囲第６５項に記載のマトリックス。 （６７）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは任意のリーシュ（ｌｅａｓｈ）である）の
   化合物を含む、蛋白を分離するためのマトリックス。 （６８）蛋白を分離する交換体を含む、蛋白を分離する
   ためのマトリックスにおいて、交換体はＮ（β−グアニ
   ジノエチル）カルバミルメチル、Ｎ（β−ビグアニジノ
   エチル）カルバミルメチル、Ｎ（β−イソメラミノノエ
   チル）、及び式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはアルカンである）の化合物よりなる群から
   選ばれる、上記マトリックス。