-
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abscheidung von alpha-Kristallen von
Phenylalanin
Beschreibung des Standes der Technik:
-
Phenylalanin ist eine essentielle Aminosäure (ein lebenswichtiger Nährstoff) und
außerdem eine industriell wichtige Substanz, die als Rohmaterial für die
Herstellung von L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, einem Süßstoff,
brauchbar ist.
-
Phenylalanin kann durch die Isolierung aus einem Proteinhydrolysat, wie von
entfetteten Sojabohnen, durch Fermentation oder durch organische Synsthese
erhalten werden, und eine Kristallisation wird im allgemeinen als
Reinigungsverfahren bei jedem dieser Verfahren gewählt. Optisch aktives Phenylalanin
kommt als alpha-Kristalle oder als beta-Kristalle vor, wobei die alpha-Kristalle in
Form von Tafeln oder Schuppen vorliegen, während die beta-Kristalle in Form
von feinen Nadeln vorliegen. Somit ist eine Kristallisation als alpha-Kristalle
besser für eine Isolierung und ergibt Produkte von hoher Qualität mit weniger
anhaftender Mutterlauge.
-
Phenylalanin kommt in Form von alpha-Kristallen bei einer Temperatur, die
oberhalb einer bestimmten Stufe liegt (normale Übergangstemperatur), und in
Form von beta-Kristallen bei einer Temperatur unterhalb der normalen
Übergangstemperatur vor. Die normale Übergangstemperatur von Phenylalanin
beträgt etwa 37ºC in wäßrigen Systemen und schwankt etwas in Abhängigkeit
von dem Kristallisationssystem. Der Übergangspunkt in einem bestimmten
Kristallisationssystem kann durch eine Untersuchung der von dem
Kristallisationssystem abgetrennten Kristalle leicht bestimmt werden, wie durch
Beobachtung unter einem Mikroskop oder durch eine Röntgen-
Pulverdiffraktometrie. Es war bekannt, daß sich die normale
Übergangstemperatur durch die Zugabe eines organischen Lösungsmittels im
allgemeinen erniedrigt, bei wäßrigen Systemen war ein solches Phänomen
jedoch nicht bekannt.
-
Somit existiert ein Bedarf, Phenylalanin-Kristalle in der alpha-Kristallform bei
Temperaturen unterhalb der normalen Übergangstemperatur zu erhalten.
Kurzfassung der Erfindung
-
Es ist somit eine erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung von
Phenlyalanin-Kristallen in hoher Qualität bereitzustellen.
-
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren zur Kristallisation
von Phenylalanin durch Abkühlen bereitzustellen, wobei die Phenyalanin-Kristalle
in der alpha-Form bleiben.
-
Diese und andere erfindungsgemäße(n) Aufgaben werden durch die
Bereitstellung eines Verfahrens zur Kristallisation von Phenyalanin in Form von
alpha-Kristallen bei einer Temperatur unterhalb der normalen
Übergangstemperatur von Phenylalanin gelöst, wobei die normale
Übergangstemperatur eine Temperatur ist, oberhalb der Phenylalanin in Form
von alpha-Kristallen existiert und unterhalb der Phenylalanin in Form von beta-
Kristallen existiert, wobei das Verfahren umfaßt, daß
bei einer Temperatur oberhalb der normalen Übergangstemperatur eine wäßrige
Lösung von Phenylalanin gebildet wird, die enthält:
-
(1) mindestens 20g Natriumchlorid auf 100 g Wasser in der Lösung; oder
-
(2) Ammoniumchlorid und ein oberflächenaktives Mittel, wobei das
oberflächenaktive Mittel in einer Menge vorhanden ist, welche eine Erhöhung
der normalen Übergangstemperatur in einer wäßrigen Lösung von Phenylalanin
durch die Anwesenheit von Ammoniumchlorid in einer Konzentration von etwa
20 g pro 100 g Wasser in der Lösung wirksam unterdrücken kann, und
diese wäßrige Lösung von Phenyalanin auf eine Temperatur unterhalb der
normalen Übergangstemperatur abgekühlt wird, wobei Phenylalanin in der alpha-
Kristallform gewonnen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
Verschiedene weitere erfindungsgemäße Gegenstände, Merkmale und damit
verbundene Vorteile werden klarer zu erkennen sein, wenn sie aufgrund der
folgenden detaillierten Beschreibung besser verständlich werden und wenn sie
im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen betrachtet werden, wobei:
-
Fig. 1 ein Pulver-Röntgenspektrum der im Beispiel 2 erhaltenen L-Phenylalanin-
Kristalle darstellt;
-
Fig.2 ein IR-Spektrum der im Beispiel 2 erhaltenen L-Phenylalanin-Kristalle
darstellt;
-
Fig.3 ein Pulver-Röntgenspektrum der im Beispiel Beispiel 3 erhaltenen Kristalle
darstellt;
-
Fig. 4 ein IR-Spektrum der im Beispiel 4 erhaltenen Kristalle darstellt;
-
Fig. 5 ein Pulver-Röntgenspektrum der im Referenzbeispiel 1 erhaltenen L-
Phenylalanin-beta-Kristalle darstellt;
-
Fig. 6 ein Diagramm darstellt, das die Löslichkeit und die Kristallform von L-
Phenylalanin in Gegenwart von Ammoniumchlorid bei 40ºC und bei 5ºC als
Funktion der Ammoniumchloridkonzentration zeigt; und
-
Fig. 7 ein Diagramm darstellt, das die Löslichkeit und die Kristallform von L-
Phenylalanin in Gegenwart von NaCl bei 40ºC, bei 30ºC, bei 5ºC und bei 0ºC
als Funktion der NaCl-Konzentration zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
-
Die Kristallform von Phenylalanin in einem wäßrigen System, das
Ammoniumchlorid oder Natriumchlorid enthält, wie Lösungen, die man durch
Hydrolyse eines Proteins in Chlorwasserstoffsäure und Neutralisierung mit
Ammoniakwasser oder Natriumhydroxid erhält, war völlig unbekannt. Die
Erfinder führten ausführliche Untersuchungen dieses Problems durch und
stellten fest, daß, wenn Ammoniakwasser zur Neutralisierung verwendet wurde,
eine Ammoniumchloridkonzentration von etwa 20 g/100 g Wasser einen
kritischen Wert darstellt, oberhalb dessen ein Übergang zu beta-Kristallen sogar
bei 40ºC erfolgt (Erhöhung der normalen Übergangstemperatur), und unterhalb
dessen Phenylalanin in Form von alpha-Kristallen bei 40ºC bestehen bleibt.
-
Weitere Untersuchungen führten zu der Feststellung, daß, wenn eine geringe
Menge eines oberflächenaktiven Mittels zu der Lösung gegeben wird, der
Übergang der Kristallform bei einer Ammoniumchloridkonzentration oberhalb des
obengenannten kritischen Wertes (20 g/100 g Wasser) nicht erfolgt, wodurch
man Phenylalanin in Form von alpha-Kristallen sogar dann erhält, wenn man auf
eine Temperatur unterhalb von 35ºC abkühlt.
-
Die Erfinder stellten weiterhin fest, daß man, wenn Natriumhydroxid zur
Neutralisierung verwendet wird, qualitativ hochwertiges Phenylalanin in Form
von alpha-Kristallen in hoher Ausbeute erhalten kann, indem man die
Natriumchloridkonzentration der Phenylalaninlösung auf einen Wert von 20
g/100 g Wasser oder mehr erhöht und auf eine Temperatur von 35ºC oder
darunter, vorzugsweise auf den Bereich von 0 bis 5ºC, abkühlt.
-
Diese Erfindung kann umfassend auf eine Vielzahl wäßriger Lösungen, die
Phenylalanin enthalten, angewendet werden. Dazu zählen Lösungen, die man
durch Proteolyseverfahren erhält (wie ein Proteinhydrolysat; eine Lösung, die
man durch Behandlung dieses Hydrolysates mit einem Ionenaustauscherharz
oder mit einem Entfärberharz erhält; eine Lösung der Rohkristalle, die man von
diesem behandelten Hydrolysat abtrennt; und die Mutterlauge, von der die
Rohkristalle abgetrennt worden sind); Lösungen, die man durch
Fermentationsverfahren erhält (wie eine fermentierte Lösung; eine Lösung, die
man durch Behandlung dieser fermentierten Lösung mit einem
Ionenaustauscherharz oder einem Entfärberharz erhält; eine Lösung der
Rohkristalle, die man von dieser behandelten Lösung abtrennt; und die
Mutterlauge, von der die Rohkristalle abgetrennt worden sind); Lösungen, die
man durch organische Synthese erhält (wie eine Lösung, die man durch die
Reaktion von DL-Acetylphenylalanin mit einer Acylase erhält); und ein HCl-
Hydrolysat der Mutterlauge, von der L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (ein
Süßstoff) abgetrennt worden ist.
-
Verschiedene oberflächenaktive Mittel erwiesen sich als wirksam, wenn sie in
einem System verwendet wurden, das Ammoniumchlorid enthielt, wobei jedoch
nicht-ionische oberflächenaktive Substanzen, wie Sorbitanalkylester (z. B.
"Nonion LP-20", hergestellt von Nippon Oil and Fats Co., Ltd.) und
Polyoxyethylen-sorbitanalkylester (z.B. "Nonion LT-221", hergestellt von Nissan
Oil and Fats Co., Ltd.) besonders zufriedenstellend waren. Die zuzugebende
Menge an oberflächenaktiven Mitteln sollte ausreichen, eine Erhöhung des
Übergangspunktes, die durch NH&sub4;Cl (20 g/100 g H&sub2;O) hervorgerufen wird, zu
verhindern, und vorzugsweise sollte sie im Bereich von 0,05 bis 0,5% bezogen
auf das Phenylalanin-Gewicht liegen (ein Bereich, der die Menge des in den
abgetrennten Phenylalanin-Kristallen enthaltenen oberflächenaktiven Mittels
minimiert und der eine ausreichende Erniedrigung der Übergangstemperatur der
Kristallform sicherstellt).
-
Die Sättigungskonzentration des Phenyalanins zum Zeitpunkt der Kristallisation
(d.h., dessen Löslichkeit) variiert mit dem verwendeten Lösungstyp. In
Systemen, die Ammoniumaspartat oder ähnliches enthalten (wie eine Lösung,
die man durch Hydrolyse der Mutterlauge, von der Kristalle oder L-Aspartyl-L-
phenylalaninmethylester abgetrennt worden sind, mit Chlorwasserstoffsäure und
nachfolgender Neutralisierung mit Ammoniakwasser erhält), kann die Rate der
Kristallabscheidung durch Aussalzen deutlich erhöht werden. Zusätzlich wird in
diesen Systemen die Übergangstemperatur weiter erniedrigt und Phenylalanin
bleibt in Form von alpha-Kristallen bei einer Temperatur von 0 bis 5ºC bestehen.
-
Bei Systemen, die Natriumchlorid enthalten, wird dessen Konzentration auf
einen Wert von 20 g/100 g Wasser oder mehr eingestellt, indem man
Natriumchlorid zusetzt, indem man die Lösung ankonzentriert oder indem man
eine Natriumquelle und eine Chlorquelle separat zusetzt, wodurch Natriumchlorid
in der Lösung gebildet wird. Die Anwendung dieses Verfahrens unter
Verwendung von hochkonzentriertem Natriumchlorid ist nicht auf wäßrige
Phenyalaninlösungen beschränkt, die man, wie oben beschrieben, durch
Neutralisierung eines Proteinhydrolysates mit Natriumhydroxid erhält. Es ist auf
jeden Typ einer wäßrigen Lösung anwendbar, die Phenylalanin enthält; z.B. kann
sogar bei einer Lösung von Phenylalanin, die durdh Fermentation ohne
Natriumchlorid gebildet wird (oder bei einer behandelten Lösung davon), die
Ausbeute an objektiv alpha-kristallinem Phenylalanin durch Zugabe von
Natriumchlorid in einer Konzentration von 20 g/100 g Wasser oder mehr erhöht
werden.
-
Nachdem diese Erfindung allgemein beschrieben worden ist, kann ein
weitergehendes Verständnis unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische
Beispiele erreicht werden, die hier nur zum Zweck der Erläuterung und ohne zu
beschränken dargestellt werden, sofern nichts anderes angegeben ist.
Beispiele
Beispiel 1
-
Ein Gemisch von 24 g Ammoniumchlorid, 5 g L-Phenylalanin und 100 g Wasser
wurde auf 70ºC erhitzt, bis man eine klare Lösung erhielt. Danach wurden 15
mg Nonion LT-221 zugegeben, die erhaltene Lösung wurde nach und nach auf
25ºC abgekühlt, und die sich abscheidenden Kristalle wurden mit einem
geringen Volumen Wasser gewaschen. Die so erhaltenen Kristalle erwiesen sich
bei Betrachtung unter einem Mikroskop und bei einer Pulver-Röntgen-
Diffraktometrie als alpha-Kristallform.
Beispiel 2
(Lösung zur Hydrolyse mit HCl)
Menge in 400 g
* = Gesamtstickstoff
-
Zu 400 g einer Lösung, die L-Phenylalanin in der oben dargestellten
Zusammensetzung enthielt, wurden 100 g Nonion LP20 gegeben, und 28%
Ammoniakwasser wurden nach und nach zugegeben, während die Temperatur
bei 80ºC gehalten wurde, bis ein pH-Wert von 5,6 erreicht wurde, wodurch sich
L-Phenylalanin-Kristalle abschieden. Die Gesamtmenge an zugegebenem
Ammoniakwasser betrug 105 ml. Nach zweistündigem Rühren des
resultierenden Gemisches wurde dieses nach und nach unter Rühren auf 5ºC
abgekühlt. Die Kristalle wurden aufgefangen und mit 70 ml Wasser gewaschen.
Die so erhaltenen Kristalle erwiesen sich als alpha-Kristallform.
-
Ausbeute: 52,8%
-
Reinheit: 93% (gemessen mit einem Aminosäureanalysator)
-
Rate der Kristallabscheidung: 85% (unter Bezugnahme auf das Pulver-Röntgen-
Diagramm Fig. 1 und das IR-Diagramm Fig. 2)
-
Menge des anhaftenden Nonion LP20: 3 ppm
Beispiel 3:
-
Ein Filterhilfsstoff wurde zu einer L-Phenylalanin-Fermentationslösung gegeben,
das resultierende Gemisch wurde filtriert, das Filtrat wurde bei 60ºC unter
reduziertem Druck an konzentriert, das Konzentrat wurde nach und nach auf
38ºC abgekühlt, und die sich abscheidenden Rohkristalle wurden aufgefangen.
Zu 6 g der so erhaltenen Rohkristalle wurden 100 ml Wasser gegeben, das
Gemisch wurde auf 8ooC erhitzt, bis man eine klare Lösung erhielt, und
Natriumchlorid wurde danach bis zu einer Konzentration von 25g/dl zugegeben.
Die resultierende Lösung wurde nach und nach unter Rühren auf 5ºC abgekühlt
und über Nacht stehengelassen. Die sich abscheidenden Kristalle wurden
aufgefangen und mit einem geringen Volumen Wasser gewaschen. Die so
erhaltenen Kristalle erwiesen sich bei einer Röntgen-Diffraktometrie als alpha-
Form (unter Bezugnahme auf das Pulver-Röntgen-Diagramm Fig. 3 und das IR-
Diagramm Fig. 4).
-
Ausbeute aus den Rohkristallen: 5,42 g
-
Reinheit: 94,2% (gemessen mit einem Aminosäureanalysator)
-
Rate der Kristallabscheidung: 85%
Beispiel 4:
(Lösung zur Hydrolyse mit HCl)
Menge in 400 g
-
Zu 100 ml einer Lösung, die L-Phenylalanin in der oben dargestellten
Zusammensetzung enthielt, wurde nach und nach eine 48%ige wäßrige NaOH-
Lösung gegeben, während die Temperatur bei 80ºC gehalten wurde, bis ein pH-
Wert von 5,6 erreicht wurde, wodurch sich L-Phenylalanin-Kristalle abschieden.
Die zugesetzte Gesamtmenge an Ätznatronlösung betrug 26 ml. Das
resultierende Gemisch wurde nach und nach unter Rühren auf 5ºC abgekühlt
und über Nacht stehengelassen. Die Kristalle wurden aufgefangen und mit
einem geringen Volumen Wasser gewaschen. Die so erhaltenen Kristalle
erwiesen sich als alpha-Kristallform.
-
Ausbeute: 11,2 g
-
Reinheit: 94,7% (gemessen mit einem Aminosäureanalysator)
-
Rate der Kristallabscheidung: 93%
Referenzbeispiel 1:
-
Eine Lösung, die L-Phenylalanin in der gleichen Zusammensetung wie in Beispiel
1 enthielt, wurde nach und nach auf 40ºC abgekühlt, ohne daß ein
oberflächenaktives Mittel zugesetzt wurde, und die sich abscheidenden Kristalle
wurden aufgefangen. Die so erhaltenen Kristalle erwiesen sich bei der
Beobachtung unter einem Mikroskop und bei der Pulver-Röntgendiffraktomtrie
als beta-Kristallform (unter Bezugnahme auf das Pulver-Röntgen-Diagramm Fig.
5).
Referenzbeispiel 2:
-
Zu 400 g einer Lösung, die L-Phenylalanin in der gleichen Zusammensetzung
wie in Beispiel 2 enthielt, wurde nach und nach, ohne Zugabe eines
oberflächenaktiven Mittels, Ammoniakwasser gegeben, bis ein pH-Wert von 5,6
erreicht wurde, und das resultierende Gemisch wurde nach und nach abgekühlt.
-
Wenn man die Temperatur auf etwa 50ºC erniedrigte, erfolgte ein
Kristallformübergang bei dem abgeschiedenen Phenylalanin (alpha - > beta), was
ein Rühren unmöglich machte. Folglich konnten die Kristalle nicht
zufriedenstellend isoliert werden.
Referenzbeispiel 3:
-
Zu 100 ml einer Lösung, die L-Phenylalanin in der gleichen Zusammensetzung
wie in Beispiel 4 enthielt, wurde nach und nach 28% Ammoniakwasser
zugegeben, während die Temperatur bei 75 bis 80ºC gehalten wurde, bis ein
pH-Wert von 5,6 erreicht wurde, wodurch sich L-Phenylalanin-Kristalle
abschieden, und das resultierende Gemisch wurde unter Rühren nach und nach
abgekühlt. Wenn die Temperatur auf etwa 35ºC erniedrigt wurde, erfolgte ein
Kristallformübergang bei dem abgeschiedenen Phenylalanin (alpha - > beta), was
ein Rühren unmöglich machte. Folglich konnten die Kristalle nicht
zufriedenstellend isoliert werden.
-
Es ist klar, daß zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden
Erfindung angesichts der oben dargestellten Lehren möglich sind. Es ist daher
einzusehen, daß innerhalb des Schutzumfanges der beigefügten
Patentansprüche die Erfindung auch anders ausgeführt werden kann, als hier
spezifisch beschrieben worden ist.