JPH0678783A - タンパクゲル化物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 安価かつ大量供給できる新規トランスグルタ
ミナーゼを見いだし、これを用いて食品その他タンパク
質のゲル化物の製造方法を開発する。 【構成】 トランスグルタミナーゼ活性を有する真性粘
菌の変形体または子実体抽出物を作用させることによ
り、タンパク質濃度１．０％以上のタンパク含有溶液又
はスラリーをゲル化させることを特徴とするタンパクゲ
ル化物の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はトランスグルタミナーゼ
活性を有する真性粘菌の変形体または子実体抽出物を作
用させることにより、タンパク質濃度１．０％以上のタ
ンパク含有溶液又はスラリーをゲル化させることを特徴
とするタンパクゲル化物の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖
内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のア
シル転移反応を触媒する酵素である。

【０００３】このトランスグルタミナーゼは、アシル受
容体としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が
作用すると分子内及び分子間にε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌ
ｙｓ架橋結合を形成させる。また、水がアシル受容体と
して機能するときは、グルタミン残基が脱アミド化され
グルタミン酸残基になる反応を進行させる。

【０００４】この新規トランスグルタミナーゼを利用し
て製造される本発明のゲル化物は、従来のゲル状食品、
ゲル状化粧料をはじめとしてヨーグルト、ゼリー、チー
ズ、ゲル状化粧料などとして用いられる（特公平1ー5038
2）。

【０００５】また、本発明に係わるゲル化物は、未加熱
で製造でき、熱に安定なゲルであるため、マイクロカプ
セルの素材、固定化酵素等の担体などとしても広範囲に
用いることができるものである。

【０００６】トランスグルタミナーゼはこれまで動物由
来、植物由来、微生物由来のものが知られている。例え
ば動物由来のものではモルモットの肝臓［Connellan,et
al.，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Journal of Biological Chemistry)２４６巻、４
号、１０９３〜１０９８頁］及び哺乳類の臓器、血液に
広く分布し、［Folk et al.,アドバンセス・イン・エン
ザイモロジー(Advancesin Enzymology)３８巻、１０９
〜１９１頁(1973)］、［Folk et al.,アドバンセス・イ
ン・プロテイン・ケミストリー(Advances in Protein C
hemistry)３１巻、１〜１３３頁(1977)］、その酵素の
特徴も研究されている。また本酵素を用いたタンパクゲ
ル化物の製造法についても報告がなされている［特公平
1ー50382］。

【０００７】植物由来のトランスグルタミナーゼはえん
どう豆の茎頂分裂部位から精製された例が一つ報告され
ている［Isaac Icekson et al.,プラント・フィジオロ
ジー(Plant Physiology)８４巻、９７２〜９７４頁(198
7)］。

【０００８】しかしこれら動植物由来のトランスグルタ
ミナーゼが安価にまた大量に調製または入手するのが困
難であることから、これら動植物由来のトランスグルタ
ミナーゼの産業への利用は、事実上不可能であった。

【０００９】微生物由来のトランスグルタミナーゼは放
線菌のストレプトベルチシリウム属から発見されており
［Ando et al.,アグリカルチュラル・アンド・バイオロ
ジカル・ケミストリー(Agricultural and Biological C
hemistry)５３巻、１０号、２６１３〜２６１７頁(198
9)］、酵素の精製、特徴について研究されている。また
本酵素を用いたタンパクゲル化物の製造法についても報
告がなされている［特開昭６４−２７４７１］。

【００１０】微生物のトランスグルタミナーゼの発見に
より大量に酵素を供給する事は可能になったが、微生物
が生産するものであるため、利用する酵素は必ず培養液
から一度抽出、分離精製しなければならない問題点があ
り、さらにポリペプトン、ラスターゲンのような高価な
培地成分存在下でないと酵素が安定に供給されない等の
問題点も存在する。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の課題は
安価かつ大量供給できる新規トランスグルタミナーゼを
見いだし、これを用いて食品その他タンパク質のゲル化
物の製造方法を開発することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】粘菌フィザルム・ポリセ
ファラム(Physarum polycephalum)にカルシウム依存性
のトランスグルタミナーゼが存在することが報告された
［Janet D. Klein etal.,ジャーナル オブ バクテリ
オロジー (Journal of Bacteriol)１７４巻、８号、２
５９９〜２６０５頁(1992)］。本発明者らは、粘菌につ
いてそのトランスグルタミナーゼ活性能を広く検索した
結果、新規にジジミウム属、ステモニティス属に属する
粘菌の菌体中にトランスグルタミナーゼ活性の存在を見
いだした。

【００１３】更に、トランスグルタミナーゼ活性を有す
るフィザルム属、ジジミウム属、ステモニティス属に属
する真性粘菌の変形体または子実体抽出物を、タンパク
質濃度１．０％以上のタンパク含有溶液又はスラリーに
作用させたところ、ゲル化が生じタンパクゲル化物を製
造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

【００１４】すなわち、本発明はトランスグルタミナー
ゼ活性を有する真性粘菌の変形体または子実体抽出物を
作用させることにより、タンパク質濃度１．０％以上の
タンパク含有溶液又はスラリーをゲル化させることを特
徴とするタンパクゲル化物の製造方法である。

【００１５】本発明に使用する真性粘菌としては、その
菌体抽出物中にトランスグルタミナーゼ活性を有し、変
形体または子実体抽出物を作用させることによってタン
パク質濃度１．０％以上のタンパク含有溶液又はスラリ
ーをゲル化させることができるものであればいずれを用
いてもよいが、具体的には以下のものが挙げられる。 フィザルム・ポリセファラム(Physarum polycephalum)
CBS491.61 ジジミウム・ニグリペス(Didymium nigripes) ATCC2836
3 ステモニティス・フラボゲニタ(Stemonitis flavogenit
a) ATCC24714

【００１６】トランスグルタミナーゼ活性を有する真性
粘菌の変形体または子実体抽出物は、ホモジナイザー、
ミキサーにより変形体あるいは、子実体を破砕すること
によって効率よく得ることができる。

【００１７】タンパクのゲル化に用いる真性粘菌の変形
体または子実体抽出物は、ホモジナイザー、ミキサーに
より変形体あるいは、子実体を破砕することによって得
られる粗抽出物のままでもよいし、トランスグルタミナ
ーゼ活性画分をさらに適宜精製して用いてもよい。トラ
ンスグルタミナーゼ画分を精製するには通常酵素精製に
用いられるあらゆる方法が使用できる。例えばエタノー
ル、アセトン、イソプロピルアルコール等の有機溶媒に
よる処理、硫安、食塩等による塩析、透析、限外ろ過
法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ
過、吸着剤、等電点分画等の方法が使用できる。またこ
れらの方法を適当に組み合わせることにより、精製度を
上げることができる。

【００１８】トランスグルタミナーゼの活性測定はベン
ジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒ
ドロキシルアミンを基質として反応を行い、生成したヒ
ドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体を形成さ
せ、525nmの吸光を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量
線より求め活性を算出する。トランスグルタミナーゼ活
性は特に記載しない限り以下に記載する方法により測定
した。 ＜活性測定法＞ 試薬Ａ 0.2M トリス塩酸緩衝液（pH7.0） 0.1M ヒドロキシルアミン 0.01M 還元型グルタチオン 0.03M ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニル
グリシン 0.005M 塩化カルシウム 試薬Ｂ 3N 塩酸 12％ トリクロロ酢酸 5％ FeCl₃・6H₂O(0.1N HClに溶解) 上記溶液の1:1:1の混合液を試薬Ｂとする。

【００１９】酵素液の0.05mlに試薬Ａ0.5mlを加えて混
合し25℃で10分間反応後、試薬Ｂを加えて反応停止とＦ
ｅ錯体の形成を行った後525nmの吸光度を測定する。対
照としてあらかじめ熱失活させた酵素液を用いて同様に
反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差
を求める。別に酵素液の代わりにＬ−グルタミン酸γ−
モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光
度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求め1分間に1
μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を1単位と
した。

【００２０】次に、真性粘菌の変形体または子実体抽出
物を用いて、タンパクゲル化物を製造する方法について
述べる。基質となるタンパク質は、リジン残基及びグル
タミン残基を有し、上述のトランスグルタミナーゼ活性
の触媒をうけるものであれば、その起源性状に制約され
るものではなく、植物性タンパク質、動物性タンパク質
などいかなるものでも使用できる。具体的には大豆タン
パク、乳タンパク、ゼラチン等を例示することができ
る。

【００２１】これらタンパク質の1.0重量％以上、好ま
しくは3.0％以上の液体またはスラリー状に調製された
ものであれば、真性粘菌の変形体または子実体抽出物の
添加により高粘性物、あるいはゲル状物質が形成され、
1.0重量％以下であれば溶液状または沈澱状の架橋高分
子化合物が得られる。さらにタンパク質溶液にNaClやCa
Cl₂を予め添加することによりゲル化が促進される場合
もある。

【００２２】かくしてトランスグルタミナーゼ活性とし
て タンパク1gに対して0.01〜2000ユニット、好ましく
は0.1〜200ユニット以上を含む真性粘菌の変形体または
子実体抽出物を添加、反応溶液のpHは4〜10、好ましく
は5〜8に調製し、2〜50℃、好ましくは10〜35℃で1分〜
24時間、好ましくは10分〜2時間インキュベートすると
架橋高分子化物ないしゲル状物を得ることができる。こ
れらの条件は特公平1ー50382に記載される方法を参考に
して適宜選択可能である。

【００２３】

【実施例】以下、本発明を実施例にてさらに詳細に説明
する。

【００２４】＜実施例１ 真性粘菌の培養と変形体また
は子実体抽出物の調製＞フィザルム・ポリセファラム(P
hysarum polycephalum) CBS491.61、ジジミウム・ニグ
リペス(Didymium nigripes) ATCC28363、ステモニティ
ス・フラボゲニタ(Stemonitis flavogenita) ATCC24714
の変形体を一白金耳ディフコ社製コーンミール寒天平板
培地上に塗布植菌後、25℃のフラン器の中で３日間培養
することにより、変形体を増殖させるとともに、変形体
の表面に子実体を形成させた。

【００２５】変形体または、子実体をかきとり、各々１
ｇ（湿重）に対して１ｍｌのMES緩衝液を加えテフロン
製ホモジナイザーで氷温化で破砕処理を行なった後、10
000rpm10分間遠心分離しその上澄を抽出物とした。

【００２６】〈実施例２ タンパクゲル化物の製造方
法〉 (1)分離状大豆タンパク「アジプロンS-2」（味の素製）
を５重量％と食塩を２重量％(2)フィブリノーゲン（シ
グマ製）を１．０重量％の溶液となるように５ｍＭ塩化
カルシウムを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH
7）を加え、各タンパクを完全に溶解または懸濁した
後、タンパク1mgあたりトランスグルタミナーゼ活性と
して0.2ユニットの活性を有する実施例１に示した３属
の真性粘菌の変形体または子実体抽出物を各々加え良く
攪はんし、25℃、10時間反応させた後、タンパク溶液の
ゲル化状態を観察した。

【００２７】尚、変形体または子実体抽出物を添加しな
い以外は全く同一の処理をしたものを対照とした。結果
は表１に示したが、抽出物を添加したもののみがゲル化
した。

【００２８】

【表１】

【００２９】

【発明の効果】本発明の真性粘菌の変形体または子実体
抽出物を用いるタンパクゲル化物の製造方法は、粘菌の
培養、並びに抽出物の調製が容易であるために安価に安
定に供給されるので実用性が高い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トランスグルタミナーゼ活性を有する真
   性粘菌の変形体または子実体抽出物を作用させることに
   より、タンパク質濃度１．０％以上のタンパク含有溶液
   又はスラリーをゲル化させることを特徴とするタンパク
   ゲル化物の製造方法。
2. 【請求項２】 真性粘菌が、フィザルム属、ジジミウム
   属、ステモニティス属に属する真性粘菌である請求項１
   記載のタンパクゲル化物の製造方法。