DE3519074C2

DE3519074C2 -

Info

Publication number: DE3519074C2
Application number: DE3519074A
Authority: DE
Inventors: Ernesto Mailand/Milano It Oppici; Onorino San Raffaele Cimena Turin/Torino It Giacoma Rosa; Carlo Turin/Torino It Varesio
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-05-28
Publication date: 1989-09-21
Also published as: CA1231969A; IT8421196A0; FR2565248A1; US4668821A; JPS60256395A; GB2159517B; BE902508A; IT8421196A1; GB8513355D0; DE3519074A1; GB2159517A; IT1174140B; FR2565248B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kristallisation von Phenylalanin mit hohem Reinheitsgrad aus enzymati schen Verfahren anfallenden Flüssigkeiten.

Die Herstellung von Phenylalanin durch enzymatische Um wandlung von Zimtsäure in Gegenwart von Ammoniak (PAL) wird in der Literatur beschrieben.

Gegen Ende des enzymatischen Verfahrens wird Phenylalanin erhalten, das aus der Reaktionsbrühe isoliert wird. Es wird dann gereinigt, wobei man eine Verbindung erhält, deren Reinheitsgrad ausreichend ist.

Phenylalanin wird als Zwischenprodukt bei der Aspartam- Synthese eingesetzt, einem bekannten Lebensmittelsüßstoff. Es ist daher ein sehr hoher Reinheitsgrad erforderlich, um zu vermeiden, daß unerwünschte Verbindungen vorhanden sind.

Die Extraktion von Phenylalanin aus den Lösungen bzw. Brü hen ist in der Vergangenheit schwierig gewesen, und es traten viele Nachteile auf.

In der US-PS 43 99 304 wird ein Verfahren zur Gewinnung von L-Phenylalanin aus den Fermentationsbrühen in Form eines ¹/₂-Sulfats beschrieben. Eine Anregung zur Gewin nung von L-Phenylalanin in Form der freien Base gibt diese Druckschrift nicht. Vielmehr heißt es in Spalte 3, Zeilen 39 bis 41, daß es beim Auskristallisieren der freien Form, das heißt der freien Base, schwierig ist, die Mutterlauge ausreichend von den Kristallen zu tren nen.

In der JP-53/39 857 wird ebenfalls ein Verfahren zur Rei nigung von Phenylalanin beschrieben. Bei diesem bekann ten Verfahren wird mit einem relativ hohen Anteil an or ganischem Lösungsmittel, einem Gemisch aus Isopropyl alkohol und Aceton gearbeitet. Erhalten werden rohe Kristalle von Phenylalanin. Eine weitere Reinigung wird nicht be schrieben. Dementsprechend finden sich in dieser Lite raturstelle keine Angaben für die Reinheit des Produktes.

Die GB-PS 14 89 468 betrifft ein Verfahren zur enzymati schen Herstellung von L-Phenylalanin, bei dem das L- Phenylalanin aus dem Reaktionsgemisch gewonnen wird. Ge mäß Beispiel 6 wird das L-Phenylalanin aus wäßriger Lö sung bei pH 5,5 ausgefällt. Angaben über die Reinheit des Produktes sind in dieser Literaturstelle nicht ent halten. Entsprechend diesem bekannten Verfahren wird das Phenylalanin vorzugsweise in Form eines Esterhydrochlo rids und insbesondere in Form seines Methylesterhydro chlorids isoliert.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Kristalli sation von Phenylalanin mit hohem Reinheitsgrad aus bei enzymatischen Verfahren anfallenden Flüssigkeiten, wel ches dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Flüssigkeit als Ausflockungsmittel Calciumhydroxid, einen silicium haltigen Zusatzstoff oder Entfärbungserde zugibt, ausge flockte Feststoffe abfiltriert, das Filtrat bis zu einer Konzentration von 40 bis 80 g/l Phenylalanin zum ersten Mal konzentriert, mit einer starken, anorganischen Säure bis zu einem pH-Wert von 2 bis 3 ansäuert, wobei man rührt und bei einer Temperatur von 3 bis 15°C arbeitet, die auskristallisierte Zimtsäure durch Filtration ge winnt, das erhaltene Filtrat mit einem Entfärbungsmittel entfärbt, welches abfiltriert wird, den pH-Wert mit Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid auf 2,5 bis 4 einstellt, die Lösung einer zweiten Konzentration auf 150 bis 220 g/l Phenylalanin unterwirft, schließlich den pH-Wert auf 5 bis 6,5 unter Rühren einstellt, wobei das Phenylalanin in Form von Kristallen mit hohem Rein heitsgrad ausgefällt wird.

In der US-PS 43 99 304 und der DE-OS 31 34 901, die oben genannt wurden, werden Verfahren zur Reinigung von Phenyl alanin, welches gemäß enzymatischem Verfahren hergestellt wird, beschrieben. Von den bekannten Verfahren unterschei det sich das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft da durch, daß ein sehr reines Phenylalanin erhalten wird, das insbesondere für die Herstellung von Aspartam geeig net ist und daß die angestrebte Verbindung mit konstan ter Qualität, unabhängig von der Beschaffenheit der Aus gangslösung bzw. -brühe erhalten wird. Ein weiterer Vor teil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß anders als bei den bekannten Extraktionsverfahren, wie zum Beispiel dem in der DE-OS 31 34 901 beschriebenen, keine organischen Lösungsmittel als Extraktionsmittel eingesetzt werden müssen. Das erhaltene Phenylalanin ent hält somit keinerlei Spuren von Lösungsmitteln.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt gegenüber allen ge nannten Verfahren eine wesentliche Verbesserung dar.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es tatsächlich möglich, ein sehr reines Produkt, was die Farbe und Durch sichtigkeit der wäßrigen Lösungen anbetrifft, zu erhalten, welches besser ist als die früher erhaltenen Produkte. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den weiteren Vor teil, daß keine Lösungsmittel verwendet werden müssen, und daher erhält man Phenylalanin, das keine Spuren von Lösungsmitteln enthält. Es ist daher besonders für die Herstellung von Aspartam geeignet, das sonst mit uner wünschten Verbindungen verunreinigt wäre.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man eine Verbindung mit konstanter Qualität, unabhängig von der Art der Ausgangslösung bzw. -brühe, erhält.

Das erfindungsgemäße Kristallisationsverfahren besteht im we sentlichen aus den folgenden Stufen:

Ausflockung und Filtration;
Konzentration zur Entfernung von Ammoniak;
Ansäuerung und Abtrennung der Zimtsäure;
Entfärbung und Konzentration, um Phenylalanin

zu erhalten.

Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man in der Lösung bzw. Brühe, die bei der en zymatischen Umwandlung erhalten wird, eine Ausflockung durchführt, wobei der Hauptteil der darin enthaltenen Verunreinigungen entfernt wird. Zu diesem Zweck wird die Brühe, die Phenylalanin, Ammoniumcarbonat und rest liche Zimtsäure enthält, mit einem Ausflockungsmittel, wie Calciumhydroxid, gegebenenfalls in Anwesenheit von Ammoniumphosphat, Magnesiumhydroxid, einem siliciumhal tigen Zusatzmittel oder einer Erde zur Entfärbung und bevorzugt in einem Filtrierhilfsmittel versetzt.

Nach dem Rühren während kurzer Zeit wird das Gemisch fil triert und das Filtrat auf eine Temperatur von 40 bis 70°C erhitzt und im Vakuum konzentriert. Es wurde ge funden, daß die bevorzugte Konzentration, die erreicht werden kann, 40 bis 80 g/l Phenylalanin beträgt.

Bei der folgenden Stufe wird die erhaltene Lösung auf einem pH-Wert von 2 bis 3 zur Isolierung von Zimtsäure angesäuert. Bevorzugt wird eine starke, anorganische Säure, wie 35- bis 45%ige Schwefelsäure, bei einer Tem peratur von 3 bis 15°C unter Rühren während einiger Stun den verwendet. Die so erhaltene Zimtsäure wird abfil triert.

Das Filtrat wird in an sich bekannter Weise mit einem Ent färbungs- bzw. Reinigungsmittel, wie Kohlenstoff zum Ent färben in einer Menge von 2 bis 15% entfärbt. Das Entfärbungsmittel wird dann abfiltriert. Der pH-Wert wird mit Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid auf 2,5 bis 4 eingestellt.

Das Filtrat wird im Vakuum bei einer Temperatur von 40 bis 80°C konzentriert, um eine Konzentration von 150 bis 220 g/l Phenylalanin zu erhalten. Der pH-Wert wird auf 5 bis 6,5 durch Zugabe von Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid eingestellt. Die Lösung wird auf eine Temperatur von 3 bis 15°C unter Rühren gekühlt und Phe nylalanin fällt in kristalliner Form aus und wird in an sich bekannter Weise abgetrennt. Die Verbindung wird mit einem sehr hohen Reinheitsgrad und in hoher Ausbeute er halten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Zu 1 l Brühe, welche 38 g Phenylalanin und 8 g Zimtsäure enthält, gibt man 4% Calciumhydroxid in Form eines fei nen Pulvers und 1% Dicalite®. Das Gemisch wird 1 h ge rührt, dann filtriert und der Filterkuchen mit 100 ml Wasser gewaschen.

Das Filtrat wird im Vakuum auf 70 g/l bei einer Tempera tur von 60°C konzentriert. Durch Zugabe von 40%iger Schwefelsäure wird der pH-Wert auf 2,5 eingestellt und das Gemisch 2 h bei 10°C gerührt. Die so erhaltene Zimt säure wird abfiltriert, der Niederschlag mit 50 ml Wasser, das mit Schwefelsäure auf pH 2,5 angesäuert ist, gewa schen. Man erhält 7,1 g Zimtsäure.

Die filtrierte Lösung wird mit Kohle zum Entfärben in ei ner Menge von 5%, bezogen auf Phenylalanin, versetzt. Das Gemisch wird 1 h gerührt und die Kohle abfiltriert. Der pH-Wert wird mit 30%iger NaOH auf 2,8 eingestellt und die Lösung im Vakuum bei 50°C auf 200 g/l konzen triert. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 30%iger NaOH auf 6 eingestellt und das Reaktionsgemisch auf 5°C ge kühlt, wobei man 2 h rührt.

Die Phenylalanin-Kristalle werden abfilriert und mit 110 ml Wasser gewaschen. Eine zweite Charge wird aus den Mutterlaugen erhalten. Die Niederschläge werden verei nigt und 6 h im Vakuum bei 45°C getrocknet. Phenylalanin wird in einer Ausbeute von 88% erhalten.
[α]²⁰ = -33,2° (c = 2, Wasser)
Durchlässigkeit = 660 nm 95%
protonometrischer Titer 99%.

Beispiel 2

Zu 1 l Brühe mit einem Gehalt von 34 g Phenylalanin und 9,5 g Zimtsäure gibt man 2% Entfärbungserde, Tonsil®, und rührt 4 h. Die nach der Filtration erhaltene Lösung wird auf 80 g/l im Vakuum bei einer Temperatur von 50°C konzentriert. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 2,6 mit 40%iger Schwefelsäure wird das Gemisch 4 h bei 2°C gerührt. Die so erhaltene Zimtsäure (8,6 g) wird ab filtriert.

Kohle zum Einfärben wird zu dem Filtrat in einer Menge von 10%, bezogen auf Phenylalanin, zugegeben und nach einstündigem Rühren wird die Kohle abfiltriert, der pH mit 30%iger NaOH auf 3,2 eingestellt und die Lösung im Vakuum bei 70°C auf 190 g/l konzentriert. Der pH-Wert wird auf 5,5 eingestellt und das Reaktionsgemisch auf 3°C abgekühlt. Phenylalanin wird abgetrennt, gewaschen und bei 45°C im Vakuum getrocknet.

Beispiel 3

Man arbeitet wie in Beispiel 1, entfernt die Zimtsäure und das Filtrat wird mit Kohlenstoff entfärbt, auf 220 g/l konzentriert, der pH-Wert wird mit Natriumhydro xid auf 6,5 eingestellt und das Reaktionsgemisch wird auf 3°C gekühlt, wobei man einen Niederschlag aus Phenyl alanin erhält, welcher abfiltriert wird.

Claims

1. Verfahren zur Kristallisation von Phenylalanin mit hohem Reinheitsgrad aus bei enzymatischen Verfahren anfallenden Flüssigkeiten, dadurch gekenn zeichnet, daß man zur Flüssigkeit als Aus flockungsmittel Calciumhydroxid, einen siliciumhalti gen Zusatzstoff oder Entfärbungserde zugibt, ausgeflock te Feststoffe abfiltriert, das Filtrat bis zu einer Kon zentration von 40 bis 80 g/l Phenylalanin zum ersten Mal konzentriert, mit einer starken, anorganischen Säu re bis zu einem pH-Wert von 2 bis 3 ansäuert, wobei man rührt und bei einer Temperatur von 3 bis 15°C arbeitet, die auskristallisierte Zimtsäure durch Filtration ge winnt, das erhaltene Filtrat mit einem Entfärbungsmit tel entfärbt, welches abfiltriert wird, den pH-Wert mit Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid auf 2,5 bis 4 einstellt, die Lösung einer weiteren Konzentration auf 150 bis 220 g/l Phenyl alanin unterwirft, schließlich den pH-Wert auf 5 bis 6,5 unter Rühren einstellt, wobei das Phenylalanin in Form von Kristallen mit hohem Reinheitsgrad ausgefällt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß bei der Zugabe von Calciumhy droxid gleichzeitig Ammoniumphosphat und/oder Magne siumhydroxid zugegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß die erste Konzentration im Vakuum bei einer Temperatur von 40 bis 70°C durchge führt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da durch gekennzeichnet, daß die zweite Konzentration im Vakuum bei einer Temperatur von 40 bis 80°C durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß das Phenylalanin aus einer Lö sung auskristallisiert wird, die bei einer Temperatur von 3 bis 15°C gehalten wird.