JP2002528091A - ペプチド擬似物の酵素介在性合成 - Google Patents

ペプチド擬似物の酵素介在性合成

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JP2002528091A JP2000578475A JP2000578475A JP2002528091A JP 2002528091 A JP2002528091 A JP 2002528091A JP 2000578475 A JP2000578475 A JP 2000578475A JP 2000578475 A JP2000578475 A JP 2000578475A JP 2002528091 A JP2002528091 A JP 2002528091A
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スティーブン・ジョン・クリフォード・テイラー
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Abstract

(57)【要約】 式(２)および(３)の化合物を酵素の存在下で反応させることから成る、式(１)の化合物の調製法 【化１】 (式中、Ａはチオール保護基であり、Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれ同じか、または異なる３０までのＣ原子の有機基であり、第一アミンも第一アミドも存在しないという条件で、いずれかの位置で任意に官能性を持つ、および、ＸはＮＨ２により置換することができる基である)。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (発明の分野) 本発明は、酵素介在性カップリングによるペプチド擬似物の合成に関する。
【０００２】 (発明の背景) ペプチド擬似物、および詳細にはα-チオペプチド擬似物は、例えばＷＯ-９６
/１１２０９、ＷＯ９６/３５７１４およびＷＯ９７/０３７８３に開示されてい
るように、リューマチおよび骨関節症さらに、骨粗鬆症および鬱血性心不全にお
ける骨の分解のような広範囲の炎症性疾患に関連する、マトリックスメタロプロ
テイナーゼを含む多くの酵素を阻害することが示されている。酵素のこのファミ
リーは、癌の少なくとも３つの側面、転移、浸潤性成長および腫瘍起因性血管形
成にも関連する。単一エナンチオマー成分から構成されるペプチド擬似物は、マ
トリックスメタロプロテイナーゼの効果選択的阻害に最大の可能性を与え、それ
により有用な治療的利点を達成する可能性がある。
【０００３】 ペプチド擬似物は、１-(３-ジメチルアミノプロピル)-３-エチルカルボジイミ
ドヒドロクロライド(J.C.Sheehan et al.; J.Org.Chem., 1961,26,2525-2528)ま
たは混合無水物のような常套のカップリング試薬を用いる常套のアミド結合形成
により入手することができるが、これらのカップリング試薬を用いたこのような
方法は値が張り、活性化された中間体はラセミ化を受けやすい可能性があり、生
成物のジアステレオマー混合物を生じる。これとは別の方法は、ラセミ化を回避
する酵素を用いることであり、さらに、反応において成分の一つがラセミ体であ
るか、光学的に濃縮されているが光学的に純粋な状態ではない場合、酵素の立体
選択性を活用して、一回のステップでその成分のカップリングおよび分割の両方
をもたらすことができる。そのような酵素が良好な安定性を有し、固定形態で利
用できる場合、酵素を回収し、再利用することができるため、酵素のペプチド結
合形成が経済的に魅力的なものとなる。
【０００４】 ＷＯ９２/０２６１７は、酵素を結晶化し、インサイチュで例えばグルタルア
ルデヒドと架橋結合して高度に不溶性の誘導体を得ることができることを開示す
る。ＣＬＥＣｓとして知られるそのような酵素は高いパフォーマンスの部位およ
び構造選択的触媒であり、そのいくらかはペプチド結合の形成に適している。そ
れらは天然の酵素に比べて、特に高温にておよび高濃度の極性有機溶媒の存在下
で、天然の酵素が活性化しない条件で、増大した安定度を有する。有機溶媒混合
物は、基質を最大限溶解するが生成物の溶解性は低くなるように設計して、バイ
オトランスフォーメーション中に生成物を沈殿させて反応を完結させることがで
きるので、酵素ペプチドの合成に有用である。
【０００５】 天然および非天然α-アミノ酸両方を含む多くのペプチドの合成が、酵素およ
びより詳細にはＰｅｐｔｉＣＬＥＣ-ＴＲのようなＣＬＥＣの酵素の両方を用い
て開示されている。Zelinski and Waldmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36:
722-4(1997); Persichetti et al., J.Am.Chem.Soc. 117:2732-7(1995)を参照
されたい。 ＵＳ-Ａ-５７２８８７６は、酵素触媒性アシル化によるアミンの分割を開示す
る。 Yi-Fong et al, J. Org. Chem. 62(11):3488-95(1997)は、有機合成の多用途
触媒としてのサブチリシンの架橋結合結晶を開示する。 Moree et al, JACS 119(17):3942-7(1997)は、ある種のペプチドの合成のため
の触媒としてのサブチリシンＢＰＮを開示する。 ＵＳ-Ａ-３８９７４８０は、Ｎ-(メルカプトアセチル)アミノ酸の調製におけ
る中間体として、そのベンゾイル保護形態を開示する。
【０００６】 (発明の概要) 本発明は、式(２)および(３)の化合物の酵素触媒性カップリングにより高い効
率で式(１)の化合物が提供されるという驚くべき発見に基づく。
【０００７】
【化３】
【０００８】 本発明に従い、ペプチド様化合物または該化合物のプレカーサーを得るための
方法は、光学的に純粋な、またはラセミ体のアミノ酸誘導体(３)または、遊離ア
ミン基を有する類似体を用いる、光学的に純粋なまたはラセミ体の式(２)のα-
置換カルボン酸誘導体のバイオトランスフォーメーションを含む。そのような反
応によりアミド結合および新規なペプチド擬似生成物が形成される。(２)のα位
がどちらも置換されていない場合、または例えば臭素と置換されている場合、カ
ップリングが全く観察されないことは注目に値する。 本発明の好ましい態様において、この方法における酵素はサーモリシンであり
、遊離酵素は一回のカップリング反応のために溶液中で用いることができる一方
で、架橋酵素結晶形態はより大きな安定度を示し、その回収と再利用が可能であ
る。生成物(１)の容易な分離も促進される。
【０００９】 この方法の明らかな利点は、基質の両方またはその一つが光学的に純粋であっ
ても、ラセミ体であっても、または光学的に活性であってもよいことである。ラ
セミ体の成分をカップリングに利用する場合、未反応の異性体を続いてラセミ化
し、カップリング反応に再利用することができる。 前記の式において、Ａはチオール保護基であり、Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれ同
じか異なっていてもよい３０までのＣ原子の有機基であり、いずれかの位置で(
第一アミンも第一アミド基も存在しないという条件で)任意に官能基を有し、お
よび、ＸはＮＨ２により置換することができる基である。バイオトランスフォー
メーション中の保護基の安定化のためにＡはアロイル、例えばベンゾイルである
ことが特に好ましく、Ａがアロイルである式(１)および(２)の所定の化合物は新
規であり、本発明の更なる側面を示す。
【００１０】 (発明の記載) 式(２)の化合物は遊離官能基Ｘ(例えばＣＯＸはカルボキシル基を含む)を有し
、α位が硫黄で置換される。α位のこのチオール基は好ましくは保護する。適当
な保護基は２０までのＣ原子のアシルおよびアロイル基である。特定の例として
は、アセチル、ベンゾイルまたはベンゾイルオキシカルボニルである。さらに、
側鎖はホモまたはヘテロジスルフィドで保護されていてもよく、前者の例はほと
んどの原子に有効な保護基である。遊離チオール基との、この位置または隣接位
置でのこの性質の酵素触媒性カップリングは一般に、酵素の不活性化のために非
常に効率が悪い。α位置での基Ｂは様々なものであり得、酵素固有の特異性によ
ってのみ制限される。
【００１１】 式(３)の化合物は遊離アミン基を有する。それらはまた、α位置に、メチルア
ミドとしてまたはジペプチドの形態で保護されているカルボキシル基を有してい
てもよく、ここで、該第二アミノ酸は例えばメチルアミドとして保護されたカル
ボキシル基で終結する。遊離アミンに対してα位の官能基Ｃは様々なものであり
得、酵素の天然特異性と構造上類似しているか、同一であってもよい。 様々な酵素を用いることができる。例としては、サーモリシン(この場合、Ｘ
は好ましくはＯＨである)またはサブチリシン(この場合、ＸはＯＲ１であっても
よく、Ｒ１は３０までのＣ元素の炭化水素、例えばＣ１-６アルキルのようない
ずれかのエステル化基である)が含まれる。該酵素は好ましくはＣＬＥＣとして
提供される。
【００１２】 前に示したように、Ｂ、ＣおよびＤのそれぞれの性質は、おそらく酵素の特異
性による以外は特に制限されない。これは、当業者に公知の適当な基準により扱
うことができる。それぞれは１またはそれ以上の官能基または非官能基により任
意に置換された、例えばアルキルのような脂肪族基または、フェニルまたはナフ
チルのようなアリール基であってもよい。
【００１３】 典型的なバイオトランスフォーメーションでは、酸およびアミン基質(２)およ
び(３)を１０ｍＭの酢酸カルシウムを含む４０％のエタノール水溶液のような溶
媒混合物中に溶解し、次いで酵素を添加して反応を開始させる。異成分から成る
混合液を４０-５０℃にて攪拌し、生成物が生じると、それは沈殿する。これと
は別に、酢酸エチルと水または１０ｍＭの酢酸カルシウム水溶液のいずれかとの
二相系を用いることができる。驚くべきことに、＞１００ｇ/ｌの高基質濃度が
良好に耐性であることが示された。ＨＰＬＣにより判定される反応の完了に際し
、酵素を次いで濾過により回収し、および、酵素が次のサイクルにおける使用の
ためにその活性のほとんどを維持することを認めることができる。
【００１４】 この反応により粗生成物溶液が残る。基質が光学的に純粋である場合、溶液を
濃縮するために溶媒を蒸留した後、生成物が沈殿し、濾過により回収することが
できる。分割とカップリングを同時に行った場合、酸性水溶液(塩酸のような)ま
たは塩基性水溶液(重炭酸ナトリウムのような)による洗浄を最初に用いて、望ま
しくないイオン物質を除去することができる。分割-カップリング反応からの生
成物は、典型的には＞９５％ｅｅおよび＞９５％ｄｅでエナンチオマー的にもジ
アステレオマー的にも濃縮することができる。必要な場合または所望により、チ
オール保護基は当業者に公知の方法により除去することができる。
【００１５】 本発明による方法は、常套のペプチド様合成に対していくつかの利点を有する
。酵素を再利用することは非常に経済的であり、光学的に純粋な基質は必要とさ
れない。さらに、生成物は立体異性体的に純粋であり、反応は常套の酵素ペプチ
ド合成に関して期待されるものよりも大きな量産効率で進行する。加えて、非反
応性のエナンチオマーに富む未変換酸基質(２)は、好ましくは本質的に無水の有
機溶媒の存在下で適当な塩基性または酸性試薬を用いた反応によりラセミ化する
ことができる。より好ましくは、ＤＡＢＣＯのような非求核有機塩基を有効なラ
セミ化のために用いる。
【００１６】 次の実施例により本発明を説明する。実施例１ (Ｓ)-２-ベンゾイルスルファニル-５-(１,３-ジオキソ-１,３-ジヒドロイソイ
ンドール-２-イル)吉草酸(６２.６ｇ、０.１６３ｍｏｌ)および(Ｓ)-２-アミノ-
４-メチル吉草酸(２,２-ジメチル-１-(Ｓ)-メチルカルバモイルプロピル)アミド
(４０ｇ、０.１５５ｍｏｌ)を酢酸エチル(４８０ｍＬ)と水(２４０ｍＬ)の二相
混合液に４５℃にて溶解し、平衡化させるために１０分間攪拌した。ＨＰＬＣ基
準サンプルをｔ＝０に関して取った。ＰｅｐｔｉＣＬＥＣ-ＴＲ酵素(４０ｍＬ)
を反応液に添加し、反応液を４５℃にて攪拌する。サンプルをＨＰＬＣ分析のた
めに規則的な間隔で取り、これにより反応が２時間以内に完了することが示され
る。酵素の濾過の後、酸性、次いで塩基性水溶液による洗浄を行い、(Ｓ)-２-[(
Ｓ)-２-ベンゾイルスルファニル-５-(１,３-ジオキソ-１,３-ジヒドロイソイン
ドール-２-イル)ペンタニルアミノ]-４-メチル吉草酸(２,２-ジメチル-１(Ｓ)-
メチルカルバモイルプロピル)アミドの溶液を得、これを次いで乾燥状態まで蒸
発させて、生成物をガラス質の泡８０ｇ、８３％として得た。
【００１７】実施例２ 酢酸エチルと水をジャケット付き容器に充填し、約４５℃まで加熱した。(Ｓ)
-２-アミノ-４-メチル吉草酸(２,２-ジメチル-１-(Ｓ)-メチルカルバモイルプロ
ピル)アミドを次いで添加する。ＰｅｐｔｉＣＬＥＣ-ＴＲを加え、続いてラセミ
体の２-ベンゾイルスルファニル-４-(３,４,４-トリメチル-２,５-ジオキソイミ
ダゾリン-１-イル)酪酸(２.０５ｅｑ)を加え、温度を４３-４７℃に維持する。
反応をＨＰＬＣによりモニターし、完了後、混合液を濾過してＰｅｐｔｉＣＬＥ
Ｃ-ＴＲを除去し、水および酢酸エチルで洗浄する。有機相を炭酸水素ナトリウ
ム溶液および次いで水で連続洗浄し、(Ｒ)-２-ベンゾイルスルファニル-４-(３,
４,４-トリメチル-２,５-ジオキソイミダゾリン-１-イル)酪酸に富む未反応出発
物質を除去する。有機相を次いで２ＭのＨＣｌで洗浄し、出発ジペプチドの残り
を除去し、および、脱イオン水で洗浄する。有機相を次いで蒸留により濃縮/共
沸乾燥する。生成物は一般に自発的に結晶化し、濾過による単離の前に懸濁液を
冷却および熟成させる。(Ｓ)-２-[(Ｓ)-２-ベンゾイルスルファニル-４-(３,４,
４-トリメチル-２,５-ジオキソイミダゾリジン-１-イル)ブチリルアミノ]-４-メ
チル吉草酸(２,２-ジメチル-１(Ｓ)-メチルカルバモイルプロピル)アミドを真空
オーブン中で５０℃にて一定重量まで乾燥させる。 反応物の利用化を向上させるために、(Ｒ)-に富むα-ベンゾイルスルファニル
酸出発物質を、抽出およびラセミ化により再利用する。
【００１８】 出発物質の重炭酸ナトリウム水溶液にイソプロピルアセテート(４ｖｏｌ)を添
加する。ｐＨを１-２に、塩酸３６％を用いて調整する。生じた混合液を濾過し
、イソプロピルアセテート(０.５ｖｏｌ)で洗浄する。相を分離し、上の有機相
を脱イオン水で洗浄する。生じた溶液を加熱して、さらに水が収集されなくなる
までＤｅａｎ Ｓｔａｒｋ条件下で還流する。イソプロピルアセテート(２ｖｏ
ｌ)を蒸留する。この段階で、水の割合は＜０.１％であるべきである。バッチを
冷却し、イソプロピルアセテート(１.５ｖｏｌ)を加える。 ＤＡＢＣＯ(０.１ｅｑｕｉｖ.)を加える。バッチを加熱して還流する(９０℃)
。ラセミ化をＨＰＬＣによりモニターする。反応は典型的には４から５時間かか
る。
【００１９】 反応混合液を冷却し、１Ｍの塩酸溶液(２ｖｏｌ)で洗浄し、次いで水(２ｖｏ
ｌ)で洗浄する。生じた有機溶液を、２.５ｖｏｌが収集されるまで大気圧で蒸留
する。トルエン(４ｖｏｌ)を加え、さらに４ｖｏｌの溶媒が収集されるまで蒸留
を続ける。トルエン(２ｖｏｌ)を加える。最終体積は酸出発物質に対しておよそ
５容量であるべきである。バッチを７５-８０℃まで冷却し、酸を加える。バッ
チをゆっくりと室温まで冷却し、一晩攪拌する。バッチを次いで１時間以上氷中
で冷却する。バッチを濾過し、トルエン(１ｖｏｌ)で洗浄し、次いで真空下で一
定重量まで８０-７５℃にて乾燥させる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スティーブン・ジョン・クリフォード・テ イラー イギリス、シービー４・０ダブリュージ ー、ケンブリッジ、ミルトン・ロード、ケ ンブリッジ・サイエンス・パーク、カイロ テック・テクノロジー・リミテッド (72)発明者 ピーター・デイビッド・ティフィン イギリス、エスジー８・５ワイアール、ハ ートフォードシャー、ロイストン、バシン グボーン、フォーチュン・ウェイ21番 Ｆターム(参考） 4B064 AE02 CA21 CB24 CB30 CD27 CE08 CE16 DA01 DA08

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式(１) 【化１】 の化合物の調製のための方法であって、式(２)および(３) 【化２】 の化合物を酵素の存在下で反応させることから成る方法(式中、Ａはチオール保
    護基であり、Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれ同じか、または異なる３０までのＣ原子
    の有機基であり、第一アミンも第一アミドも存在しないという条件で、いずれか
    の位置で任意に官能基を持つ、および、ＸはＮＨ２により置換することができる
    基である)。
  2. 【請求項２】 Ａが１０までのＣ原子のアシルまたはアロイル基である請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 Ａがベンゾイルである請求項１または請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 酵素が架橋結合した酵素結晶の形態である前記請求項いずれ
    か一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ＤがＣＯＮ(Ｒ)２(式中、各Ｒは独立にＨまたは有機基であ
    るが、両方のＲがＨではない)である前記請求項いずれか一項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 Ｄがα中心に１またはそれ以上の(Ｓ)配置のα-アミノ酸残
    基を結合している前記請求項いずれか一項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 ＸがＯＲ１であり、Ｒ１がＨまたは、３０までのＣ原子のエ
    ステル基である前記請求項いずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 Ｒ１がＨである請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 酵素がサーモリシンである請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 酵素が立体選択的であり、式(１)の化合物が、実質的に単
    一の立体異性体として形成される前記請求項いずれか一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 式(３)の化合物が単一の立体異性体として用いられる請求
    項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 式(３)の化合物を、立体異性体の混合物として用いる請求
    項１０記載の方法。
  13. 【請求項１３】 式(２)の化合物を、９０％ｅｅまたはそれ以上の、ほぼ単
    一のエナンチオマーの形態で用いる請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】 式(２)の化合物をラセミ体で、または９０％ｅｅ未満のエ
    ナンチオマーの非ラセミ体混合物として用いる請求項１０〜１２のいずれか一項
    に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 さらに、式(２)の未反応化合物をラセミ化することを含む
    請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 さらに、チオール保護基を除去することを含む前記請求項
    いずれか一項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 Ａが２０までのＣ原子のアロイルである請求項１に定義す
    る式(１)または(２)の化合物。
  18. 【請求項１８】 Ｘが請求項７または請求項８に定義されるものである請求
    項１７記載の化合物。
  19. 【請求項１９】 式(１)の請求項１８記載の化合物。
  20. 【請求項２０】 式(２)の請求項１８記載の化合物。
  21. 【請求項２１】 Ｄが請求項５または請求項６に定義されるものである式(
    １)の請求項１７または請求項１８記載の化合物。
  22. 【請求項２２】 Ａがベンゾイルである請求項１７から２１のいずれか一項
    に記載の化合物。
JP2000578475A 1998-10-23 1999-10-20 ペプチド擬似物の酵素介在性合成 Pending JP2002528091A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

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