JPH0423995A - トランスペプチデーション用試薬及び方法 - Google Patents
トランスペプチデーション用試薬及び方法Info
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- JPH0423995A JPH0423995A JP2129148A JP12914890A JPH0423995A JP H0423995 A JPH0423995 A JP H0423995A JP 2129148 A JP2129148 A JP 2129148A JP 12914890 A JP12914890 A JP 12914890A JP H0423995 A JPH0423995 A JP H0423995A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は酵素法によるペプチド合成に関し、更に詳細に
はトランスペプチデーション用試薬及び方法に関する。
はトランスペプチデーション用試薬及び方法に関する。
目的の配列を持ったペプチドを得る手段として、１）遺
伝子操作、２）化学合成、３）酵素合成、が挙げられる
。遺伝子操作法では比較的長鎖のペプチドを大量に得る
ことができ、化学合成法では短時間で希望のペプチドが
得られ、しかも様々な修飾アミノ酸を持つものも合成可
能であり、また、酵素法では化学合成法に比べてラセミ
体を生成せず、側鎖官能基の保護を必要としないという
利点がある。
伝子操作、２）化学合成、３）酵素合成、が挙げられる
。遺伝子操作法では比較的長鎖のペプチドを大量に得る
ことができ、化学合成法では短時間で希望のペプチドが
得られ、しかも様々な修飾アミノ酸を持つものも合成可
能であり、また、酵素法では化学合成法に比べてラセミ
体を生成せず、側鎖官能基の保護を必要としないという
利点がある。
酵素法による合成としてはセリンカルボキシペプチダー
ゼを用いるカルスベルブ（Ｃａｒｓｂｅｒｇ、）法（特
公昭５６−５００５１９号）、林の方法（特公昭６２−
２３２３９３号）、構出らの方法（特公昭６３−２１６
４９７号）、バチルス・サーモプロテオリチカス （Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍ。
ゼを用いるカルスベルブ（Ｃａｒｓｂｅｒｇ、）法（特
公昭５６−５００５１９号）、林の方法（特公昭６２−
２３２３９３号）、構出らの方法（特公昭６３−２１６
４９７号）、バチルス・サーモプロテオリチカス （Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍ。
ｐｒｏｔｅｏｒｉｔｉｃｕｓ ）由来の金属プロテアー
ゼやサーモリシンなどのエンドペプチダーゼを用いる磯
和らの方法〔イソワ（Ｉｓｏｗａ）ら、ブレチンオブ
ザ ケミカル ソサエティー 才ブ ジャパン（Ｂｕｌ
ｌ、 ［：ｈｅｍ、 Ｓａｃ、 Ｊａｐａｎ）、第５０
巻、第２７６６頁（１９７７）：）、パパインを用いる
方法〔クルマン（Ｋｕｌｌｍａｎｎ、 Ｗ、 ）、バイ
オケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コ
ミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ｒｅｓ。
ゼやサーモリシンなどのエンドペプチダーゼを用いる磯
和らの方法〔イソワ（Ｉｓｏｗａ）ら、ブレチンオブ
ザ ケミカル ソサエティー 才ブ ジャパン（Ｂｕｌ
ｌ、 ［：ｈｅｍ、 Ｓａｃ、 Ｊａｐａｎ）、第５０
巻、第２７６６頁（１９７７）：）、パパインを用いる
方法〔クルマン（Ｋｕｌｌｍａｎｎ、 Ｗ、 ）、バイ
オケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コ
ミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ｒｅｓ。
Ｃｏｒｎｍｕｎ、 ） 、第９１巻、第６９３頁（１９
７９） ：］が行われており、これらはプロテアーゼの
逆反応を利用したものである。
７９） ：］が行われており、これらはプロテアーゼの
逆反応を利用したものである。
マルクセン（Ｍａｒｋｕｓｓｅｎ）はトリプシンを用い
たトランスベブチデーション反応によりヒトインシュリ
ンを製造した（特公昭５６−１３５４５２号） 〔発明が解決しようとする課題〕 遺伝子操作法では長鎖のペプチドを合成できるが、核酸
にコードし得る２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸残基
を含むペプチドは得られない。化学合成法で２０残基以
上のアミノ酸を含むペプチドを得ようとすると収率が極
端に悪くなる。プロテアーゼの逆反応を用いる方法では
アミノ末端とカルボキシル末端の保護が場合によって必
要であり、有機溶媒中で反応しなければ収率が著しく低
い場合があるために産物が変性する危険性がある。マル
クセンの方法では改変したい位置の近くにリジン又はア
ルギニン残基が存在することが必要である。
たトランスベブチデーション反応によりヒトインシュリ
ンを製造した（特公昭５６−１３５４５２号） 〔発明が解決しようとする課題〕 遺伝子操作法では長鎖のペプチドを合成できるが、核酸
にコードし得る２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸残基
を含むペプチドは得られない。化学合成法で２０残基以
上のアミノ酸を含むペプチドを得ようとすると収率が極
端に悪くなる。プロテアーゼの逆反応を用いる方法では
アミノ末端とカルボキシル末端の保護が場合によって必
要であり、有機溶媒中で反応しなければ収率が著しく低
い場合があるために産物が変性する危険性がある。マル
クセンの方法では改変したい位置の近くにリジン又はア
ルギニン残基が存在することが必要である。
本発明の目的は上記従来技術にかんがみ、容易かつ安価
な新たな酵素的ペプチド合成法を提供することにある。
な新たな酵素的ペプチド合成法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はトランスペ
プチデーション反応用試薬に関する発明であり、アスパ
ラギン残基特異的プロテアーゼを含有することを特徴と
する。
プチデーション反応用試薬に関する発明であり、アスパ
ラギン残基特異的プロテアーゼを含有することを特徴と
する。
そして、本発明の第２の発明はペプチドの製造方法に関
する発明であり、トランスペプチデーション反応により
ペプチドを製造する方法において、触媒としてアスパラ
ギン残基特異的プロテアーゼを用いることを特徴とする
。
する発明であり、トランスペプチデーション反応により
ペプチドを製造する方法において、触媒としてアスパラ
ギン残基特異的プロテアーゼを用いることを特徴とする
。
本発明者らは鋭意研究を行った結果、特願平１−２９７
４５０号として見出したし一アスパラギンのＣ末端側ア
ミド結合のみを選択的に水解するプロテアーゼ（アスパ
ラギン残基特異的プロテアーゼと称する）が、トランス
ペプチデーションを触媒することを新たに見出し本発明
を完成した。
４５０号として見出したし一アスパラギンのＣ末端側ア
ミド結合のみを選択的に水解するプロテアーゼ（アスパ
ラギン残基特異的プロテアーゼと称する）が、トランス
ペプチデーションを触媒することを新たに見出し本発明
を完成した。
本発明で用いるアスパラギン残基特異的プロテアーゼは
、Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを選択的
に氷解するプロテアーゼであればよく、起源、製法等は
問わないが、例えばタチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ
ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）の種子より得られるアスパ
ラギン残基特異的プロテアーゼが挙げられる（特願平１
−２９７４５０号参照） 触媒としてのアスパラギン残基特異的プロテアーゼは例
えばタチナタマメの種子から特願平１−２９７４５０号
明細書に記載のごとく次のようにして得られる酵素を用
いる。
、Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを選択的
に氷解するプロテアーゼであればよく、起源、製法等は
問わないが、例えばタチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ
ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）の種子より得られるアスパ
ラギン残基特異的プロテアーゼが挙げられる（特願平１
−２９７４５０号参照） 触媒としてのアスパラギン残基特異的プロテアーゼは例
えばタチナタマメの種子から特願平１−２９７４５０号
明細書に記載のごとく次のようにして得られる酵素を用
いる。
タチナタマメの種子を緩衝液中で粉砕し、その抽出物に
対してイオン交換クロマトグラフィ、パラマーキュリ安
息香酸を担体に固定化したカラムを用いるアフィニティ
ークロマトグラフィー、及びゲルろ過を行うことによっ
てアスパラギン残基特異的プロテアーゼが得られる。
対してイオン交換クロマトグラフィ、パラマーキュリ安
息香酸を担体に固定化したカラムを用いるアフィニティ
ークロマトグラフィー、及びゲルろ過を行うことによっ
てアスパラギン残基特異的プロテアーゼが得られる。
一般にチオールプロテアーゼがペプチド鎖の氷解を触媒
するに当っては次のような機構で行われていると考えら
れている。すなわち、まず水解されるべきペプチド結合
のＮ末端側のアミノ酸又はペプチドによって酵素の活性
中心のＳＨ基がアシル化され、その後に水の求核攻撃に
よって酵素が脱アシルされて反応が完結する。
するに当っては次のような機構で行われていると考えら
れている。すなわち、まず水解されるべきペプチド結合
のＮ末端側のアミノ酸又はペプチドによって酵素の活性
中心のＳＨ基がアシル化され、その後に水の求核攻撃に
よって酵素が脱アシルされて反応が完結する。
反応液中に比較的高濃度、例えば０．３Ｍ以上、のペプ
チド又はアミノ酸が存在すると脱アシルの際にアミツリ
シスによって一旦切断されたペプチド結合のカルボキシ
ル側にペプチド又はアミノ酸が付加される。この反応を
トランスペプチデーションと呼ぶ。なお、アミツリシス
を行うペプチド又はアミノ酸をアミン成分と呼ぶ。
チド又はアミノ酸が存在すると脱アシルの際にアミツリ
シスによって一旦切断されたペプチド結合のカルボキシ
ル側にペプチド又はアミノ酸が付加される。この反応を
トランスペプチデーションと呼ぶ。なお、アミツリシス
を行うペプチド又はアミノ酸をアミン成分と呼ぶ。
加水分解反応とトランスペプチデーション反応の起こる
比率は反応時のｐＨ、アミン成分の濃度、プロテアーゼ
の種類などの反応条件によって大きく左右される。
比率は反応時のｐＨ、アミン成分の濃度、プロテアーゼ
の種類などの反応条件によって大きく左右される。
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、触媒としてアスパ
ラギン残基特異的プロテアーゼを用い、ＰＨ７，５〜８
で０．３Ｍ以上のアミン成分を用いれば効率よくトラン
スベブチデーション反応が起こることを見出した。
ラギン残基特異的プロテアーゼを用い、ＰＨ７，５〜８
で０．３Ｍ以上のアミン成分を用いれば効率よくトラン
スベブチデーション反応が起こることを見出した。
アスパラギン残基特異的プロテアーゼを用いて行うトラ
ンスベプチデーション反応は例えば下記一般式（Ｉ）： Ａ−Ａｓｎ Ｂ＋Ｃ−Ａ −＾５ｎ−Ｃ十 Ｂ（
Ｉ） （式中Ａはアミノ酸若しくはペプチド又はそれらの誘導
体あるいはＨを表し、Ａｓｎはアスパラギン残基を表し
、Ｂはアミノ酸若しくはペプチド又はそれらの誘導体あ
るいはＮＨ２を表し、Ｃはアミノ酸若しくはペプチド又
はそれらの誘導体を表す。以下同じ）で示されるトラン
スペプチデーション反応が挙げられる。
ンスベプチデーション反応は例えば下記一般式（Ｉ）： Ａ−Ａｓｎ Ｂ＋Ｃ−Ａ −＾５ｎ−Ｃ十 Ｂ（
Ｉ） （式中Ａはアミノ酸若しくはペプチド又はそれらの誘導
体あるいはＨを表し、Ａｓｎはアスパラギン残基を表し
、Ｂはアミノ酸若しくはペプチド又はそれらの誘導体あ
るいはＮＨ２を表し、Ｃはアミノ酸若しくはペプチド又
はそれらの誘導体を表す。以下同じ）で示されるトラン
スペプチデーション反応が挙げられる。
上北トランスペプチデーションは、一般式（）：
％式％（）
を有するペプチド又はペプチド誘導体を製造する方法に
おいて、一般式（■）： Ａ−Ａｓｎ−Ｂ （ＩＩ）を有するペ
プチド又はペプチド誘導体（以下Ａｓｎ成分と略す）と
一般式（■）： Ｈ−Ｃ（ＩＶ） を有するアミノ酸若しくはペプチド又はそれらの誘導体
（以下アミン成分と略す）の混合水溶液にアスパラギン
残基特異的プロテアーゼを触媒として用いる反応である
。
おいて、一般式（■）： Ａ−Ａｓｎ−Ｂ （ＩＩ）を有するペ
プチド又はペプチド誘導体（以下Ａｓｎ成分と略す）と
一般式（■）： Ｈ−Ｃ（ＩＶ） を有するアミノ酸若しくはペプチド又はそれらの誘導体
（以下アミン成分と略す）の混合水溶液にアスパラギン
残基特異的プロテアーゼを触媒として用いる反応である
。
本発明のトランスベプチデーション反応で上記式Ｉの反
応の１例としては、下記式（Ｖ）で示される反応が挙げ
られる。
応の１例としては、下記式（Ｖ）で示される反応が挙げ
られる。
Ａ−＾５ｎ−Ｂ＋Ｄ−Ａｓｎ−Ｅ →Ａ−Ａｓｎ−Ｅ
＋Ｄ−＾５ｎ−Ｂ （Ｖ）式中りはアミノ酸若しく
はペプチド又はそれらの誘導体あるいはＨを表し、Ｅは
アミノ酸若しくはペプチド又はそれらの誘導体あるいは
ＮＨ２を表すが、ＡとＤ及びＢとＥが同一のことはない
。
＋Ｄ−＾５ｎ−Ｂ （Ｖ）式中りはアミノ酸若しく
はペプチド又はそれらの誘導体あるいはＨを表し、Ｅは
アミノ酸若しくはペプチド又はそれらの誘導体あるいは
ＮＨ２を表すが、ＡとＤ及びＢとＥが同一のことはない
。
アミノ酸の誘導体とは、アミノ酸のα−カルボキシル基
がアミド化又はエステル化されたもの、糖又は糖鎖が付
加されたアミノ酸、α−アミノ酸がアシル化されたもの
、及び水酸基がリン酸化又は硫酸化されたアミノ酸を指
す。また、ペプチドの誘導体とは上記のアミノ酸の誘導
体を少なくとも１残基含むペプチドを指す。
がアミド化又はエステル化されたもの、糖又は糖鎖が付
加されたアミノ酸、α−アミノ酸がアシル化されたもの
、及び水酸基がリン酸化又は硫酸化されたアミノ酸を指
す。また、ペプチドの誘導体とは上記のアミノ酸の誘導
体を少なくとも１残基含むペプチドを指す。
一般式（ＩＩ）で表されるペプチド又はその誘導体は生
物から抽出する、遺伝子工学的に生産する、化学合成す
るなどの方法によって得ることができる。一般式（ＩＶ
）で表されるペプチド、アミノ酸、及びそれらの誘導体
も同様にして得られる。
物から抽出する、遺伝子工学的に生産する、化学合成す
るなどの方法によって得ることができる。一般式（ＩＶ
）で表されるペプチド、アミノ酸、及びそれらの誘導体
も同様にして得られる。
以下、トランスペプチデーションについて説明する。
第１図はトランスペプチデーション反応に対するｐＨの
影響を示すグラフである。ＤＮＰＰｒｏ−Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ａｓｎ−ＮＨ２（ＤＮＰは２，４−ジニトロフ
ェニル基を表す）をＡｓｎ成分、０．５Ｍ Ｇｌｙ−
Ｇｌｙをアミン成分として水酸化ナトリウム又は塩酸で
ｐ）Ｉを調整し、３７℃で２０分間反応した後Ｃ＋ａ逆
相ＨＰＬＣで分析した結果トランスベプチデーションの
至適ｐＨは７．７であった。黒丸印はトランスペプチデ
ーションの結果生成したＤＮＰ Ｐｒ。
影響を示すグラフである。ＤＮＰＰｒｏ−Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ａｓｎ−ＮＨ２（ＤＮＰは２，４−ジニトロフ
ェニル基を表す）をＡｓｎ成分、０．５Ｍ Ｇｌｙ−
Ｇｌｙをアミン成分として水酸化ナトリウム又は塩酸で
ｐ）Ｉを調整し、３７℃で２０分間反応した後Ｃ＋ａ逆
相ＨＰＬＣで分析した結果トランスベプチデーションの
至適ｐＨは７．７であった。黒丸印はトランスペプチデ
ーションの結果生成したＤＮＰ Ｐｒ。
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ Ｇｌｙを、Ｘ印は
氷解の結果生成したＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
Ａｓｎを示す（以下同じ）横軸はｐＨを、縦軸は反応産
物の相対量を示す。
氷解の結果生成したＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
Ａｓｎを示す（以下同じ）横軸はｐＨを、縦軸は反応産
物の相対量を示す。
第２図はｐ）１７．７において様々な濃度のアミン成分
であるＧｌｙ−ｃｔｙの存在下反応した結果を示す。Ａ
ｓｎ成分としてはＤＮＰ−Ｐｒ。
であるＧｌｙ−ｃｔｙの存在下反応した結果を示す。Ａ
ｓｎ成分としてはＤＮＰ−Ｐｒ。
−Ｇｌｕ Ａｌａ−Ａｓｎ ＮＨ２を用いた。
横軸はＧｕｙ−Ｇｌｙの濃度（Ｍ）を、縦軸は反応産物
の相対量を示す。アミン成分の増加と共にトランスペプ
チデーション効率は上昇し、０．３Ｍを超えると氷解産
物を上回る。
の相対量を示す。アミン成分の増加と共にトランスペプ
チデーション効率は上昇し、０．３Ｍを超えると氷解産
物を上回る。
第３図はｐＨ７，７においてアミン成分として０．５Ｍ
のＧｌ ｙ−Ｇｌｙｓ Ａｓｎ成分としてＤＮＰ Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ ＡｓｎＮＨ，の存在下３７℃
で様々な時間反応した結果を示す。横軸は時間（分）を
、縦軸はトランスペプチデーションの結果生成したＤＮ
ＰＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの
相対量を示す。本酵素はｐＨ４，５〜６において安定で
あるが、それ以上のｐＨで不安定なので８０分を超える
と酵素の失活のために反応はこれ以上進まなくなる。
のＧｌ ｙ−Ｇｌｙｓ Ａｓｎ成分としてＤＮＰ Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ ＡｓｎＮＨ，の存在下３７℃
で様々な時間反応した結果を示す。横軸は時間（分）を
、縦軸はトランスペプチデーションの結果生成したＤＮ
ＰＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの
相対量を示す。本酵素はｐＨ４，５〜６において安定で
あるが、それ以上のｐＨで不安定なので８０分を超える
と酵素の失活のために反応はこれ以上進まなくなる。
本発明によれば種々のペプチドを容易に合成することが
可能である。特にペプチドのＣ末端がアミド化された生
理活性ペプチドの合成に有利な方法である。
可能である。特にペプチドのＣ末端がアミド化された生
理活性ペプチドの合成に有利な方法である。
以下実施例で本発明をより具体的に説明するが、本発明
はこれら実施例に限定されるものではない。
はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
市販ジャックビーンミール（シグマ社製）５００ｇを１
ｍＭ ＤＴＴ、、ＩＯＩＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）でホモゲナイズし遠心分離
により上清を得た。該上滑を上記緩衝液に対して透析後
、再び生じた沈殿を遠心分離により除去し、ＳＰ−トヨ
パール６５０Ｍ（東ソー製）によるイオン交換クロマト
グラフィーヲ行った。５Ｐ−）コバール６５０Ｍカラム
に吸着し、０．５Ｍ塩化ナトリウムにて溶出した活性画
分を６０％飽和硫安沈殿後、０．１Ｍ塩化ナトリウム、
１ ｍＭ Ｄ Ｔ Ｔ 、 １ ｍＭ Ｅ Ｄ
Ｔ Ａを含む２０＋ｎＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）に対
して透析した。次にバラマーキュリ安息香酸を固定化し
たトヨパール（東ソー製）によるクロマトグラフィーを
行い、１Ｍ塩化ナトリウム：５０ｒｎＭＤＴＴ、１ｃｎ
Ｍ ＥＤＴＡを含む酢酸緩衝液（ｐ）Ｉ５．０）で溶
出した両分をロイシルアルギナール力ラム（オルガノ製
）によるアフィニティークロマトグラフィーを行い、同
カラムに吸着されない活性画分を回収した。この両分を
排除分子量１０．０００の限外ろ過膜にて濃縮した後ト
ヨパールＨＷ−５５３（東ソー製）によるゲルろ過を行
った。こうして得られた酵素標品を以下の検討に用いた
。
ｍＭ ＤＴＴ、、ＩＯＩＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）でホモゲナイズし遠心分離
により上清を得た。該上滑を上記緩衝液に対して透析後
、再び生じた沈殿を遠心分離により除去し、ＳＰ−トヨ
パール６５０Ｍ（東ソー製）によるイオン交換クロマト
グラフィーヲ行った。５Ｐ−）コバール６５０Ｍカラム
に吸着し、０．５Ｍ塩化ナトリウムにて溶出した活性画
分を６０％飽和硫安沈殿後、０．１Ｍ塩化ナトリウム、
１ ｍＭ Ｄ Ｔ Ｔ 、 １ ｍＭ Ｅ Ｄ
Ｔ Ａを含む２０＋ｎＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）に対
して透析した。次にバラマーキュリ安息香酸を固定化し
たトヨパール（東ソー製）によるクロマトグラフィーを
行い、１Ｍ塩化ナトリウム：５０ｒｎＭＤＴＴ、１ｃｎ
Ｍ ＥＤＴＡを含む酢酸緩衝液（ｐ）Ｉ５．０）で溶
出した両分をロイシルアルギナール力ラム（オルガノ製
）によるアフィニティークロマトグラフィーを行い、同
カラムに吸着されない活性画分を回収した。この両分を
排除分子量１０．０００の限外ろ過膜にて濃縮した後ト
ヨパールＨＷ−５５３（東ソー製）によるゲルろ過を行
った。こうして得られた酵素標品を以下の検討に用いた
。
実施例２
Ａｓｎ成分として０．０２ｍＭ ＤＮＰ−Ｐｒ。
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＮＨａ 、アミン成分とし
て０．５Ｍ Ｇｌｙ−Ｇｌｙを用い、５ｍＭＤＴＴと
０．００４８ｍＵの酵素を含む反応液中で３７℃におい
て２０分間様々なｐＨでトランスペプチデーション反応
を行った。ｐＨの調整はＩＮ塩酸又はＩＮ水酸化ナトリ
ウムで行った。
て０．５Ｍ Ｇｌｙ−Ｇｌｙを用い、５ｍＭＤＴＴと
０．００４８ｍＵの酵素を含む反応液中で３７℃におい
て２０分間様々なｐＨでトランスペプチデーション反応
を行った。ｐＨの調整はＩＮ塩酸又はＩＮ水酸化ナトリ
ウムで行った。
反応後、ＣＩａ逆相カラムを用いたＨＰＬＣで３５０
ｎｍの吸光度のあるピークを分取して６Ｎ塩酸加水分解
したものをアミノ酸分析によって同定した。その結果を
第１図に示す。この図かられかるようにこの酵素は弱酸
性では脱アミド反応を主に触媒し、中性付近ではトラン
スペプチデーション反応を触媒した。
ｎｍの吸光度のあるピークを分取して６Ｎ塩酸加水分解
したものをアミノ酸分析によって同定した。その結果を
第１図に示す。この図かられかるようにこの酵素は弱酸
性では脱アミド反応を主に触媒し、中性付近ではトラン
スペプチデーション反応を触媒した。
実施例３
実施例２のＧＩｙ Ｇｌｙの代りに０．５ＭＧｌｙ−Ｇ
ｌｙ−ＮＨ２（ｐ）（７，７）をアミン成分としてトラ
ンスペプチデーションを行った。
ｌｙ−ＮＨ２（ｐ）（７，７）をアミン成分としてトラ
ンスペプチデーションを行った。
ＨＰＬＣでＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ及
びそれのアミド以外に現れたピークを分取して塩酸加水
分解後アミノ酸分析を行ってトランスペプチデーション
を確認した。
びそれのアミド以外に現れたピークを分取して塩酸加水
分解後アミノ酸分析を行ってトランスペプチデーション
を確認した。
実施例４
１１残基のアミノ酸からなるペプチド、Ｈｌｓ−Ｔｙｒ
−１ｉｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ ＩｌｅＴｈｒ−Ａｒｇ−
Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ，（ペニンスラ社製）０
．２ｍＭをＡｓｎｍ分、Ｇｌｙ ＧｌｙＳＧｌｙ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ。
−１ｉｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ ＩｌｅＴｈｒ−Ａｒｇ−
Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ，（ペニンスラ社製）０
．２ｍＭをＡｓｎｍ分、Ｇｌｙ ＧｌｙＳＧｌｙ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ。
Ｇｌｙ ＮＨ＊又はＧ Ｉ ｙ Ｇ ｌ ｙ −Ｎ
Ｈ２のいずれか１つ０．５Ｍをアミン成分として３７
℃、ｐ）１７．７で３時間トランスペプチデーション反
応を行い、Ｃ１１ｌ逆相ＨＰＬＣで分取した後生成した
各ペプチドのアミノ酸配列を決定しトランスペプチデー
ション反応を確認した。トランスペプチデーション反応
産物と氷解反応産物の比はそれぞれ１：ｌ １：１，７
：１．４：１であり、高収率でトランスペプチデーショ
ン反応が起こっていた。
Ｈ２のいずれか１つ０．５Ｍをアミン成分として３７
℃、ｐ）１７．７で３時間トランスペプチデーション反
応を行い、Ｃ１１ｌ逆相ＨＰＬＣで分取した後生成した
各ペプチドのアミノ酸配列を決定しトランスペプチデー
ション反応を確認した。トランスペプチデーション反応
産物と氷解反応産物の比はそれぞれ１：ｌ １：１，７
：１．４：１であり、高収率でトランスペプチデーショ
ン反応が起こっていた。
以上詳細に説明したように、本発明によりペプチド鎖中
のし一アスパラギン残基のカルポキシル側にペプチド若
しくはアミノ酸又はそれらの誘導体を付加する方法が提
供された。
のし一アスパラギン残基のカルポキシル側にペプチド若
しくはアミノ酸又はそれらの誘導体を付加する方法が提
供された。
本発明により生理活性を有する各種ペプチドを酵素的に
製造することが可能である。
製造することが可能である。
第１図はトランスペプチデーション反応に対するｐＨの
影響を示すグラフ、第２図はトランスベブチデーション
反応に対するグリシルグリシンの濃度の影響を示すグラ
フ、第３図はトランスペプチデーション反応に対する反
応時間の影響を示すグラフである。
影響を示すグラフ、第２図はトランスベブチデーション
反応に対するグリシルグリシンの濃度の影響を示すグラ
フ、第３図はトランスペプチデーション反応に対する反
応時間の影響を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アスパラギン残基特異的プロテアーゼを含有するこ
とを特徴とするトランスペプチデーション反応用試薬 ２、トランスペプチデーション反応によりペプチドを製
造する方法において、触媒としてアスパラギン残基特異
的プロテアーゼを用いることを特徴とするペプチドの製
造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2129148A JPH0423995A (ja) | 1990-05-21 | 1990-05-21 | トランスペプチデーション用試薬及び方法 |
| EP19910303884 EP0458475A3 (en) | 1990-05-21 | 1991-04-30 | Transpeptidation reagent and method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2129148A JPH0423995A (ja) | 1990-05-21 | 1990-05-21 | トランスペプチデーション用試薬及び方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0423995A true JPH0423995A (ja) | 1992-01-28 |
Family
ID=15002326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2129148A Pending JPH0423995A (ja) | 1990-05-21 | 1990-05-21 | トランスペプチデーション用試薬及び方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0458475A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0423995A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07509128A (ja) * | 1992-07-13 | 1995-10-12 | バイオネブラスカ・インコーポレーテッド | 組換型ポリペプチドの修飾方法 |
| US5656456A (en) * | 1992-07-13 | 1997-08-12 | Bionebraska, Inc. | Chemical method for selective modification of the N- and/or C-terminal amino acid α-carbon reactive group of a recombinant polypeptide or a portion thereof |
| US5512459A (en) * | 1993-07-20 | 1996-04-30 | Bionebraska, Inc. | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02261378A (ja) * | 1989-04-03 | 1990-10-24 | Takara Shuzo Co Ltd | エンドペプチダーゼ |
-
1990
- 1990-05-21 JP JP2129148A patent/JPH0423995A/ja active Pending
-
1991
- 1991-04-30 EP EP19910303884 patent/EP0458475A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0458475A3 (en) | 1992-03-18 |
| EP0458475A2 (en) | 1991-11-27 |
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