JP2002500874A - ペプチド合成のための修飾された酵素およびその使用方法 - Google Patents
ペプチド合成のための修飾された酵素およびその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、酵素からの1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換された修飾された酵素であって、該システイン残基の少なくともいくつかが、修飾された酵素を形成するためにシステイン残基中のチオール水素をチオール側鎖で置換することにより修飾されており、該修飾された酵素が高エステラーゼ活性および低アミダーゼ活性を有することを特徴とする修飾酵素に関する。また、修飾された酵素を産生する方法も提供される。本発明はまた、ペプチド合成において修飾された酵素を使用する方法に関する。
Description
【０００１】 関連出願の説明 本出願は、ここに引用される、1998年1月23日に出願された米国仮特許出願第6
0/072,351号、および1998年1月23日に出願された米国仮特許出願第60/072,265号
に優先権を主張する。
0/072,351号、および1998年1月23日に出願された米国仮特許出願第60/072,265号
に優先権を主張する。
【０００２】 発明の分野 本発明は、1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換されており、 該システイン残基が、修飾された酵素を形成するためにシステイン残基の少なく
ともいくつかの中のチオール水素をチオール側鎖で置換することにより修飾され
ている、修飾酵素に関する。修飾された酵素は、高エステラーゼ活性および低ア
ミダーゼ活性を有する。本発明はまた、ペプチド合成における修飾された酵素の
使用に関する。
ともいくつかの中のチオール水素をチオール側鎖で置換することにより修飾され
ている、修飾酵素に関する。修飾された酵素は、高エステラーゼ活性および低ア
ミダーゼ活性を有する。本発明はまた、ペプチド合成における修飾された酵素の
使用に関する。
【０００３】 発明の背景 部位定方向突然変異誘発による酵素特性の修飾は、制限を克服するための分子
生物学的方法が最近得られた(Cornish et al.,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,34:62
1-633(1995))とはいえ、天然アミノ酸の置換に限られてきた。しかしながら、最
近の方法はたいていの実験室では行うのが難しい。対照的に、酵素のコントロー
ルされた化学的修飾は、酵素構造の容易で柔軟な修飾のために広い可能性を提供
し、それにより酵素特異性のコントロールされた調整のために広い可能性を開く
。
生物学的方法が最近得られた(Cornish et al.,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,34:62
1-633(1995))とはいえ、天然アミノ酸の置換に限られてきた。しかしながら、最
近の方法はたいていの実験室では行うのが難しい。対照的に、酵素のコントロー
ルされた化学的修飾は、酵素構造の容易で柔軟な修飾のために広い可能性を提供
し、それにより酵素特異性のコントロールされた調整のために広い可能性を開く
。
【０００４】 化学的修飾による酵素特性の変化は、サブチリシンBPNの活性部位セリン残基 をシステインに化学的に形質転換(CH2OH→CH2SH)することによりチオールサブチ
リシンを産生したBender(Polgar et al.,J.Am.Chem.Soc.,88:3153-3514(1996)) およびKoshland(Neet et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,56:1606-1611(1966))の グループにより1966年にされた最初の報告とともに、以前に広がった。Wu(Wu et
al.,J.Am.Chem.Soc.,111:4514-4515(1989);Bell et al.,Biochemistry,32:3754
-3762(1993))およびPeterson(Peterson et al.,Biochemistry,34:6616-6620(199
5))、およびより最近は、Suckling(Suckling et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,3:
531-534(1993))により、合成の可能性を有するものを含む、化学的に産生された
人工酵素への関心が復活した。
リシンを産生したBender(Polgar et al.,J.Am.Chem.Soc.,88:3153-3514(1996)) およびKoshland(Neet et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,56:1606-1611(1966))の グループにより1966年にされた最初の報告とともに、以前に広がった。Wu(Wu et
al.,J.Am.Chem.Soc.,111:4514-4515(1989);Bell et al.,Biochemistry,32:3754
-3762(1993))およびPeterson(Peterson et al.,Biochemistry,34:6616-6620(199
5))、およびより最近は、Suckling(Suckling et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,3:
531-534(1993))により、合成の可能性を有するものを含む、化学的に産生された
人工酵素への関心が復活した。
【０００５】 発明の概要 本発明の1つの態様は、酵素からの1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基に
より置換された修飾された酵素であって、該システイン残基の少なくともいくつ
かが、修飾された酵素を形成するためにシステイン残基中のチオール水素をチオ
ール側鎖で置換することにより修飾されており、該修飾された酵素が高エステラ
ーゼ活性および低アミダーゼ活性を有することを特徴とする修飾酵素に関する。
より置換された修飾された酵素であって、該システイン残基の少なくともいくつ
かが、修飾された酵素を形成するためにシステイン残基中のチオール水素をチオ
ール側鎖で置換することにより修飾されており、該修飾された酵素が高エステラ
ーゼ活性および低アミダーゼ活性を有することを特徴とする修飾酵素に関する。
【０００６】 本発明の別の態様は、修飾された酵素を産生する方法に関する。この方法は、
酵素中の1つ以上のアミノ酸がシステイン残基で置換されている酵素を提供し、 修飾された酵素を形成するためにシステイン残基の少なくともいくつかの中のチ
オール水素をチオール側鎖で置換する、各工程を含む。修飾された酵素は、高エ
ステラーゼ活性および低アミダーゼ活性を有する。
酵素中の1つ以上のアミノ酸がシステイン残基で置換されている酵素を提供し、 修飾された酵素を形成するためにシステイン残基の少なくともいくつかの中のチ
オール水素をチオール側鎖で置換する、各工程を含む。修飾された酵素は、高エ
ステラーゼ活性および低アミダーゼ活性を有する。
【０００７】 図面の簡単な説明 図１は、酵素により触媒されるペプチド結合を示す。
【０００８】 図２は、化学的に修飾された突然変異体酵素を産生するためのサブチリシンバ
チルスレンタス(Bacillus lentus)突然変異体の化学的修飾を示す。
チルスレンタス(Bacillus lentus)突然変異体の化学的修飾を示す。
【０００９】 図３は、エステラーゼ対アミダーゼ活性について一定のkcat/KMの割合を示す 。エステラーゼおよびアミダーゼ活性は、それぞれ、スクシニル−アラニン−ア
ラニン−プロリン−フェニルアラニン−チオベンジルエステル("suc-AAPF-SBn")
およびスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−パラ−
ニトロアナリド("suc-AAPF-pNA")基質で測定した。全ての化学的に修飾された突
然変異体は、酵素-CH2-S-Rの構造を有し、調査した様々のR基の構造が示されて いる。N62Cファミリーにおいては、中間の長さの直鎖アルキル基はヘキシル(c) であり、L217Cファミリーにおいては、ペンチル(d)であった；n.d.=測定されな かった。比較のために、WT酵素についての割合は17であった。
ラニン−プロリン−フェニルアラニン−チオベンジルエステル("suc-AAPF-SBn")
およびスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−パラ−
ニトロアナリド("suc-AAPF-pNA")基質で測定した。全ての化学的に修飾された突
然変異体は、酵素-CH2-S-Rの構造を有し、調査した様々のR基の構造が示されて いる。N62Cファミリーにおいては、中間の長さの直鎖アルキル基はヘキシル(c) であり、L217Cファミリーにおいては、ペンチル(d)であった；n.d.=測定されな かった。比較のために、WT酵素についての割合は17であった。
【００１０】 図４は、sucAAPF（太い黒線）が結合されているサブチリシンバチルスレンタ スの活性部位を示す。調査した触媒性の三連構造および４つの活性部位残基が示
されている。残基62はS2 ポケットの一部であり、残基217はS1'（遊離基）ポケ ットの開口部にあり、残基166はS1ポケットの底部にあり、残基222はS1ポケット
とS1'ポケットとの間にある。
されている。残基62はS2 ポケットの一部であり、残基217はS1'（遊離基）ポケ ットの開口部にあり、残基166はS1ポケットの底部にあり、残基222はS1ポケット
とS1'ポケットとの間にある。
【００１１】 図５は、サブチリシンバチルスレンタス修飾された酵素を使用するL-アミノ酸
のペプチドライゲーションを示す。
のペプチドライゲーションを示す。
【００１２】 図６は、サブチリシンバチルスレンタス修飾された酵素を使用するD-アミノ酸
のペプチドライゲーションを示す。
のペプチドライゲーションを示す。
【００１３】 図７は、サブチリシンバチルスレンタスを有するZ-D-Phe-OBnのZ-保護基の考 えられる結合を示す。大きい疎水性カルボベンゾキシ保護(Z)基は、D-フェニル アラニン側鎖の代わりにS1ポケット中で結合している。
【００１４】 図８は、修飾された酵素を産生するためのサブチリシンバチルスレンタスのS1
66C突然変異体の化学的修飾を示す。
66C突然変異体の化学的修飾を示す。
【００１５】 発明の詳細な説明 本発明は、酵素からの1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換さ れた修飾された酵素であって、該システイン残基の少なくともいくつかが、修飾
された酵素を形成するためにシステイン残基中のチオール水素をチオール側鎖で
置換することにより修飾されている、修飾酵素に関する。修飾された酵素は、高
エステラーゼ活性および低アミダーゼ活性を有する。
された酵素を形成するためにシステイン残基中のチオール水素をチオール側鎖で
置換することにより修飾されている、修飾酵素に関する。修飾された酵素は、高
エステラーゼ活性および低アミダーゼ活性を有する。
【００１６】 好ましくは、酵素はプロテアーゼである。より好ましくは、酵素はバチルス
サブチリシンである。サブチリシンは、生体触媒作用、特にキラルの分解能、多
機能化合物の部位選択性アシル化、ペプチド結合、およびグリコペプチド合成に
おける使用が増加しているアルカリ性セリンプロテアーゼである。後者の２つの
使用方法は、部位定方向突然変異誘発および非天然アミノ酸をタンパク質中へ導
入する化学的修飾を提供するので、特に関心がもたれている。図１に示されるよ
うに、サブチリシンは、次いで第一アミンと反応してペプチド産物を形成するア
シル酵素中間体を最初に形成することにより、エステル基質から始まるペプチド
結合形態に触媒作用を及ぼすことができる。従って、この用途には、アシル酵素
形態を促進するためには高エステラーゼ活性が、所望の産物のペプチド結合の加
水分解を最小にするためには低アミダーゼ活性が必要である。通常、サブチリシ
ンはこれらの必要条件を満たさず、サブチリシンのエステラーゼ対アミダーゼの
選択性の改良が長い間求められてきた。
サブチリシンである。サブチリシンは、生体触媒作用、特にキラルの分解能、多
機能化合物の部位選択性アシル化、ペプチド結合、およびグリコペプチド合成に
おける使用が増加しているアルカリ性セリンプロテアーゼである。後者の２つの
使用方法は、部位定方向突然変異誘発および非天然アミノ酸をタンパク質中へ導
入する化学的修飾を提供するので、特に関心がもたれている。図１に示されるよ
うに、サブチリシンは、次いで第一アミンと反応してペプチド産物を形成するア
シル酵素中間体を最初に形成することにより、エステル基質から始まるペプチド
結合形態に触媒作用を及ぼすことができる。従って、この用途には、アシル酵素
形態を促進するためには高エステラーゼ活性が、所望の産物のペプチド結合の加
水分解を最小にするためには低アミダーゼ活性が必要である。通常、サブチリシ
ンはこれらの必要条件を満たさず、サブチリシンのエステラーゼ対アミダーゼの
選択性の改良が長い間求められてきた。
【００１７】 実施例 実施例１ −シス突然変異体の産生 バチルスレンタスからのサブチリシン("SBL")に対する遺伝子を、突然変異誘 発のためにバクテリオファージM13mp19ベクター中にクローニングした（ここに 引用される米国特許第5,185,258号）。オリゴヌクレオチド有向突然変異誘発を 、ここに引用されるZoller et al.,Methods Enzymol.,100:468-500(1983)に記載
されるように行った。突然変異された配列をクローン化し、取り出し、バチルス
サブチリス宿主中で発現プラスミドGG274中に再び導入した。PEG(50%)を安定剤 として加えた。得られた粗タンパク質濃縮液を、小さい分子量の不純物を除去す
るために、まずpH5.2の緩衝剤（20mMのアセテートナトリウム、5mMのCaCl2）と ともにSaphadexTM G-25脱塩基質を通すことにより精製した。次に脱塩カラムに ついてたまった分画を、アセテートナトリウム緩衝剤（上述）中で強い陽イオン
交換カラム(SP SepharoseTM FF)にかけ、pH5.2のNaClアセテート緩衝剤の0mMか ら200mMまでの一段階の勾配でSBLを溶出した。ミリポア精製水に対する溶出液の
透析および続く凍結乾燥の後に、無塩の酵素粉末を得た。0℃で30分間0.1MのHCl
でインキュベートすることにより変成された突然変異体酵素および野生型酵素の
純度を、Pharmacia(Uppsala,Sweden)からのPhastTM Systemを使用して均質のゲ ル上でSDS-PAGEにより確かめた。SBLの濃度を、ここに引用されるBradford,Anal ytical Biochemistry ,72:248-254(1976)の方法に基づくBio-Rad(Hercules,CA)色
素試薬キットを使用して測定した。酵素の特異的な活性を、実施例３に記載され
る方法を使用してpH8.6の緩衝剤中で測定した。
されるように行った。突然変異された配列をクローン化し、取り出し、バチルス
サブチリス宿主中で発現プラスミドGG274中に再び導入した。PEG(50%)を安定剤 として加えた。得られた粗タンパク質濃縮液を、小さい分子量の不純物を除去す
るために、まずpH5.2の緩衝剤（20mMのアセテートナトリウム、5mMのCaCl2）と ともにSaphadexTM G-25脱塩基質を通すことにより精製した。次に脱塩カラムに ついてたまった分画を、アセテートナトリウム緩衝剤（上述）中で強い陽イオン
交換カラム(SP SepharoseTM FF)にかけ、pH5.2のNaClアセテート緩衝剤の0mMか ら200mMまでの一段階の勾配でSBLを溶出した。ミリポア精製水に対する溶出液の
透析および続く凍結乾燥の後に、無塩の酵素粉末を得た。0℃で30分間0.1MのHCl
でインキュベートすることにより変成された突然変異体酵素および野生型酵素の
純度を、Pharmacia(Uppsala,Sweden)からのPhastTM Systemを使用して均質のゲ ル上でSDS-PAGEにより確かめた。SBLの濃度を、ここに引用されるBradford,Anal ytical Biochemistry ,72:248-254(1976)の方法に基づくBio-Rad(Hercules,CA)色
素試薬キットを使用して測定した。酵素の特異的な活性を、実施例３に記載され
る方法を使用してpH8.6の緩衝剤中で測定した。
【図１】 酵素により触媒されるペプチド結合を示す図
【図２】 サブチリシンバチルスレンタス(Bacillus lentus)突然変異体の化学的修飾を 示す図
【図３】 エステラーゼ対アミダーゼ活性について一定のkcat/KMの割合を示すグラフ
【図４】 sucAAPF（太い黒線）が結合されているサブチリシンバチルスレンタスの活性 部位を示す図
【図５】 サブチリシンバチルスレンタス修飾された酵素を使用するL-アミノ酸のペプチ
ドライゲーションを示す図
ドライゲーションを示す図
【図６】 サブチリシンバチルスレンタス修飾された酵素を使用するD-アミノ酸のペプチ
ドライゲーションを示す図
ドライゲーションを示す図
【図７】 サブチリシンバチルスレンタスを有するZ-D-Phe-OBnのZ-保護基の考えられる 結合を示す図
【図８】 サブチリシンバチルスレンタスのS166C突然変異体の化学的修飾を示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１１Ｄ 3/386 // Ｃ１１Ｄ 3/386 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA14 DA07 EA04 HA06 4B050 CC02 CC04 DD02 GG01 HH01 4B064 AG01 CA02 CA19 CB30 CC24 4H003 DA01 EC02 FA47
Claims (1)
- 【請求項１】 酵素からの1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により 置換された修飾された酵素であって、該システイン残基の少なくともいくつかが
、修飾された酵素を形成するためにシステイン残基中のチオール水素をチオール
側鎖で置換することにより修飾されており、該修飾された酵素が高エステラーゼ
活性および低アミダーゼ活性を有することを特徴とする修飾酵素。
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| US5244791A (en) * | 1984-05-29 | 1993-09-14 | Genecor International, Inc. | Methods of ester hydrolysis |
| US5037741A (en) * | 1986-08-18 | 1991-08-06 | The Coca Cola Company | Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides |
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