DK163435B - Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf - Google Patents
Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK163435B DK163435B DK452188A DK452188A DK163435B DK 163435 B DK163435 B DK 163435B DK 452188 A DK452188 A DK 452188A DK 452188 A DK452188 A DK 452188A DK 163435 B DK163435 B DK 163435B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- amino
- alkyl
- aralkyl
- aryl
- process according
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/022—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -X-C(=O)-(C)n-N-C-C(=O)-Y-; X and Y being heteroatoms; n being 1 or 2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
- C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
- C07K5/0613—Aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
i
DK 163435 B
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater af dipeptider af den i krav 1's indledning anførte art.
5 Der har i dé seneste år været stigende interesse for dipeptider og dipeptid-derivater eventuelt indeholdende en aminosyrerest af D-konfiguration med henblik på disses potentielle farmakologiske virkninger, f.eks. som antibiotika. Ligeledes er der stor interesse for dipeptider 10 indenfor områder som kunstig ernæring - såvel human som veterinær - sødemidler og indenfor agrokemien f.eks. som insektbekæmpelsesmidler.
Sådanne dipeptider H-A-B-Y kan fremstilles ved hjælp af 15 kendte kemiske koblingsreaktioner, men fælles for alle disse metoder er, at det som regel er nødvendigt at beskyttede de involverede aminosyrer - A og B - på henhold-vis aminogruppen og carboxylsyregruppen samt ofte også på sidekæderne, hvis disse bærer funktionelle grupper. På 20 grund af de anvendte reagenser og betingelser er der endvidere iboende risiko for sidereaktioner under det kemiske koblingstrin. Racemisering, fortrinsvis på A-komponen-ten, er en sådan væsentlig sidereaktion. Ved at erstatte det kemiske koblingstrin med et enzymatisk koblingstrin, 25 der forløber under milde betingelser, kan sådanne sidereaktioner og racemisering undgås, hvorved der dannes et stereokemisk rent produkt.
Tilstedeværelsen af amino- eller carboxylbeskyttelses-30 grupper er obligatorisk ved kemisk kobling og med få undtagelser også ved enzymatisk kobling under anvendelse af endoproteaser ifølge den kendte teknik.
Herved tilføres disse processer som forklaret nedenfor 35 adskillige uønskede træk, der i alvorlig grad påvirker deres procesøkonomi i industrielt omfang, hvilket er særligt tydeligt ved dipeptidfremstilling. Ulemperne opstår
DK 163435 B
2 i forbindelse med beskyttelsesgruppernes indførelse, fjernelse og tilstedeværelse under processen, hvilket forøger de samlede procesomkostninger og -tid samt udbyttet som sådant.
5
Typiske eksempler på almindeligt anvendte amino-beskyt-telsesgrupper er grupper af carbobenzoxy (Z-) og tert-butoxycarbonyl- (Boc-) typen, der har en med aminosyre-resterne sammenlignelig molekylvægt. For det første skal 10 beskyttelsesgrupperne indføres i udgangsmaterialerne ved hjælp af egnede dyre midler i et separat reaktionstrin efterfulgt af et isoleringstrin. Tilstedeværelsen af disse hydrofobe grupper har ofte en drastisk effekt på mellemprodukternes og reaktionsprodukternes opløselighed og 15 kan påvirke både den type og mængde af opløsningsmidler, der kræves til deres behandling, og den lethed hvormed de kan oprenses og debeskyttes. Endvidere skal debeskyttel-sen ske i et separat trin efterfulgt af et oprensningstrin.
20
Der findes et antal reaktioner til dette formål, men med undtagelse af katalytisk hydrogenering, der i sig selv volder industrielle problemer, foregår disse reaktioner under voldsomme og ofte stærkt sure eller basiske betin-25 gelser, hvilket ofte forårsager en række sidereaktioner. Resultatet heraf vil være et urent produkt, medmindre dette underkastes krævende og omstændelig oprensning.
De sidste trin i denne forholdsvis lange række syntese-30 trin kan således blive en ret omfattende debeskyttelse til opnåelse af de ønskede dipeptider. På grund af de næsten uundgåelige sidereaktioner kræves desuden ofte ret omstændelige rensningsprocedurer for at opnå et produkt · med den ønskede høje renhedsgrad.
35
Et dipeptid, der har tiltrukket sig stor opmærksomhed i de senere år er L-Asp-L-Phe-methylester, også kendt som 3
DK 163435B
aspartam, og derivater deraf, der har vundet stor udbredelse som sødemidler. Kemisk syntese af aspartam er behæftet med de ovennævnte ulemper.
5 Forsøg på at undgå aminoterminal-beskyttelse ved fremstillingen af aspartam og dets derivater har omfattet mikrobiel gæring, f.eks. de i EP-Al-074095, EP-A2-102529 og EP-A2-154472 beskrevne gæringsprocesser. Denne teknik er fundamentalt forskellig fra syntetiske metoder og er 10 afhængig af specifikke organismer for hvert peptid. Den er derfor ikke generelt anvendelig i forbindelse med andre dipeptider. Desuden er udbytterne ofte lave og genvindingen fra gæringsmediet omstændelig.
15 De ovennævnte ulemper ved de kendte processer til aspar-tamfremstilling er bekræftet i EP-A2-269390. I denne ansøgning opstilles der krav på en fremgangsmåde til fremstilling af L-Asp-L-Phe-alkylestere, hvorved L-Asp-a-es-tere eller -a-amider omsættes i et solventmedium med L-20 Phe-alkylestere i nærvær af et enzym, en mikroorganisme, der indeholder enzymet, eller en enzymholdig fraktion af en mikroorganisme, eller enzymet immobiliseret på en bærer, hvilket enzym er i stand til at danne L-Asp-L-Phe-alkylestere ved kondensation af de ovenævnte Asp- og Phe-25 derivater.
Det ses, at der skal anvendes et enzym, der har specifik esterase- eller amidaseaktivitet over for Asp, men ikke over for Phe. Det eneste enzym, der er omtalt, er den ex-30 tracellulære protease med esterolytisk aktivitet, der dannes af Staphylococcus aureus V8.
Selvom således anvendeligheden af N-a-ubeskyttede Aspestere eller -amider er foreslået - på lige fod med N-a-35 beskyttede sådanne eller 0-estere eller -amider - til fremstilling af et meget specifikt peptid, er anvendeligheden kun understøttet af ét eksempel, hvor der anvendes
DK 163435 B
4 temmeligt særprægede reaktionsbetingelser, nemlig f emdobbelt overskud af substratkomponent. På denne baggrund kan man ikke ud fra EP-A2-269390 udlede nogen generel lære vedrørende anvendeligheden af N-ubeskyttede sub-5 stratkomponehter ved dipeptidsyntese katalyseret af amidase- eller esteraseenzymer.
Set i lyset af den totale procesøkonomi er det derfor en åbenlys fordel at kunne undgå beskyttelsesgrupper, også 10 på amino- og carboxyterminalen. Det kan være interessant at kunne fremstille et dipeptid, der har sidekædebeskyt-telse, men ingen terminalbeskyttelse, og det vil fremgå, at dette er muligt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, når man går ud fra sidekædebeskyttede men amino-ubeskyt-15 tede udgangsmaterialer. Herved kan der opnås de samme fordele med hensyn til milde reaktionsbetingelser og total procesøkonomi. Om ønsket kan sidekædebeskyttelses- gruppen fjernes kemisk eller enzymatisk; i reglen under mildere betingelser end det er muligt for amino-beskyt-20 telsesgrupper.
Kendte er de enzymkatalyserede koblingsreaktioner, der tillader anvendelse af eventuelt sidekæde-ubeskyttede aminosyrederivater og eventuelt en Crterminal ubeskyttet 25 B-komponent (nucleophil). Der kan eksempelvis henvises til dansk patentskrift nr. 155613 samt det tilsvarende EP patentskrift nr. 17485 (EP-Bl-17485).
I EP-Bl-17485 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling 30 af peptider ved omsætning af en substratkomponent valgt blandt aminosyreestere og aminosyreamider med en aminkom-ponent (nucleophil) valgt blandt L-aminosyreamider, L-aminosyrer eller L-aminosyreestere i nærvær af et L-spe-cifikt serin- eller thiolcarboxypeptidase-enzym.
35
Hvis der skal fremstilles et dipeptid ved fremgangsmåden ifølge EP-Bl-17485, anvendes der som substratkomponent 5
DK 163435B
obligatorisk et N-terminalbeskyttet aminosyrederivat, og den indgående aminosyre er obligatorisk en L-aminosyre.
Som beskrevet i patentansøgning WO88/06187 med prioritet 5 fra 13. februar 1987, har det overraskende vist sig at de i EP-B1-17485 anvendte serin- og thiolcarboxypeptidaser er i stand til at udnytte N-ubeskyttede aminosyreestere eller -amider som substratkomponent i kontrollerede reaktioner til fremstilling af dipeptider og dipeptid-deriva-10 ter, og at det er muligt at undertrykke en eventuel oli-gomerisering af substratet.
Man har endvidere længe været klar over, at nogle endo-proteaser kan katalysere oligomerisering af visse N-15 ubeskyttede aminosyreestere med L-konfiguration, (Fruton, J.S. Advances in Enzymology, 53: 239-306, 1982), men det er aldrig tidligere forsøgt udnyttet til fremstilling af dipeptider, der ikke er simple dimere. Resultaterne af sådanne observationer har som regel været en blanding af 20 en til tider lang række oligomere. Oligomeriseringsgraden og blandingens kompleksitet afhænger af de dannede produkters opløselighed. Det skal endvidere nævnes, at den kendsgerning, at et givet enzym kan katalysere et givet N-a-ubeskyttet aminosyrederivat, ikke automatisk indebæ-25 rer en lignende evne til at katalysere koblingsreaktioner med samme derivat. Jvf. de af Andersen, A.J. citerede referencer i "Peptides, Structure and Function". Proc. of the 9. Ann. peptide symposium, Eds. Deber, C.M. et al.,
Pierce (1985), p. 355.
30
Af denne grund har anvendelsen af serin- og thiolendo-proteaser til peptidfremstilling været begrænset til anvendelsen af amino- og carboxyterminalbeskyttede udgangsmaterialer, som beskrevet i US-A-4.086.136, der f.eks.
35 omtaler papain, stembromelein, ficin, chymopapain og chymotrypsin.
DK 163435 B
6
De ovennævnte amino- og carboxyterminalbeskyttede udgangsmaterialer er også obligatoriske, hvis der anvendes aspartat-endoproteaser, f.eks. pepsin, som beskrevet i US-A-3.972.773, og hvis der anvendes metallo-endopro-5 teaser, som ~ beskrevet i EP-A1-009585 ved fremstillingen af Z-AspPheOMe.PheOMe-salt. Ved disse reaktioner af kondensationstypen er det obligatorisk, at substratkomponenten er på fri e-carboxylsyreform, som vist i EP-A2-220923.
10
Anvendelsen af amino- og carboxyterminalbeskyttede udgangsmaterialer har også været anset for obligatorisk ved ikke-proteaser, f.eks. esteraser med amidase-aktivitet,
Blair West et al., Tetrahedron letters, Vol. 28 No. 15, 15 p. 1629-32 (1987), der anvendte porcin pancreatisk lipase, Candida cylindracea lipase og porcinlever esterase i organiske medier, eventuelt indeholdende en vandig puffer.
20 Cellulaser har hidtil også kun været anvendt syntetisk til polymerisation ved reaktioner af kondensationstypen med fuldstændigt fri Æ-aminosyrer, som beskrevet af Kitazume, T. et al, J. Flourine Chem. 36 (1987) p. 225-236.
25
Det har indtil nu ikke været muligt at fremstille de dia-stereomere dipeptider af DL-, LD- og DD-konfiguration eller peptider indeholdende Ø-aminosyrerester fra amino-ubeskyttede substratkomponenter ved hjælp af carboxypep-30 tidaser, med undtagelse af hvad der er beskrevet i WO88/06187 og generelt heller ikke med noget proteolytisk enzym (klasse EC 3.4). Der har været gjort forsøg med en anden klasse enzymer, aminoacyl-t-RNA-synthetase (klasse EC 6.1) som eksemplificeret i EP-A1-086053. Her skal der 35 anvendes et specifikt enzym for hver type aminosyrerest, og endvidere er dyre Co-faktorer såsom ATP nødvendige. Samtidig er udbytterne meget ringe, så selvom en vis
DK 163435 B
7 mængde dipeptidester eller -amid blev isoleret og identificeret, krævede det typisk ti gange så meget Co-faktor overskud og hundrede gange så meget nucleophil-overskud og flere hundrede gange så meget enzym-overskud baseret 5 på vægt.
En artikel af Gaertner et al., Proteins: Structure,
Function and Genetics 3: 130-137 (1988) bekræfter indirekte fordommen mod anvendelse af N-a-ubeskyttede 10 aminosyrer som substratkomponenter ved enzymatisk peptidsyntese. Sekundær hydrolyse af det frisk fremstillede produkt var et væsentligt problem, som man tidligere stødte på, og man forsøgte derfor at nedsætte vand-aktiviteten i reaktionsmediet under anvendelse af organiske 15 opløsningsmidler. Gaertner et al. beskriver dipeptid-fremstilling under anvendelse af chymotrypsin, der var blevet kemisk modificeret til forøgelse af dets opløselighed i organiske medier. Under anvendelse af et antal N-e-beskyttede aminosyreestere som substratkomponenter og 20 aminosyreamider som nucleophilkomponenter blev der opnået Ν-α-beskyttede dipeptidamider i gode udbytter i et benzen medium. Der blev således opnået a-Bz-Lys-Phe-NH^ i et udbytte på mere end 98% ved omsætning af α-Bz-Lys-OMe med Phe-N^. Under anvendelse af e-Z-LysOEt, d.v.s. en side-25 kædebeskyttet men N-a-ubeskyttet lysinester, dannedes ingen e-Z-Lys-Phe-Nfi^. Gaertner et al kommenterer ikke dette resultat, men det indikerer at de tilsyneladende mente, at aminogruppe-beskyttelsen af substratkomponenten var obligatorisk.
30 Nærværende opfindelse, der er en videreudvikling af opfindelsen ifølge W088/06187, bygger på den overraskende konstatering, at muligheden for udnyttelse af N-a-ubeskyttede aminosyreestere og amider som substratkomponent 35 i kontrollerede reaktioner til fremstilling af dipeptider og dipeptid-derivater ikke er begrænset til serin- eller thiolcarboxypeptidaser, men også er mulig i almindelighed
DK 163435 B
8 med amidase- eller esterase-enzymer, især serinendopro-teaser, thiolendoproteaser, lipaser og esteraser.
Det har endvidere overraskende vist sig, at også N-a-ube-5 skyttede amihosyrederivater af D-konfiguration kan anvendes som substrater i disse reaktioner, således at det foruden LL-dipeptider også er muligt at syntetisere DL-dipeptider. Omsætningshastigheden for D-substrater er imidlertid i almindelighed noget lavere end for L-sub-10 strater under ens betingelser, men forskellen i hastighed er langt mindre end for de tilsvarende N-beskyttede ami-nosyreestere, hvor D-substratet omsættes med en hastighed, der er langt lavere end hastigheden for L-substratet; Purdie et al., Biochem. Biophys. Acta, 268 (1972), 15 523. Der er imidlertid stor individuel forskel mellem en zymerne i denne henseende. Syntese-udbytterne er ofte lige så høje ved de ubeskyttede D-substrater i forhold til de ubeskyttede L-substrater.
20 Det er kendt, at nogle endoproteaser er i stand til at udnytte en nucleophil-komponent af D-konfiguration i reaktioner med N-beskyttede substratkomponenter. Det er således muligt afhængig af sekvensen at syntetisere dipeptider med LL-, DL-, LD- eller BD-konfiguration ved 25 fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er således ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.
30 Som eksempler på anvendelige aminocarboxy 1 syrer kan nævnes aliphatiske aminosyrer, såsom monoaminomonocarboxyl-syrer, f.eks. glycin (Gly), alanin (Ala), valin (Val), norvalin (Nval), leucin (Leu), isoleucin (iso-Leu) og norleucin (Nleu), hydroxyaminosyrer, såsom serin (Ser), 35 threonin (Thr) og homoserin (homo-Ser), svovlholdige aminosyrer, såsom methionin (Met) eller cystin (CysS) og cystein (CysH), monoaminodicarboxylsyrer, såsom aspara-
DK 163435 B
9 ginsyre (Asp), glutaminsyre (Glu) og amider deraf, såsom asparagin (Asn) og glutamin (Gin), diaminomonocarboxylsy-rer, såsom ornithin (Orn) og lysin (Lys), arginin (Arg), aromatiske aminosyrer, såsom phenylalanin (Phe) og tyro-5 sin (Tyr), samt heterocycliske aminosyrer, såsom histidin (His), prolin (Pro) og tryptophan (Trp). Som eksempler på anvendelige amino-forbindelser med mere usædvanlig struktur kan nævnes penicillamin (Pen), eller ω-aminosyrer, såsom Ø-alanin (BAla), 0-phenylalanin (BPhe) eller τ-ami-10 nosmørsyre (GABA) eller alkoholer afledt af alanin. I substratkomponenten og i nucleophilkomponenten kan de som nævnt også være på D-form.
Det fremgår, at definitionerne for Y-gruppen i peptidde-15 rivatet med formlen H-A-B-Y afspejles i de forskellige nucleophilkomponenter i krav 1. (a) og (b) indeholder således begge C-terminale blokeringsgrupper.
Ligesom ved opfindelsen ifølge WO88/06187 er fordelene 20 ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen i forhold til de omtalte kendte metoder minimal eller ingen sidekædebe-skyttelse, ingen N-beskyttelse af substratkomponenten, der kan have både D- og L-konfiguration, ingen risiko for racemisering, få syntesetrin og et forventet forholdsvis 25 rent slutprodukt, hvilket tilsammen åbner mulighed for en yderst enkel og økonomisk fremstillingsmetode.
DK 163435B
ίο hydroxy eller nitro.
Også omfattet af opfindelsen er de processer, hvor der intermediært dannes et peptid indeholdende gruppen 5 R2 / 10 -N eller -OR* \ R3 hvorefter denne gruppe fraspaltes under dannelse af en 15 carboxylsyregruppe. Denne spaltning kan katalyseres af et andet eller det samme enzym, som blev anvendt til dannelsen af peptidet, omend under andre reaktionsbetingelser.
Der kan også foretages C-terminale modifikationer af Y-gruppen.
20
Enzymer kan også anvendes til fraspaltning af sidekæde-beskyttelsesgrupper. På tale som anvendelige enzymer kommer, afhængigt af beskyttelsesgruppens type, proteoly-tiske enzymer, lipaser og esteraser, .jvf. "The peptides, 25 Analysis, Synthesis, Biology" Vol 9, Special Methods in Peptide Synthesis Part C. J.A. Glass, Enzymatic Manipulation of Protecting Groups in Peptide Synthesis, Academic Press 1987.
30 Eksempler på enzymer med esterase- og/eller amidase-akti-vitet, som derfor forventes at være aktive katalysatorer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, fremgår af efterfølgende tabel.
35 En nærmere beskrivelse af disse enzymer gives bl.a. af
Perlmann, G.E. et al., Colowick, S. P. & Kaplan, N. 0.
(eds.) Methods of Enzym. 8 (1966) (1970), 28 (1972), 11
DK 163435B
35 (1975) and 45 (1976), Fruton, S-, Adv. Enzymol. 53, p.
239, Wiley (1982), Abassi, A. et al. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 367, p. 441-45 (1986), Dixon, M. and Webb E. C. "Enzymes", 3rd ed. Longman Group (1979), Torrey, S. ed.) 5 in "Enzyme Technology, Recent Advances", Biotech. Rev. 2,
Noyes Data Corporation (1983), samt Laane, C., Tramper, S., Lilly, M.D. (eds.) "Biocatalysis in Organic Media", .lsevier (1987), Asano, Y. et al., Angew. Chem. 101, (1989), p. 511-512, Kitazume, T., et al., J. Flourine 10 Chem. 36 (1987), p. 225-236.
15 20 25 30 35
DK 163435 B
12 TABEL 1 I. Proteaser forskellige fra carboxypeptidaser; 5 ' Enzym (Fork) Normal kilde A) Thiolendoproteaser; Papain (P) Papaya
Chymopapain (CP) Papaya
Bromelain (B) Ananas 10 Ficin (F)) Figen (Ficus)
Clostripain (CL) Clostridium histolyticum B) Serinendoproteaser: Trypsin (T) Pancreas 15 Chymotrypsin (CT) Pancreas
Elastase (E) Pancreas
Subtilisin (S) Bacillus licheniformis eller 20 subtilis
Thermitase (TV) Thermoactino- myces vulgaris
Proteinase K (K) Tritrachium 25 album
Valyl-proteinase (VP) Candida tropicalis
Postprolin specifik endopeptidase (PPSE) Flavo- 30 bactericum meningo- septicum
Achromobacter lyticus Protease I (AL-I) Achromobacter 35 lyticus
Endoproteinase ArgC (AC) Submaxillaris kirtler 13
DK 163435B
Endoproteinase LysC (LC) Lysobacter enzymogenes
Thrombin (TB) Blodplasma 5 II. Andre hydrolaser, der påvirker ester-bindinger
Carboxylesterase (EC.3.1.1.1) Lever
Arylhydrolase (EC.3.1.1.2) Plasma
Triacylglycerollipase (EC.3.1.1.3) Animalsk, 10 især fra porcin vegetabilsk pancreas eller eller micro-
Candida cylindracea biel eller Lipolase® (NOVO) ( fra Aspergillus sp) 15 Eddikeester acetylesterase (EC.3.1.1.6) Amimalsk væv
Arylglycerollipase (EC.3.1.1.23) Animalsk eller vegetabilsk 20 III. Glycosidaser
Cellulase, især fra (EC.3.2.1.4) Animalsk,
Trichoderma viride vegetabilsk 25 eller Aspergillus niger eller mikrobiel 30 På tale som særligt foretrukne enzymer kommer trypsin, chymotrypsin, subtilisin, elastase, papain, chymopapain, clostripain, porcin pancreas-lipase og Candida cylindracea lipase.
35 Det anvendté enzym kan også være kemisk modificeret eller være en biosyntetisk mutant af en naturlig form.
14
DK 163435 B
Som illustreret nærmere i det følgende er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ret enkel.
Reaktionen foretages i et vandigt reaktionsmedium, der om 5 ønsket kan indeholde indtil 90%, fortrinsvis indtil 60%, af et polært organisk opløsningsmiddel, der er blandbart med vand, og som er kompatibelt med det anvendte enzym under de givne betingelser. Foretrukne opløsningsmidler er lavere alkoholer, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, 10 dimethoxyethan, ethylenglycol.
Det er vigtigt at holde en ret konstant pH-værdi i reaktionsblandingen. Denne pH-værdi ligger mellem 3 og 11, fortrinsvis mellem 5 og 10,5, især mellem 6 og 10, βρει 5 cielt mellem 7 og 9,5, og afhænger iøvrigt af de konkrete udgangsmaterialer, det dannede peptid og enzymet.
Alternativt foretages reaktionen i et ikke-vandigt, ikke-polært medium bestående af vand, organiske opløsningsmid-20 ler, der er er ublandbare med vand, f.eks. benzen, toluen, octaner, heptaner, dialkylethere, etc, der er kompatible med enzymer med esterase- og/eller amidase-akti-vitet, især lipaser. Som yderligere eksempler kan nævnes hexaner, ethylacetat, ethylpropionat og methylenchlorid.
25
Disse i hovedsagen ikke-polære reaktionsmedier kan indeholde indtil 10% vand i opløst form til tilvejebringelse af optimal enzymkapacitet eller reaktionsstabilitet.
30 Reaktionstemperaturen er fortrinsvis stuetemperatur og derover, 20-50eC, men temperaturer i intervallet 0-80°C er anvendelige, hvis de er fordelagtige under de øvrige givne betingelser. Ved høje opløsningsmiddel-betingelser kan der anvendes temperaturer under 0 eller over 80°C.
Koncentrationen af de to reaktionskomponenter kan varieres inden for vide grænser, men oftest vil nucleophil- 35
DK 163435 B
15 komponenten være i overskud, og for at undgå oligomerise-ring af substratkomponenten tilsættes denne ofte med mellemrum i mindre portioner fordelt over hele reaktionsforløbet. Hvis der anvendes et stort overskud af en for en-5 zymet god nucleophilkomponent, observeres der overraskende ingen oligomer i sering, og der kan anvendes høje substratkoncentrationer uden sidereaktioner. Hvis der ønskes et homodipeptid, hvor A = B, kan man undgå oligomerise-ring fra en enkel nucleophilkomponent under anvendelse af 10 forskellige carboxybeskyttelsesgrupper på substrat- og nucleophilkomponenten.
Således kan udgangskoncentrationen for substratkomponenten typisk være 0,005 - 2 molær og for nucleophilkomponen-15 ten i de tilfælde, hvor denne tilsættes separat 0,005 - 3 molær. Det vil i de fleste situationer være muligt at genvinde overskud af nucleophilkomponenten og hydrolyseproduktet fra substratkomponenten til eventuel reesteri-ficering og genanvendelse. Komponenterne kan let føres 20 tilbage til processen, hvilket skyldes deres enkle struktur og fraværet af sidereaktioner og debeskyttelsestab.
Enzymkoncentrationerne kan ligeledes varieres, men er ofte noget højere (5-50 um) (eller endnu højere, indtil 25 “ 500 am) end de koncentrationer, der er brugbare ved an vendelse af N-beskyttede aminosyreestersubstrater, men den til gennemførelse af reaktionen krævede mængde kan dog nedsættes mere end tifold ved anvendelse af et stabilt immobiliseret enzympræparat, hvorved udnyttelse af 30 enzymet i en kontinuert proces kan opnås.
Reaktionsmediet kan også indeholde salte, såsom NaCl og CaCl2, der har indflydelse på enzymets binding til substratet og kan stabilisere enzymet, samt et komplexbin-35 dingsmiddel for tilstedeværende metalioner, såsom EDTA, og mercaptostabiliserende midler, såsom DTT (dithio-threitol), BME eller Cystein kan anvendes sammen med
DK 163435 B
16 f.eks. thiolendoproteaser.
Dette overraskende hydrolyseforløb afspejler sig i de efterfølgende eksempler, der illustrerer fremstillingen 5 af forskellige dipeptider ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af en række enzymer.
Generel metode for eksempel 1-13 og eksempel 18 et seq.
10 Reaktionerne, udført i analytisk skala med et reaktionsvolumen på 1 ml, blev udført i en pH-stat, idet den valgte pH-værdi blev holdt konstant ved automatisk tilsætning af 1 N NaOH bortset fra eksemplerne med højt indhold af organiske opløsningsmidler, eller immobiliserede enzymer, 15 hvor betingelserne er angivet i de enkelte eksempler. Reaktionstemperatur var stuetemperatur, hvor ikke andet er anført. I tabellen er desuden opført reaktionskoncentrationer, indhold af organisk opløsningsmiddel, produkt og udbytte. Reaktionstider ligger typisk mellem 0,5 og 5 20 timer, og enzymkoncentrationerne er typisk 5-20 am, hvor intet andet er anført.
Produktidentifikation og bestemmelse af produktudbytte blev udført ved hjælp af reverse-phase HPLC (Waters 6000 25 A pumper, 660 gradientblander, UK 6 injektor) på en C^g NOVA PAK kolonne (Waters, RCM) under anvendelse af passende gradienter af elueringssystemer indeholdende 50 mM triethylammoniumphosphat, pH 3,0 fra 0% til 80% acetoni-tril med et flow på 2 ml/min. Elueringen blev fulgt ved 30 hjælp af en UV-detektor (Waters 480) ved 230 nm, 254 nm, 278 nm eller 290 nm.
Produkterne identificeredes ved aminosyreanalyse af fraktioner fra HPLC-analysen, der svarede til den formodede 35 produkttop og/eller ved HPLC-sammenligning med et kemisk syntetiseret referenceprodukt. Disse blev fremstillet efter kendte principer, som regel via reaktion mellem B0C- 17
DK 163435 B
A-OSu - tert.butyloxycarbonyl - succinimidester-derivatet af substrataminosyren - og den anvendte nucleophilkompo-nent efterfulgt af deblokering af den N-terminale amino-syrerest. Det var i alle tilfælde muligt at adskille LL-5 og DD-dipept"ider fra de diastereomere DL- og LD-dipeptid-produkter.
Produktudbytterne blev for de produkter, der kun kan de-tekteres ved 230 nm, bestemt ved hjælp af absorptions/ 10 koncentrationskurven for den kemisk syntetiserede refe renceforbindelse. For de øvrige produkter blev udbytterne bestemt på basis af forholdet mellem de integrerede arealer under toppene i elueringskromatogrammet, svarende til henholdsvis produkt og den reaktant, der absorberer ved 15 den pågældende bølgelængde.
Reaktionsbetingelserne i fremstillingseksemplerne 14-17 beskrives i de enkelte eksempler. Reaktionerne blev fulgt på analytisk HPLC som beskrevet- Enzymkoncentrationerne 20 er generelt lavere og reaktionstiderne længere end i de tilsvarende analytiske eksempler, men det er ikke forsøgt at optimere reaktionsbetingelserne.
25 30 35
Eksempel 1 18
DK 163435 B
Trypsin a) katalyseret syntese af L,L-dipeptidamider med L-argininethylester (50 nM) som substratkomponent og L-5 aminosyreamider som nucleophilkomponenter ved forskellige koncentrationer i vand ved pH 8,5
Nucleophil (Kone.) Produkt Udbytte 10 Leucinamid (0,2 M) ArgLeuNH2 20%
Leucinamid (0,7 M) ArgLeuNH2 32%
Methioninamid (0,25M) ArgMetNH2 31%
Methioninamid (0,5 M) ArgMetNH2 52%
Methioninamid (1,0 M) ArgMetNH2 90% 15 Serinamid (0,5 M) ArgSerNH2 45%
Tyrosinamid (0,5 M) ArgTyrNH2 46% 20 a) 10 um 25 30 35
Eksempel 2
DK 163435B
19
Trypsin ) katalyseret syntese af diastereomere L,D- og D,L-dipeptidamider med L- eller D-argininethylester (50 5 mM) som substratkomponent og L- eller D-leucin- og methioninamider som nucleophilkomponenter i vand ved pH 8,5.
Substrat Nucleophil (kone.) Udbytte 10 ________ D-argOEt L-leucinamid (0,2 M) argLeuNH2 20% D-argOEt L-Leucinamid (1,0 M) argLeuNH^ 30% D-arg0Et L-Methioninamid (0,5 M) argMetNH2 68% L-ArgOEt D-methioninamid (1,0 M) ArgmetNH2 5% 15 a) 10 um 20 25 30 35
Eksempel 3 20
DK 163435 B
g
Trypsin ) katalyseret syntese af L,L-dipeptidamider med L-aminosyreamider (0,5 M) som nucleophilkomponenter og L-5 Lysin- eller Histidinethylester (50 mM) som substratkomponent i vand ved pH 8,5.
Substrat Nucleophil Produkt Udbytte 10 LysOEt Methioninamid LysMetN^ 81%
LysOEt Tryptophanamid LysTrpNH2 32%
LysOEt Alaninamid LysAlaNH2 5%
HisOEt Methioninamid HisMetN^ 62% 15 a) 10 m 20 25 30 35
DK 163435B
Eksempel 4 21 α-Chymotrypsin a) katalyseret syntese af L,L-dipeptid-amider med L-Tyrosinethylester (50 mM) som substrat-5 komponent og L-aminosyrer som nucleophilkomponenter i vand.
Nucleophil (Kone.) pH Produkt Udbytte 10 Leucinamid (0,2 M) 9,0 TyrLeuNH2 68%
Argininamid (0,4 M) 8,5 TyrArgNH2 90%
Serinamid (0,4 M) 8,5 TyrSerNH2 75% 15 a) 5 m 20 25 30 35
Eksempel 5 22
DK 163435 B
α-Chymotrypsin a) katalyseret syntese af L,D-dipeptid-amider med L-Tyrosinethylester (5 eller 50 mM) som 5 substratkomponent og D-aminosyreamider som nucleophil-komponenter i vand
Nucleophil (Kone.) pH Produkt Udbytte 10 D-leucinamid (0,2 M) 9,0 Tyrleufffl^ 17%b) D-isoleucinamid (0,3 M) 9,0 TyrileN^ 23%15) D-serinamid (0,4 M) 8,5 TyrserN^ 35% 15 3) 5 am k) 5 mM substrat 20 25 30 35
Eksempel 6 23
DK 163435 B
α-Chymotrypsin katalyseret syntese af D,L-dipeptidamider med D-tyrosinethylester (50 mM) som substratkomponent og 5 L-Leucinamicf som nucleophilkomponent i vand ved pH 9,0.
Nucleophil (kone.) Produkt Udbytte0) 10 L-Leucinamid (0,2 M) D,L-tyrLeuNH_ 40%a) ^ u L-Leucinamid (0,3 M) D,L-tyrLeuIM^ 68%°) a) 50 um enzym 15 100 um enzym °) Forlænget reaktionstid - dage 20 25 30 35
Eksempel 7 24
DK 163435 B
a α-Chymotrypsin ) katalyseret syntese af L,L- og L,D-dipeptidamider og -estere med forskellige L-aminosyre-5 estere (50 mM) som substratkomponent og L- eller D-aminosyreestere (0,8 M) eller amider som nucleophil-komponent ved pH 8,5.
10 Substrat Nucleophil Medium Produkt Udbyt- . d.
te ) L-PheOEt L-ArgNH2b) Vand PheArgNH2 82% L-TyrOEt L-SerOEt Vand TyrSerOEt 48%C) 15 L-TyrOBzl L-SerOEt 30% DMF TyrSerOEt 40%C) L-TyrOBzl L-SerOMe 30% DMF TyrSerOMe 39%C) L-TyrOBzl D-serOMe 30% DMF TyrserOMe 21%C) 20 3) 5 (im ) 0,4 M nucleophil c) ved 90% omsætning j ) hydrolyse/diketopiperazin dannet som følge af produktets ustabilitet blev observeret under disse 25 betingelser i mængder på 15-35% og er ikke inkluderet i de rapporterede udbytter.
30 35
Eksempel 8 25
DK 163435 B
Subtilisin A a) katalyseret syntese af sidekaede-beskyttet L-Aspartyl-D-alanylamid med L-Aspartyldiestere (0,1 M) 5 som substratkomponenter og D-alaninamid som nucleophil-komponent ved pH 8,5
Nuchleophil Ud-
Substrat (Kone.) Medium Produkt bytte 10 _ L-Asp(0Et)2 (1,0 M) Vand Asp(0Et)alaNH2 9% L-Asp(OEt)2 (2,0 M) Vand Asp(0Et)alaNH2 24% L**Asp(0Bzl)2b) (0,5 M 30% DMSO Asp(0Bzl )alaNH2 8% L-Asp(OBzl)2b) (1,0 M) 30% DMSO Asp(OBzl)alaNH2 20% 15 _ a) 5 rnn b) 50 mM substrat, 20 urn enzym 20 25 30 35
Eksempel 9 26
DK 163435 B
g
Elastase ) katalyseret syntese af L,L-amider med aminosyrebenzylester (50 mM) som substratkomponent og 5 aminosyreamid (0,5 M) som nucleophilkomponenter i vand ved pH 8,5
Substrat Nucleophil Produkt Udbytte 10 ____ L-ValOBzl L-Argininamid ValArgNH2 59% a) 40 um 15 20 25 30 35
DK 163435B
Eksempel 10 27
Papayathiolendoprotease a) katalyseret syntese af L, L-dipeptidamider med aminosyreestere (50 mM) som substrat-5 komponenter og L-aminosyreamider (0,8 M) som nucleophil-komponenter i vand ved pH 8,5
Enzym Substrat Nucleophil Produkt Udbytte 10 Papain LysOEt AlaNH2 LysAlaNH2 60%
Papain LysOMe AlaNH2 LysAlaNH2 55%
Chymopapain LysOEt AlaNH2 LysAlaNH2 23%
Chymopapain LysOMe AlaNH2 LysAlaNH2 34% 15 a) 100 um, 1 mM EDTA, 10 mM Cystein 20 25 30 35
Eksempel 11 28
DK 163435 B
a
Clostripain ) katalyseret syntese af L,L-dipeptidamider og estere med L-Argininethylester som substratkomponent 5 (50 mM) og ' L-aminosyreamider som nucleophilkomponenter ved pH 8,5
Nucleophil (kone.) Medium Produkt Udbytte 10 L-Methioninamid (0,5 M) Vand ArgMetitt^ 38% L-Phenylalaninamid (0,2 M) 30% EtOH ArgPheNH2 6% L-Phenylalaninamid (0,6 M) 30% DMF ArgPheNH2 65%
15 a) 5 um enzym, 50 mM CaCl2, 10 mM DTT, pH indstillet med TEA
20 25 30 35
Eksempel 12 29
DK 163435 B
Sk
Porcin pancreas-lipase ) katalyseret syntese af L,L-dipeptidamider med L-aminosyreethylestere (50 mM) som 5 substratkomponenter og L-aminosyreamider som nucleophil-komponenter i 30% EtOH ved pH 8,5
Substrat Nucleophil (Kone.) Produkt Udbytte 10 L-TrpOEt L-MetNH2 (1,5 M) TrpMetNH2 71% L-TrpOEt L-MetNH2 (1,0 M) TrpMetNH2 54% L-TyrOEt L-SerNH2 (1,5 M) TyrSerNH2 69% L-MetOEt L-MetNH2b) (1,0 M) MetMetNH2 31%C) 15 a) 500 um D) Omsætning i rent vand c) Ved ufuldstændig omsætning 20 25 30 35
Eksempel 13 30
DK 163435 B
a
Candida cylindracea Lipase ) katalyseret syntese af L,L-dipeptidamider med L-aminosyreethylestere (50 mM) som 5 substratkomponenter og L-aminosyreamider som nucleophil-komponenter i 30% EtOH ved pH 8,5
Substrat Nucleophil (Kone.) Produkt Udbytte 10 L-TrpOEt L-MetNH- (1,5 M) TrpMetNH« 75%b) * Δ b L-TyrOEt L-SerNH2 (1,5 M) TyrSerNH2 50% ) g ) 1000 μπι, forlænget reaktionstid 15 ; Versus hydrolyse ved mindre end 50% omsætning 20 25 30 35
Eksempel 14 31
DK 163435 B
Præparativ syntese af L,L-TryptophanylMethioninamid, TrpMetNH2 5 -
Fremgangsmåde L-Tryptophanethylester hydrochlorid (4,0 g, 15 mmol) og L-Methioninamid hydrochlorid (55,7 g, 330 mmol) opløses i 10 195 ml H20 og 90 ml ethanol. pH indstilles til 8,5 med natriumhydroxid. Reaktionen startes ved tilsætning af 0,8 g rå porcin pancreas-lipase og blev holdt ved pH 8,5 under hele reaktionsforløbet. Resten af substratkomponenten (4,0 g, 15 mmol) tilsættes efter 5 t og reaktionen fort-15 sættes natten over, hvorefter den standses ved indstilling af pH til 3 med HCl-opløsning.
Reaktionsblandingen fortyndes derpå, og ethanol fjernes ved inddampning under reduceret tryk, og blandingen fil-20 treres. Filtratet oprenses ved RP-præparativ HPLC (Waters Prep LC/System 500A) under anvendelse af to kolonner (5.7 x 30 cm) pakket med 60 tun C-18 partikler og 5 mM HCl/ethanol blandinger som eluent.
25 Opsamlede fraktioner indeholdende rent produkt koncentreres under reduceret tryk og frysetørres til slut.
Herved fremkommer 4,78 g L,L-Tryptophanylmethioninamid-hydrochlorid (12,9 mmol, 43%) som et amorft pulver.
30
Identifikation
Produktet blev identificeret som hydrochloridet indeholdende 10,3% chlorid (på vægtbasis).
Aminosyreanalyse påviste fravær af frie aminosyrer men gav følgende resultat efter sut hydrolyse: 35 32
DK 163435 B
Met (1,00)
Trp (1,00) 5 Den specifikke optiske rotation i 50% MeOH, c=0,2 med natrium D-linie blev bestemt til +40,0° ved 20°C.
Renhed 10 HPLC-renhed: 92,4% (Novapak Mm C-18, 0,1 M ammonium- phosphat, pH 3,0/acetonitril, 220 nm).
Vandindhold ifølge Karl Fisher: 5,3% (på vægtbasis).
15 Kvantisering af α-aminogruppen ved reaktion med
Trinitrobenzensulphonsyre og UV-detektion: 75,8% (på vægtbasis).
Peptid-indhold bestemt ved UV-kvantisering: 88,3% (på
20 vægtbasis) (281 nm, Trp-absorbans i MeOH: 0,1 N KOH
(1:1)).
25 30 35
Præparativ syntese af L,D-Tyrosylserinamid, TyrserNl^
Eksempel 15 33
DK 163435 B
5 Fremgangsmåde L-tyrosinethylester-hydrochlorid (2,5 g, 10 mmol) og D-serinamid hydrochlorid (17,5 g, 100 mmol) opløses i 200 ml vand. pH indstilles til 8,5 med natriumhydroxid, og 10 reaktionen startes ved tilsætning af 50 mg a-chymotrypsin og holdes ved pH 8,5 under hele reaktionsforløbet. Efter 30 min. begynder udfældningen af tyrosin. Resten af substratet (5,0 g, 20 mmol) tilsættes i to portioner af 2,5 g i løbet af 1 time. Reaktionsblandingen omrøres i 2 t, 15 hvorefter reaktionen stoppes ved indstilling af pH til 3 med HC1-opløsning.
Den dannede tyrosin frafiltreres, og filtratet oprenses ved RP-præparativ HPLC (Waters Prep LC/System 500A) under 20 anvendelse af to kolonner (5,7 x 30 cm) pakket med 20 uM C-18 partikler og 50 uM eddikesyre som eluent.
Opsamlede fraktioner indeholdende rent produkt koncentreres under reduceret tryk og frysetørres til slut under 25 tilsætning af vandig HC1.
Herved fremkom 2,8 g L,D-Tyrosylserinamid-hydrochlorid (9,2 mmol, 31%) som et amorft pulver.
30
Identifikation
Produktet blev identificeret som hydrochloridet indeholdende 16,0% chlorid (på vægtbasis).
Aminosyreanalyse påviste fravær af frie aminosyrer, men efter sur hydrolyse fremkom følgende resultat: 35 34
DK 163435 B
Ser (1,10)
Tyr (0,90) 5 Den specifikke optiske rotation i 50% MeOH, c=0,3 med natrium D-linie blev bestemt til +58,0° ved 20°C.
Renhed 10 HPLC-renhed: 97,4 (Novapak 4 um C-18, 0,1 M ammonium-phosphat, pH 3,0/acetonitril, 220 nm).
Vandindhold ifølge Karl Fisher: 1,8% (på vægtbasis).
15 Kvantisering af o-aminogruppen ved reaktion med
Trinitrobenzensulfonsyre og UV-detektion: 81% (på vægtbasis) .
20 25 30 35
Præparativ syntese af D,L-tyrosylLeucinamid, tyrLeuN^
Eksempel 16 35
DK 163435 B
5 Fremgangsmåde D-tyrosinethylester-hydrochlorid (3,5 g, 14 mmol) og L-Leucinamid-hydrochlorid (14 g, 84 mmol) opløses i 246 ml 0,1 M KCl-opløsning, og pH indstilles til 9,0 med na-10 triumhydroxid. Reaktionen startes ved tilsætning af 0,7 g α-chymotrypsin og omrøres ved stuetemperatur i to dage. pH holdes konstant på 9,0 under hele reaktionsforløbet. Reaktionen standses ved indstilling af pH til 3 med HC1-opløsning.
15
Den dannede tyrosin frafiltreres, og filtratet oprenses ved RP-præparativ HPLC (Waters Prep LC/System 500A) under anvendelse af to kolonner (5,7 x 30 cm) pakket med 20 uM C-18 partikler og 5 mM som eluent.
20
Opsamlede fraktioner indeholdende rent produkt koncentreres ved inddampning under reduceret tryk og frysetørres til slut.
25 Herved fremkom 2,50 g D,L-tyrosylLeucinamid-hydrochlorid (7,6 mmol, 54%) som et amorft pulver.
Identifikation 30 Produktet blev identificeret som hydrochloridet indeholdende 9,8% chlorid (på vægtbasis).
Aminosyreanalyse påviste fravær af frie aminosyrer, men efter sur hydrolyse fremkom følgende resultat:
Tyr (0,98)
Leu (1,03) 35 36
DK 163435 B
Den specifikke optiske rotation i vand, c=0,l med natrium D-linien blev bestemt til -129,4° ved 20°C.
5 Renhed HPLC-renhed: 92,9% (Novapak 4 um C-18, 0,1 M ammonium- phosphat, pH 3,0/acetonitril, 220 nm).
10 Vandindhold ifølge Karl Fisher: 6,8% (på vægtbasis)
Kvantisering af α-aminogruppen ved omsætning med Trinitrobenzensulphonsure og UV-detektering: 74,9%.
15 UV-kvantisering: 74,9% (tyrosinphenolat-absorbans ved 293 nm i 0,1 M KOH).
20 25 30 35
Eksempel 17
Præparativ syntese af L,L-ArginylMethioninamid, ArgMetN^ 37
DK 163435 B
5 Fremgangsmådé L-Argininethylester-dihydrochlorid (4,1 g, 15 mmol) og L-Methioninamid-hydrochlorid (55,4 g, 300 mmol) opløses i 300 mi vand. pH indstilles til 8,5 med natriumhydroxid.
10 Reaktionen startes ved tilsætning af 50 mg trypsin, og pH holdes konstant på 8,5 under hele reaktionsforløbet. Resten af substratet (8,2 g, 30 mmol) tilsættes i løbet af 1 t. Reaktionen standses derefter ved indstilling af pH til 3 med HC1-opløsning.
15
Reaktionsblandingen fortyndes og oprenses ved gentagen kation-udbytning på en "DOWEX® A650 Wx4" og en CM-Sepharose 6B kolonne under anvendelse af henholdsvis ammoniumacetat- og NaCl/HCl-saltgradienter, og afsaltes til 20 slut.
Opsamlede produktfraktioner indeholdende rent produkt koncentreres ved inddampning og frysetørres til slut.
25 Herved fremkommer der 10,7 g L,L-ArginylMethioninamid di-hydrochlorid (28,3 mmol, 63%) som et hvidt amorft pulver.
Identifikation 30 Der måltes mindre end 0,2% (på vægtbasis) acetat og 22,9% (på vægtbasis) chlorid, d.v.s produktet forefindes som dihydrochlorid.
Arg (1,00)
Aminosyreanalyse påviste fravær af frie aminosyrer, men 35 efter sur hydrolyse fremkom følgende resultat: 38
DK 163435 B
Λ
Met (0,80)
Den specifikke optiske rotation i 50% MeOH, C-0,2 med natrium D-linie blev bestemt til +19,5° ved 20°C.
5
Renhed HPLC-renhed: 95,1% (Novapak C-18, 0,1 M ammoniumphosphat med alkylsulfonat, pH 4,5/acetonitril, 220 nm).
10
Vandindhold ifølge Karl Fisher: 9.1% (på vægtbasis).
Peptidindhold bestemt ved aminosyreanalyse: 72% (på vægtbasis) baseret på Arginin.
15 20 25 30 35 39
DK 163435 B
EKSEMPEL 18
Fremstilling af L,L-methionyl-methioninamid katalyseret o 5 med Eupergit-C immobiliseret porcin pancreatisk lipase ) under anvendelse af L-methioninethylester som substratkomponent og L-methioninamid som nucleophilkomponent i vand og homogene vandige/organiske blandinger ved pH 8,5.
10 Substrat- Nucleo- Organisk opløs- kone. phil % ningsmiddel Udbytte ) 50 mM 1,0 M 0 - 68% 100 mM 0,5 M 30 Isopropanol 26% 15 ------------------------------------------------------- a) Porcin pancreatisk lipase immobiliseredes på Eupergit C efter den af producenten anbefalede procedure til en s lutkoncentration svarende til ca. 400 μπι på gelen 20 ifølge aktivitets assay.
w D) Reaktionsblandinger med volumener på 1-3 reaktions-lejevolumener recirkuleredes over den med enzym gel pakkede kolonne, indtil substratet var fuldstændig 25 omsat ifølge HPLC (0,5-2 d), mens pH holdtes konstant ved hjælp af en pH-stat.
30 35 40
DK 163435 B
EKSEMPEL 19
S
Porcin pancreatisk lipase ) og a-chymotrypsin ) katalyseret syntese af L,L-tryptophanyl-alanin-tert-5 butylester i- rene organiske opløsningsmidler med L- tryptophanethylester (50 mM) som substratkomponent og L-alanin-tert-butylester (0,3 M) som nucleophilkomponent, begge på saltfri from.
10 Enzym a) Opløsningsmiddel Omsætning c) Udbytte c) PPL CH2Cl2/n-Hexan (1:3) 30% 13% CT CH2Cl2/n-Hexan (1:3) 56% 17% 15 PPL ch2c12 7% 10% CT CH2C12 50% 3% PPL b) CH2Cl2/Isooctan (1:1) 82% b) 26% 20 a) 500-2000 urn frysetørret enzymholdig væske tilsattes direkte til blandingen, der omrørtes i 24 h.
) 500 uM enzym, reaktionstid 3 d.
25 C) Omsætning af udgangsmateriale og udbytte versus hydrolyse bestemtes ved HPLC af prøver bratkølet med DMF, inddampet og genopløst i DMF/syre-vand. Kontrolprøver påviste hverken omsætning eller udbytte.
30 35 EKSEMPEL 20 41
DK 163435 B
a α-chymotrypsin ) katalyseret syntese af sidekæde-beskyttede L,L-dipeptidamider med L-tyrosin- eller L-5 phenylalaninfethylestere (50 mM) som substratkomponenter og L-S-acetamidomethylcysteinamid (0,6 M) som nucleophil-komponent i vand ved pH 8,5.
Substrat Produkt Udbytte 10 _ L-TyrOEt TyrCys(-SAcm)NH2 62% L-PheOEt PheCys(-SAcm)NH2 78%
15 3) 5 WM
20 25 30 35 42
DK 163435 B
EKSEMPEL 21 a a-chymotrypsin ) katalyseret syntese af L,L-dipeptidalkoholer under anvendelse af L-tyrosin- og L-5 phenylalaninethylestere (50 mM) som substratkomponenter og L-aminosyrealkoholer (0,5 M) som nucleophilkomponenter i vand ved pH 8,5.
Substrat Nucleophil Produkt Udbytte 10 ________ L-TyrOEt L-MetCH20H TyrMetCH2OH 42% L-TyrOEt L-LeuCH2OH TyrLeuCH2OH 46% L-PheOEt L-MetCH20H PheMetCH2OH 60% 15
a) 10 uM
20 25 30 35 EKSEMPEL 22 43
DK 163435 B
g
Trypsin ) katalyseret syntese af L,L-dipeptidamider med arginin-paranitroanilid (10 mM) som substratkomponent og 5 L-aminosyreamider (0,3 M) som nucleophilkomponenter i 40% DMF ved pH 8,5.
Nucleophil Produkt Udbytte 10
Methioninamid ArgMetNH2 45%
Leucinamid ArgLeuNH2 31%
Tyrosinamid ArgTyrNH2 14% 15
a) 5 uM
b) Bestemt versus hydrolyse via en standard ved mindre end 80% omsætning.
20 25 30 35 44
DK 163435 B
EKSEMPEL 23 a h
Papain ) ) katalyseret syntese af L,L-lysyl-alaninamid under anvendelse af L-lysinethylester (50 mM) som 5 substratkomponent og L-alaninamid (0,8 M) som nucleophil-komponent i vand ved forskellige pH-værdier.
pH Udbytte c) 10 6/5 21% 4,5 47% a) 50 nM, 2 mM EDTA, 10 mM Cystein.
15 ) Forlænget reaktionstid; mindre end 50% omsætning.
c) Bestemt versus hydrolyse under anvendelse af en standard og korrigeret for ufuldstændig omsætning.
20 25 30 35
DK 163435B
EKSEMPEL 24 45 α-chymotrypsin a) og clostripain katalyseret syntese af L,L-dipeptidestere under anvendelse af L-aminosyre-5 ethylestere '(50 mM) som substratkomponenter og L-amino-syreethyl- eller tert-butylestere som nucleophil-komponenter i vand ved pH 7,5 og 8,5.
Enzym Substrat Nucleophil (Kone.) Produkt Udbytte 10 _ CT TrpOEt AlaOtBu (0,8 M) TrpAlaOtBu 12% CT TrpOEt ValOEt (0,8 M) TrpValOEt 18% CL ArgOEt MetOEt (1,0 M) ArgMetOEt 33% c) 15 a) 5 uM, 0,1 M KC1, pH 7,5.
10 uM, 50 mM CaC^, 10 mM DTT, pH 8,5 indstillet med TEA.
20 c) Mindre end 50% omsætning.
25 30 35 EKSEMPEL 25 46
DK 163435 B
fl a
Porcin pancreatisk lipase ) og lipolase (Novo) (LIP) ) i, og Rhizopus arrhizus lipase (RA) °) katalyseret syntese 5 af L, L-methi'onyl-methioninamid under anvendelse af forskellige L-raethioninestere som substratkomponenter og L-methioninamid som nucleophilkomponent i forskellige homogene vandige/organiske opløsningsmiddelblandinger ved pH 8,5 og 1,0 M nucleophilkomponent, medmindre andet er 10 anført.
Ester Organisk Udbyt-
Enzym substrat (Kone.) % opløsningsmiddel te e) 15 PPL C) Ethyl (50 nM) 0 - 55% PPL d) Ethyl (50 mM) 0 - 36% PPL Ethyl (150 mM) 0 - 42% PPL Ethyl (200 mM) 15 Dimethoxyethan 20% PPL Ethyl (150 mM) 30 Isopropanol 36% 20 PPL Ethyl (50 mM) 90 Ethylenglycol 42% PPL n-Propyl (50 mM) 0 - 55% PPL n-Hexyl (50 mM) 0 - 39% LIP Ethyl (50 mM) 0 - 47% LIP Ethyl (50 mM) 15 Dimethoxyethan 35% 25 LIP n-Hexyl (50 mM) 0 - 32% RA Ethyl (50 mM) 30 Ethanol 23%
a) 1000 uM - 2000 nM 30 ^) 50 jiM
°) PH 9,0 d) 0,25 M nucleophil e) Små mængder deamideringsprodukter blev observeret under disse betingelser og er ikke inkluderet i de 35 rapporterede udbytter.
EKSEMPEL 26 47
DK 163435 B
Trichoderma viridae Cellulase katalyseret syntese af L,L-TyrGlyNH2 under anvendelse af L-tyrosinethylester som 5 substratkomp'onent og glycinamid som nucleophilkomponent i vand.
Substrat (Kone.) Nucleophil (Kone.) Produkt Udbytte C) 10
TyrOEt a) (20 mM) GlyNH2 (0,6 M) TyrGlyNH2 23%
TyrOEt b) (10 mM) GlyNH2 (0,8 M) TyrGlyNH2 34% 15 a) 1000 fiM råenzym, pH 8,5 °) 500 μΜ råenzym, pH 8,0 c) Bestemt versus hydrolyse ved mindre end 30% omsætning og korrigeret for hydrolyse og aminolyse påvist i 20 kontrolprøver under lignende betingelser.
25 30 v 35 48
DK 163435 B
EKSEMPEL 27
Serinendoprotease ) katalyseret syntese af o-aminosyreholdige dipeptider under anvendelse af L-5 tyrosinethyléster (25 mM) som substratkomponent og forskellige ω-aminocarboxylsyreestere som nucleophil-komponenter i 30% DMF ved pH 9,5.
Enzym Nucleophil Kone. Produkt Udbytte 10 _
Chymotrypsin Ø-Ala-OEt 1,5 M L-Tyr-ØAlaOEt 4%
Subtilisin 0-Ala-OEt 1,5 M L-Tyr-ÆAlaOEt 7%
Chymotrypsin GABA-OEt b) 1,5 M L-Tyr-GABAOEt 4%
Subtilisin GABA-OEt 1,5 M L-Tyr-GABAOEt 4% 15 _ a) 20 aM.
) GABA = r-aminosmørsyre 20 25 30 35 EKSEMPEL 28 49
DK 163435 B
Præparativ syntese af L,L-Tryptophanylvalin, TyrValOH, via mellemproduktet L,L-Tryptophanylvalinethylester, 5 TyrValOEt
Fremgangsmåde 10 L-Tryptophanethylester-hydrochlorid (8,0 g, 30 mmol) og L-valinethylester-hydrochlorid (65,4 g, 360 mmol) opløses i 300 ml vand, og pH indstilles til 8,5 med natriumhydroxid. Reaktionen startes ved tilsætning af 75 mg α-chymotrypsin, omrøres i 45 min ved stuetemperatur og 15 holdes ved konstant pH-værdi under hele reaktionsfor løbet. Derefter standsedes reaktionen ved indstilling af pH til 3 med HC1-opløsning.
Blandingen filtreres derpå, og filtratet oprenses ved RP-20 præparativ HPLC (Waters Prep LC/System 500A) under anvendelse af to kolonner (5,7 x 30 cm) pakket med 50 um C-18 partikler og elueres med 5 mM HC1 og stigende koncentrationer af alkohol.
25 Opsamlede fraktioner indeholdende rent produkt koncentreres ved inddampning under reduceret tryk og frysetørres til slut.
Herved fremkommer 1,70 g L,L-Tryptophanylvalinethylester-30 hydrochlorid (4,6 mmol, 15%) som et amorft pulver.
Den herved fremkomne dipeptidester genopløses i 20 ml vand, og pH indstilles til 6,5. 2 ml suspension indeholdende 20 mg porcinlever esterase (EC 3.1.1.1) tilsættes 35 derefter, og reaktionen omrøres natten over ved konstant pH-værdi, hvorefter den rene reaktion var fuldstændig, og pH indstilles til 3.
DK 163435 B
50
Blandingen afsaltes under anvendelse af en (2,5 x 25 cm) 15 μπι C-18 RP-HPLC kolonne. Herefter elueres med stigende koncentrationer af alkohol i 50 mM HOAc.
5
Opsamlede fraktioner indeholdende rent produkt koncentreres ved inddampning under reduceret tryk og frysetørres til slut.
10 Herved fremkom 1,28 g L,L-tryptophanylvalin (4,2 mmol, 92%) som et amorft pulver.
TrpValOH - Analyse 15 Identifikation
Produktet havde et acetatindhold på 4,0% (på vægtbasis).
Chlorid påvistes ikke.
20
Aminosyreanalyse påviste fravær af frie aminosyrer, men gav følgende resultat efter sur hydrolyse:
Val (1,00) 25 Trp (1,00)
Den specifikke optiske rotation i 1% HOAc, c=0,01, med natrium D-linie blev bestemt til +26,1° ved 20°C.
30 Renhed
HPLC-renhed: 98,7% (Novapak 4 urn C-18, 0,1 M
ammoniumphosphat, pH 3,0/acetonitril, 220 nm).
35 Vandindhold ifølge Karl Fischer: 5% (på vægtbasis).
UV-kvantisering: 86% (ved 280 nm i 0,1 N KOH).
Claims (13)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af dipeptider og deri-5 vater deraf med den almene formel H-A-B-Y hvor A betyder en eventuelt sidekædebeskyttet L-eller D-10 a-aminocarboxy1syrerest eller -o-aminocarboxylsyrerest, og B betyder en eventuelt sidekædebeskyttet L- eller D-a-aminocarboxylsyrerest eller »-aminocarboxylsyrerest, der kan være den samme eller forskellig fra A, og Y er OH eller en C-terminal blokeringsgruppe valgt blandt estere, 15 amider og N-substituerede amider, idet A dog ikke kan være Asp eller Glu, når B er Phe og Y er alkyl, eller BY kan betyde en aminoalkoholrest B1-CHY1-0H 20 hvori B er et decarboxyderivat af en aminocarboxylsyre som defineret i relation til B, og er H, alkyl, aryl eller aralkyl, eller salte og hydrater deraf, kendetegnet ved, at man omsætter en substratkomponent, 25 der er et aminosyrederivat med formlen R2 i / H-A-OR eller H-A-N \ 3 R0 30 hvori A har den ovenfor nævnte betydning, R1 betyder al- kyl, aryl eller aralkyl eventuelt substitueret med inerte substituenter, eller R1 er et α-des-amino-fragment af en 2 3 22 aminocarboxylsyre, og R og R er ens eller forskellige, og hver betyder hydrogen, alkyl, aryl eller aralkyl even- DK 163435 B 52 tuelt substitueret med inerte substituenter, med en nucleophilkomponent valgt blandt 5 (a) aminosyreamider med formlen R2 / H-B-N \ 3 10 2 hvor B er som defineret ovenfor, og R har den ovenfor 3' 3 nævnte betydning og R har den ovenfor for R angivne betydning, idet dog R , når R betyder hydrogen, også kan betyde hydroxy eller amino, 15 (b) aminosyreestere med formlen H-B-OR4 20 4 hvor B er som defineret ovenfor, og R betyder alkyl, aryl eller aralkyl, og (c) aminoalkoholer med formlen 25 11 H-B-CHY-OH, 1 1 hvor B og Y har ovenfor nævnte betydning ^ i nærvær af et amidase- eller esteraseenzym, forskelligt fra serin- eller thiolcarboxypeptidaser, i opløsning eller dispersion, hvorefter man om ønsket fraspalter en tilstedeværende sidekæde-beskyttelsesgruppe eller en C-terminal beskyttelsesgruppe og/eller om ønsket overfører ^ det opnåede dipeptid i et salt eller hydrat deraf. DK 163435 B 53
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det anvendte enzym er valgt blandt serin- eller thiolendoproteaser, lipaser, esteraser og glycosidaser.
3. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det anvendte enzym er immo-biliseret.
4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, 10 kendetegnet ved, at der anvendes en vandig reaktionsopløsning eller -dispersion indeholdende 0-90%, fortrinsvis 0-60%, af et polært organisk opløsningsmiddel, der er blandbart med vand, og har en pH-værdi på 3-11, fortrinsvis 5-10,5, specielt 6-10, især 7-9,5. 15
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det organiske opløsningsmiddel er valgt blandt alkanoler, dimethylsulfoxid, dimethylformamid, dimethoxy-ethan og ethylenglycol. 20
6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at der anvendes en organisk reaktionsopløsning eller -dispersion indeholdende 0-10% vand.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at der anvendes et upolært organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis valgt blandt dialkylestere, ethylacetat, ethylpropionat, octaner, heptaner og petroleumsether.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at der anvendes en flydende substrat- eller nucleo-philkomponent, der også kan fungere som det organiske opløsningsmiddel.
9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der som substratkomponent anvendes en D- og L-aminocarboxylsyreester valgt blandt DK 163435 B 54 benzylestere og ligekaedede eller forgrenede C^-Cg alkyl-estere eventuelt substitueret med inerte substituenter.
10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, 5 kendetegnet ved, at der som nucleophil-kompo- nent anvendes et aminosyreamid med formlen H-B-NHR3 3 10 hvori R er hydrogen eller C^-Cg alkyl, og B er en L-eller D-a-aminocarboxylsyrerest.
11. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-9, kendetegnet ved, at der som nucleophilkomponent an- 15 vendes en ester med formlen H-B-OR4 4 hvori B er en L- eller D-aminocarboxylsyrerest, og R er 20 Ci-C3 a1*?1·
12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at i det dannede dipeptid tilstedeværende C-terminale beskyttelsesgrupper Y fra- 25 spaltes enzymatisk, enten ved hjælp af det samme enzym, som anvendtes ved dipeptiddannelsen, eller ved hjælp af et enzym med en anden ester- eller amid-specificitet.
13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, 30 kendetegnet ved, at i det dannede dipeptid tilstedeværende sidekæde-beskyttelsesgrupper fraspaltes enzymatisk, fortrinsvis ved hjælp af en esterase eller lipase eller et proteolytisk enzym. 35
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK452188A DK163435C (da) | 1988-08-12 | 1988-08-12 | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf |
| DE68913880T DE68913880T2 (de) | 1988-08-12 | 1989-08-14 | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Dipeptiden. |
| PCT/DK1989/000193 WO1990001555A1 (en) | 1988-08-12 | 1989-08-14 | A process for enzymatic production of dipeptides or structurally related compounds |
| EP89308232A EP0359399B1 (en) | 1988-08-12 | 1989-08-14 | Process for the enzymatic production of dipeptides |
| JP1508952A JPH04501056A (ja) | 1988-08-12 | 1989-08-14 | ジペプチドまたは構造関連化合物の酵素的製造方法 |
| AU40792/89A AU4079289A (en) | 1988-08-12 | 1989-08-14 | A process for enzymatic production of dipeptides or structurally related compounds |
| AT89308232T ATE103003T1 (de) | 1988-08-12 | 1989-08-14 | Verfahren zur enzymatischen herstellung von dipeptiden. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK452188 | 1988-08-12 | ||
| DK452188A DK163435C (da) | 1988-08-12 | 1988-08-12 | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK452188D0 DK452188D0 (da) | 1988-08-12 |
| DK452188A DK452188A (da) | 1990-02-13 |
| DK163435B true DK163435B (da) | 1992-03-02 |
| DK163435C DK163435C (da) | 1992-07-20 |
Family
ID=8134301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK452188A DK163435C (da) | 1988-08-12 | 1988-08-12 | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0359399B1 (da) |
| JP (1) | JPH04501056A (da) |
| AT (1) | ATE103003T1 (da) |
| AU (1) | AU4079289A (da) |
| DE (1) | DE68913880T2 (da) |
| DK (1) | DK163435C (da) |
| WO (1) | WO1990001555A1 (da) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR930002966B1 (ko) * | 1990-11-24 | 1993-04-16 | 주식회사 미 원 | 디펩티드의 제조방법 |
| US5508182A (en) * | 1991-02-13 | 1996-04-16 | Schneider; Manfred P. | Esterification of hydrophilic polyols by adsorption onto a solid support and employing a substrate-immiscible solvent |
| DK53191D0 (da) * | 1991-03-25 | 1991-03-25 | Carlbiotech Ltd As | Organosvovlforbindelse og farmaceutisk praeparat indeholdende en saadan forbindelse |
| WO1995003321A1 (en) * | 1993-07-20 | 1995-02-02 | Bionebraska, Inc. | Method for endomodification of proteins |
| FR2708938B1 (fr) * | 1993-08-09 | 1995-11-03 | Bioeurope | Procédé enzymatique perfectionné de préparation d'oligomères de L-lysine. |
| DE19834308C2 (de) * | 1998-07-30 | 2002-11-07 | Univ Leipzig | Verfahren zur Herstellung von Säureamiden |
| KR100635803B1 (ko) | 2001-07-26 | 2006-10-19 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 펩타이드 생성 효소 유전자, 펩타이드 생성 효소 및디펩타이드의 제조방법 |
| KR20030080439A (ko) * | 2002-04-08 | 2003-10-17 | 새롬시엠에스 주식회사 | 인쇄매체를 이용한 홀로그램 부분 정착, 박리방법 및 그에의해 형성된 플라스틱 필름 |
| WO2004022733A1 (ja) * | 2002-07-26 | 2004-03-18 | Ajinomoto Co., Inc. | ペプチドを生成する新規酵素およびこれを生産する微生物およびこれらを用いるジペプチドの製造方法 |
| KR20070034103A (ko) | 2002-07-26 | 2007-03-27 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 신규 펩타이드 신타제 유전자 |
| WO2004011652A1 (ja) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | トリペプチド以上のペプチドの製造方法 |
| JP2005040037A (ja) * | 2003-07-25 | 2005-02-17 | Ajinomoto Co Inc | ジペプチドの製造方法、それに用いるペプチド生成酵素、およびペプチド生成酵素の製造方法 |
| JP2005168405A (ja) * | 2003-12-11 | 2005-06-30 | Ajinomoto Co Inc | ジペプチドの製造方法 |
| JP5754682B2 (ja) * | 2010-01-27 | 2015-07-29 | 国立大学法人鳥取大学 | Ｄ−，ｌ−ペプチドの立体選択的合成法 |
| WO2013051685A1 (ja) | 2011-10-07 | 2013-04-11 | 味の素株式会社 | 変異型γ－グルタミルトランスフェラーゼ、及び、γ-グルタミルバリルグリシン又はその塩の製造法 |
| CN107936089B (zh) * | 2017-11-07 | 2021-01-29 | 重庆大学 | 一种合成苯丙氨酰-赖氨酸二肽的方法 |
| JPWO2019208700A1 (ja) * | 2018-04-26 | 2021-04-30 | ゼリア新薬工業株式会社 | ジペプチド及びこれを含有する医薬組成物 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RO80806A (ro) * | 1979-04-06 | 1983-02-01 | De Forenede Bryggerier As,Dk | Procedeu pentru obtinerea enzimatica a peptidelor |
| US4506011A (en) * | 1981-09-05 | 1985-03-19 | Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters |
| EP0154472B1 (en) * | 1984-03-07 | 1989-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for the production of l-aspartyl-l-phenylalanine ester |
| NZ217813A (en) * | 1985-10-21 | 1991-01-29 | Grace W R & Co | Dipeptides and process for their preparation using an enzyme coupling agent |
| CA1339674C (en) * | 1986-11-21 | 1998-02-17 | Genencor, Inc. | Enzymatic l-aspartyl-l-phenylalanine alkyl ester production |
| DK72587D0 (da) * | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider |
-
1988
- 1988-08-12 DK DK452188A patent/DK163435C/da not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-08-14 DE DE68913880T patent/DE68913880T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-14 EP EP89308232A patent/EP0359399B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-14 AU AU40792/89A patent/AU4079289A/en not_active Abandoned
- 1989-08-14 WO PCT/DK1989/000193 patent/WO1990001555A1/en unknown
- 1989-08-14 JP JP1508952A patent/JPH04501056A/ja active Pending
- 1989-08-14 AT AT89308232T patent/ATE103003T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68913880T2 (de) | 1994-09-22 |
| AU4079289A (en) | 1990-03-05 |
| DE68913880D1 (de) | 1994-04-21 |
| DK163435C (da) | 1992-07-20 |
| DK452188D0 (da) | 1988-08-12 |
| ATE103003T1 (de) | 1994-04-15 |
| JPH04501056A (ja) | 1992-02-27 |
| EP0359399B1 (en) | 1994-03-16 |
| DK452188A (da) | 1990-02-13 |
| EP0359399A1 (en) | 1990-03-21 |
| WO1990001555A1 (en) | 1990-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI70597B (fi) | Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av peptider | |
| DK163435B (da) | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf | |
| US4543329A (en) | Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins | |
| Lombard et al. | Recent trends in protease-catalyzed peptide synthesis | |
| EP0278787B1 (en) | A process for enzymatic production of dipeptides | |
| EP0640687B1 (en) | Methods of using, storing and transporting metal protease enzyme in a stabilized form | |
| Houng et al. | Kinetic resolution of amino acid esters catalyzed by lipases | |
| CN101027315B (zh) | 用于合成和选择性生物催化修饰肽、肽模拟物和蛋白的方法 | |
| US8883444B2 (en) | Peptide synthesis using enzymatic activation and coupling | |
| Fischer et al. | A novel approach to enzymatic peptide synthesis using highly solubilizing Nα-protecting groups of amino acids | |
| Stepanov et al. | Subtilisin and α-chymotrypsin catalyzed synthesis of peptides containing arginine and lysine p-nitroanilides as c-terminal moieties | |
| Kijima et al. | Facile optical resolution of amino acid esters via hydrolysis by an industrial enzyme in organic solvents | |
| EP0324659B1 (en) | Enzymatic process for producing immunomodulating pentapeptides and intermediates for use in the process | |
| Miyazawa et al. | Utilization of proteases from Aspergillus species for peptide synthesis via the kinetically controlled approach | |
| Krenitsky et al. | An aminoacyltransferase preparation from beef liver | |
| Groeger et al. | Papain‐catalyzed synthesis of dipeptides | |
| DK163365B (da) | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptidderivater | |
| Sugihara et al. | A new type of aminoacyltransferase from Saccharothrix sp. AS-2 favorable for the synthesis of D-amino acid-containing peptides | |
| DK155613B (da) | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af peptider | |
| NO157706B (no) | Fremgangsmÿte for enzymatisk fremstilling av peptider. | |
| CA1177429A (en) | Process for enzymatic production of peptides | |
| Shih et al. | Immobilized Aspergillus Oryzae Protease Catalyzed Formation of Peptide Bonds in Organic Solvent | |
| Tanaka et al. | Enzymatic Preparation of Optically Active Silicon-containing Ami no Acids | |
| JAKUBKE | Leipzig University, Biosciences Division, Department of Biochemistry | |
| Jakubke | Are Proteases Suitable Tools for the Formation of Peptide Bonds? |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |