DE69913557T2 - Enzymatische synthese von peptidomimetika - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die Synthese von Peptidmimetika über enzymvermittelte Kupplung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es wurde gezeigt, dass Peptidmimetika, und insbesondere α-Thiopeptidmimetika, viele Enzyme hemmen, einschließlich Matrix-Metalloproteinasen, die in einem breiten Bereich von entzündlichen Krankheiten eine Rolle spielen, wie rheumatoider und Osteoarthritis, ebenso wie Knochenabbau bei Osteoporose und Stauungsinsuffizienz des Herzens, zum Beispiel wie in WO 96/11209, WO 96/35714 und WO 97/03783 beschrieben. Diese Familie von Enzymen spielt auch eine Rolle bei mindestens drei Aspekten von Krebs, Metastasierung, invasivem Wachstum und Angiogenese. Peptidmimetika, die aus einzelnen Enantiomerbestandteilen aufgebaut sind, können das größte Potential beim Bewirken selektiver Hemmung von Matrix-Metalloproteinasen bieten, und dadurch einen nützlichen therapeutischen Vorteil erzielen.
  • Peptidmimetische Verbindungen können mittels herkömmlicher Bildung von Amidbindungen unter Verwendung von Standard-Kupplungsreagenzien wie 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (J. C. Sheehan et al.; J. Org. Chem., 1961, 26, 2525–2528) oder gemischten Anhydriden zugänglich gemacht werden, aber solche Verfahren mit diesen Kupplungsreagenzien sind teuer, und aktivierte Zwischenprodukte können für Racemisierung anfällig sein, was diastereomere Gemische von Produkten zur Folge hat. Eine alternative Verfahrensweise ist es, ein Enzym zu verwenden, wodurch Racemisierung vermieden wird; wenn überdies eine der Komponenten bei der Reaktion racemisch oder in einem optisch angereicherten, aber nicht reinen Zustand ist, dann kann die Stereospezifität des Enzymes dazu benutzt werden, sowohl die Kupplung wie auch die Aufspaltung dieser Komponente in einem einzigen Schritt zu bewirken. Wenn ein solches Enzym eine gute Stabilität besitzt und in immobilisierter Form erhältlich ist, dann wird enzymatische Peptidbindungsbildung wirtschaftlich interessant, weil das Enzym zurückgewonnen und wiederverwendet werden kann.
  • WO 92/02617 offenbart, dass Enzyme in situ kristallisiert und vernetzt werden können, zum Beispiel mit Glutaraldehyd, um in hohem Maß unlösliche Derivate zu ergeben. Solche Enzyme, bekannt als CLEC's, sind regio- und stereoselektive Katalysatoren hoher Leistung, von denen einige zur Bildung von Peptidbindungen geeignet sind. Sie besitzen eine gegenüber dem nativen Enzym erhöhte Stabilität, speziell bei erhöhten Temperaturen und in der Gegenwart hoher Konzentrationen polarer organischer Lösemittel, Bedingungen, unter denen die nativen Enzyme nicht aktiv sind. Organische Lösemittelgemische sind nützlich für enzymatische Peptidsynthese, weil sie so ausgelegt werden können, dass sie maximale Löslichkeit der Substrate gestatten, jedoch ein geringes Lösevermögen für das Produkt haben, welches während der Biotransformation ausfallen kann, wodurch die Reaktion zur Vollständigkeit vorangetrieben wird.
  • Die Synthese einer Anzahl von sowohl natürliche wie auch nicht natürliche α-Aminosäuren enthaltenden Peptiden ist unter Verwendung beider Enzyme und noch besonderer von CLEC's wie PeptiCLEC-TR beschrieben worden. Siehe Zelinski und Waldmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36: 722–4 (1997); Persichetti et al, J. Am. Chem. Soc. 117: 2732–7 (1995).
  • US-A-5728876 offenbart die Aufspaltung von Aminen durch enzymkatalysierte Acylierung.
  • Yi-Fong et al, J. Org. Chem. 62(11): 3488–95 (1997) offenbaren vernetzte Kristalle von Subtilisin als vielseitig verwendbaren Katalysator für organische Synthesen.
  • Moree et al, JACS 119(17): 3942–7 (1997) offenbaren Subtilisin BNP als Katalysator für die Synthese bestimmter Peptide.
  • US-A-3897480 offenbart, als Zwischenverbindungen bei der Herstellung von N-(Mercaptoacetyl)-aminosäuren, benzoylgeschützte Formen davon.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, dass enzymkatalysierte Kupplung von Verbindungen der Formel (2) und (3) Verbindungen der Formel (I) mit hohem Wirkungsgrad bereitstellt.
  • Figure 00030001
  • Erfindungsgemäß umfasst ein Verfahren zur Herstellung peptidartiger Verbindungen, oder Vorläufern solcher Verbindungen die Biotransformation eines optisch reinen oder racemischen α-substituierten Carbonsäurederivates der Formel (2) mit einem optisch reinen oder racemischen Aminosäurederivat (3) oder einem Analogen davon mit einer freien Aminogruppe. Eine solche Reaktion bildet die Amidbindung und ein neues peptidmimetisches Produkt. Es ist bemerkenswert, dass wenn die α-Stellung in (2) entweder unsubstituiert ist oder zum Beispiel mit Brom substituiert ist, keine Kupplung beobachtet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Enzym in diesem Verfahren Thermolysin, und während das freie Enzym in Lösung verwendet werden kann, um eine einzige Kupplungsreaktion zu bewirken, zeigt die Form des vernetzten Enzymkristalls eine viel größere Stabilität, was seine Zurückgewinnung und Wiederverwendung gestattet. Einfache Abtrennung des Produktes (1) wird ebenfalls erleichtert.
  • Ein bedeutender Vorteil dieses Verfahrens ist, dass beide oder eines der Substrate optisch rein, racemisch oder optisch aktiv sein können. In dem Fall wo eine racemische Komponente bei der Kupplung verwendet wird, kann das nicht umgesetzte Isomer nachfolgend racemisiert und bei der Kupplungsreaktion wiederverwendet werden. Die Verbindung der Formel (2) kann in der Form eines überwiegend einzelnen Enantiomers von 90% oder höher Enantiomerenüberschuss verwendet werden. Alternativ kann sie in racemischer Form oder eine nicht-racemische Mischung von Enantiomeren mit einem Enantiomerenüberschuss von weniger als 90% sein.
  • In den angegebenen Formeln ist A eine Thiol-Schutzgruppe, B, C und D sind jeweils gleiche oder verschiedene organische Gruppen von bis zu 30 C-Atomen, wahlweise an irgendeiner Stellung funktionalisiert, mit der Maßgabe, dass weder ein primäres Amin noch ein primäres Amid vorhanden ist, und X eine Gruppe ist, die durch NH2 ersetzt werden kann. Es ist besonders bevorzugt, dass A Aroyl ist, zum Beispiel Benzoyl, wegen der Stabilität der Schutzgruppe während der Biotransformation; bestimmte Verbindungen der Formeln (1) und (2), wobei A Aroyl ist, können neuartig sein. D ist vorzugsweise CON(R)2, wobei jedes R unabhängig voneinander H oder eine organische Gruppe ist, die R's aber nicht beide H sind. D enthält vorzugsweise auch einen oder mehrere α-Aminosäurereste von (S)-Konfiguration am α-Zentrum.
  • Verbindungen der Formel (2) haben eine freie funktionelle Gruppe X, zum Beispiel wo COX eine Carboxylgruppe umfasst und in der α-Stellung mit Schwefel substituiert ist. Diese Thiolgruppe in der α-Stellung ist vorzugsweise geschützt. Geeignete Schutzgruppen sind Acyl- und Aroylgruppen mit bis zu 20 C-Atomen, zum Beispiel bis zu 10 C-Atomen. Spezielle Beispiele sind Acetyl, Benzoyl oder Benzyloxycarbonyl. Zusätzlich kann die Seitenkette als entweder ein Homo- oder Heterodisulfid geschützt sein, wobei das erstgenannte Beispiel die atomeffizienteste Schutzgruppe ist. Enzymkatalysierte Kupplungen dieser Art mit einer freien Thiolgruppe an dieser oder benachbarten Stellungen sind wegen der Inaktivierung des Enzyms im Allgemeinen sehr ineffizient. Die Gruppe B an der α-Stellung kann unterschiedlich sein, und ist nur durch die innewohnende Spezifizität des Enzyms beschränkt.
  • Verbindungen der Formel (3) haben eine freie Amingruppe. Sie können auch ein Carboxyl an der α-Stellung haben, das geschützt ist, zum Beispiel als ein Methylamid oder in der Form eines Dipeptids, bei dem die zweite Aminosäure mit einer geschützten Carboxylgruppe endet, zum Beispiel als das Methylamid. Die Funktionalität C, α zu dem freien Amin, kann unterschiedlich sein und kann entweder strukturell ähnlich oder die gleiche wie die natürliche Spezifizität für das Enzym sein.
  • Es können verschiedene Enzyme verwendet werden. Beispiele schließen Thermolysin (in welchem Fall X vorzugsweise OH ist) oder Subtilisin ein (in welchem Fall X OR1 sein kann, wobei R1 eine veresternde Gruppe wie eine Kohlenwasserstoffgruppe von bis zu 30 C-Atomen, zum Beispiel C1-6-Alkyl ist). Das Enzym wird vorzugsweise als ein CLEC bereitgestellt.
  • Wie vorstehend angezeigt, ist die Art jedes von B, C und D nicht besonders eingeschränkt, außer vielleicht durch die Enzymspezifizität. Dies wird von einem Fachmann verstanden und kann mittels einem Fachmann bekannter, geeigneter Maßnahmen gehandhabt werden. Jedes kann zum Beispiel aliphatisch, wie Alkyl, oder Aryl, wie Phenyl oder Naphthyl sein, wahlweise substituiert durch eine oder mehrere funktionelle oder nicht-funktionelle Gruppen.
  • In einer typischen Biotransformation werden die Säure- und Aminsubstrate (2) und (3) in einem Lösemittelgemisch gelöst, wie 40% Ethanol in 10 mM Calciumacetat enthaltendem Wasser, und dann wird das Enzym zugesetzt, um die Reaktion in Gang zu setzen. Das heterogene Gemisch wird bei 40–50°C gerührt, und wenn das Produkt gebildet wird, fällt es aus. Alternativ kann ein zweiphasiges System von Ethylacetat und entweder Wasser oder 10 mM Calciumacetat in Wasser verwendet werden. Überraschenderweise wurde gefunden, dass hohe Konzentrationen an Substrat, von > 100 g/l, gut vertragen wurden. Nach Abschluss der Reaktion, wie mittels HPLC beurteilt, kann das Enzym dann mittels Filtration zurückgewonnen, und als viel von seiner Aktivität zur Verwendung in darauftolgenden Zyklen beibehaltend befunden werden.
  • Diese Reaktion kann eine rohe Lösung von Produkt hinterlassen. Wenn die Substrate optisch rein sind, dann kann nach Abdestillieren der Lösemittel, um die Lösung einzuengen, das Produkt ausgefällt und mittels Filtration gewonnen werden. Wenn Aufspaltung und Kupplung gleichzeitig durchgeführt wurden, dann kann als erstes Waschen mit wässriger Säure (wie Salzsäure) oder wässriger Base (wie Natriumbicarbonat) verwendet werden, um das unerwünschte ionische Substrat zu entfernen. Die Produkte von Aufspaltungs-Kupplungs-Reaktionen können sowohl an Enantiomer wie an Diastereomer angereichert sein, typischerweise mit > 95% Isomerenüberschuß und > 95% Diastereomerenüberschuß. Die Thiolschutzgruppe kann, wenn nötig oder gewünscht, mittels den Fachleuten bekannter Verfahren entfernt werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen peptidartigen Synthesen. Das Zurückgewinnen des Enzyms erlaubt größere Wirtschaftlichkeit, und es werden keine optisch reinen Substrate benötigt. Überdies sind die Produkte in stereoisomerer Hinsicht rein, und die Reaktionen verlaufen bei Volumenwirkungsgraden, die größer sind als diejenigen, die für herkömmliche enzymatische Peptidsynthesen erwartet werden. Zusätzlich kann nicht umgewandeltes saures Substrat (2), das an nicht reaktivem Enantiomer angereichert ist, durch Umsetzung mit einem geeigneten basischen oder sauren Reagens racemisiert werden, vorzugsweise in der Gegenwart eines im Wesentlichen wasserfreien organischen Lösemittels. Noch bevorzugter wird eine nicht-nukleophile organische Base wie DABCO verwendet, um die Racemisierung zu bewirken.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
  • Beispiel 1
  • (S)-2-Benzoylsulfanyl-5-(1,3-dioxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)pentansäure (62,6 g, 0,163 mol) und (S)-2-Amino-4-methylpentansäure-(2,2-dimethyl-1-(S)-methylcarbamoylpropyl)amid (40 g, 0,155 mol) wurden in einem zweiphasigen Gemisch von Ethylacetat (480 ml) und Wasser (240 ml) gelöst und zur Gleichgewichtseinstellung 10 Minuten lang gerührt. Für t = 0 wurde eine HPLC-Bezugsprobe entnommen. Das PeptiCLEC-TR-Enzym (40 ml) wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei 45°C gerührt. Es wurden in regelmäßigen Abständen Proben zur HPLC-Analyse entnommen, was zeigte, dass die Reaktion in 2 Stunden abgeschlossen war. Filtration des Enzyms, gefolgt von sauren, dann basischen wässrigen Waschvorgängen, ergab eine Lösung von (S)-2-[(S)-2-Benzoylsulfanyl-5-(1,3-dioxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)pentanylamino]-4-methylpentansäure-(2,2- dimethyl-1(S)-methylcarbamoylpropyl)amid, die dann zur Trockene eingedampft wurde, um das Produkt als einen glasartigen Schaum zu ergeben, 80 g, 83%.
  • Beispiel 2
  • Ethylacetat und Wasser wurden in ein ummanteltes Gefäß geladen und auf ungefähr 45°C erwärmt. Dann wurde (S)-2-Amino-4-methylpentansäure-(2,2-dimethyl-1-(S)-methylcarbamoylpropyl)amid zugesetzt. Das PeptiCLEC-TR wurde geladen, gefolgt von racemischer 2-Benzoylsulfanyl-4-(3,4,4-trimethyl-2,5-dioxoimidazolin-1-yl)buttersäure (2,05 Äquivalente) und die Temperatur bei 43–47°C gehalten. Die Reaktion wurde mittels HPLC überwacht und nach Abschluss wurde das Gemisch filtriert, um das PeptiCLEC-TR zu entfernen, indem mit Wasser und Ethylacetat hindurch gewaschen wurde. Die organische Phase wurde nacheinander mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung und dann mit Wasser gewaschen, um nicht umgesetzte Ausgangsmaterialien, angereichert mit (R)-2-Benzoylsulfanyl-4-(3,4,4-trimethyl-2,5-dioxoimidazolin-1-yl)buttersäure, zu entfernen. Die organische Phase wurde dann mit 2 M HCl und entionisiertem Wasser gewaschen, um Reste des Ausgangs-Dipeptids zu entfernen. Die organische Phase wurde dann durch Destillation eingeengt/azeotrop getrocknet. Das Produkt kristallisiert im Allgemeinen spontan, und die Suspension wurde vor der Isolierung mittels Filtration abgekühlt und altern gelassen. Das (S)-2-[(S)-2-Benzoylsulfanyl-4-(3,4,4-trimethyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)butyrylamino]-4-methylpentansäure-(2,2-dimethyl-1(S)-methylcarbamoylpropyl)amid wurde in einem Vakuum-Trockenschrank bei 50°C zu konstantem Gewicht getrocknet.
  • Um die Ausnutzung der Reaktanden zu verbessern, wurde das (R)-angereicherte α-Benzoylsulfanylsäure-Ausgangsmaterial mittels Extraktion und Racemisierung zurückgeführt.
  • Der Lösung der Ausgangsmaterialien in wässrigem Natriumbicarbonat wurde Isopropylacetat zugesetzt (4 Vol.). Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 36%iger Salzsäure auf 1–2 eingestellt. Das entstandene Gemisch wurde filtriert und mit Isopropylacetat (0,5 Vol.) hindurchgewaschen. Die Schichten wurden getrennt, und die obere organische Schicht wurde mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die entstandene Lösung wurde unter Dean-Stark-Bedingungen am Rückfluss erwärmt, bis kein weiteres Wasser mehr gesammelt wurde. Isopropylacetat (2 Vol.) wurde abdestilliert. Bei diesem Stadium sollte der Prozentsatz an Wasser ≤ 0,1% sein. Der Ansatz wurde abgekühlt und Isopropylacetat (1,5 Vol.) geladen.
  • DABCO (0,1 Äquivalent) wurde geladen. Der Ansatz wurde zum Rückfluss (90°C) erwärmt. Die Racemisierung wurde mittels HPLC überwacht. Die Reaktion dauert typischerweise zwischen vier und fünf Stunden.
  • Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und mit 1 M Salzsäurelösung (2 Vol.), dann mit Wasser (2 Vol.) gewaschen. Die entstandene organische Lösung wurde bei atmosphärischem Druck destilliert, bis 2,5 Vol. gesammelt waren. Toluol (4 Vol.) wurde geladen und die Destillation fortgesetzt, bis weitere 4 Vol. an Lösemittel gesammelt waren. Dann wurde Toluol (2 Vol.) geladen. Das endgültige Volumen sollte ungefähr 5 Volumina in Bezug auf das Säure-Ausgangsmaterial betragen. Der Ansatz wurde auf 75–80°C abgekühlt und mit Säure geimpft. Der Ansatz wurde langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und über Nacht gerührt. Der Ansatz wurde dann in Eis ≥ 1 Stunde lang abgekühlt. Der Ansatz wurde filtriert und mit Toluol gewaschen (1 Vol.), dann unter Vakuum bei 80–75°C auf konstantes Gewicht getrocknet.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1)
    Figure 00090001
    welches das Umsetzen von Verbindungen der Formeln (2) und (3)
    Figure 00090002
    in der Gegenwart eines Enzyms umfasst, wobei A eine Thiol-Schutzgruppe, B, C und D jeweils gleiche oder verschiedene organische Gruppen von bis zu 30 C-Atomen sind, wahlweise an irgendeiner Stellung funktionalisiert, mit der Maßgabe, dass weder ein primäres Amin noch ein primäres Amid vorhanden ist, und X eine Gruppe ist, die durch NH2 ersetzt werden kann.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei A eine Acyl- oder Aroylgruppe von bis zu 20 C-Atomen ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei A Benzoyl ist.
  4. Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Enzym in der Form eines vernetzten Enzymkristalls vorliegt.
  5. Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei D CON(R)2 ist, wobei jedes R unabhängig voneinander H oder eine organische Gruppe ist, die R's aber nicht beide H sind.
  6. Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei D einen oder mehrere Aminosäurereste von (S)-Konfiguration am α-Zentrum einschließt.
  7. Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei X OR1 ist und R1 H oder eine veresternde Funktion von bis zu 30 C-Atomen ist.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei R1 H ist.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Enzym Thermolysin ist.
  10. Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Enzym stereoselektiv ist und die Verbindung der Formel (1) als ein im Wesentlichen einzelnes Stereoisomer gebildet wird.
  11. Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Verbindung der Formel (3) als ein einzelnes Stereoisomer verwendet wird.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Verbindung der Formel (3) als eine Mischung von Stereoisomeren verwendet wird.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Verbindung der Formel (2) in der Form eines überwiegend einzelnen Enantiomers, von 90% Enantiomerenüberschuß oder höher, verwendet wird.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Verbindung der Formel (2) in racemischer Form oder als eine nicht-racemische Mischung von Enantiomeren mit einem Enantiomerenüberschuß von weniger als 90% verwendet wird.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, das zusätzlich das Racemisieren von nicht umgesetzter Verbindung der Formel (2) umfasst.
  16. Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, das zusätzlich das Entfernen der Thiol-Schutzgruppe umfasst.
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