JPH01501995A

JPH01501995A - 酵素合成方法

Info

Publication number: JPH01501995A
Application number: JP62502329A
Authority: JP
Inventors: ウィットテッカー、ロバート・ジョージ
Original assignee: コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼイション
Priority date: 1986-04-10
Filing date: 1987-04-08
Publication date: 1989-07-13
Also published as: EP0303602A1; AU591557B2; AU7236587A; WO1987006268A1; EP0303602A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵素合成方法本発明はアスパラギン酸塩基又はクルタミン酸塩基のいずれかをアミノ酸又はアミノ酸誘導体のＮ末端基に結合する方法に関する。本発明による方法はプロリン又はヒドロプロリンを除くアミノ酸らに応用され、且つアミノ酸が単離されているが又はペプチドのＮ末端基として存在するかにかかわらず実施可能である。従って本発明の方法はペプチド合成にを用である。

本発明による方法はアスバルターム（ＡＳＰＡＲＡＴＡＭＥ）の一般名で知られる人工甘味料の製造に特に遇している。アスバルタームは最初１９６６年に発見されたもので、次の構造式を有するジペプチドである。

アスパラギン酸　フェニルアラニンメチルエステルこれは砂糖の１００から２００倍の甘味力を有する。当該技術に於てアミノ酸を酵素により結合することが知られている。この公知文献として米国特許第４．０８６゜１３６号、同第４，１１６，７６８号、同第４，２８９゜７２１、同第４，５２１．５１４号及びオストラリア特許第５５８３３０号等が挙げられる。これら公知の方法によると、遊離ヒドロオキシル基を有するアミノ酸誘導体をアミノ酸誘導体又はペプチドに結合する際にこれを酵素の存在下で行う。これら凡ての公知の方法ではアミノ酸の結合をもたらすのに縮合反応を用いている。この反応の典型的な一般例は次の通りである。

Ａ１−０Ｒ＋　Ｈ−Ａ２Ｊ■Ｌ→Ａ１−　Ａ２＋Ｈ２０但し、Ａｌ及びＡ２はアミノ酸又はペプチドである。

本発明者は酵素ペプチド合成にチオールブロテナーゼを用いる点に関し研究中に、アスパルタームの誘導体、Ｚ−Ｌ−アスパルチル（β−ベンジルエステル）− Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（２はペンジオクシカルボニルの慣用略字）を形成するためにＺ−Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの反応に於てチオールブロテナーゼが触媒作用を有することを発見した。更に研究を進めた結果ノ酸誘導体又はペプチドのＮ末端基に結合するのに適用できることも判明した。

チオールブロテナーゼのエステラーゼ活性により反応が従来の縮合反応による方法を用いた場合より遥かに早く、効率が良いことが利点である。遊離カルボキシル基を有するアスパラギン酸又はグルタミン酸誘導体を用いた方法は異なると同時に反応に要する時間が分単位に対し日単位と効率が悪い。本発明の方法に於てエステラーゼ活性は遊離カルボキシル基を発生させないし、むしろ酵素Ｃ成分錯体に於てＣ成分のエステルはペプチド結合形成時に進入Ｎ成分のアミノ酸基による核作用を受け開環される。

本発明は、アスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩をアミノ酸のＮ末端基に付加する方法に関し、この場合アミノ酸はＣ末端保護基を有する誘導体として単独で或いはペプチドのＮ末端残基として存在する。本発明方法はチオールプロテナーゼの存在下で下記の一般式を有する化合物但しｎは１又は２Ｂ１はエステル結合を形成することができる基Ｂ２はエステル結合を形成でき且つチオールブロテナーゼにより開環可能な基Ｘは脂肪層又は芳香属疎水性基をアミノ酸又はＣ末端保護基を有するアミノ酸誘導体又はペプチドと反応させ一般式但しＡは前記アミノ酸又はこの誘導体又はペプチドで任意でＸ及びＢ１基を分子から除去したものを有する化合物を得ることにある。

本発明の好ましい実施例ではチオールブロテナーゼはパパイン又はキモパパインであり、ｎは１、Ｘはペンジルオクシ力ルボニル（Ｚとして周知）、Ｂ１及びＢ２は相方共ベンジル基、Ａはフェニルアラニンのメチルエステルである。反応生成物からＺ及びＢ１ベンジル基を除去してアスバルタームを製するのに水素添加方法を用いる。

チオールプロテナーゼは文献（例えばＡＤＶＡＮＣＥＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　Ｖｏｌ、５３，２３９−３０６頁参照）に紹介させていて周知であり、これには酵素パパイン、キモパパイン、フィシン、ブロメリン、カテプシンＢ、Ｃ及びストレブトコカールブロテナーゼ等が含まれる。Ｚの外に、本発明に於て他の多くの脂肪層又は芳香属疎水性基が用いられる。これらにはｔ−ＢＯＣ，Ｂ、ｐｏｃ及びＦｍｏ　ｃ等が含まれる。これらの化合物の用途及び特徴は５ＣＨＥＣＨＴＥＲＩ及びＢＥＲＧＥＲＡによるＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｐｈｙｓ、ＲＥＳ、Ｃ０ＭＭ、Ｖｏ　１．２７，１５７−１６２頁に且つＦＲＵＴＯＮ　Ｊ、ＳによりＡＤＶＡＮＣＥＳＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹＶｏ　１．５３，２３９− ３０６頁にそれぞれ紹介されている。

Ｂ１、及び／２はＢ２の位置でベンジルを置換できる基は例えばエチル又はメチル基である。但し、アスバルタームを製造する場合の反応率はＢ１及びＢ２が共にベンジル４である時がより大である。アスバメルターム製造の如く、本発明方法によりアスパラギン酸塩基又はグルタミン酸塩基を一つのアルミ酸誘導体に結合する場合、アミノ酸のＣ末端を保護することが望ましい。このアミン成分のカルボキシル基の保護基としてアルコクシ基、置換又は未置換ペンジルオクシ基、又はアミノ基が用いられる。当業者に明らかな通り、本発明によりアスパラギン酸塩基又はグルタミン酸塩基をペプチドに結合する場合、ペプチドのＣ末端を保護する必要はない。何故ならば、任意にすることはできるが、アスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩基が結合するペプチドのアミノ酸残基のカルボキシル基は既にペプチドを構成する他のアミノ酸残基により間接的に保護されているからである。

本発明を更に実施例につき詳述する。

（ｉ）Ｚ−Ｌ−アスパルチル（β−ベンジルエステル）−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの形成ａ）　ジメチルフォルムアシド中の１．０　ＭＺ−Ｌアスパラギン酸ジベンジルエステルｂ）　１１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び　２８　ｍＭメルカプトエタノール更に５．９μＭ活性パパインを含む５５％エタノール中の２７８　ｍＭ　Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、　ｐＩ（８，５反　応 “ａ”／部を“ｂ”　９部に室温で加え、ｐＨ８゜５に保った。合成状態を高圧液クロマトグラフ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により監視した。反応率は用いた”ａ＝の量に関して反応時間は約２〜３時間で７Ｏから８０％であった。合成生成物たるＺ −Ｌ−により抽出した。他の凡ての反応生成物は回収可能で、加水分解生成物であるＺ−Ｌ−アスノくラギン酸β−ベンジルエステルはリサイクルしてＺ−Ｌ− アスパラギン酸ジベンジルエステルを再生できる。実験によるとパパインは反応作条下で安定であるが、定期的に再活性の必要があることが判これはパラジウム触媒と水素ガスを用いた水素添加反応によるものである。この反応全体について第１図に概略を示した。Ｚ−Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステルの使用が他のアスパラギン酸誘導体に比し利点があるので本発明によるアスパルターム製造方法は他の公知の方法より種々の点で優れている。相方のカルボキシス基が同じ置換を有するので、比較的安価につくれる試薬である。Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの結合後側鎖は保護された状態にあるので、生成物を容品に析出できる。この点に関し、ある先行技術の方法、例えば米国特許第４，５２１．０２４号の方法等に於ては析出のために付加化合物を必要としているのに注目したい。Ｚ及びベンジル基は共に１回の触媒水素添加で合成生成物から除去し、アスバルタームを生成することができる。

ａ）　ジメチルフォルムアミド中の１．０　ｍＺ−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルｂ）　１１　ｍＭ　ＥＰＴＡ及び　２８　ｍＭメルカプトエタノール更に２．４μＭ活性パパインを含む４４％ジメチルフォルムアンド中の２２２　ｍＭ　Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、　ｐ）１８．５反　応 “ａ”／部を°ｂ”９部に室温で加え、ｐＨを８゜５に保った。合成状態をＨＰＬＣで監視した。用いた“ａｏの量に関し反応率は約９０％であった。

合成生成物たるＺ−Ｌ−グルタミン（γ−ベンジＺ−Ｌ−アスパルチル（β−ベンジル）−Ｌ−ａ）　ジメチルフォルムアンド中の８００　ｍＭＺ−Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステルｂ）　１１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び２８　ｍＭメルカプトエタノール更に２．４　μＭ活性パパインを含む５５％ジメチルフォルムアシド中の２２２　ｍＭ　Ｌ−アラニンエチルエステル、°ａ°／部を”ｂ’　９部に室温で加え、ｐＨ８゜５に保った。合成はＨＰＬＣにより監視した。Ｚ−Ｌ −アラニンエチルエステルに導入された“ａｌａ）　ジメチルフォルムアシド中の１．０　ＭＺ−Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステルｂ）　１１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び２８　ｍＭメルカプトエタノール更に５．９　μＭ活性パパインを含む５５％ジメチルフォルムアシド中の６６７　ｍＭ　Ｌ−セリンアシド、ｐＨ８゜反　応ａ°７部をｂ’　９部に室温で加え、ｐＨを８゜５に保った。反応はＨＰＬＣで監視した。Ｚ−Ｌ−アスパルチル（β−ベンジル）−Ｌ−セリンに導入されたａ ′の量に関し、反応率は約４０〜５０％であった。

実施例５ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アスパルチル（β−ベンジル）−アラニン−Ｌ−イソロイシル −Ｌ−フェニルラニンメチルエステルの形成ａ）　ジメチルフォルムアンド中の１．０　Ｍｔ−ブチルオキシカルボキシル− し−アスパラギン酸ジベンジルエステルｂ）　２８　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び４．３μＭ活性パパインを含む５５％ジメチルフォルムアシド中の１１１　ｍＭ　Ｌ−アラニル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、ｐＨ８，５反　応 “ａ−／部を°ｂ”　９部に室温で加え、ｐＨを８゜５に保った。反応はＨＰＬＣで監視した。用いた°ａ°の量に関し反応率は約３０〜４０％であった。合成生成物であるｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アスパルチル（β−ベンジル）−アラニン−し− イソロイ国際ｖ４ｆ報告、＋　−−、＋−−、、−、、−−、ＰＣＴ／ＡＵ　８７１０００９２八＋ＸＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　：ＮＴＥＲＮＡＴＴＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＦｕＲＴ　ＯＮ

Claims

【特許請求の範囲】〔１〕アミノ酸がＣ末端保護基を有する誘導体として単独で或いはペブチドのＮ末端残基として存在するアスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩をアミノ酸のＮ末端基付加する方法に於て、チオールブロテナーゼの存在下で下記の一般式を有する化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、ｎは１又は２、Ｂ１はエステル結合を形成することができる基Ｂ２はエステル結合を形成でき且つチオールブロテナーゼにより開環可能な基Ｘは脂肪属又は芳香属疎水性基をアミノ政又はＣ末端保護基を有するアミノ酸誘導体又はペブチドと反応させ一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但しＡは前記アミノ酸又はこの誘導体又はペブチドで任息でＸ及びＢ１基を分子から除去したものを有する化合物を合成することを特徴とする方法。〔２〕前記Ｂ１及びＢ２が同じ又は異なり、メチル、エチル及びベンジルからなる群から選ばれ且つ前記アミノ酸誘導体がＣ末端保護基を有することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。〔３〕前記チオールブロテナーゼがパパイン又はキモパパインであり且つ前記Ｘがベンジルオキシカルボキシル（Ｚ）又はｔ−ブチロオクシカルボキシル（ｔ− ＢＯＣ）であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。〔４〕前記Ｂ１及びＢ２が共にベンジル、前記チオールブロテナーゼがパパイン、ＸがＺであり更にＸ及びＢ１基が水素添加により除去されることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。〔５〕ａ）Ｚ−Ｌ−アネパラギン酸ジベンジルエステルをパパインの存在下でＬ −フエニルアラニンメチルエステルと反応させ、ｂ）生成したＺ−Ｌ−アスパルチル（β−ベンジルエステル）−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを回収し、ｃ）（ｂ）の回収生成物を水素添加反応に付しベンジル及びＺ基を除去することからなるＬ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル（アスパルターム）を製造する方法。