DE2157693B2 - Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C aus einer Fermentationsbrühe in Form eines N-Acylderivates - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das durch die Ansprüche gekennzeichnete Verfahren.

Cephalosporin C ist durch eine Aminosäurefunktion in seiner Seitenkette charakterisiert. Die Aminosäure existiert in Form eines Zwitterions in wäßriger Lösung und ist als solche sehr wasserlöslich. Wegen seiner stark ionischen Natur ist es äußerst schwierig, es durch Lösungsmittelextraktion der Brühe zu gewinnen.

Verfahren zur Gewinnung von Cephalosporin C aus Fermentationsbrühen durch Lösungsmittelextraktion werden in der GB 10 14 883, den US 32 27 707 und 35 22 248 sowie den DE-OS 19 33 187 und 20 31754 beschrieben, und zwar werden bei diesen Verfahren Fermentationsbrühen, die Cephalosporin C enthalten, unter Reaktionsbedingungen mit einer Anzahl chemischer Reagentien in Kontakt gebracht, die mit der freien Aminogruppe in der Seitenkette des Cephalosporin C reagieren. Das Cephalosporin C-Derivat wird leicht durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel aus der Fermentationsbrühe gewonnen.

Zur Isolierung von Cephalosporin C aus den Fermentationsbrühen, bei der die Potenzen (Konzentrationen) im Bereich von 1340 bis 1570 y/ml liegen, wird in dem Verfahren der US 35 22 248 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure verwendet, die sich mit Cephalosporin C umsetzt, um das aus dem Lösungsmittel extrahierbare N-Trinitrophenylderivat zu bilden, das anschließend zu 7-ACA in etwa 5O°/oiger Ausbeute aufgespalten wird. 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure ist im Handel nicht erhältlich. Sie wird durch Umsetzen von Pikrylchlorid in n-Butanol mit einer wäßrigen Natriumsulfitlösung hergestellt.

In der DE-OS 19 33 187 wird die Verwendung von N-Alkyl- oder N-Arylisocyanaten oder Halogenformiaten zu? Bildung von Alkyl- und Arylcarbamoyl-cephalosporin-C-derivaten beschrieben, die in etwa 55%iger Ausbeute zu 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) umgewandelt werden. Die N-Alkyl- und N-Arylisocyanate sind schädliche Chemikalien, die in großen Mengen schwierig zu handhaben sind.

Die DE-OS 20 31 754 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure aus Cephalosporin C, bei dem zunächst die Seitenkettenaminogruppe und dann die Carboxylgruppen des Cephalosporin C geschützt wurden, anschließend eine Halogenierung und Umsetzung des gebildeten Iminohalogenids mit Alkohol zum Iminoäther und schließlich eine Hydrolyse erfolgte. Als Schutzgruppe für die Aminogruppe wurde eine «-Halogenalkoanoyl- oder λ, Λ-Dihalogenalkanoylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen nach üblichen Acylierungsmethoden, z. B. durch Umsetzung mit dem entsprechenden Acylchlorid, in das Cephalosporin C eingeführt Die Umsetzung mit dem Acylchlorid wurde in der Fermentationsbrühe durchgeführt Das N Acylcephalosporin C wurde dann in Form des Chinolinsalzes oder des Natriumsalzes aus der Fermentationsbriihe isoliert Dabei betrugen die Ausbeuten in dieser Stufe für das Chinolinsalz etwa 50 bis 74% und für das Natriumsalz etwa 52%. Daher wurde

ίο betont, daß die bei der Isolierung von Cephalosporin C aus der Fermentationsmischung auftretenden hohen Verluste durch Verwendung eines Aminsahes vermieden werden sollten.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß erfindungsgemäß zur Abtrennung von Cephalosporin C aus einer Fermentationsbrühe bei Verwendung von Benzoylchlorid als Acylierungsmittel das N-Cenzoylcephalosporin C einfach in Form des Natriumsalzes in hoher Ausbeute aus der Fermentationsbrühe isoliert und sodann in das N-Benzoylcephalosporin C umgewandelt werden kann, wobei die Gesamtausbeute für alle Stufen, bezogen auf den Gehalt der Fermentationslösung an Cephalosporin C, etwa 73% üeträgt

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Benzoylchlorid zur Herstellung eines Amidderivates von Cephalosporin C verwendet. Dieses Verfahren ist insofern von Vorteil, als es sowohl bei Cephalosporin C-Fermentationsbrühen mit hohen Potenzen als auch bei Brühen mit so niedrigen Potenzen wie 700 y/ml angewandt werden kann. Benzoylchlorid ist eine preiswerte, leicht erhältliche Chemikalie. So wird also durch die Erfindung ein einfaches, billiges Verfahren zur Gewinnung von Cephalosporin C aus Fermentationsbrühen in Form von N-Benzoylcephalosporin C

)5 bereitgestellt.

Cephalosporin ⁽ Fermentationsbrühen enthalten bedeutende Mengen von Penicillin N. Die letztere Substanz muß bei dem Verfahren zerstört werden, um eine Verunreinigung der anschließend hergestellten 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) zu vermeiden. Dies geschieht dadurch, daß man die stärkere Empfindlichkeit des Penicillin-jJ-lactamrings im Verhältnis zu derjenigen des Cephalosporin C-jS-lactamrings gegenüber Säuren ausnutzt. Durch Einstellen des pH-Werts der filtrierten Fermentationsbrühe auf 2,5 mit 50% Schwefelsäure und anschließende Lagerung bei 5°C wird das Penicillin N vollständig zerstört. Für die industrielle Produktion wird das Penicillin N zweckmäßigerweise dadurch zerstört, daß n.jn die filtrierte

^r)0 Brühe mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH Wert von 2,5 einstellt und die Brühe mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur stehen läßt. Selbst wenn die Brühe unter diesen Bedingungen sogar 12 Stunden gehalten wird, tritt kein nennenswerter Verlust der Cephalosporin C-potenz ein. Die Brühe wird nun in ein Reaktions- oder Aufsetzgefäß filtriert, und der pH-Wert mit 50%iger Natriumhydroxidlösung auf 5,5 eingestellt.

Die Benzoylierung der Cephalosporin C-Fermenta-

tionsbrühe wird nach den üblichen Schotten-Baumann-Bedingungen durchgeführt. Benzoylchlorid wird wäh rend drei Stunden der auf 10 bis 15°C gekühlten Brühe zugesetzt. Während der Zugabe wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 50%igem wäßrigen Natriumhydroxid bei einem pH-Wert von 7 bis 10, vorzugsweise 8,0 bis 8,5 gehalten. Nach Ablauf der Umsetzung wird der pH-Wert auf 1 bis 3, vorzugsweise 1,8 bis 2 gehalten, und das N-Benzoylcephalosporin C, das sich gebildet hat, wird durch Extraktion mit einem einem mit Wasser

nicht mischbaren Lösungsmitte! oder Lösungsmittelgemisch, beispielsweise mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkohol, wie n-Butanoi, n-Amylalkohol, n-Hexanol oder Benzylalkohol, oder mit einem Ester, wie beispielsweise Äthylacetat oder -butylat, oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Keton, wie beispielsweise Diäthylketon oder Methylisobutylketon, oder mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff, wie beispielsweise Chloroform, Methylenchlorid oder Äthylenchlorid, oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel, abgetrennt.

N-Benzoylcephalosporin C wird nach dem in der BE 7 18 824 beschriebenen Verfahren zu 7-Aminocephalosporansäure umgewandelt, dabei beträgt die Ausbeute etwa 65%.

Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Die gesamte Cephalosporin C-Fermentationsbrühe wurde mit konientrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt, mit 2% (GewVVol.) Filterhilfe versetzt und filtriert. Der pH-Wert der filtrierten Brühe wurde mit konzentrierter Schwefelsäure auf 2,5 eingestellt, und das Ganze wurde mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. während welchen Zeitraums das gesamte anwesende Penicillin N zerstört wurde. Anschließend wurde die Brühe in ein Reaktions- oder Aufsatzgefäß filtriert und der pH-Wert mit 50°/oigem wäßrigen Natriumhydroxid auf 5,5 eingestellt. in

Die Brühe wurde auf 10 bis 15°C gekühlt, und der pH-Wert wurde mit 50°/oigen: wäßri^-n Natirumhydroxid auf 8,0 eingestellt. Anschlie3end wurden im Verlauf von etwa drei Stunden etwa 4 ml Bei :oylchlorid je I Brühe in gleichen Mengenanteilen in Abständen von 10 ι·, Minuten zugesetzt. Während der Zugabe wurde der pH-Wert des Reaktionsgemischs mit 50%igem wäßrigen Natriumhydroxid auf 8,0 bis 8,5 gehalten. Nach vollständiger Zugabe des Benzoylchlorids ließ man den pH-Wert sich auf einen Wert zwischen 7,0 und 7,5 stabilisieren (etwa 15 Minuten waren erforderlich) und der pH-Wert stellte sich auf 5,5 ein.

Der pH-Wert der benzoylierien Brühe wurde mit 5O°/oiger Schwefelsäure auf 1,8 eingestellt, und V₅ Volumen Butanol wurden zugesetzt. Die Butanolschicht αί wurde abgetrennt, und die wäßrige Phase wurde mit einem zweiten Ά Volumen Butanol extrahiert. Die saure benzoylierte Brühe kann auch wahlweise mittels eines Extraktors nach Podbielniak in einem Verhältnis von 3 : 1 (Brühe: Butanol) extrahiert werden. Die Butanolex- ^r,o trakte wurden kombiniert, ¹A Volumen Wasser wurden zugesetzt, der pH-Wert wurde mit 50%igem wäßrigen Natriumhydroxid auf 6,5 eingestellt, und die wäßrige Schicht wurde abgetrennt. Nach einer zweiten Extraktion mit '/5 Volumen Wasser wurden die wäßrigen Mengenanteile kombiniert, und der pH-Wert wurde mit 25%iger wäßriger Schwefelsäure auf 4,5 eingestellt. V3 Volumen Methylisobutylketon wurden zugesetzt, die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und zweimal erneut mit '/3 Volumen Methylisobutylketon extrahiert Der pH-Wert der wäßrigen Phase wurde auf 1,8 eingestellt, und die Lösung wurde dreimal mit '/3 Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden kombiniert, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur entfernt

Das restliche nach der Entfernung des Lösungsmittels verbleibende öl wurde in Aceton (3,791/400 ml öl) gelcn und mit Aktivkohle (50 g/3,79 1 Aceton) etwa 15 Minuten lang behandelt Die Holzkohle wurde abfiltriert, mit V;o Volumen Aceton gewaschen, und die kombinierte Acetonlösung (Filtrat und Waschlö^uing) wurde mit Natriumäthylhexanoat titriert. Der Endpunkt kann zweckmäßigerweise als der Punkt angesehen werden, an dem die Acetonlösung nicht länger einen sofortigen Niederschlag bei Zugabe weiterer Natriumäthylhexanoatlösung bildet. Während des Titrierens ist ein heftiges Rühren erforderlich, damit das Produkt nicht gummiartig wird. Der Niederschlag wird abfiltriert, einmal mit '/20 Volumen Aceton und zweimal mit V20 Volumen Methylisobutylketon gewaschen. Das Zerreiben des Produktes während des Waschens mit Methyiisobutylketon ist wichtig, um ein freifließendes kristallines Material zu erhalten. Das kristalline Produkt wurde mit einem Filterkörper unter Stickstoff getrocknet.

Eine Lösung von Mononatrium-N-benzoylcephalosporin C (1 g/25 ml) in Wasser wurde mit 4 n-Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und filtriert. Die wäßrige Lösung wurde mit 50%iger Schwefelsäure auf pH 1,8 eingestellt und mit drei V₃ Volumen Anteilen Äthylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum bei einer Badtemperatur von 40°C zu einem halbfesten Material eingedampft. Der Rückstand wurde in Acelon gelöst, 15 Minuten lang mit Aktivkohle (V5 des Startgewichts an Mononatriumsalz) behandelt und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zu einem halbfesten Material eingedampft, in einem kleinen Volumen Aceton gelöst, geimpft und bei 0⁰C über Nacht stehengelassen. Die Kristalle wurden abfiltriert, zweimal mit sehr geringen Volumen kaltem Acelon gewaschen und auf dem Filter getrocknet. Die Ausbeute an N-Benzoylcephalosporin C betrug etwa 73%, bezogen auf den Gehalt der Fermentationslösung an Cephalosporin C; Schmelzpunkt = 92 bis 102°C; _fto= +74° (C 1,15,CH₃OH).

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C aus einer Fermentationsbrühe in Form eines N-Acylderivates, durch Umsetzung der Fermentationslösung mit einem Acylierungsmittel und Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man Benzoylchlorid als Acylierungsmittel verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei einem pH-Wert von 8,0 bis 8,5 durchführt