DE3013701A1 - Verfahren zur reinigng von alpha - l-aspartyl-l-phenylalanin-niedrigalkylestern - Google Patents
Verfahren zur reinigng von alpha - l-aspartyl-l-phenylalanin-niedrigalkylesternInfo
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Description
Sagami Chemical Ajinomoto Co. Toyo Soda
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von o£-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern
(auch als d-APE bezeichnet).
Die ti -L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester
und insbesondere der <*-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester
(auch als «i-APM bezeichnet) besitzen eine
starke, saccharoseartige Süßkraft und sind daher als neuartige Süßstoffe von Interesse.
Bislang wurde eine Vielzahl von Verfahren zur Synthese von ^-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern
vorgeschlagen, wie beispielsweise die Methode der Herstellung dieser Verbindungen durch direktes Verknüpfen
von L-Phenylalanin-methylester mit einem
Additionssalz von Asparaginsäureanhydrid mit einer starken Säure. Dieses Verfahren liefert jedoch unvermeidbar
Nebenprodukte, wie einen Tripeptidester, der durch das Kuppeln des als Produkt anfallenden
ei -L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters mit
einem weiteren Molekül der Asparaginsäure gebildet wird, ein Tripeptid, das durch Hydrolyse einer Estergruppe
aus dem Tripeptidester gebildet wird, c^-l-Aspartyl-L-phenylalanin
(auch als d-AP bezeichnet), das durch Hydrolyse des t^-L-Aspartyl-L-phenylalaninniedrigalkylesters
gebildet wird, und ein Diketopiperazinderivat (auch als DKP bezeichnet), insbesondere
3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin, das durch Ringbildung aus dem ß(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester
erzeugt wird.
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Sagami Chemical Ai inomoto Co. Toyo Soda
-A-
Es ist weiterhin bekannt, dxe EX-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester
dadurch herzustellen, daß man eine N-geschützte L-Asparaginsäure und einen L-Phenylalanin-niedrigalky!ester mit Hilfe eines
Enzyms kondensiert und dann die Schutzgruppe abspaltet. Diese Methode führt in einem geringeren
Ausmaß zur Bildung von Nebenprodukten. Jedoch ist es selbst bei Anwendung dieser Verfahrensweise kaum
möglich, die Bildung von c(-L-Aspartyl-L-phenylalanin
und der oben angesprochenen Diketopiperazinderivate weitgehend auszuschließen".
Mögliche Methoden zur Abtrennung und Reinigung der o( -L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester
könnten darin bestehen, diese Verbindungen durch ein Kristallisationsverfahren zu reinigen. In diesem
Fall neigen jedoch die angesprochenen Nebenprodukte wegen ihrer ähnlichen chemischen Struktur mit
den tf -L-Äspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern
dazu, Mischkristalle zu bilden. Somit ist es auch mit dieser Verfahrensweise kaum möglich, diese Nebenprodukte
zu entfernen.
Bei einer weiteren bekannten Verfahrensweise zur Abtrennung dieser Nebenprodukte wird ein Anionenaustauscherharz
eines spezifischen Typs verwendet. Diese Verfahrensweise ist in der offengelegten
japanischen Patentanmeldung Nr. 35660/1977 beschrieben. Nach dieser Verfahrensweise werden die angesprochenen
Nebenprodukte in einem wäßrigen Lösungsmittel mit einem Anionenaustauscherharz des Acetatoder
Formiat-Typs in Kontakt gebracht, um diese Verunreinigungen durch Adsorption selektiv zu entfernen.
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Es ist angegeben, daß es nicht möglich ist, die gewünschte Reinigungswirkung zu erreichen, wenn man
ein anderes Anionenaustauscherharz als das der angegebenen Typen organischer Säuren verwendet, da die
Verunreinigung des Dipeptidestermaterials, das heißt eines «(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters,
zunehmen würde, wenn man ein Anionenaustauscherharz eines solchen Typs verwenden würde.
Es besteht aber nach wie vor ein Bedürfnis zur
Schaffung eines Verfahrens zur Reinigung von o( -L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern
unter Verwendung eines Anionenaustauscherharzes.
Es wurde nunmehr gefunden, daß man die oC-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester
in wirksamer Weise mit Hilfe eines Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs
reinigen kann, was angesichts der Tatsache als überraschend anzusehen ist, daß dies als unmöglich angesehen
wird, es sei denn, man würde ein Anionenaustauscherharz in Form des Additionsprodukts mit
einer schwachen organischen Säure einsetzen.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reinigung von Verunreinigungen enthaltenden
öi-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß man den o( -L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester
in einem wäßrigen Lösungsmittel mit einem Anionenaustauscherharz des Cl-Typs in Kontakt bringt, um die Verunreinigungen
durch Adsorption an dem Anionenaustauscherharz zu entfernen.
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Erfindungsgemäß kann die Reinigung in wirksamster Weise unter Einsatz eines rohen o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters
erreicht werden, der mit Hilfe der oben angesprochenen Methode, bei der ein Enzym verwendet wird, hergestellt worden ist.
Im Gegensatz zu den of-L-Aspartyl-L-phenylalaninniedrigalkylestern,
die mit Hilfe der oben angesprochenen chemischen Herstellungsweisen gebildet worden
sind, enthalten die o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester,
die mit Hilfe der enzymatischen Verfahrensweise synthetisiert worden sind, als Hauptverunreinigungen <X-L-Aspartyl-L-phenylalanin
und Diketopiperazinderivate und nur geringe Mengen anderer Verunreinigungen, die auf die Ausgangsmaterialien
zurückgehen. Daher ist es für die in dieser Weise hergestellten c^-L-Aspartyl-L-phenylalaninniedrigalkylester
besonders wesentlich, #-L-Aspartyl-L-phenylalanin
und die Diketopiperazinderivate zu entfernen.
Wenn man einen ot-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester,
der c^-L-Aspartyl-L-phenylalanin und
ein Diketopiperazinderivat enthält , mit einem Anionenaustauscherharz des Cl-Typs in einem wäßrigen
Lösungsmittel mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahrensweise
in Kontakt bringt,wird der c(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester
von dem Harz überhaupt nicht adsorbiert, während die Verunreinigungen O^-L-Aspartyl-L-phenylalanin und das Diketopiperazinderivat
von dem Harz adsorbiert werden.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man als Harz
irgendein Anionenaustauscherharz des Cl-Typs verwenden.
Es ist jedoch bevorzugt, ein stark basisches Anionenaustauscherharz einzusetzen.
Als wäßriges Lösungsmittel verwendet man bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren Wasser oder eine Mischung aus Wasser und einem inerten organischen Lösungsmittel,
das in Wasser löslich ist, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Aceton, Methyläthylketon, Tetrahydrofuran,
Dioxan, Äthylenglykol, Dimethylformamid oder dergleichen .
Der Kontakt des Anionenaustauscherharzes mit der die Verunreinigungen enthaltenden Lösung des o(.-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters
kann in irgendeiner Weise erfolgen. Beispielsweise führt man die Lösung durch eine mit dem Harz gefüllte Säule oder bringt die
Lösung und das Harz in einem Gefäß unter Rühren oder unter Bewegen miteinander in Kontakt.
Die Temperatur zum Zeitpunkt des Kontakts beeinflußt die Adsorption der Verunreinigungen
nicht wesentlich. Jedoch stellt die Anwendung erhöhter Temperaturen ein Problem im Hinblick auf die Stabilität
der <s{-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester dar.
Demzufolge liegt die Temperatur vorzugsweise in einem Bereich von 0 bis 700C.
Die Rückgewinnung des gereinigten o( -L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters
aus der mit dem Anionenaustauscherharz des Cl-Typs behandelten wäßrigen Lösung kann in üblicher Weise erfolgen, beispielsweise
durch eine normale Kristallisation. Wenn man
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3(1137QT
ο
eine Lösung des^-L-Aspartyl-L-phenylalaninniedrigalkylesters
mit relativ niedriger Konzentration behandelt, gewinnt man den oi-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester
beispielsweise durch Einengen und Abkühlen der Lösung. Wenn man eine relativ konzentrierte Lösung bei erhöhter Temperatur
behandelt, kann man den ti.-L-Aspartyl-L-phenylalaninr
niedrigalkylester durch einfaches Abkühlen der Lösung gewinnen.
Bei der Anwendung der oben angesprochenen Verfahrensweise, bei der ein Anionenaustauscherharz in Form
eines Salzes mit einer schwachen organischen Säure eingesetzt wird, macht es der niedrige Dissoziationsgrad
der schwachen organischen Säure erforderlich, eine große Menge der schwachen organischen Säure
oder ihres Salzes in hoher Konzentration einzusetzen, wenn die adsorbierten Verunreinigungen von dem Harz
desorbiert werden sollen, um dieses wiederverwenden zu können. Zur Vermeidung dieser Nachteile ist es
erforderlich, das Anionenaustauscherharz zunächst in die OH-Form zu überführen und dann wieder in das
Salz der schwachen organischen Säure umzuwandeln.
Wenn man jedoch erfindungsgemäß das Anionenaustauscherharz
des Cl-Typs verwendet, kann man dieses ohne weiteres mit Hilfe einer Chloridionen enthaltenden
Lösung, wie einer Chlorwasserstoffsäurelösung oder einer Salzlösung, regenerieren.
Weiterhin werden bei Anwendung der erstgenannten Methode organische Säureionen, die eine größere
Affinität für den ci-L-Aspartyl-L-phenylalaninniedrigalkylester
besitzen,durch Ionenaustausch in
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die Lösung des behandelten oi-L-Aspartyl-L-phenylaianin-niedrigalkylesters
eingeführt. Im Gegensatz dazu werden bei der erfindungsgemäßen Verfahrensweise
lediglich Chloridionen in die behandelte Lösung eingebracht, die ohne weiteres durch Kristallisation
oder dergleichen abgetrennt werden können, so daß die Gewinnung des tf-L-Aspartyl-L-phenylalaninniedrigalkylesters
ohne weiteres möglich ist.
ο Ein weiterer Vorteil)des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist darin zu sehen, daß die Abwasser leichter beseitigt werden können, da diese keine organischen
Säuren oder Salze davon enthalten.
-j 5 Wie aus den obigen Ausführungen ohne weiteres hervorgeht,
ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren in einfacher Weise die selektive Entfernung von Verunreinigungen,
insbesondere der oben angesprochenen Diketopiperazinderivate und von o£-L-Aspartyl-L-
2ö phenylalanin aus diese Verunreinigungen enthaltenden
et-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung
der Erfindung.
Die in den nachfolgenden Beispielen angegebenen Analysenwerte wurden durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie
ermittelt, die unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurde:
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Vorrichtung:
Für tf-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester:
Säule mit einem Innendurchmesser von 7^5 mm und einer
Länge von 20 cm, die mit einem Chromatographiegel (TSK-GeI LS-170) mit einer Korngröße von 5 μπι gefüllt
ist;
für Ck-L-Aspartyl-L-pheny!alanin und die Diketopiperazinderivate:
Säule mit einem Innendurchmesser von 4,0 mm und einer Länge von 10 cm, die mit einem Chromatographiegel (TSK-GeI IEX-210) mit einer Korngröße von 5 μΐη gepackt ist, bzw. Säule mit einem Innendurchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 40 cm, die mit einem Chromatographiegel .(TSK-GeI LS-170J mit einer Korngröße von 5 μια gepackt ist.
Säule mit einem Innendurchmesser von 4,0 mm und einer Länge von 10 cm, die mit einem Chromatographiegel (TSK-GeI IEX-210) mit einer Korngröße von 5 μΐη gepackt ist, bzw. Säule mit einem Innendurchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 40 cm, die mit einem Chromatographiegel .(TSK-GeI LS-170J mit einer Korngröße von 5 μια gepackt ist.
Elutionsmittel; Wäßrige Natriumacetatlösung Strömungsgeschwindigkeit: 0,9 ml/min
Meßtemperatur: 250C
Detektor: UV-Detektor ("UVIDEC-III" der Firma Nippon
Detektor: UV-Detektor ("UVIDEC-III" der Firma Nippon
Bunko K.K.) Die Messung erfolgte £>ei einer Wellenlänge von: 256 nm
° Man bereitet eine zu behandelnde Lösung durch Auflösen
von 200 mg oi-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
und 20 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin)
in 50 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man durch
Auflösen von 220 mg eines rohen <X-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylesters,
der 9,1% des Diketopiperazinderivats enthält, erhält. Zu dieser Lösung gibt man 2,0 g (Trockengewicht) eines stark basischen
Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs (Amberlite IRA-
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410) und rührt mit Hilfe eines Magnetrührers während
20 Minuten bei 300C. Dann filtriert man die Reaktionslösung
und wäscht das Harz mit 20 ml Wasser. Anschließend unterwirft man die Mischung aus dem
Filtrat und dem Waschwasser der oben angesprochenen hochgeschwindigkeitschromatographischen Analyse zur
Bestimmung der enthaltenen Mengen an oC-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
und 3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin. Es zeigt sich, daß die
Mischung 187 g c<-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
und 0,70 mg des Diketopiperazinderivats enthält. Das Verhältnis der Menge des Diketopiperazinderivats
zu der Gesamtmenge, von o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
und dem Diketopiperazinderivat beträgt 0,37%. Die Ausbeute an o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
beträgt 93,5%.
Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 400 mg C(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
20 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin)
und 20 mg U-L-Aspartyl-L-phenylalanin in 100 ml Wasser. Diese
Lösung entspricht einer Lösung, die man erhält, wenn man rohen c(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
der 4,5% des Diketopiperazinderivats und 4,5% ei-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält, löst. Zu
dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs
(Amberlite IRA-900). Man rührt in einem Inkubator während 20 Minuten bei 3O0C. Dann filtriert man die
Reaktionslösung und wäscht das Harz mit 50 ml Wasser. Anschließend unterwirft man die Mischung aus dem
Filtrat und dem Waschwasser der oben angesprochenen
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Analysenmethode, wobei sich zeigt, daß die Mischung
398 mg oC-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester,
1,1 mg des Diketopiperazinderivats und 1,4 mg t>(-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Die Verhältnisse
der enthaltenen Mengen des Diketopiperazins bzw. von oC-L-Aspartyl-L-phenylalanin zu der Gesamtmenge
von «(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methy!ester, Diketopiperazinderivat
und ci-L-Aspartyl-L-pheny !alanin
betragen 0,27% bzw. 0,35%. Die Ausbeute an c(-L-Äspartyl-L-phenylalanin-methy!ester
beträgt 99,5%.
Man bereitet eine Behandlungslösung der gleichen Zusammensetzung wie der in Beispiel 2 beschriebenen.
Diese Lösung versetzt man mit 4,0 g (Trockengewicht) eines Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs (Amberlite
IRA-410). Dann führt man die anschließenden Behandlungsmaßnahmen nach der Verfahrensweise von Beispiel 2
durch. Die Analysenergebnisse zeigen, daß die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 383 mg 6(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
und 1,0 mg des Diketopiperazinderivats enthält, während keine merklichen
Mengen an oC -L-Aspartyl-L-phenylalanin festzustellen sind. Der Gehalt an dem Diketopiperazinderivat,
bezogen auf die Gesamtmenge von o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
und Diketopiperazinderivat beträgt 0,26%. Die Ausbeute an wl-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester
beträgt 95,8%.
Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von
400 mg ^-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
40 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin)
und 40 mg
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<* -L-Aspartyl-L-phenylalanin in 100 ml Wasser. Diese
Lösung entspricht einer Lösung von rohem Oi -L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
der jeweils 8,33% des Diketopiperazinderivats bzw. c<-L-Aspartyl-L-phenylalanin
enthält. Zu dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes
des Cl-Typs (Amberlite IRA-410)
und führt die Behandlung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise durch. Die Analysenergebnisse zeigen,
daß die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 400 mg o( -L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
1,8 mg des Diketopiperazinderivats und 2,3 mg ti -L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Die Gehalte an
dem Diketopiperazinderivat und an <X-L-Aspartyl-L-phenylalanin,
bezogen auf die Gesamtmenge von ^-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
Diketopiperazinderivat und C^ -L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen
0,45% bzw. 0,57%. Der ^-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethy!ester
wird quantitativ zurückgewonnen.
Man beschickt eine zylindrische Säule mit einem Innendurchmesser von 12 mm mit 10 g (Trockengewicht) eines
stark basischen Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs (Amberlite IRA-410), das ein Volumen von 18,3 ml
in der Säule ausfüllt. Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 5,0 g C(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
100 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin)
und 100 mg o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin in 400 ml
Wasser. Die Lösung entspricht einer Lösung von rohem °( -L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, der jeweils
1,9% des Diketopiperazinderivats und tf-L-Aspartyl-L-phenylalanin
enthält.
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Man läßt die zu behandelnde Lösung bei einem SV von 12 und bei einer Temperatur von 290C durch die
Harzsäule dringen. Dann wäscht man das Harz mit 100 ml Wasser. Man teilt einen Teil der in dieser
Weise erhaltenen Lösung in aliquote Anteile auf und unterwirft diese der Analyse in der oben angegebenen
Weise. Es zeigt sich, daß die durch die Säule geführte Lösung 5,0 g ot-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester
(100% Ausbeute) enthält, während weder das Diketopiperazinderivat noch t* -L-Aspartyl-L-phenylalanin
nachgewiesen werden können. Die in dieser Weise erhaltene, durch die Säule geführte Lösung
wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 255 g des Lösungsmittels durch Destillation entfernt.
Anschließend läßt man den Rückstand durch Kühlen über Nacht im Kühlschrank kristallisieren. In dieser Weiser
erhält man 2,49 g (49,8%) kristallinen o( -L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester.
In den Kristallen lassen sich weder das Diketopiperazinderivat noch «(-L-Aspartyl-L-phenylalanin nachweisen.
Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 5,0 g o(.-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
100 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin)
und 100 mg o( -L-Aspartyl-L-phenylalanin in einer Mischung aus 350 ml und 50 ml Methanol. Diese Lösung
entspricht einer Lösung, die man durch Auflösen von rohem tf-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester erhält,
der jeweils 1,9% des Diketopiperazinderivats und c( -L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Man behandelt
diese Lösung nach der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrensweise unter Verwendung von 10g des in
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Beispiel 5 eingesetzten Harzes.
Die Analyse der in dieser Weise erhaltenen, durch die Säule geführten Lösung zeigt, daß sie 4,87 g
oC-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester (97,5%)
enthält, während sich in der Lösung weder &( -L-Aspartyl-L-phenylalanin
noch das Diketopiperazinderivat feststellen lassen.
Man engt die durch die Säule geführte Lösung durch Destillation unter vermindertem Druck ein und kühlt
sie nach der Abtrennung von 237 g des Lösungsmittels in einem Kühlschrank über Nacht zur Kristallisation
ab. In dieser Weise erhält man 2,90 g (57,9%) 0C-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester in Form von
Kristallen, in denen sich weder o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin
noch das Diketopiperazinderivat nachweisen lassen.
Man bereitet eine Behandlungslösung der gleichen Zusammensetzung wie der in Beispiel 2 beschriebenen.
Zu dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines mäßig basischen Anionenaustauscherharzes
(Amberlite IRA-68), das in die Hydrochlorid-Form
überführt worden ist, und führt die Behandlung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise durch.
Die Analysenwerte zeigen, daß die erhaltene Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 393 mg o<-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
14,4 mg des Diketopiperazinderivats und 6,5 mg o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin
enthält. Die Verhältnisse des Gehalts an dem Diketopiperazinderivat und an «(-L-Aspartyl-L-
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phenylalanin, bezogen auf die Gesamtmenge an QL-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketopiperazinderivat
und oC -L-Aspartyl-L-phenylalanin
betragen 3,5% bzw. 1,6%. Die Ausbeute an ^-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
beträgt 97,5%.
Man bereitet eine Behandlungslösung der gleichen
Zusammensetzung wie der von Beispiel 2. Zu dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines
schwach basischen Anionenaustauscherharzes. (Amberlite
IR-45), das in die Hydrochlorid-Form überführt
worden ist. Dann führt man die Behandlung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise durch.
Die Analysenergebnisse zeigen, daß die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 390 mg oi-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
6,3 mg des Diketopiperazinderivats und 4,9 mg c^-L-Aspartyl-L-phenylalanin
enthält. Die Verhältnisse der Gehalte an dem Diketopiperazinderivat und ^-L-Aspartyl-L-phenylalanin,
bezogen auf die Gesamtmenge an <o(. -L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketopiperazinderivat
und o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 1,6% bzw. 1,2%. Die Ausbeute an
Oi -L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester beträgt
97,5%.
Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen
von 4,0 g ^-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
100 mg L-Asparaginsäure und 100 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure
in 400 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man erhält,
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wenn man rohen o< -L-Aspartyl-L-phenylalar.in-methylester,
der jeweils 2,4% L-Asparaginsäure bzw. N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure
enthält, auflöst. Die Behandlungslösung wird mit 14g des in Beispiel 5 verwendeten
Harzes unter Anwendung der Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt.
Die Analysenwerte der in dieser Weise erhaltenen, durch die Säule geführten Lösung zeigen,daß die Lösung
3,96 g (99%) &£ -L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
enthält, während sich weder L-Asparaginsäure noch N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure nachweisen lassen.
Man bildet N-Benzyloxycarbonyl- fci-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester
durch Kondensieren von N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und L-Phenylalanin-methylester
unter Verwendung von Thermoase, einem proteolytischen Enzym. Anschließend bildet man
durch Abspalten der Benzyloxycarbonylgruppe durch eine Hydrogenolysereaktion 316 g einer wäßrigen Lösung
von sC-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester. Diese
Lösung enthält 25,10 g oi-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester,
0,533 g eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin),
0,249 g ni -L-Aspartyl-L-phenylalanin und 0,055 g
L-Asparaginsäure, was einer wäßrigen Lösung eines rohen o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylesters entspricht,
der 2,0% des Diketopiperazinderivats, 0,94% o(-L-Aspartyl-L-phenylalanin und 0,21% L-Asparaginsäure
enthält, entspricht.
Ö3QCU3/Q8ß9
Sagami Chemical Aj inomoto Co.
Toyo Soda
- 18 -
Man beschickt ein zylindrisches Glasrohr mit einem Innendurchmesser von 2 cm mit 15,5 g (Trockengewicht)
eines stark basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-410) des Cl-Typs. Man bringt die oben
beschriebene Behandlungslösung mit Wasser auf ein Gesamtgewicht von 674 g. Man führt dann die Lösung
bei einer Temperatur von 55°C mit einer SV von 5,2 durch die Harzsäule. Nach dem Hindurchführen der Lösung
wäscht man die Harzsäule mit 65 ml Wasser. In dieser Weise erhält man 719 g eines Abstroms aus der durch
die Säule geführten Lösung und dem Waschwasser, den man über Nacht zur Kristallisation in einem Kühlschrank
stehen läßt. Man filtriert die gebildeten Kristalle ab und wäscht sie mit 36 ml Wasser, wobei
man 19,6 g (78,0%) kristallinen b£-L-Aspartyl-L phenylalanin-methylester
erhält. Die Kristalle enthalten 25 mg des Diketopiperazinderivats und 8 mg oC-L-Aspartyl-L-phenylalanin. Die zurückbleibende
Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser enthält 5,24 g o£-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester,
28 mg des Diketopiperazinderivats und 7 mg OC-L-Aspartyl-L-phenylalanin.
Weder in den Kristallen noch in der Filtratmischung läßt sich L-Asparaginsäure nachweisen.
Die Verhältnisse der Gehalte an dem Diketopiperazinderivat
bzw. an oC-L-Aspartyl-L-phenylalanin, bezogen auf die Gesamtmenge an in dem Abstrom enthaltenem
fe£-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketopiperazinderivat
und o<-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen
0,2% bzw. 0,1%. Die Ausbeute an O(-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester
beträgt 98,8%.
030043/0889
Sagami Chemical Ajinomoto Co. Toyo Soda
- 19 -
ZUSAMMENFASSUNG
Es wird ein Verfahren zur Reinigung von Verunreinigungen enthaltenden <s£ -L-Aspartyl-L-phenyalanin-
niedrigalkylestern beschrieben. Hierbei bringt man den «i. -L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester
in einem wäßrigen Medium mit einem Anionenaustauscherharz des Cl-Typs in Kontakt, um die Verunreinigungen
an dem Anionenaustauscherharz zu adsorbieren. Die in den Ot-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern
enthaltenen Verunreinigungen, insbesondere Diketopiperazinderivate und et-L-Aspartyl-L-phenylalanin,
werden in einfacher Weise selektiv entfernt. Das
gewünschte reine Produkt kann ohne weiteres gewonnen werden und die anfallenden Abfallflüssigkeiten
und dergleichen können ohne weiteres und ohne
Schwierigkeiten beseitigt werden.
Schwierigkeiten beseitigt werden.
030043/0869
Claims (5)
- TER MEER-MÜLLER-STEINMEISTERBeim Europäischen Patentamt zugelassene Vertreter — Professional Representatives before the European Patent Office Mandataires agrees pres !'Office europeen des brevetsDipl.-Chem. Dr, N. ter Meer Dipl.-lng. H. Steinmaister^ MQ"erDhBOOO MÜNCHEN 22 D-48OO BIELEFELD 1Case: 1182 10. April 1980SAGAMI CHEMICAL RESEARCH CENTER, No. 4-5, Marunouchi 1-chome, Chiyoda-ku, Tokyo 100 JapanAJINOMOTO CO., INC.,No. 5-8, Kyobashi 1-chome, Chuo-ku, Tokyo 104 JapanTOYO SODA MANUFACTURING CO., LTD., No. 4560, Oaza-tonda, Shin-nanyo-shi, Yainaguchi-ken 746 JapanVerfahren zur Reinigung von &-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalky!esternPriorität: 10. April 1979, Japan, Nr. 43274/79PATENTANSPRÜCHEVerfahren zur Reinigung von Verunreinigungen enthaltenden tf -L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern, dadurch gekennzeichnet, daß man den o(.~L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester in einem wäßrigen Lösungsmittel mit einem Anionenaustauscher des Cl-Typs in Kontakt030043/0869Sagami Chemical Aj inomoto Co. Toyo Sodabringt/ hierdurch die Verunreinigungen an das Anionenaustauscherharz adsorbiert und den oC-l-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester in gereinigtem Zustand gewinnt.
5 - 2. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch g e kennz eichnet, daß die niedrigmolekulare Alkylgruppe des oi-L-Aspartyl-L-phenylalaninniedrigalkylesters eine Methylgruppe ist.
- 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßriges Lösungsmittel eine wäßrige Lösung verwendet.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßriges Lösungsmittel eine wäßrige Methanollösung verwendet.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zu beseitigenden Verunreinigungen c^-L-Aspartyl-L-phenylalanin und 3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin umfassen.030043/0869
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