DE69221024T2

DE69221024T2 - Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-Estern oder Erythorbinsäure-Estern

Info

Publication number: DE69221024T2
Application number: DE69221024T
Authority: DE
Inventors: Shiro Miyamoto; Keiichi Sakashita; Akihiro Sakimae
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1991-05-18
Filing date: 1992-04-29
Publication date: 1997-12-18
Anticipated expiration: 2012-04-30
Also published as: US5455174A; EP0514694A1; DE69221024D1; EP0514694B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG:

Gebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines organischen Säureesters der Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure unter Ausnutzung einer Umesterung durch ein Enzym.

Stand der Technik:

Ascorbinsäure und Erythorbinsäure werden allgemein als Zusatzstoffe für Nahrungsmittel und Kosmetika verwendet, um deren Oxidation zu verhindern, da Ascorbinsäure und Erythorbinsäure ein starkes Reduktionsvermögen haben.
Nichtsdestoweniger, da Ascorbinsäure und Erythorbinsäure sich nicht leicht in Ölen lösen, werden sie zu ihren organischen Säureestern mit einer hohen Öllöslichkeit, wie z.B. Palmitat, Myristat oder Stearat, umgesetzt, so dass die Oxidation öliger Nahrungsmittel, wie z.B. von Nüssen, Kartoffelchips, Mayonnaise, Margarine, gebratenen Snacks usw., verhindert wird.
Zudem sind einige Salze der organischen Säureester der Ascorbinsäure als oberflächenaktive Agenzien für Nahrungsmittel und als Anti-Bräunungsmittel für Früchte und Blumen nützlich.
Ein Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-6- palmitinsäureester wurde in der JP-OS Nr. 54-88261 offenbart. In diesem Verfahren wird Fluorwasserstoff als Lösungsmittel und als Katalysator verwendet.
Zudem offenbarte die JP-OS Nr. 59-17Q085 ein Verfahren zur Herstellung eines Fettsäureesters der Ascorbinsäure, in dem Schwefelsäure mit einer Konzentration von über 96 % als Lösungsmittel und Katalysator verwendet wurde.
In diesen Verfahren wird eine stark korrosive Säure, wie z.B. Fluorwasserstoff oder Schwefelsaure, verwendet. Daher weisen die Verfahren die Nachteile auf, dass der Apparat und die Gefässe gegen Korrosion sehr resistent sein müssen, dass die Handhabung der Reaktionsmischung schwierig ist und dass eine grosse Menge Alkali für das Abwasser benötigt wird.
Um die Nachteile der herkömmlichen Verfahren zu überwinden, wurde ein Verfahren zur Herstellung eines Esters durch Umsetzen der Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure mit einer Carbonsäure oder ihrem Ester in einem organischen Lösungsmittel in Anwesenheit eines Enzyms als Katalysator in der japanischen Patentanmeldung Nr. 27069/1990 (JP-OS Nr. 3-117495, EP-A2-0 401 704) von einem der Erfinder und anderen vorgeschlagen. Dieses Verfahren weist den Vorteil auf, dass die Reaktion unter milderen Bedingungen mit hoher Selektivität durchgeführt werden kann als die herkömmlichen Verfahren, und dass herkömmliche Anlagen verwendet werden können. Nichtsdestotrotz, da die Estersynthese gemäss diesem Verfahren im wesentlichen im Gleichgewicht verläuft, beträgt die Konzentration des Estersder Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure in der Reaktionsmischung nur 2 bis 3 % aufgrund der Bildung von Wasser. Daher ist die Produktivität nicht zufriedenstellend.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Als Ergebnis kontinuierlicher Forschung zur Überwindung der oben erläuterten Defekte wurde gefunden, dass ein organischer Säureester mit einer hohen Reaktionsgeschwindigkeit und in einer hohen Konzentration synthetisiert werden kann, wenn Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure mit einem organischen Säureenolester, der durch die allgemeine Formel (I) dargestellt ist:
R&sub1;COO- =CH&sub2; (I)
worin R&sub1; eine Alkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe bedeutet, und R&sub2; ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet, in einem organischen Lösungsmittel, dessen Löslichkeit (Gew./Vol.) für Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure bei 25ºC 0,3 % oder mehr beträgt, in Anwesenheit einer aktiven Lipase umgesetzt wird, so dass ein organischer Ester der Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure gebildet wird, der durch die allgemeine Formel (II) oder (III) dargestellt ist.
worin R&sub1; die gleiche Bedeutung wie oben hat.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

In der vorliegenden Erfindung, obwohl die Anzahl Kohlenstoffatome der Alkylgruppe, dargestellt durch R&sub1; in der allgemeinen Formel, nicht besonders beschränkt ist, schliesst die Alkylgruppe Alkylgruppen mit einer verhältnismässig kleinen Anzahl Kohlenstoffatome, wie z.B. die Methylgruppe (Anzahl der Kohlenstoffatome = 1), Ethylgruppe (Anzahl der Kohlenstoffatome = 2) und Propylgruppe (Anzahl der Kohlenstoffätome = 3) wie auch längere Alkylgruppen, wie die Dodecylgruppe (Anzahl der Kohlenstoffatome 12), Pentadecylgrüppe (Anzahl der Kohlenstoffatome = 15) und Hexadecylgruppe (Anzahl der Kohlenstoffatome = 16) ein. Die Alkylgruppe schliesst auch solche mit einer ungesättigten Bindung, wie z.B. die Oleylgruppe, ein. Als Aralkylgruppe sei z.B. die Benzylgruppe und als Arylgruppe z.B. die Phenylgruppe erwähnt.
Zur Synthese der Ester sind eine direkte Synthese eines Esters aus einer Säure und einem Alkohol, eine Umesterung eines Esters mit einem Alkohol und eine Umesterung eines Esters mit einer Säure bekannt. Diese sind alle Gleichgewichtsreaktionen und daher erfordern sie eine Trennung solcher Nebenprodukte, wie Wasser, Alkohol und Säure, von dem Reaktionssystem in einer guten Effizienz, so dass das Produkt mit einem hohen Umsetzungsgrad erhalten wird. Bei der Herstellung eines Esters durch Verwendung eines Enzyms werden die gleichen Bedingungen benötigt.
Die Gründe, wieso ein organischer Säureenolester als Substrat zum Herstellen des Esters verwendet wird, sind die folgenden:
(1) solch ein Ester hat eine geringe Bindungsenergie zwischen dem Alkoxyteil und dem Acylteil, so dass ein Enzym-Acyl-Komplex leicht gebildet wird; und
(2) Aceton oder Acetaldehyd, welche als Nebenprodukt der Umesterung gebildet werden, können nicht als Substrat für die folgende Umesterung dienen, und daher wird eine gegenläufige Reaktion nicht verlaufen, so dass der Ester mit einem hohen Umsetzungsgrad hergestellt werden kann.
Verschiedene Reaktionen sind für die Synthese eines Esters in einem organischen Lösungsmittel unter Verwendung eines Enzyms durchgeführt worden. Es wird gesagt, dass der logarithmische Wert (log p) des organischen Lösungsmittel zwischen Octanol und Wasser als Massstab zur Auswahl des organischen Lösungsmittels für solche Reaktionen ist. Es wurde berichtet, dass ein organisches Lösungsmittel, dessen log p 2 oder mehr, vorzugsweise 4 oder mehr, beträgt, für eine stabile Durchführung der Enzymreaktion bevorzugt ist (C. Laane, J. Tramper und M.D. Lilly, Stud. arg. Chem. 29, 65 (1987)).
Andererseits sind die erfindungsgemäss verwendete Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure sehr wasserlöslich und ein organischer Säureenolester ist sehr öllöslich. Daher löst ein Lösungsmittel, dessen log p 2 oder mehr beträgt, nicht sowohl die Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure wie auch den Enolester. Zur Lösung dieses Problems kann ein Zweikomponentensystem, bestehend aus einem Lösungsmittel mit einem grösseren Wert von log p und Wasser in Betracht gezogen werden. Jedoch, da Ascorbinsäure und Erythorbinsäure leicht in Wasser oxidiert werden, kann ein Zweikomponentensystem als Lösungsmittel für die Reaktion nicht bevorzugt sein.
Als Ergebnis der Untersuchung der organischen Lösungsmittel für die Synthese des organischen Esters wurde gefunden, dass die Reaktion mit einer guten Ausbeute verläuft, wenn ein Lösungsmittel, dessen Löslichkeit (Gew./Vol.) für Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure bei 25ºC 0,3 % oder mehr beträgt, verwendet wird. Unter einer grossen Anzahl von Lösungsmitteln werden Pyridin (Löslichkeit: mehr als 6 %), t-Butanol (Löslichkeit: 0,62 %), Dioxan (Löslichkeit: 0,57 %) oder Tetrahydrofuran (Löslichkeit: 1,1 %) bevorzugt.
Der Wassergehalt in dem Reaktionssystem ist zur Unterdrückung der Rückreaktion, wie oben beschrieben, wichtig. Es wurde in Erwägung gezogen, dass an dem Enzym gebundenes Wasser zur Beibehaltung der dreidimensionalen Struktur des Enzyms und zur Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität in einem organischen Lösungsmittel notwendig ist. Ein Wassergehalt von vorzugsweise 100 bis 10.000 ppm, besonders bevorzugt von 1.000 bis 5.000 ppm, in dem organischen Lösungsmittel ist bevorzugt. Ein Wassergehalt über 10.000 ppm oder unter 100 ppm wird in einer unerwünschten Erniedrigung der Reaktionsgeschwindigkeit und/oder in einer Erhöhung der Nebenreaktionen, wie z.B. die Rückreaktion und die Hydrolyse des Enolesters resultieren.
Die erfindungsgemäss verwendete Lipase schliesst jede durch ein Tier, eine Pflanze oder einen Mikroorganismus hergestellte Lipase ein, solange sie eine katalytische Aktivität für die Umesterungs (Esteraustausch)-Reaktion der Ascorbinsäure oder Erythorbinsaure mit einem organischen Säureenolester besitzt, und eine im Handel erhältliche Lipase kann unabhängig von ihrer Herkunft verwendet werden.
Wenn eine Lipase deaktiviert wurde, kann die Lipase durch die folgenden Schritte reaktiviert werden:
(1) Lösen der deaktivierten Lipase in einem Puffer und anschliessende Trocknung;
(2) Lösen einer deaktivierten Lipase in einem Puffer, Zugabe eines oberflächenaktiven Agenses in die Pufferlösung und anschliessende Trocknung;
(3) Lösen einer deaktivierten Lipase in einem Puffer und anschliessende Zugabe einer Diatomeenerde in die Pufferlösung, so dass die Lipase auf der Diatomeenerde immobilisiert wird, und Trocknen; oder
(4) Lösen einer deaktivierten Lipase in einem Puffer, gleichzeitige Zugabe des oberflächenaktiven Agenses und von Diatomeenerde zu der Pufferlösung, und Trocknen.
(Ein Phosphatpuffer und Lecithin können vorzugsweise als Puffer bzw. oberflächenaktives Agens verwendet werden.)
Ungereinigte Lipase oder gereinigte Lipase können verwendet werden, auch Zellen oder homogenisierte Zellen, enthaltend Lipase, können als Lipasequelle verwendet werden.
Die Immobilisierung der Lipase auf einem für das organische Lösungsmittel unlöslichen Träger erhöht die Reaktionsausbeute beträchtlich.
Der Träger schliesst anorganische Träger, wie Diatomeenerde, poröses Glas, Bimsstein, Bisquit-Keramik und Aktivkohle und in dem organischen Lösungsmittel unlösliche organische Träger, wie Polyethylenharz, Polypropylenharz, Ionenaustauscherharz und vernetztes Polyacrylamidharz, ein. Unter diesen sind poröse Materialien mit einer grossen Oberfläche besonders bevorzugt.
Ein Verfahren zum ionischen Binden an die Trägeroberfläche und ein Verfahren zum kovalenten Binden an die Trägeroberfläche, welche chemisch zur Einführung beispielsweise von Aldehydgruppen und Isocyanatgruppen behandelt wurden, werden für die Immobilisierung des Enzyms verwendet. Weiterhin, da eine Lipase normalerweise in einem organischen Lösungsmittel unlöslich ist, kann es ausreichend durch ein einfaches und stabiles Verfahren immobilisiert werden, bei dem ein Träger zu einer wässrigen Lösung einer Lipase hinzugefügt wird, und dann diese miteinander unter Rühren vermischt und bis zur Trockenheit konzentriert werden.
Die Verwendung eines oberflächenaktiven Agenses zur Immobilisierung ist vorteilhaft, um die Stabilität der Lipase in dem organischen Lösungsmittel zu verbessern. Das oberflächenaktive Agens wird zu der Lipaselösung hinzugefügt, so dass eine Micelle um die Lipase entsteht. Die Immobilisierung der so erhaltenen Micell-Lipase hält das organische Lösungsmittel von der Lipase fern und schützt ihre enzymatische Aktivität vor dem Unwirksamwerden. Das für die Immobilisierung der Lipase verwendete oberflächenaktive Agens kann ein kationisches oberflächenaktives Agens, ein ampholytisches oberflächenaktives Agens oder ein nicht-ionisches oberflächenaktives Agens sein, da die Oberfläche der Lipase anionisch ist. Beispiele für das kationische oberflächenaktive Agens schliessen ein aliphatisches Ammoniumsalz und Benzalkoniumsalz eiii. Das ampholytische oberflächenaktive Agens schliesst Lecithin (Phosphatidylcholin), Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, ein carboxybetainartiges ampholytisches oberflächenaktives Agens, ein Aminocarboxylat und Imidazoliniumbetain ein. Zudem schliesst das nicht-ionische oberflächenaktive Agens Fettsäureester der Sucrose, des Sorbitans, des Propylenglykols, des Glycerins und des Polyethylenglykols, Mannitoldialkylether, Sorbitoldialkylether und Glycerinmonoalkylether ein.
Die Umesterung kann in einer solchen Weise durchgeführt werden, dass ein organisches Lösungsmittel zu einer Mischung einer aktiven Lipase oder einer immobilisierten Lipase, Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure und eines organischen Säureenolesters hinzugefügt wird, so dass eine Suspension erhalten wird, und anschliessend eine bevorzugte Menge Wasser zu dieser Suspension gegeben wird, und hiernach die Suspension gerührt wird. Graduelles Fliessen einer Reaktionsmischung in eine mit immobilisierter Lipase oder lipasehaltigen Mikroorganismen gefüllten Säule können für die Umesterung verwendet werden. Die Reaktionstemperatur beträgt 10 bis 90ºC, vorzugsweise 20 bis 60ºC. Das Produkt kann von der Reaktionsmischung durch herkömmliche Methoden getrennt werden; beispielsweise getrennt, mit Wasser gewaschen und durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel gereinigt werden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines organischen Säureesters der Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure unter milderen Bedingungen als die der herkömmlichen Verfahren zur Verfügung. Die erfindungsgemässe Reaktion kann in nörmalen Behältern durchgeführt werden, und die Reinigung des Produkts ist sehr vereinfacht.

Beispiele:

Die Erfindung wird nun detaillierter durch Beispiele beschrieben. Jedoch sollte dies nicht derart verstanden werden, dass die Erfindung durch diese spezifischen Beispiele beschränkt ist.

BEISPIEL 1

Zuerst werden 0,4 g "Amano Lipase PS" (hergestellt von Amano Seiyaku K.K.) in 10 ml eines 1/20 M wässrigen Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 gelöst, und die Lösung wurde dann unter reduziertem Druck bis zur Trockne abgedampft, so dass eine vorbehandelte Lipase PS erhalten wurde. 2 g Ascorbinsäure und 6,7 g Stearinsäurevinylester wurden in 40 ml getrocknetem Pyridin (Wassergehalt: 1200 ppm) gelöst, und die vorbehandelte Lipase PS zu dieser Mischung gegeben. Die Reaktion wurde bei 40ºC unter starkem Rühren durchgeführt. Nach 4 Stunden wurde eine Konzentration von Ascorbinsäure-6-stearat in der Reaktionsmischung von 11,5 % gemäss der HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatografie)-Analyse gefunden. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat wurde dann in 200 ml eisgekühlte 6 N wässrige Salzsäure gegossen. Das Präzipitat wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und dann unter reduziertem Druck getrocknet, wobei 6 g des Rohprodukts erhalten wurden. Das Rohprodukt wurde dann mit heissem Hexan gewaschen, wobei 5,2 g eines weiss-gelben Produkts erhalten wurden. Der Gehalt an Ascorbinsäure-6-stearat in dem Produkt betrug 96%.

BEISPIEL 2

Zuerst wurden 0,4 g der "Amano Lipase PS" in 10 ml eines 1/20 M wassrigen Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 gelöst, und 3,6 g Diatomeenerde wurden hierzu hinzugefügt. Die Mischung wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockne verdampft, so dass eine immobilisierte Lipase PS erhalten wurde. 4 g Ascorbinsäure und 10,5 g Stearinsäurevinylester wurden in 40 ml getrocknetem t-Butanol (Wassergehalt: 2.000 ppm) gelöst, und die immobilisierte Lipase PS wurde hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei 40ºC unter heftigem Rühren durchgeführt. Nach 24 Stunden wurde eine Konzentration von Ascorbinsäure-6-stearat in der Reaktionsmischung von 22,2 % gemäss der HPLC-Analyse gefunden. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und dann wurde das Filtrat in Wasser gegossen:. Das Präzipitat wurde filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet, wobei 17,1 g eines Rohprodukts erhalten wurden. Dieses wurde mit heissem Hexan gewaschen, wobei 7,17 g eines gereinigten Produkts erhalten wurden. Der Gehalt an Ascorbinsäure-6- stearat in dem gereinigten Produkt betrug 95,1 %.

BEISPIEL 3

Eine immobilisierte Lipase PS wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 3 hergestellt. 4 g Ascorbinsäure und 10,5 g Stearinsäurevinylester wurden in 40 ml getrocknetem Tetrahydrofuran gelöst, und 4 g der immobilisierten Lipase PS wurden hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei 40ºC unter heftigem Rühren durchgeführt. Nach 24 Stunden wurde eine Konzentration von Ascorbinsäure-6- stearat in der Reaktionsmischung von 15,3 % gemäss der HPLC-Analyse gefunden. Der Wassergehalt des Reaktionssystems betrug 1.000 ppm.

BEISPIEL 4

Eine immobilisierte Lipase PS wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 hergestellt. 2 g Ascorbinsäure und 7 g Stearinsäurevinylester wurden in 40 ml getrocknetem Dioxan gelöst, und 4 g der immobilisierten Lipase PS wurden hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei 40ºC durchgeführt. Nach 24 Stunden wurde eine Konzentration von Ascorbinsäure-6-stearat in der Reaktionsmischung von 14,0 % gemäss der HPLC-Analyse gefunden. Der Wassergehalt des Reaktionssystems betrug 1.200 ppm.

BEISPIEL 5

4 g der gemäss Beispiel 2 hergestellten immobilisierten Lipase PS wurden zu 40 ml einer t-Butanollösung (Wassergehalt: 120 ppm), enthaltend 4 g Ascorbinsäure und 12 g Vinylpalmitat, hinzugegeben. Die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei 40ºC fortgeführt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und unter reduziertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Das Rohprodukt wurde aus Ethylacetat umkristallisiert, wobei 9,2 g Ascorbinsäure-6-palmitat erhalten wurden. Der Wassergehalt des Reaktionssystems betrug 600 ppm.

BEISPIEL 6

4 g der gemäss Beispiel 2 hergestellten immobilisierten Lipase PS wurden zu 40 ml einer trockenen t-Butanollösung, enthaltend 4 g Ascorbinsäure und 3 g Vinylacetat, hinzugegeben. Die Reaktion wurde 20 Stunden lang bei 50ºC fortgeführt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und konzentriert, wobei 4,8 g rohes Ascorbinsäure-6-acetat erhalten wurden. Die Umkristallisierung aus Aceton-Benzol ergab einen Kristall mit einer Reinheit von 93 %. Der Wassergehalt des Reaktionssystems betrug 650 ppm.

BEISPIEL 7

4 g der gemäss Beispiel 2 hergestellten immobilisierten Lipase PS wurden zu 40 ml einer trockenen Tetrahydrofuranlösung, enthaltend 4 g Ascorbinsäure und 3 g Isopropenylacetat, hinzugegeben, und dann wurde die Reaktion 22 Stunden lang bei 40ºC fortgeführt. Die Reaktionsmischung wurde dann filtriert, konzentriert und aus Aceton-Benzol umkristallisiert, wobei 4,5 g Ascorbinsäure-6-acetat erhalten wurden. Der Wassergehalt des Reaktionssystems betrug 700 ppm.

VERGLEICHSBEISPIEL 1

Zu 40 ml Diisopropylether (welches häufig für die enzymatische Veresterung verwendet wird, und die Löslichkeit der Ascorbinsäure bei 25ºC beträgt 0,00011 %), enthaltend 2 g Ascorbinsäure und 6,7 g Stearinsäurevinylester, wurden 0,4 g der wie in Beispiel 1 vorbehandelten Lipase PS hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei 40ºC fortgeführt. Nach 24 Stunden wurde die Konzentration von Ascorbinsäure-6-stearat auf 0,3 % gemäss der HPLC-Analyse bestimmt.

VERGLEICHSBEISPIEL 2

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Hexan (Ascorbinsäure löste sich bei 25ºC hierin nicht) als Lösungsmittel verwendet wurde, und es wurde gefunden, dass keine Reaktion bei 40ºC während 24 Stunden stattfand.

VERGLEICHSBEISPIEL 3

Unter Verwendung der in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 vorbehandelten Lipase PS wurden 2 g Ascorbinsäure und 6 g Stearinsäure in 40 ml Dioxan 24 Stunden lang bei 40ºC hintereinander, umgesetzt, die Reaktionsmischung wurde gemäss der HPLC-Analyse analysiert. Eine Konzentration von Ascorbinsäure-6-stearat von 1,95 % wurde gefunden. Der Wassergehalt in dem Reaktionssystem betrug 11.000 ppm.

BEISPIEL 8

Die gleichen Verfahrensschritte wie die von Beispiel 5 wurden wiederholt, mit der Ausnahme, dass Vinylmyristat anstelle von Vinylpalmitat verwendet wurde, und 8,9 g Ascorbinsäure-6-myristat wurden erhalten.

BEISPIEL 9

Die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 5 wurden wiederholt, mit der Ausnahme, dass Erythorbinsäure anstelle von Ascorbinsäure verwendet wurde und 9,1 g Erythorbinsäure-6-stearat wurden erhalten.

BEISPIELE 10 BIS 14

Vergleich von Stabilisationsbehandlungen:

1 g der Amano Lipase PS wurden in 25 ml eines 1/20 M wässrigen Phosphatpuffers mit einem pH von 7,0 gelöst, und 0,8 g Lecithin wurden zu der Pufferlösung hinzugegeben. Nach Rühren wurden 10 g Diatomeenerde zu der Pufferlösung gegeben, und die Suspension wurde weiter gerührt. Daraufhin wurde die Suspension bis zur Trockne unter reduziertem Druck bei 50ºC konzentriert, wodurch eine stabilisierte Lipase hergestellt wurde (Beispiel 10).
Andererseits wurden drei Arten von Lipasen zum Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit unter Verwendung der gleichen Verfahrensschritte wie oben beschrieben hergestellt, nur dass Lecithin nicht hinzugefügt wurde (Beispiel 12), die Diatomeenerde nicht hinzugefügt wurde (Beispiel 13) oder weder Lecithin noch die Diatomeenerde, hinzugegeben wurden (Beispiel 14). Auch eine im Handel erhältliche deaktivierte Lipase PS (durch keine der oben beschriebenen Verfahrensschritte behandelt) wurde verwendet (Beispiel 11).
Die Reaktionen wurden in der folgenden Weise durchgeführt:
Zu entwässertem t-Butanol wurden 4 g Ascorbinsäure, 4 g einer der oben erwähnten Lipasen (nur dass die Lipase in den Beispielen 12 bis 14 in einer solchen Menge hinzugegeben wurde, dass die hydrolytische Aktivität identisch zu der der stabilisierten Lipase in Beispiel 10 war) und 7,7 g Phenylstearat hinzugegeben und die Reaktion wurde 24 Stunden lang durchgeführt, während die Temperatur des Reaktionssystems jeweils auf 40ºC gehalten wurde, gefolgt von einer Bestimmung der Menge des hergestellten Ascorbinsäure-6-stearats gemäss der HPLC-Analyse wie in Tabelle 1 gezeigt. Der Wassergehalt in dem Reaktionssystem betrug stets 400 ppm. TABELLE 1 Menge an Ascorbinsäure-6-stearat, hergestellt nach 24- stündiger Reaktion

BEISPIELE 15 BIS 17

Vergleich der oberflächenaktiven Agenzien:

Beispiel 10 wurde wiederholt, nur dass Sorbitanmonostearat, Natriumdodecylbenzolsulfonat oder Dodecylamin statt Lecithin hinzugefügt wurde, wodurch immobilisierte Lipase hergestellt wurde, und die Reaktionen wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 10 durchgeführt, wobei diese Ergebnisse in Tabelle 2 zusammen mit dem Ergebnis von Beispiel 10 gezeigt werden. TABELLE 2 Vergleich der oberflächenaktiven Agenzien

BEISPIEL 18

Synthese von Ascorbinsäurepalmitat:

Unter Verwendung der durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 10 hergestellten stabilisierten Lipase wurde eine Reaktion 24 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 10 durchgeführt, nur dass 7,4 g Vinylpalmitat anstelle von Vinylstearat verwendet wurden. Die HPLC-Analyse ergab, dass die Konzentration von Ascorbinsäure-6-palmitat 19,6 % betrug. Der Wassergehalt in dem Reaktionssystem betrug 400 ppm.

BEISPIEL 19

Synthese von Ascorbinsäure-6-acetat:

Unter Verwendung der gemäss Beispiel 10 hergestellten stabilisierten Lipase wurde eine Reaktion 24 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 10 durchgeführt, nur dass 2,6 g Isopropenylacetat anstelle von Vinylstearat verwendet wurden. Die Konzentration von in der Reaktionsmischung hergestelltem Ascorbinsäure-6- acetat wurde mittels HPLC-Analyse auf 12 % bestimmt.

BEISPIEL 20

Eine stabilisierte Lipase wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 10 hergestellt, nur dass Amano Lipase M10 (hergestellt durch Amano Seiyaku K.K.) anstelle von Amano Lipase PS verwendet wurde. Die stabilisierte Lipase wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 18 mit Vinylpalmitat umgesetzt. Nach 24 Stunden wurde eine Konzentration von Ascorbinsäure-6-palmitat von 5,3 % mittels HPLC-Analyse gefunden.

BEISPIEL 21

Eine stabilisierte Lipase wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 10 hergestellt, nur dass Amano Lipase F (hergestellt von Amano Seiyaku K.K.) anstelle von Amano Lipase PS verwendet wurde. Die stabilisierte Lipase wurde mit Vinylpalmitat unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 18 umgesetzt. Nach 24 Stunden wurde eine Konzentration von Ascorbinsäure-6-palmitat von 5,5 % mittels HPLC-Analyse gefunden.

BEISPIEL 22

Eine stabilisierte Lipase wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 10 hergestellt, nur dass Amano Lipase AP10 (hergestellt von Amano Seiyaku K.K.) anstelle von Amano Lipase PS verwendet wurde. Die stabilisierte Lipase wurde mit Vinylpalmitat unter, den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 18 umgesetzt. Nach 24 Stunden wurde eine Konzentration von Ascorbinsäure-6-palmitat von 9,3 % gefunden.

BEISPIEL 23

Eine stabilisierte Lipase wurde gemäss Beispiel 10 hergestellt, nur dass Amano Lipase AP6 (hergestellt von Amano Seiyaku K.K.) anstelle von Amano Lipase PS verwendet wurde. Die stabilisierte Lipase wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 18 mit Vinylpalmitat umgesetzt. Nach 24 Stunden wurde eine Konzentration von Ascorbinsäure-6-palmitat von 7,4 % gemäss HPLC-Analyse gefunden.

BEISPIEL 24

Eine stabilisierte Lipase wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 10 hergestellt, nur dass Lipozyme IM20 (hergestellt von Novo Industri A/S, eine an einem Ionenaustauscherharz immobilisierte Lipase) anstelle von Amano Lipase PS verwendet wurde. Die stabilisierte Lipase wurde mit Phenylpalmitat unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 18 umgesetzt. Nach 24 Stunden wurde eine Konzentration von Ascorbinsäure-6-palmitat von 12,1 % gemäss HPLC-Analyse gefunden.
Aus dem obigen wird klar, dass die Menge des hergestellten organischen Säureesters der Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure pro Gewichtseinheit Lipase gemäss der Erfindung sehr hoch ist und dass die Reaktionsselektivität dahingehend auch hoch ist, dass der organische Säureester in der Reaktionsmischung viel leichter isoliert und gereinigt werden kann als bei herkömmlichen Verfahren.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines, organischen Säureesters, umfassend das Umsetzen von Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure mit einem organischen Säureenolester, dargestellt durch die allgemeine Formel (I)

R&sub1;COO- =CH&sub2; (I)

worin R&sub1; eine Alkyl-, Aralkyl- oder Arylgruppe, und R&sub2; ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet,

in einem organischen Lösungsmittel mit einer Löslichkeit (Gew./Vol.) für Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure von 0,3 % oder mehr bei 25ºC in Anwesenheit einer aktiven Lipase, so dass ein organischer Säureester der Ascorbinsäure oder Erythorbinsäure, dargestellt durch die allgemeinen Formeln (II) oder (III):

gebildet wird, worin R&sub1; die gleiche Bedeutung wie oben hat.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das organische Lösungsmittel ein Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pyridin, t-Butanol, Dioxan und Tetrahydrofuran, ist.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das organische Lösungsmittel 100 bis 10.000 ppm Wasser enthält.

4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin die Reaktion in Anwesenheit einer an einem in dem organischen Lösungsmittel unlöslichen Träger immobilisierten Lipase durchgeführt wird.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, worin die Lipase durch die Zugabe eines kationischen Tensids, eines ampholytischen Tensids oder eines nicht-ionischen Tensids stabilisiert wird, bevor die Lipase an dem in dem organischen Lösungsmittel unlöslichen Träger immobilisiert wird.