JPH02261378A - エンドペプチダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はペプチド又はタンパク質中のアスパラギン残基
のＣ末端側ペプチド結合を特異的に加水分解するエンド
ペプチダーゼに関する。

〔従来の技術〕

植物種子中に存在するレクチンや貯蔵タンパク質のＣ末
端アミノ酸はアスパラギンである例が多い。タチナタマ
メ［Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉａ　ｅｎｓｉｆｏｒ−ｍｉ
ｓ　〕由来のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の場合も、
α型及びその断片化サブユニットといわれるβ型（二本
鎖型）のいずれのＣ末端アミノ酸もアスパラギンである
。近年、Ｃａｎ　Ａは前駆体から一旦β類似型が生成し
、その後備中のアスパラギン残基部位でペプチド転移に
よる再結合が進行し一本鎖のα型が形成されるという生
合成スキームが報告されたＣ　Ｄ、　Ｊ、ボーレス（Ｄ
。

Ｊ、　Ｂｏｗｌｅｓ　）ら、ジャーナル　オブ　セル　
バイオロジイ（Ｊ、　Ｃｅｊｌ　Ｂｉｏｌ、）、第１°
０２巻、第１２８４頁（１９８６年）〕。

これらのことは特異的加水分解とペプチド転移を触媒す
るアスパラギン残基特異的エンドペプチダーゼの存在を
強く示唆するものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

特定のアミノ酸残基を認識し、特異的に加水分解するエ
ンドペプチダーゼとしては、リジン残基特異的酵素、ア
ルギニン残基特異的酵素、グルタミン酸・アスパラギン
酸特異的酵素、プロリン特異的酵素等が報告されている
。

本発明の目的はアスパラギン残基に特異的な酵素を提供
することにある。

〔課題を解決するための手段］ 本発明を概説すれば、本発明は植物種子例えはタチナタ
マメから単離・精製されたペプチド又はタンパク質中の
アスパラギン残基のＣ末端側ペプチド結合を特異的に加
水分解するエンドペプチダーゼに関するものである。本
発明者らは、ＣＯｎ＾前駆体のプロセッシングがパラク
ロロ゛メルクリベンゼンスルホン酸で阻害さレルコとを
見出し、本阻害物質を固定化したアフイニティクロマト
グラフィーを用いてアスパラギン残基特異的エンドペプ
チダーゼを単離・精製し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明のエンドペプチダーゼは、次の酵素化学
的性質を有するものである。

作用及び基質特異性：ペプチド又はタンパク質における
アスパラギン残基のＣ末 端側ペプチド結合を特異的に加水分 解する 阻害剤：パラクロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）パラ
クロロメルクリベンゼンスルホ ン酸（ＰＣＩＢＳ） Ｎ−エチルマレイミド（ＮＢＭ） ｐＨ及び温度安定性：　１０（ｂｎＭメルカプトエタノ
ール存在下において、ＰＩＩ５．Ｏで３５℃、１０時間
、ｐＨ７，０で３５℃、２時間安定至適ｐＨ：４，５〜
５．５ 至適温度：４０℃付近 以下に本発明の構成を詳細に説明する。

アスパラギン残基を特異的に認識するエンドペプチダー
ゼの関与が強く示唆されるＣｏｎ＾のプロセッシングは
、ＳＨ酵素阻害物質であるＰＣＭＢ５により強く阻害を
受けることが明らかになった。そこでバラメルクリ安息
香酸（ＰＭＢ）をアガロースゲルに固定化したアフィニ
ティクロマトグラフィー及び種々のイオン交換クロマト
グラフィー、ゲルろ過法等の精製手段により本酵素の単
離・精製を行った。精製過程での基質は口ＮＰ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｕ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｎ）ｌｚを用い、反応によ
り生成した口ＮＰ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｕ−＾１ａ−Ａｓｎ
を逆相系ＨＰＬＣ’により定量し、た。得られた精製酵
素はＰＣＭＢ５で強く阻害され、目的のＣｏｎ＾のプロ
セッシングに関与する酵素であることが示唆された。次
に種々の合成ペプチドを基質として本酵素の特異性を検
討した。ＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−＾１ａ−＾５ｎ−Ｖ
ａｌ−１１ｅ−＾ｒｇ−ＮＬ　％フィサレミン（Ｐｈｙ
ｓａｌａｅｍｉｎ　）　（Ｐｙｒ。

−Ｇｌｕ−＾１ａ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−＾５ｎ−Ｌｙｓ−
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨｓ　
）　、”−−−ロテンシン（Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ）
（Ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−＾５ｎ
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
１１ａ−Ｌｅｕ　）を基質として、ｐＨ５，０，３５℃
、２１時間、本酵素により消化を行った後、逆相系）Ｉ
ＰＬＣにより分析し、２１５ｎｍの波長により吸収の認
められたピークをそれぞれ分取し、塩酸加水分解後、ア
ミノ酸組成分析により生成したペプチドフラグメントを
同定した。その結果、本酵素は上記ペプチドをアスパラ
ギン残基のＣ末端側ペプチド結合のみを切断しているこ
とが確認された。

本発明のエンドペプチダーゼは種々の植物種子より得る
ことができる。例えば上記したタチナタマメのほか、イ
ンゲン、アズキ、ダイズ、カポチャ、トウモロコシ等を
用いることができる。

植物種子よりの本発明のエンドペプチダーゼの精製方法
は公知の酵素精製法であるイオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過法等を用いて
行うことができるが、阻害物質を用いたアフイニテイク
ロマトグラフィーが特に効果的である。

〔実施例〕

以下本発明を実施例により更・に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ 日本産未熟タチナタマメ５００ｇを２ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸す）　＋
Ｊウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）でホモ
ゲナイズし遠心分離により上清を得た。

８０％硫安沈殿後上記緩衝液に対し透析し、ＳＰ−トヨ
バールカラムクロマトグラフィーを行った。塩化ナトリ
ウム濃度勾配法により活性画分を溶出し、再び上記緩衝
液に対し透析した。活性の測定は口ＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇ　
ｌ　ｕ−＾１ａ−＾５ｎ−ＮＬを用い、ＨＰＬＣにより
生成物を定量することにより行った。

続いてＰＭＢをアガロースに固定化して作ったカラムを
用いてアフィニティクロマトグラフィーを行った。

塩化す）　ＩＪウム濃度勾配法により活性画分を回収し
精製酵素を得た。得られた精製酵素はＰＣＭＢ５ＰＣＭ
Ｂ５　、　ＮＢＭにより強く阻害された。また０ＮＰ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−＾１ａ−＾５ｎ−ＮＬを基質とした時
の反応至適ｐＨは４．５〜５．５であった。フィサレミ
ン（Ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−＾１ａ−＾５ｐ−ｐｒｏ−＾８
にしｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−
ＮＨｚ）を基質としてｐＨ５，０，３５℃、２１時間反
応を行ったところ、基質はほぼ完全に消失し、Ｐｙｒｏ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−＾ｓｎ及びＬｙｓ
−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨｓの
２種のペプチドが生成した。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明によりアスパラギン
残基特異的エンドペプチダーゼが提供された。本酵素は
アスパラギン残基特異的なタンパク質限定加水分解及び
ペプチド転移反応を行うことができ、タンパク質工学の
分野で有用である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の酵素化学的性質： 作用及び基質特異性：ペプチド又はタンパク質における
   アスパラギン残基のＣ末 端側ペプチド結合を特異的に加水分 解する 阻害剤：パラクロロメルクリ安息香酸 パラクロロメルクリベンゼンスルホ ン酸 Ｎ−エチルマレイミド ｐＨ及び温度安定性：１００ｍＭメルカプトエタノール
   存在下において、ｐＨ５．０で３５℃、１０時間、ｐＨ
   ７．０で３５℃、２時間安定至適ｐＨ：４．５〜５．５ 至適温度：４０℃付近 を有していることを特徴とするエンドペプチダーゼ。