JPS637760B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、豚インシユリンにアクロモバクター
リテイクスの生産するプロテアーゼを作用させ、
式 〔式中、Ｒは第三ブチルオキシカルボニル
（BOC）等のプロトンソルボリシス的に若しくは
β―脱離により分解しうるアミノ保護基を意味す
る。〕 で表わされるデス―B30―アラニン―豚インシユ
リン又はそのペンタアルキルエステルを得、つい
で式（） Thr（But）OBut （） で表わされるアミノ酸と縮合させた後常法により
保護基を除去することからなるヒトインシユリン
の製造方法に関するものである。
リテイクスの生産するプロテアーゼを作用させ、
式 〔式中、Ｒは第三ブチルオキシカルボニル
（BOC）等のプロトンソルボリシス的に若しくは
β―脱離により分解しうるアミノ保護基を意味す
る。〕 で表わされるデス―B30―アラニン―豚インシユ
リン又はそのペンタアルキルエステルを得、つい
で式（） Thr（But）OBut （） で表わされるアミノ酸と縮合させた後常法により
保護基を除去することからなるヒトインシユリン
の製造方法に関するものである。
なお、式中Glyはグリシンの、Pheはフエニル
アラニンの、Asnはアスパラギンの、Lysはリジ
ンの残基を表わし、Butはターシヤリーブチル基
を示めす。
アラニンの、Asnはアスパラギンの、Lysはリジ
ンの残基を表わし、Butはターシヤリーブチル基
を示めす。
天然に存在するペプチド或るいは蛋白質からの
フラグメントをペプチドの半合成に使用すること
は、従来から知られている。例えば豚インシユリ
ンのヒトインシユリンへの変換がScience177巻
623頁（1972）及び特開昭51−91288号に記載され
ている。これら公知のヒトインシユリンの製法
は、いずれも、デス―B23―30―オクタペプチド
―インシユリン（豚）を出発物質として利用し、
除去されたオクタペプチドの代りに、B30位にア
ラニンの代りにスレオニンを有する合成的に製造
されたオクタペプチド誘導体を導入してヒトイン
シユリンを製造するという方法である。これら公
知の方法では、ヒトインシユリンのアミノ酸順列
に相当するオクタペプチドを合成する必要があ
り、繁雑である。
フラグメントをペプチドの半合成に使用すること
は、従来から知られている。例えば豚インシユリ
ンのヒトインシユリンへの変換がScience177巻
623頁（1972）及び特開昭51−91288号に記載され
ている。これら公知のヒトインシユリンの製法
は、いずれも、デス―B23―30―オクタペプチド
―インシユリン（豚）を出発物質として利用し、
除去されたオクタペプチドの代りに、B30位にア
ラニンの代りにスレオニンを有する合成的に製造
されたオクタペプチド誘導体を導入してヒトイン
シユリンを製造するという方法である。これら公
知の方法では、ヒトインシユリンのアミノ酸順列
に相当するオクタペプチドを合成する必要があ
り、繁雑である。
本発明者らは、豚インシユリンとヒトインシユ
リンとのアミノ酸順列の違いはB30位のアラニン
とスレオニンとの相異のみである点に着目し、塩
基性アミノ酸であるリジンのカルボキシル基にも
つぱら優先的に作用するアクロモバクターリテイ
クス（Achromobacter lyticus）の生産するプロ
テアーゼを豚インシユリンに作用させて得られた
デス―B30―アラニン―インシユリンのトリ―
BOC誘導体又はそのペンタアルキルエステルと
式（）で表わされる保護されたスレオニンとの
縮合反応について検討したところ、両物質の反応
が進行しヒトインシユリンが生成することを見い
出し本発明を完成した。
リンとのアミノ酸順列の違いはB30位のアラニン
とスレオニンとの相異のみである点に着目し、塩
基性アミノ酸であるリジンのカルボキシル基にも
つぱら優先的に作用するアクロモバクターリテイ
クス（Achromobacter lyticus）の生産するプロ
テアーゼを豚インシユリンに作用させて得られた
デス―B30―アラニン―インシユリンのトリ―
BOC誘導体又はそのペンタアルキルエステルと
式（）で表わされる保護されたスレオニンとの
縮合反応について検討したところ、両物質の反応
が進行しヒトインシユリンが生成することを見い
出し本発明を完成した。
本発明で使用するアクロモバクターリテイクス
の生産するプロテアーゼは、公知の酸素蛋白であ
り、例えば、特公昭46−42953号公報に培養法が、
農化第48巻第11号11月N140頁1974年（昭和49年）
に培養液からのプロテアーゼの分離精製法が農化
第52巻第１号１月N6頁1978年（昭和53年）に性
質が記載されており、具体的にはペプトン、ミル
クカゼイン、サツカローマ、無機塩からなる栄養
培地にアクロモバクタリーテイクスを接種し振と
う培養し、プロテアーゼはアセトン沈澱後、カル
ボキシメチルセルローズ及びジエチルアミノエチ
ルセルローズ、セフアデスクG75カラムクロマト
にて順次精製し更に焦点電気泳動法にて処理する
ことにより分離精製でき、分子量は約３万至適PH
9.0で最適温度は約50℃であつた。
の生産するプロテアーゼは、公知の酸素蛋白であ
り、例えば、特公昭46−42953号公報に培養法が、
農化第48巻第11号11月N140頁1974年（昭和49年）
に培養液からのプロテアーゼの分離精製法が農化
第52巻第１号１月N6頁1978年（昭和53年）に性
質が記載されており、具体的にはペプトン、ミル
クカゼイン、サツカローマ、無機塩からなる栄養
培地にアクロモバクタリーテイクスを接種し振と
う培養し、プロテアーゼはアセトン沈澱後、カル
ボキシメチルセルローズ及びジエチルアミノエチ
ルセルローズ、セフアデスクG75カラムクロマト
にて順次精製し更に焦点電気泳動法にて処理する
ことにより分離精製でき、分子量は約３万至適PH
9.0で最適温度は約50℃であつた。
本発明の縮合反応は従来法と同様の反応条件が
適用可能であり、即ち、式（）で表わされる物
質又はそのエステルと１当量又は過剰の式（）
で表わされる物質とを、ジメチルホルムアミド、
テトラヒドロフラン等の溶媒中、縮合剤の存在下
で反応させる。縮合剤としては、それぞれ約１当
量の１―ヒドロキシベンゾトリアゾール及びジシ
クロヘキシルカルボジイミドが用いられ、反応
は、トリエチルアミン又は１―エチルモルホリン
等を添加しPH７〜８で行われる。
適用可能であり、即ち、式（）で表わされる物
質又はそのエステルと１当量又は過剰の式（）
で表わされる物質とを、ジメチルホルムアミド、
テトラヒドロフラン等の溶媒中、縮合剤の存在下
で反応させる。縮合剤としては、それぞれ約１当
量の１―ヒドロキシベンゾトリアゾール及びジシ
クロヘキシルカルボジイミドが用いられ、反応
は、トリエチルアミン又は１―エチルモルホリン
等を添加しPH７〜８で行われる。
BOC及び第三ブチル保護基の分解は、反応生
成物をトリフルオル酢酸を用いて約２時間室温で
処理する。エステルを出発物質として得られたエ
ステルを有する反応生成物のケン化は、0.3N―
NaOHにより０℃で１時間処理すればよい。
成物をトリフルオル酢酸を用いて約２時間室温で
処理する。エステルを出発物質として得られたエ
ステルを有する反応生成物のケン化は、0.3N―
NaOHにより０℃で１時間処理すればよい。
本発明の出発物質として使用される豚インシユ
リンは、種々の保護基を有するものを含むが、保
護基を有さない豚インシユリンを使用してプロテ
アーゼを作用させ、その後保護基を導入すること
もできる。
リンは、種々の保護基を有するものを含むが、保
護基を有さない豚インシユリンを使用してプロテ
アーゼを作用させ、その後保護基を導入すること
もできる。
式（）で表わされる物質のＲとしては、通
常、BOCが用いられ、またエステルとしては、
通常、ペンタメチルエステルが用いられる。次に
式（）で表わされる物質の調製方法を上記のＲ
がBOC、エステルがメチルエステルであるもの
を一例として説明する。
常、BOCが用いられ、またエステルとしては、
通常、ペンタメチルエステルが用いられる。次に
式（）で表わされる物質の調製方法を上記のＲ
がBOC、エステルがメチルエステルであるもの
を一例として説明する。
豚インシユリンをトリス緩衝液（PH9.5）に溶
かした後、アクロモバクター リテイクスの生産
するプロテアーゼ（セリンプロテアーゼ）を加
え、ニンヒドリン比色法でアラニンの生成量が理
論量に達するまで反応させ、PH５に調製して沈殿
したデスアラニンインシユリンを既知の方法
（Biochemistry ６巻 3559頁 1967）に従つて
BOC化し、式（）で表わされるN〓A1，N〓B1，
N〓B29―トリ―BOC―デス―B30―アラニンイン
シユリンを得る。
かした後、アクロモバクター リテイクスの生産
するプロテアーゼ（セリンプロテアーゼ）を加
え、ニンヒドリン比色法でアラニンの生成量が理
論量に達するまで反応させ、PH５に調製して沈殿
したデスアラニンインシユリンを既知の方法
（Biochemistry ６巻 3559頁 1967）に従つて
BOC化し、式（）で表わされるN〓A1，N〓B1，
N〓B29―トリ―BOC―デス―B30―アラニンイン
シユリンを得る。
また、一方の式（）で表わされる物質である
N〓A1，N〓B1，N〓B29―トリ―BOC―デス―B30―
アラニンペンタメチルエステル等は次のように調
製される。豚インシユリンを85％エタノール―
0.2N―HClに溶かし、次いで30倍量のジアゾメ
タンと反応させ、（Science 177巻 623頁 1972）
生成した豚インシユリンヘキサメチルエステルを
トリス緩衝液（PH7.5）に溶かした後、アクロモ
バクターリテイクスの生産するプロテアーゼ
（セリンプロテアーゼ）を加え、電気泳動で何ら
豚インシユリンヘキサメチルエステルが検出され
なくなるまで反応させる。PH8.2での等電点沈殿
で生じた化合物を上記の方法に従いBOC化し出
発物質であるエステルを得る。
N〓A1，N〓B1，N〓B29―トリ―BOC―デス―B30―
アラニンペンタメチルエステル等は次のように調
製される。豚インシユリンを85％エタノール―
0.2N―HClに溶かし、次いで30倍量のジアゾメ
タンと反応させ、（Science 177巻 623頁 1972）
生成した豚インシユリンヘキサメチルエステルを
トリス緩衝液（PH7.5）に溶かした後、アクロモ
バクターリテイクスの生産するプロテアーゼ
（セリンプロテアーゼ）を加え、電気泳動で何ら
豚インシユリンヘキサメチルエステルが検出され
なくなるまで反応させる。PH8.2での等電点沈殿
で生じた化合物を上記の方法に従いBOC化し出
発物質であるエステルを得る。
本発明に使用されるプロテアーゼ（セリプロ
テアーゼ）は既知の酵素であり、Ｌ―リジンのカ
ルボキシル基におけるエステル結合及びアミド結
合を特異的に水解する基質特異性を有し、また、
ジイソプロピルフオスフオフロリド、Ｌ―リジン
クロロメチルケトンにより阻害を受け、また、
K+、R+ b、Cs +、B++ a、及びメチルアミン、メチル
グアニジンによつて拮抗的に強く阻害されるとい
う性質を有している。
テアーゼ）は既知の酵素であり、Ｌ―リジンのカ
ルボキシル基におけるエステル結合及びアミド結
合を特異的に水解する基質特異性を有し、また、
ジイソプロピルフオスフオフロリド、Ｌ―リジン
クロロメチルケトンにより阻害を受け、また、
K+、R+ b、Cs +、B++ a、及びメチルアミン、メチル
グアニジンによつて拮抗的に強く阻害されるとい
う性質を有している。
次に実施例を挙げ本発明方法を更に詳細に説明
する。
する。
実施例 １
豚インシユリン190mg、Achromobacter
lyticusプロテアーゼ0.63mgを0.05Mトリス緩衝
液（PH9.5）190mlに溶かし、かきまぜながら、33
℃で20時間反応させた。次いで氷冷後、1N―
HClでPH５とし、沈殿物を凍結乾燥させるとデス
―B30―アラニンインシユリン105mgが得られ、
これは酸性及び塩基性電気泳動において単一バン
ドを示した。この物質（105mg）をジメチルホル
ムアミド14ml、トリエチルアミン23mg、BOC―
アジド910mgに溶かし、40℃で、１時間撹拌した。
エーテルで沈殿させることによにトリ―BOC―
デス―B30―アラニンインシユリン103mgを得た。
この物質をジメチルホルムアミド３ml中に、１―
ヒドロキシベンゾトリアゾール40mg、Thr（But）
OBut31mg及びトリエチルアミン16μと共に溶解
した。次いで、氷冷下、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド62mgを加え、18時間かきまぜた。分離し
たジシクロヘキシル尿素を濾去し、生成物をエー
テルにより沈殿させた。沈殿物（94mg）をトリフ
ルオル酢酸3.1mlと２時間、室温で処理すること
により保護基をはずした。エーテルで沈殿させて
得られた化合物（89mg）には、酸性及び塩基性電
気泳動において、ヒトインシユリンと同じ移動度
を示す物質（８mg）が含まれていた。
lyticusプロテアーゼ0.63mgを0.05Mトリス緩衝
液（PH9.5）190mlに溶かし、かきまぜながら、33
℃で20時間反応させた。次いで氷冷後、1N―
HClでPH５とし、沈殿物を凍結乾燥させるとデス
―B30―アラニンインシユリン105mgが得られ、
これは酸性及び塩基性電気泳動において単一バン
ドを示した。この物質（105mg）をジメチルホル
ムアミド14ml、トリエチルアミン23mg、BOC―
アジド910mgに溶かし、40℃で、１時間撹拌した。
エーテルで沈殿させることによにトリ―BOC―
デス―B30―アラニンインシユリン103mgを得た。
この物質をジメチルホルムアミド３ml中に、１―
ヒドロキシベンゾトリアゾール40mg、Thr（But）
OBut31mg及びトリエチルアミン16μと共に溶解
した。次いで、氷冷下、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド62mgを加え、18時間かきまぜた。分離し
たジシクロヘキシル尿素を濾去し、生成物をエー
テルにより沈殿させた。沈殿物（94mg）をトリフ
ルオル酢酸3.1mlと２時間、室温で処理すること
により保護基をはずした。エーテルで沈殿させて
得られた化合物（89mg）には、酸性及び塩基性電
気泳動において、ヒトインシユリンと同じ移動度
を示す物質（８mg）が含まれていた。
実施例 ２
氷冷したエタノール21.3mlと0.2NHCl3.8mlの
混合溶液中に豚インシユリン250mgを溶かし、か
きまぜながらジアゾメタン45mlを少しずつ分けて
加えた。その間、反応液のPHを４―５に1NHCl
を用いて維持した。エーテルを加え、生じた油状
物質をアセトンで沈殿させた。この沈殿物（豚イ
ンシユリンヘキサメチルエステル）は酸性電気泳
動で単一バンドを示し、豚インシユリンと区分さ
れる。沈殿物（190mg）を0.05Mトリス緩衝液
（PH7.5）190mlに溶かし、次いでAchromobacter
lytiusの生産するプロテアーゼ（0.63mg）を加
え、33℃で、23時間反応させた。永冷後、1N―
NaOHでPH8.2とし、沈殿（デス―B30―アラニン
インシユリンペンタメチルエステル）を得た。こ
の沈殿は酸性電気泳動で単一バンドを示し、豚イ
ンシユリンヘキサメチルエステルと区別される。
この沈殿（134mg）をジメチルホルムアミド18ml
に溶かし、次いでトリエチルアミン30mg、BOC
―アジド1.160ｇを加え、40℃で、５時間反応さ
せた後室温まで冷やし、エーテルで沈殿させた。
この沈殿物（トリ―BOC―デス―B30―アラニン
インシユリンペンタメチルエステル、142mg）を
ジメチルホルムアミド３ml中に、１―ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール40mg、Thr（But）OBut49mg、
トリエチルアミン16μと共に溶解した次いでジ
シクロヘキシルカルボジイミド62mgを加え、室温
で18時間かきまぜた。分離したジシクロヘキシル
尿素を濾去し、生成物をエーテルにより沈殿させ
た。この沈殿物（139mg）をトリフルオル酢酸4.7
mlと室温で２時間反応させ、泳冷した溶液から生
成物をエーテル添加で沈殿させた。この沈殿物
（130mg）を0.3NNaOH5mlで０℃で１時間ケン化
させ、PH５での等電点沈殿、次いでアセトン沈殿
を行つた。この沈殿物（123mg）には、酸性及び
塩基性電気泳動において、ヒトインシユリンと同
じ移動度を示す物質（６mg）が含まれていた。
混合溶液中に豚インシユリン250mgを溶かし、か
きまぜながらジアゾメタン45mlを少しずつ分けて
加えた。その間、反応液のPHを４―５に1NHCl
を用いて維持した。エーテルを加え、生じた油状
物質をアセトンで沈殿させた。この沈殿物（豚イ
ンシユリンヘキサメチルエステル）は酸性電気泳
動で単一バンドを示し、豚インシユリンと区分さ
れる。沈殿物（190mg）を0.05Mトリス緩衝液
（PH7.5）190mlに溶かし、次いでAchromobacter
lytiusの生産するプロテアーゼ（0.63mg）を加
え、33℃で、23時間反応させた。永冷後、1N―
NaOHでPH8.2とし、沈殿（デス―B30―アラニン
インシユリンペンタメチルエステル）を得た。こ
の沈殿は酸性電気泳動で単一バンドを示し、豚イ
ンシユリンヘキサメチルエステルと区別される。
この沈殿（134mg）をジメチルホルムアミド18ml
に溶かし、次いでトリエチルアミン30mg、BOC
―アジド1.160ｇを加え、40℃で、５時間反応さ
せた後室温まで冷やし、エーテルで沈殿させた。
この沈殿物（トリ―BOC―デス―B30―アラニン
インシユリンペンタメチルエステル、142mg）を
ジメチルホルムアミド３ml中に、１―ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール40mg、Thr（But）OBut49mg、
トリエチルアミン16μと共に溶解した次いでジ
シクロヘキシルカルボジイミド62mgを加え、室温
で18時間かきまぜた。分離したジシクロヘキシル
尿素を濾去し、生成物をエーテルにより沈殿させ
た。この沈殿物（139mg）をトリフルオル酢酸4.7
mlと室温で２時間反応させ、泳冷した溶液から生
成物をエーテル添加で沈殿させた。この沈殿物
（130mg）を0.3NNaOH5mlで０℃で１時間ケン化
させ、PH５での等電点沈殿、次いでアセトン沈殿
を行つた。この沈殿物（123mg）には、酸性及び
塩基性電気泳動において、ヒトインシユリンと同
じ移動度を示す物質（６mg）が含まれていた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 豚インシユリンにアクロモバクターリテイク
スの生産するプロテアーゼを作用させ、式 （式中、Ｒはプロトンソルボリシス的に若しく
はβ―脱離により分解しうるアミノ保護基を意味
する。）で表わされるデス―B30―アラニン―豚
インシユリン又はそのペンタアルキルエステルを
得、ついで式、Thr（But）OBut、で表わされる
アミノ酸と縮合させることを特徴とするヒトイン
シユリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4357478A JPS54135789A (en) | 1978-04-13 | 1978-04-13 | Preparation of human insulin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4357478A JPS54135789A (en) | 1978-04-13 | 1978-04-13 | Preparation of human insulin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54135789A JPS54135789A (en) | 1979-10-22 |
| JPS637760B2 true JPS637760B2 (ja) | 1988-02-18 |
Family
ID=12667511
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4357478A Granted JPS54135789A (en) | 1978-04-13 | 1978-04-13 | Preparation of human insulin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS54135789A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57155997A (en) * | 1981-10-30 | 1982-09-27 | Shionogi & Co Ltd | Insulin derivative |
| JPS62116598A (ja) * | 1981-10-30 | 1987-05-28 | Shionogi & Co Ltd | インシユリン誘導体の製造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5141378A (ja) * | 1974-10-03 | 1976-04-07 | Teijin Ltd |
-
1978
- 1978-04-13 JP JP4357478A patent/JPS54135789A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5141378A (ja) * | 1974-10-03 | 1976-04-07 | Teijin Ltd |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS54135789A (en) | 1979-10-22 |
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