DE3013701C2

DE3013701C2 -

Info

Publication number: DE3013701C2
Application number: DE3013701A
Authority: DE
Inventors: Masashige Kubo; Yuji Shin-Nanyo Yamaguchi Jp Nonaka; Keiichi Tokuyama Yamaguchi Jp Kihara
Original assignee: Ajinomoto Co Inc; Sagami Chemical Research Institute; Toyo Soda Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Sagami Chemical Research Center Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1979-04-10
Filing date: 1980-04-10
Publication date: 1989-06-01
Also published as: FR2453845A1; GB2047711B; JPS55136257A; GB2047711A; CH643531A5; US4309341A; CA1148943A; DE3013701A1; FR2453845B1; JPS6049199B2

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von reinen α-L- Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern gemäß Oberbegriff des Hauptan spruches.

Die α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester und insbesondere der α-L- Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (auch als-α-APM bezeichnet) besitzen eine starke, saccaroseartige Süßkraft und sind daher als neuartige Süßstoffe von Interesse.

Bislang wurde eine Vielzahl von Verfahren zur Synthes von α-Aspartyl-L- phenylalanin-niedrigalkylestern vorgeschlagen, wie beispielsweise die Methode der Herstellung dieser Verbindungen durch direktes Verknüpfen von L-Phenyl alanin-methylester mit einem Additionssalz von Asparaginsäureanhydrid mit einer starken Säure. Dieses Verfahren liefert jedoch unvermeidbar Nebenpro dukte, wie einen Tripeptidester, der durch das Kuppeln des als Produkt anfallen den α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters mit einem weiteren Mole kül der Asparaginsäure gebildet wird, ein Tripeptid, das durch Hydrolyse einer Estergruppe aus dem Tripeptidester gebildet wird, α-L-Aspartyl-L-phenylalanin (auch als α-AP bezeichnet), das durch Hydrolyse des α-L-Aspartyl-L-phenylala nin-niedrigalkylesters gebildet wird, und ein Diketopiperazinderivat (auch als DKP bezeichnet), insbesondere 3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin, das durch Ringbildung aus dem α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester erzeugt wird.

Es ist weiterhin bekannt, die α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester dadurch herzustellen, daß man eine N-geschützte L-Asparaginsäure und einen L- Phenylalanin-niedrigalkylester mit Hilfe eines Enzyms kondensiert und dann die Schutzgruppe abspaltet. Diese Methode führt in einem geringeren Ausmaß zur Bildung von Nebenprodukten. Jedoch ist es selbst bei Anwendung dieser Verfah rensweise kaum möglich, die Bildung von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin und der oben angesprochenen Diketopiperazinderivate weitgehend auszuschließen.

Mögliche Methoden zur Abtrennung und Reinigung der α-L-Aspartyl-L-phenyl alanin-niedrigalkylester könnten darin bestehen, diese Verbindungen durch ein Kristallisationsverfahren zu reinigen. In diesem Fall neigen jedoch die angespro chenen Nebenprodukte wegen ihrer ähnlichen chemischen Struktur mit den α-L- Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern dazu, Mischkirstalle zu bilden. Somit ist es auch mit dieser Verfahrensweise kaum möglich, diese Nebenproduk te zu entfernen.

Bei einer weiteren bekannten Verfahrensweise zur Abtrennung dieser Nebenpro dukte wird ein Anionenaustauscherharz eines spezifischen Typs verwendet. Diese Verfahrensweise ist in der JP-OS 35 660/1977 beschrieben. Nach dieser Verfahrensweise werden die angesproche nen Nebenprodukte in einem wäßrigen Lösungsmittel mit einem Anionen austauscherharz in der Acetat- oder Formiat-Form in Kontakt gebracht, um diese Verunreinigungen durch Adsorption selektiv zu entfernen.

Es ist angegeben, daß es nicht möglich ist, die gewünschte Reinigungswirkung zu erreichen, wenn man ein Anionenaustauscherharz in einer anderen Form als der organischen Säuren verwendet, da sonst die Verunreinigungen des Dipeptid estermaterials, das heißt eines α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkyl esters, zunehmen würden.

Aus der US-PS 38 33 554 ist ein Verfahren zur Reinigung von α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-niedrigalkylestern bekannt, gemäß dem Peptidverunreinigungen durch Adsorption an einem Anionenaustauscher in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und einem inerten, wasserlöslichen organischen Lösungsmittel ent fernt werden. Dabei ist angegeben, daß die stark basigen Anionenaustauscher in schwacher organischer Säureform die einzigen Ionenaustauscherharze sind, welche die Entfernung der chemisch nahe verwandten Verunreinigungen von den relativ instabilen Dipeptidestern ermöglichen, ohne daß die gewünschten Pro dukte angegriffen werden.

Aus Bull. Chem. Soc. Japan 50 (1977) 2413-2416 sind Untersuchungen über die Ab trennung von Aminosäuren und ähnlichen Verbindungen von L-Aspartyl-L- phenylalaninmethylestern und verwandten Dipeptidestern durch Ionen austausch-Chromatographie bekannt. Dabei werden als Ionenaustauscher ledig lich Kationenaustauscherharze eingesetzt.

Es besteht nun aber nach wie vor ein Bedürfnis zur Schaffung eines Verfahren zur Reinigung von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern unter Verwen dung eines Anionenaustauscherharzes.

Es wurde nunmehr gefunden daß man die α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-nied rigalkylester in wirksamer Weise mit Hilfe eines Anionenaustauscherharzes in der Cl-Form reinigen kann, was angesichts der Tatsache als überraschend anzusehen ist, daß dies außer mit einem Anionen austauscherharz in Form eines Additionsproduktes mit einer schwachen organi schen Säure als unmöglich angesehen wurde.

Gegenstand der Erfindung ist daher das Verfahren gemäß Hauptanspruch. Die Unteransprüche betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen dieser Ver fahrensweise.

Erfindungsgemäß kann die Reinigung in wirksamster Weise unter Einsatz eines rohen α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-niedrigalkylesters erreicht werden, der mit Hilfe der oben angesprochenen Methode, bei der ein Enzym verwendet wird, hergestellt worden ist.

Im Gegensatz zu den α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- niedrigalkylestern, die mit Hilfe der oben angespro chenen chemischen Herstellungsweisen gebildet wor den sind, enthalten die α-L-Aspartyl-L-phenyl alanin-niedrigalkylester, die mit Hilfe der enzyma tischen Verfahrensweise synthetisiert worden sind, als Hauptverunreinigungen α-L-Aspartyl-L-phenyl alanin und Diketopiperainderivate und nur geringe Mengen anderer Verunreinigungen, die auf die Ausgangs materialien zurückgehen. Daher ist es für die in die ser Weise hergestellten α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- niedrigalkylester besonders wesentlich, α-L-Aspartyl- L-phenylalanin und die Diketopiperazinderivate zu entfernen.

Wenn man einen α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrig alkylester, der α-L-Aspartyl-L-phenylalanin und ein Diketopiperazinderivat enthält, mit einem Anionenaustauscherharz in der Cl-Form in einem wäßrigen Lösungsmittel mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfah rensweise in Kontakt bringt, wird der α-L-Aspartyl- L-phenylalanin-niedrigalkylester von dem Harz über haupt nicht adsorbiert, während die Verunreinigungen α-L-Aspartyl-L-phenylalanin und das Diketopiperazin derivat von dem Harz adsorbiert werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man als Harz irgendein Anionenaustauscherharz in der Cl-Form verwen den. Es ist jedoch bevorzugt, ein stark basisches Anionenaustauscherharz einzusetzen.

Als wäßriges Lösungsmittel verwendet man bei dem er findungsgemäßen Verfahren Wasser oder eine Mischung aus Wasser und einem inerten organischen Lösungsmit tel, das in Wasser löslich ist, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Aceton, Methyläthylketon, Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthylenglykol oder Dimethylformamid.

Der Kontakt des Anionenaustauscherharzes mit der die Verunreinigungen enthaltenden Lösung des α-L-Aspartyl- L-phenylalanin-niedrigalkylesters kann in irgendeiner Weise erfolgen. Beispielsweise führt man die Lösung durch eine mit dem Harz gefüllte Säule oder bringt die Lösung und das Harz in einem Gefäß unter Rühren oder unter Bewegen miteinander in Kontakt.

Die Temperatur zum Zeitpunkt des Kon takts beeinflußt die Adsorption der Verunreinigungen nicht wesentlich. Jedoch stellt die Anwendung erhöhter Temperaturen ein Problem im Hinblick auf die Stabilität der α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester dar. Demzufolge liegt die Temperatur vorzugsweise in einem Bereich von 0 bis 70°C.

Die Rückgewinnung des gereinigten α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-niedrigalkylesters aus der mit dem Anionenaustauscherharz in der Cl-Form behandelten wäßri gen Lösung kann in üblicher Weise erfolgen, beispiels weise durch eine normale Kristallisation. Wenn man eine Lösung des α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- niedrigalkylesters mit relativ niedriger Konzentra tion behandelt, gewinnt man den α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-niedrigalkylester beispielsweise durch Einengen und Abkühlen der Lösung. Wenn man eine relativ konzentrierte Lösung bei erhöhter Temperatur behandelt, kann man den a-L-Aspartyl-L-phenylalanin- niedrigalkylester durch einfaches Abkühlen der Lösung gewinnen.

Bei der Anwendung der oben angesprochenen Verfahrens weie, bei der ein Anionenaustauscherharz in Form eines Salzes mit einer schwachen organischen Säure eingesetzt wird, macht es der niedrige Dissoziations grad der schwachen organischen Säure erforderlich, eine große Menge der schwachen organischen Säure oder ihres Salzes in hoher Konzentration einzusetzen, wenn die adsorbierten Verunreinigungen von dem Harz desorbiert werden sollen, um dieses wiederverwenden zu können. Zur Vermeidung dieser Nachteile ist es erforderlich, das Anionenaustauscherharz zunächst in die OH-Form zu überführen und dann wieder in das Salz der schwachen organischen Säure umzuwandeln.

Wenn man jedoch erfindungsgemäß das Anionenaustauscher harz in der Cl-Form verwendet, kann man dieses ohne weiteres mit Hilfe einer Chloridionen enthaltenden Lösung, wie einer Chlorwasserstoffsäurelösung oder einer Salzlösung, regenerieren.

Weiterhin werden bei Anwendung der erstgenannten Methode organische Säureionen, die eine größere Affinität für den α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- niedrigalkylester besitzen, durch Ionenaustausch in die Lösung des behandelten α-L-Aspartyl-L-phenyl alanin-niedrigalkylesters eingeführt. Im Gegensatz dazu werden bei der erfindungsgemäßen Verfahrens weise lediglich Chloridionen in die behandelte Lösung eingebracht, die ohne weiteres durch Kristal lisation abgetrennt werden können, so daß die Gewinnung des α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- niedrigalkylesters ohne weiteres möglich ist.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfah rens ist darin zu sehen, daß die Abwässer leichter beseitigt werden können, da diese keine organischen Säuren oder Salze davon enthalten.

Wie aus den obigen Ausführungen ohne weiteres hervor geht, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren in einfacher Weise die selektive Entfernung von Verun reinigungen, insbesondere der oben angesprochenen Diketopiperazinderivate und von a-L-Aspartyl-L- phenylalanin aus diese Verunreinigungen enthaltenden α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläute rung der Erfindung.

Die in den nachfolgenden Beispielen angegebenen Analysenwerte wurden durch Hochgeschwindigkeits- Flüssigkeits-Chromatographie ermittelt, die unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurde:

Vorrichtung:
Für α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester:
Säule mit einem Innendurchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 20 cm, die mit einem Chromatographiegel (TSK-Gel LS-170) mit einer Korngröße von 5 µm gefüllt ist;
für α-L-Aspartyl-L-phenylalanin und die Diketo piperazinderivate:
Säule mit einem Innendurchmesser von 4,0 mm und einer Länge von 10 cm, die mit einem Chromatographiegel (TSK-Gel IEX-210) mit einer Korngröße von 5 µm gepackt ist, bzw. Säule mit einem Innendurchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 40 cm, die mit einem Chromato graphiegel (TSK-Gel LS-170) mit einer Korngröße von 5 µm gepackt ist.

Elutionsmittel: Wäßrige Natriumacetatlösung
Strömungsgeschwindigkeit: 0,9 ml/min
Meßtemperatur: 25°C
Detektor: UV-Detektor ("UVIDEC-III" der Firma Nippon Bunko K.K.)

Die Messung erfolgte bei einer Wellenlänge von: 256 nm

Beispiel 1

Man bereitet eine zu behandelnde Lösung durch Auflösen von 200 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester und 20 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6- carboxymethyl-2,5-diketopiperazin) in 50 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man durch Auflösen von 220 mg eines rohen α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-methylesters, der 9,1% des Diketo piperazinderivats enthält, erhält. Zu dieser Lösung gibt man 2,0 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes in der Cl-Form (Amberlite IRA- 410) und rührt mit Hilfe eines Magnetrührers während 20 Minuten bei 30°C. Dann filtriert man die Reak tionslösung und wäscht das Harz mit 20 ml Wasser. Anschließend unterwirft man die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser der oben angesprochenen hochgeschwindigkeitschromatographischen Analyse zur Bestimmung der enthaltenen Mengen an α-L-Aspartyl- L-phenylalanin-methylester und 3-Benzyl-6-carboxy- methyl-2,5-diketopiperazin. Es zeigt sich, daß die Mischung 187 g α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methyl ester und 0,70 mg des Diketopiperazinderivats ent hält. Das Verhältnis der Menge des Diketopiperazin derivats zu der Gesamtmenge von α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-methylester und dem Diketopiperazin derivat beträgt 0,37%. Die Ausbeute an α-L-Aspartyl- L-phenylalanin-methylester beträgt 93,5%.

Beispiel 2

Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 400 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester, 20 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6- carboxymethyl-2,5-diketopiperazin) und 20 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin in 100 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man erhält, wenn man rohen α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methyl ester, der 4,5% des Diketopiperazinderivats und 4,5% α-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält, löst. Zu dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes in der Cl-Form (Amberlite IRA-900). Man rührt in einem Inkubator während 20 Minuten bei 30°C. Dann filtriert man die Reaktionslösung und wäscht das Harz mit 50 ml Wasser. Anschließend unterwirft man die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser der oben angesprochenen Analysenmethode, wobei sich zeigt, daß die Mischung 398 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester, 1,1 mg des Diketopiperazinderivats und 1,4 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Die Verhältnis se der enthaltenen Mengen des Diketopiperazins bzw. von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin zu der Gesamtmenge von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Di ketopiperazinderivat und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 0,27% bzw. 0,35%. Die Ausbeute an α-L- Aspartyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 99,5%.

Beispiel 3

Man bereitet eine Behandlungslösung der gleichen Zusammensetzung wie der in Beispiel 2 beschriebenen. Diese Lösung versetzt man mit 4,0 g (Trockengewicht) eines Anionenaustauscherharzes in der Cl-Form (Amberlite IRA-410). Dann führt man die anschließenden Behandlungs maßnahmen nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 durch. Die Analysenergebnisse zeigen, daß die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 383 mg α-L- Aspartyl-L-phenylalanin-methylester und 1,0 mg des Diketopiperazinderivats enthält, während keine merk lichen Mengen an α-L-Aspartyl-L-phenylalanin festzu stellen sind. Der Gehalt an dem Diketopiperazinderivat, bezogen auf die Gesamtmenge von α-L-Aspartyl-L-phenyl alanin-methylester und Diketopiperazinderivat beträgt 0,26%. Die Ausbeute an α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- methylester beträgt 95,8%.

Beispiel 4

Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 400 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 40 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6- carboxymethyl-2,5-diketopiperazin) und 40 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin in 100 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung von rohem α-L- Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, der jeweils 8,33% des Diketopiperazinderivats bzw. α-L-Aspartyl- L-phenylalanin enthält. Zu dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionen austauscherharzes in der Cl-Form (Amberlite IRA-410) und führt die Behandlung in der in Beispiel 2 be schriebenen Weise durch. Die Analysenergebnisse zeigen, daß die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 400 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 1,8 mg des Diketopiperazinderivats und 2,3 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Die Gehalte an dem Diketopiperazinderivat und an a-L-Aspartyl-L- phenylalanin, bezogen auf die Gesamtmenge von α-L- Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketopiperazin derivat und α-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 0,45% bzw. 0,57%. Der α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- methylester wird quantitativ zurückgewonnen.

Beispiel 5

Man beschickt eine zylindrische Säule mit einem Innen durchmesser von 12 mm mit 10 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes in der Cl-Form (Amberlite IRA-410), das ein Volumen von 18,3 ml in der Säule ausfüllt. Man bereitet eine Behandlungs lösung durch Auflösen von 5,0 g α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-methylester, 100 mg eines Diketopiperazin derivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin) und 100 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin in 400 ml Wasser. Die Lösung entspricht einer Lösung von rohem α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, der jeweils 1,9% des Diketopiperazinderivats und α-L-Aspartyl-L- phenylalanin enthält.

Man läßt die zu behandelnde Lösung bei einem SV von 12 und bei einer Temperatur von 29°C durch die Harzsäule dringen. Dann wäscht man das Harz mit 100 ml Wasser. Man teilt einen Teil der in die ser Weise erhaltenen Lösung in aliquote Anteile auf und unterwirft diese der Analyse in der oben ange gebenen Weise. Es zeigt sich, daß die durch die Säu le geführte Lösung 5,0 g α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- methylester (100% Ausbeute) enthält, während weder das Diketopiperazinderivat noch α-L-Aspartyl-L- phenylalanin nachgewiesen werden können. Die in die ser Weise erhaltene, durch die Säule geführte Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 255 g des Lösungsmittels durch Destillation entfernt. Anschließend läßt man den Rückstand durch Kühlen über Nacht im Kühlschrank kristallisieren. In dieser Wei ser erhält man 2,49 g (49,8%) kristallinen α-L- Aspartyl-L-phenylalanin-methylester. In den Kristal len lassen sich weder das Diketopiperazinderivat noch α-L-Aspartyl-L-phenylalanin nachweisen.

Beispiel 6

Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 5,0 g α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methyl ester, 100 mg eines Diketopiperazinderivats (3- Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin) und 100 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin in einer Mischung aus 350 ml und 50 ml Methanol. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man durch Auflösen von rohem α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester erhält, der jeweils 1,9% des Diketopiperazinderivats und α-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Man behandelt diese Lösung nach der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrensweise unter Verwendung von 10 g des in Beispiel 5 eingesetzten Harzes.

Die Analyse der in dieser Weise erhaltenen, durch die Säule geführten Lösung zeigt, daß sie 4,87 g α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester (97,5%) enthält, während sich in der Lösung weder α-L- Aspartyl-L-phenylalanin noch das Diketopiperazin derivat feststellen lassen.

Man engt die durch die Säule geführte Lösung durch Destillation unter vermindertem Druck ein und kühlt sie nach der Abtrennung von 237 g des Lösungsmittels in einem Kühlschrank über Nacht zur Kristallisation ab. In dieser Weise erhält man 2,90 g (57,9%) α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester in Form von Kristallen, in denen sich weder α-L-Aspartyl-L- phenylalanin noch das Diketopiperazinderivat nach weisen lassen.

Beispiel 7

Man bereitet eine Behandlungslösung der gleichen Zu sammensetzung wie der in Beispiel 2 beschriebenen. Zu dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines mäßig basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-68), das in die Chlorid-Form überführt worden ist, und führt die Behandlung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise durch.

Die Analysenwerte zeigen, daß die erhaltene Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 393 mg α-L- Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 14,4 mg des Diketopiperazinderivats und 6,5 mg α-L-Aspartyl-L- phenylalanin enthält. Die Verhältnisse des Gehalts an dem Diketopiperazinderivat und an α-L-Aspartyl-L- phenylalanin, bezogen auf die Gesamtmenge an α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketo piperazinderivat und α-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 3,5% bzw. 1,6%. Die Ausbeute an α-L-Aspartyl- L-phenylalanin-methylester beträgt 97,5%.

Beispiel 8

Man bereitet eine Behandlungslösung der gleichen Zusammensetzung wie der von Beispiel 2. Zu dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines schwach basischen Anionenaustauscherharzes (Amber lite IR-45), das in die Chlorid-Form überführt worden ist. Dann führt man die Behandlung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise durch.

Die Analysenergebnisse zeigen, daß die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 390 mg α-L-Aspartyl- L-phenylalanin-methylester, 6,3 mg des Diketo piperazinderivats und 4,9 mg α-L-Aspartyl-L-phenyl alanin enthält. Die Verhältnisse der Gehalte an dem Diketopiperazinderivat und α-L-Aspartyl-L- phenylalanin, bezogen auf die Gesamtmenge an α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketo piperazinderivat und α-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 1,6% bzw. 1,2%. Die Ausbeute an α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 97,5%.

Beispiel 9

Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 4,0 g α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 100 mg L-Asparaginsäure und 100 mg N-Benzyloxy carbonyl-L-asparaginsäure in 400 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man erhält, wenn man rohen α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methyl ester, der jeweils 2,4% L-Asparaginsäure bzw. N-Benzyl oxycarbonyl-L-asparaginsäure enthält, auflöst. Die Behandlungslösung wird mit 14 g des in Beispiel 5 ver wendeten Harzes unter Anwendung der Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt.

Die Analysenwerte der in dieser Weise erhaltenen, durch die Säule geführten Lösung zeigen, daß die Lösung 3,96 g (99%) α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester enthält, während sich weder L-Asparaginsäure noch N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure nachweisen las sen.

Beispiel 10

Man bildet N-Benzyloxycarbonyl-α-L-aspartyl-L- phenylalanin-methylester durch Kondensieren von N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und L-Phenyl alanin-methylester unter Verwendung von Thermoase, einem proteolytischen Enzym. Anschließend bildet man durch Abspalten der Benzyloxycarbonylgruppe durch eine Hydrogenolysereaktion 316 g einer wäßrigen Lösung von α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester. Diese Lösung enthält 25,10 g α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- methylester, 0,533 g eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin), 0,249 g α-L-Aspartyl-L-phenylalanin und 0,055 g L-Asparaginsäure, was einer wäßrigen Lösung eines rohen α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylesters ent spricht, der 2,0% des Diketopiperazinderivats, 0,94% α-L-Aspartyl-L-phenylalanin und 0,21% L-Aspara ginsäure enthält, entspricht.

Man beschickt ein zylindrisches Glasrohr mit einem Innendurchmesser von 2 cm mit 15,5 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-410) in der Cl-Form. Man bringt die oben beschriebene Behandlungslösung mit Wasser auf ein Gesamtgewicht von 674 g. Man führt dann die Lösung bei einer Temperatur von 55°C mit einer SV von 5,2 durch die Harzsäule. Nach dem Hindurchführen der Lösung wäscht man die Harzsäule mit 65 ml Wasser. In dieser Weise erhält man 719 g eines Abstroms aus der durch die Säule geführten Lösung und dem Waschwasser, den man über Nacht zur Kristallisation in einem Kühl schrank stehen läßt. Man filtriert die gebildeten Kristalle ab und wäscht sie mit 36 ml Wasser, wobei man 19,6 g (78,0%) kristallinen α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-methylester erhält. Die Kristalle enthal ten 25 mg des Diketopiperazinderivats und 8 mg α-L-Aspartyl-L-phenylalanin. Die zurückbleibende Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser enthält 5,24 g α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 28 mg des Diketopiperazinderivats und 7 mg α-L- Aspartyl-L-phenylalanin. Weder in den Kristallen noch in der Filtratmischung läßt sich L-Asparaginsäure nachweisen.

Die Verhältnisse der Gehalte an dem Diketopiperanzin derivat bzw. an α-L-Aspartyl-L-phenylalanin, bezogen auf die Gesamtmenge an in dem Abstrom enthaltenem α-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketo piperazinderivat und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin be tragen 0,2% bzw. 0,1%. Die Ausbeute an α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-methylester beträgt 98,8%.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von reinen α-L-Aspartyl-L-phenylalanin- niedrigalkylestern durch Adsorption der bei ihrer Herstellung gebildeten Peptid- Nebenprodukte an einem Anionenaustauscher in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und einem inerten, wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anionenaustauscher einen Anionen austauscher in der Cl-Form einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man α-L-Aspartyl-L- phenylalanin-methylester gewinnt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßriges Lösungsmittel eine wäßrige Methanollösung einsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verunreinigungen α-L-Aspartyl-L-phenylalanin und 3-Benzyl-6-carboxy methyl-2,5-diketopiperazin entfernt.