DE1517761A1

DE1517761A1 - Wasserunloesliche Enzyme

Info

Publication number: DE1517761A1
Application number: DE19661517761
Authority: DE
Inventors: Kazuyuki Mineura; Nobuo Nakamura; Masso Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1965-03-20
Filing date: 1966-03-21
Publication date: 1970-01-29
Also published as: GB1108533A

Description

Patentanmeldung
WASSERIINLÖSLICHE ENZBDS

Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Aminosäure aus der entsprechenden Acyl-1-aminosäure durch eine spezifische, asymmetrische Hydrolyse, wobei ein wasserunlösliches Enzym verwendet wird, das durch chemische Kupplung einer Acylase eines Mikroorganismus mit einem wasserunlöslichen Trägerstoff erhalten wird·

Zum Zwecke der optischen Spaltung einer dl-Aminosäure, die auf synthetischem Wege erhalten ist, wurde üblicherweise als ein günstiges und sicheres Spaltverfahren die Hydrolyse einer asymmetrischen N-Acyl-dl-aminosäure, die durch Acylierung einer dl-Aminosäure erhalten ist, durch Acylase angesehen. Als für diesen Zweck zu verwendende Acylasequelle sind neuerdings Pilze und Bakterien anstelle von tierischen Geweben als wichtig erkannt worden. Unter solchen Acylasen von Mikroorganismen haben neuerdings ZeH-Acylasen eines Bakteriums, insbesondere von Pseudomonas, eine bevorzugte Stellung anderen Acylasen gegenüber eingenommen. Jedoch haben solche Acylasen auch ihre Nachteile ( wie z.B. ungünstiges Wachstum des Bakteriums Pseudomonas, genetische Unstabilität, Tendenz zum Absterben u„ dgl«) ο

Die durch Mikroorganismen, z.Bo Micrococcus glutamicus oder Pseudomonas cruciviae , gewonnene Acylase wirkt spezifisch auf Acyl-1-amiriosäure unter Gewinnung der entsprechenden 1-Aminosäure durch Hydrolyse, während ihre Spezifität auf das Substrat sehr breit ist. Ihre Aktivität zeigt außerdem geringe Unterschiede bezüglich der Subs trat typen. Daher ist die "Verwendung dieser Acylase für die optische Spaltung einer Aminosäure sehr vorteilhaft· Gerade in solch einem günstigen Verfahren müssen jedoch die Kosten zum Züchten der Mikroorganismen einen beträchtlichen Teil der Kosten für die optische Spaltung durch asymmetrische Hydrolyse einnehmen, weil die Acylase als Zeil-Zusammensetzung erhalten werden kann« Von diesem Gesichtspunkt aus, wenn also das Enzym billiger gewonnen oder wiederholt verwendet werden kann, wird es möglich, ver-

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schiedene 1-Aminosäuren kommerziell mit geringen Kosten zu liefern, weil so diese optische Spaltung mit einem weit geringeren Kostenaufwand durchgeführt werden kann.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein neues wasserunlösliches Enzym zu schaffen, das für die Gewinnung von 1-Aminosäuren geeignet ist·

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, ein wasserunlösliches Enzym zu schaffen, das stabil und hervorragend geeignet ist» N-Acylaminosäure zwecks Erhalt einer 1-Aminosäure zu hydrolisieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung einer 1-Aminosäure durch Verwendung des genannten wasserunlöslichen Enzyms zu schaffen, wobei die !-.Aminosäure auf kürzerem Wege und mit geringeren Kosten hergestellt werden kann.

Andere Gegenstände und Hauptmerkmale der vorliegenden Erfindung werden nach dem Lesen der Beschreibung und der Patentansprüche verständlich werden.

Die Erfinder haben Methoden erarbeitet, Acyläse wiederholt zu verwenden, und haben die Reaktion unter Verwendung eines wasserunlöslichen Enzympräparats ausgeführt, welches durch Kupplung einer Acylase mit einem wasserunlöslichen Trägerstoff erhalten wird. Das so erhaltene wasserunlösliche Enzym ist sehr stabil und hydrolysiert asymmetrisch spezifisch Acyl-1-aminosäure sehr wirksam. Deshalb kann die Spaltung von Aminosäure sehr sparsam durch dieses Enzym durchgeführt werden, wobei verschiedenartige 1-Aminosäuren billiger erhalten werden können.

Es ist kürzlich versucht worden, verschiedene biochemische Reaktionen durch Verwendung von Protein auszuführen, das gekuppelt ist mit einer hochmolekularen Verbindung frei von der Abnahme biochemischer Aktivität des Proteins. Solche Versuche sind jedoch hauptsächlich ausgeführt worden, um die Antigen-Antikörper-Heaktion bei Verwendung von Antigen gekuppelt mit einer hochmolekularen Verbindung zu erforschen.

Ähnliche Studien sind an mehreren Enzymen durchgeführt worden, jedoch wurde nur über verhältnismäßig begrenzte Arten von Enzymen berichtet, wie z.B. Diastase, Papain usw., während wenige Berichte über die Reaktionsbedingungen hochmolekularer Verbindungen und

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des Enzymproteins, sowie über die Charakteristik^ des erhaltenen wasserunlöslichen Enzyms vorliegen. Als Ergebnis wurden relativ wenige praktische Kenntnisse gewonnen. In einem dieser prakti- , sehen Gebrauchsbeispiele der wasserunlöslichen Enzyme wurde kürzlich entdeckt (Japanese Patent Publication 24 876/64 und 27 492/64), daß gewisse Verfahren, unlösliche Enzyme durch Reaktion mit N-*arboxy-ά -aminosaureanhydrid unlöslich zu machen, für aus Filzen hergestellte Acylasen verwendet werden können, wobei die erhaltenen wasserunlöslichen Acylasen für die optische Spaltung von Aminosäure zu verwenden sind.

Die iSrfinder stellten ein wasserunlösliches Enzym durch Kupplung von 1-GIutaminsäure-dehydrase mit verschiedenen hochmolekularen Trägerstoffen her zur Ausführung der spezifischen intramolekularen Ring-Schluß-Reaktion der !-Glutaminsäure, und haben Acylasen eines Lakteriums, wie Micrococcus glutamicas und Pseudomonas cruciviae, mit Erfolg auf hochmolekularen Trägerstoffen fixiert, um ein stabiles und wasserunlösliches Acylasepräparat zu erhalten; dadurch wurde ein brauchbares asymmetrisches Hydrolyseverfahren der Acylaminosäure ausgearbeitet .Das Verfahren zur asy;nmetrischen Hydrolyse

von Acylaminosäure durch Verwendung eineii bakteriellen, auf einem hochmolekularen Trägerstoff fixierten Acylase stellt eine weitgehend neuartige und fortschrittliche Erfindung dar, die für die Ausführung eines kommerziellen Spaltungsverfahrens der Aminosäure von Nutzen ist.

Als Trägerstoff hochmolekularer Verbindungen kann in der vorliegenden Erfindung jede Art hochmolekularer Verbindung verwendet werden, die eine funktioneile Gruppe besitzt, welche imstande ist, sich mit Ensymprotein zu kuppeln, ohne daß dabei die Aktivität der verwendeten bakteriellen Acylase abnimmt. Solche hochmolekularen Verbindungen schließen im allgemeinen funktioneile Gruppen ein, die imstande sind zur Kupplung mit einer Carboxylgruppe einer sauren Aminosäure oder einer endständigen Aminosäure des Enzymproteins, mit einer Aminogruppe basischer Aminosäure oder endständiger Aminosäure, einer Phenolgruppe des Tyrosins, einer Imidazolgruppe des Histidine, einer "iirminogruppe des Tryptophane, einer Thiolgruppe des Cysteine, einer Guanidingruppe des Arginine,

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einer Hydroxylgruppe des Serins, Threonine, Hydroxypyrolins. usw., mit einer Methylmercapto-Gruppe des Methionine, einer Phenylgruppe des Phenylalanine, einer Amidogruppe des Glutamine und Asparagine usw. Solche hochmolekularen Verbindungen, die fähig sind, sich mit einer Phenolgruppe zu kuppeln, schließen hochmole-. kulare Verbindungen mit einer Aminophenyl-Gruppe ein, die leicht das Diazoniumsalz bilden kann, welches zur Diazo-Kupplung mit einer Phenolgruppe befähigt ist, während solche Verbindungen, die zur Kupplung mit einer Aminogruppe befähigt sind, hochmolekulare Verbindungen mitunfassen» die ein Säureanhydrid, Chlorcarboxyl-, Isocyanat-, Säureazid- oder Mtro-fluorphenyl-Gruppen enthalten.

Die hochmolekularen Verbindungen, die die oben erwähnten funktionellen Gruppen enthalten, schließen natürliche hochmolekulare Verbindungen ein wie Cellulose, Dextran, Peptide, Proteine usw., synthetische Polymere wie das synthetische Aminosäurepolymer, Styrolharz und Acrylharz.

Unter den oben beschriebenen Trägerstoffen sind natürliche hochmolekulare Verbindungen wie Cellulose, Dextran usw. bevorzugt zu verwenden, da sie eine p-Aminophenylgruppe, eine Dinitro-fluorphenylgruppe und ein synthetisches Polymer wie Styrolharz besitzen. Enzyme, die fähig sind, sich mit den genannten hochmolekularen Verbindungen zu kuppeln, müssen natürlich eine möglichst geringe Menge unreinen Proteins enthalten. Es ist möglich, rohes Enzym zu verwenden, das man durch Mahlen und Extrahieren der Zellen von Micrococcus glutamicus oder Pseudomonas cruciviae erhalten hat. Wenn ein gereinigtes Enzym für eine solche Quelle erforderlich ist, kann man das Enzym durch übliche technische Reinigung erhalten, bei der das Enzym mittels verschiedener Methoden gereinigt werden kann, z.B. durch Aussalzen, Hitzbehandlung, Lösungsniederschlag, Chromatographie usw. Es ist auch möglich, solche Verfahren zur Gewinnung von rohem Enzym anzuwenden.

Die Substratspezifität der aus dem oben erwähnten Enzym hergestellten wasserunlöslichen Acylase ist fast der ähnlich, die von der intakten Zelle eines Mikroorganismus erhalten wird. Die Reaktion von Trägerstoff und Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter Bedingungen allgemeiner chemischer Behandlungen ausgeführt werden, wenn nicht die enzymatische Aktivität in einem geeigneten Bereich gehalten wird. Mit anderen 7/orten müssen die oben erwähnten hoch-

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molekularen Verbindungen, welche die genannten funktionellen Grup- - pen- enthalten, der Reaktion mit Enzymprotein bei einer niedrigeren (Temperatur und bei einem p„ von nicht-denaturierendem Protein unterworfen werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Reaktionstemperatur vorzuziehen, die niedriger liegt als die Umgebungstemperatur. Bessere Resultate können bei einer Temperatur unter 10⁰C und bei einem Pjr-Wert von ungefähr 6-8 erzielt werden. Es ist möglich, die Reaktion unter anderen Bedingungen auszuführen. Vorzugsweise führt man die Reaktion innerhalb von 2-10 Stunden aus. Jede längere oder kürzere Reaktionszeit kann zu einer nachteiligen Abnahme der spezifischen Aktivität des wasserunlöslichen Enzyms führen·

Nach Beendigung der Reaktion muß «jede mögliche Gegenwirkung, die in Rest-Trägerstoffen, die nicht reagiert haben, noch zu finden ist, dadurch inaktiv gemacht werden, daß man sie mit einer geeigneten niedermolekularen Verbindung reagieren läßt, die z.B.' zu den folgenden Gruppen gehören kann: Amine, organische Säuren, Phenol, Naphtol usw.

Die Hauptcharakteristika der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Acylase, wie Substratspezifität, optimaler Ρττ-Wert usw., sind fast jenen der ursprünglichen Acylase ähnlich. Die der vorliegenden Erfindung gemäße wasserunlösliche Acylase wirkt spezifisch auf verschiedene N-Acyl-1-aminosäuren, um die entsprechenden 1-Aminosäuren zu •gewinnen. Noch dazu ist die Stabilität der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzyme viel höher als die der ursprünglichen Enzyme, seine Löslichkeit in Wasser ist vollständig verloren gegangen, -und seine enzymatische Aktivität ist nicht vermindert, selbst mit einer großen Wassermenge oder einer gebräuchlichen Pufferlösung. Die Stabilität des vorliegenden Enzyms ist so hoch, daß kein bemerkenswerter Rückgang der Aktivität nach mehrmonatigem Aufbewahren bei Raumtemperatur zu finden ist« Ferner ist seine Aktivität nach der Verwendung als Substrat der N-Acylaminosäure für einen längeren Zeitraum nicht zurückgegangen, natürlich muß es vermieden werden, die erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzyme unter sehr trockenen Bedingungen aufzubewahren, da sonst die Aktivität vermindert werden kann.

Die wasserunlösliche Acylase, hergestellt durch Kupplung einer rohen bakteriellen Acylase eines Stammes von Micrococcus ^lutamicus mit einem aus p-Aminobenzyl-öellulose erhaltenen Diazoniumsalz, hatte beispielsweise die folgenden chemischen Charakteristik. .

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1 g Trockengewicht; des genannten Präparats hatte die Aktivität, ungefähr 5 g N-Acetyl-l-methionin in einer Konzentration von 0,1 - 0,2 Mol bei 58⁰C und einem p„-'iVert von 6,5 innerhalb von 3-6 Stunden ausreichend zu hydrolysieren. Das wasserunlösliche Enzym, das durch Kupplung einer rohen bakteriellen Acyläse eines Stammes von Fseudomonas cruciviae mit einem aus p-Aminobenzylcellulose erhaltenen Diazoniumsalz, hatte z.B. die folgenden enzymatischen chemischen Charakteristika.

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1 β Trockengewicht des Präparats hatte die Aktivität, 10 g N-Acetyl-1-methionin einer Konzentration von 0,1 Mol bei 38⁰C und einem p„-¥/ert von 8,5 innerhalb von ungefähr 20 Stunden yoll*- ständig zu hydrolysieren. Die Aktivität, dieses Präparats zeigte einige Unterschiede, welche von den Substratarten abhängen, und ist am stärksten bei einem p„-Wert von 7-9· Als Reaktionstempera tür ist vorzugsweise 35-45C zu wählen. Beispiele der spezifischen Aktivitäten dieses Präparates auf verschiedene Substrate werden in der folgenden Tabelle aufgezeigt (man setze 100 für eine Aktivität für N-Acetyl-1-methionin).

Substrat ■ Spezifische Aktivität

N-Acetyl-1-methionin 100

N-Acetyl-1-alanin 100

N-Acetyl-1-valin 100

N-Acetyl-1-leucin 30

N-Acetyl-1-threonin 100

N-Acetyl-1-tryptophan 100

N-Chloracetyl-l-isoleucin 160

N-Chloracetyl-1-norleucin 1200

N-Chloracetyl-1-serin 200

N-Chloracetyl-1-phenylalanin 450

Das erfindungsgemäße wasserunlösliche Enzym ist ähnlich wirksam auf verschiedene oC -N-Acyl-1-aminosäuren, anders als in der obigen Tabelle aufgezeigt; weiterhin ist es wirksam für N-Acyl-1-aminosäure, die eine Acylgruppe wie Benzoyl, Dichloracetyl, Formyl usw. besitzt. Deshalb ist es möglich, die optische Spaltung von dl-Aminosäure unter Verwendung von erfindungsgemäßem wasserunlöslichem Enzym vorteilhaft auszuführem.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die wasserunlöslichen Enzyme, die ähnlich hohe Aktivitäten unabhängig von den Unterschieden der Substrattypen der N-Acyl-aminosäuren besitzen, zu erhalten, welche für die optische Spaltung verschiedener Aminosäuren anwendbar sind.

Das erfindungsgemäße wasserunlösliche Enzym ist besonders wirksam für N-Acyl-1-aminosäuran, wie z.B. N-Acetyl-1-methionin, N-Acetyl-1-alanin, N-Acetyl-1-valin, N-Acetyl-1-leucin, N-Chloracetyl-1-alanin, N-Chloracetyl-1-valin, N-Chloracetyl-l-isoleucin, N-Acetyl-1-norvalin, N-Acetyl-1-Norleucin usw., wobei es möglich

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ist, die asymmetrische Hydrolyse für die optische Spaltung ausreichend auszuführen. Außerdem können andere Acylaminosäuren, deren l-Formen auf die Substrate übertragen werden, mit dem was·- serunlöslichen Enzym zur Ausführung der erfindungsgemäßen asymetrischen Hydrolyse behandelt werden. In Hinblick auf das Vorhandensein von Strukturen wie ot -N-Acylaminosäure kann jeder andere strukturelle Unterschied für die Verwendung der vorliegenden Erfindung unwirksam sein. Mit anderen Worten ist das vorliegende Enzym für Acy!gruppen verwendbar wie Benzoyl, Dichloracetyl, Chlorpropyonyl, Formyl usw., ausgenommen Acetyl und Chloracetyl· Das vorliegende Präparat ist so stabil, daß die Aktivität nach Einwirken auf 0,2 mol. wässrige Lösung von N-Acetyl-1-methionin (Pti 7»0) bei 45° C 4-8 Stunden lang überhaupt nicht vermindert wird. Deshalb ist es möglich, die optische Spaltung von Aminosäure dauernd durch asymmetrische Hydrolyse von N-Acyl-dl-aminosäure auszuführen, deren wässrige Lösung durch eine mit dem erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzym gefüllte Kolonne geschickt worden ist. Die Wirksamkeit des vorliegenden Präparats wird durch Metällionen nicht spezifisch beeinflußt. Manchmal jedoch wird, die Reaktionszeit durch Zusatz von Metallionen wie Kobalt- oder Manganionen ziemlich verkürzt, was von den Typen des Mikroorganismus und des Substrats abhängig ist.

Wie oben erwähnt ist der Zweck der asymmetrischen Hydrolyse der K-Acylaminosäure durch das erfindungsgemäße wasserunlösliche Enzym die Ausführung der optischen Spaltung von Aminosäure. Gemäß der vor liegenden Erfindung ist es mögxich, eine Reaktionsmischung zu bekommen, die keine Verunreinigung, wie z.E. Enzymprotein, enthält. Deshalb ist es durchaus möglich, !-Aminosäure von bleibender Acyl-d-aminosäure zu trennen, wodurch die Reaktionslösung in für jeden Aminosäuretyp günstigster Weise behandelt werden kann.

Die folgenden zahlreichen Beispiele sollen die Erfindung erläutern, aber sollen nicht ihre Reichweite begrenzen. Ahnliche gute Ergebnisse kann man erhalten, wenn man anaere hochmolekulare Verbindungen als Trägerstoffe verwendet, geicupj.elt mit verschiedenen Enzymen, oder wenn man andere N-Acylaminosäuren als die oben erwähnten für ähnliche Verfahren verwendet. Fseudomonas cruciviae Gray and Thornton und Mierococcus glutamicus , die für die nach-

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stehenden Beispiele verwendet wurden, sind bekannte Bakterien, die a'uch von der American Type Culture Collection verfügbar sind.

Beispiel 1:

Eine Zellextraktlösung eines Stammes von Micrococcus glutamicus wurde mit Aceton versetzt, um eine teilweise gereinigte Acylase auszufällen. In einer "Tris"-Pufferlösung mit einem Ptt von 8,5 ließ man die Acylase mit Diazoniumchlorid reagieren, das aus p-Aminobenzyl-Cellulose in 8 Stunden bei fS O⁰C unter Rühren erhalten wurde. Die Nachbehandlung wurde unter Zusatz von (^ -Naphtol ausgeführt. 40 g der vollständig gewaschenen wasserunlöslichen Acyläse wurden der wässrigen Lösung zugesetzt, die durch Lösen von 582 g N-Acetyl-dl-methionin in 20 1 Wasser und durch Einstellen auf einen p^-Wert von 7»3 mit Ätznatron bereitet war. Die Reaktion ließ man bei 37⁰C 4 Stunden lang laufen.

Nach Abschluß der Reaktion wurde das Enzym durch Filtrieren abgetrennt, das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert und dem Konzentrat wurde Methanol zugesetzt, so daß man durch Kühlen 112 g 1-Methionin-Kristalle erhielt. Schmelzpunkt 279-280⁰C (zersetzt), ^25,. _+21|7o _(c. 3 , _{1 nHC}l).

Die methanolhaltige Mutterlauge wurde auf ähnliche Weise konzentriert, und der erhaltene Sirup wurde mit Petroläther gewaschen und dann kristallisiert. Die Ausbeute durch Umkristallisation aus Wasser betrug 182 g Acetyl-d-methionin, Schmelzpunkt 99 - 101⁰C,

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_D » +. 19,7 (c - 2, Wasser).

Das vorher abgetrennte unlösliche Enzym behält seine Aktivität vollständig und kann wiederholt verwendet werden.

Beispiel 2:

Durch Reaktion, ähnlich wie in Beispiel 1, einer rohen Acylase, die durch Ultraschall-Behandlung von Zellen eines Stammes von Micrococcus glutamicus erhalten wurde, mit Diazoniumsalz, hergestellt durch Diazotierung von Polyamin-Styrolharz, wurde eine

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-50,5° ( c ■ 1, Wasser).

wasserunlösliche Acylase bereitet»

10 g des PJnzyms wurden zu 1 1 wässriger Lösung gegeben, hergestellt durch Auflösung von 50 g N-Acetyl-dl-tryptophan und Neutralisation mit Ätznatron/ auf p„ 7>0. Die Reaktion lieii man 4 Stunden lang bei ungefähr 40⁰C laufen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Enzym durch Filtrieren abgetrennt. Das Filtrat wurae leicht sauer eingestellt und dann mit Äthylacetat extrahiert. Die wässrige Phase wurde unter leicht reduziertem Druck konzentriert und dann gekühlt. Die gewonnenen Kristalle wurden durch Filtrieren abgetrennt und ergaben eine Ausbeute von 16,5 g !-Tryptophan. Es zeigte sich kein deutlicher Zersetzungspunkt.

Die Lösung der Äthylacetatphase 7/urde verdampft, und der Rückstand wurde aus 7/asser umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 20 g Acety1-d-tryptophan, Schmelzpunkt 187 - 188⁰C,

/j _D » + 29,3° ( c » 1, 1 η 2;aOH).

Das vorher abgetrennte wasserunlösliche Enzym behalt seine Aktivität und kann wiederholt verwendet werden.

Beispiel 3:

Zellen eines Stammes von Uicrococcus glutamicus wurden zur Gewinnung roher Acylase mit Ultraschall behandelt. In einer 0,1 η Natriumbicarbonatlösung ließ man die rohe Acylase bei 5°C 7 Stunden lang unter Rühren reagieren, wobei ein Trägerstoff verwendet wurde, der durch Nitrieren ("nitrosating") eines Mischpolymers der Ale ^acrylsäure und des Met^crylsäure-^-fluoranilids erhalten worden war. Durch gründliches Waschen und Filtrieren wurde unlösliche Acylase erhalten. 200 g des genannten Enzyms wurden in eine Kolonne gefüllt. Dann ließ man eine N-Chloracetyl-dl-alaninlösung mit einer Konzentration von 40 mg/ml und einem Pjr-Wert von 7|2 mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 80 ml/Std. hindurchfließen, ma ein Reaktionsgemisch zu bekommen, das 1-Aianin und N-Chloracetyl-d-alanin enthielt. 2,4 1 des Reaktionsgemisches, das durch 30-stündiges Hindurchschicken der Lösung erhalten war, wurden durch eine Kolonne

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geschickt, die mit 2,5 1 der Η-Form eines stark sauren Ionenaustauscherharzes von Diaion SKTfI A gefüllt war. Die Eluierung wurde durch 2 η wässriges Ammoniak ausgeführt. Das Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, das Konzentrat mit Methanol versetzt und zwecks Kristallisation gekühlt. Die Kristalle wurden abgetrennt und getrocknet. Die Ausbeute betrug 26 g 1-Alanin, Schmelzpunkt 291 - 295° C (zersetzt),

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L?') D " ¹⁴'¹° (^c - 5, 5 η HCl).

Der Ablauf des Ionenaustauscherharzes wurde unter reduziertem Druck konzentriert und ergab 47 g N-Chloracetyl-d-alanin, Schmelzpunkt 90-91 ⁰G,

(OiJ _D « 43,3 (c - 2, Wasser).

Das in die Kolonne gefüllte Enzym behält noch genügend Aktivität, so da3 weitere asymmetrische Hydrolysereaktionen durchgeführt werden können.

Beispiel 4:

Eine Zellextraktlösung eines Stammes von Fseudomonas cruciviae wurde zur Ausfällung einer teilweise gereinigten Acylase mit Ammoniumsulfat versetzt. Dann wurde die Acylase in einer "Tris"-Pufferlösung mit einem p„-Wert von 8,0 mit Diazoniumchlorid zur Reaktion gebracht, das aus p-Aminobenzyl-Cellulose bei 5°C innerhalb von 6 Stunden unter Rühren erhalten worden war. Die Nachbehandlung wurae mite*' -l^aphtol ausgeführt. 15 g eines gründlich gewaschenen, unlöslichen Enzyms wuraen der wässrigen Lösung zugesetzt, die 3SO g K-Acetyl-dl-methionin in einer 0,1 mol. Konzentration enthielt, und wurden mit Ätznatron auf einen p^-Wert von 8,5 eingestellt. Weiterhin wurde Kobaltchlorid in der Lösung gelöst, um

■χ
eine 10 mol. Konzentration zu haben. Die Reaktion wurde bei *+5°C 8 Stunaen lang ausgeführt.

Nach Abschluß der Reaktion wurde das Enzym durch Filtrieren abgetrennt. Das Filtrat wurde konzentriert, mit dem etwa 10-fachen Volumen Aceton versetzt und dann gekühlt. Die erhaltenen Kristalle trennte man ab und· trocknete sie. Die Ausbeute betrug 1CS g 1-Methionin, Schmelzpunkt 280 - 281⁰C ^ztrsetzt),

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	25	+ 19	.8°	11	2,	Wasser).
	D ⁼
**ι)***			(c =

Das vorher abgetrennte unlösliche Enzym behält vollständig seine Aktivität und kann wiederholt verwendet werden.

Beispiel 5J

Zellen eines Stammes von Pseudomonas cruciviae wurden durch .Ultraschall-Behandlung zur Extraktion einer rohen Acyläse gebrochen. In einer Lösung von -6-π" η Natriumbicarbonat ließ man die Acylase bei 1O⁰C 7 Stunden lang unter Rühren mit dem Trägerstoff reagieren, der durch Nitrieren ("nitroting") von einem Mischpolymer der Methacrylsäure und des Methacrylsäure-3-fluoranilids gewonnen wurde. Die unlösliche Acylase erhielt man durch gründliches Waschen und Filtrieren. 50 g des Enzyms wurden in eine Kolonne gefüllt, und die wässrige Lösung, die 20 mg/ml N-Chloracetyl-dl-alanin und 10 Mol Kobaltionen bei einem p_H-kVert von 7,5 enthielt, wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/Std. bei 50⁰C durch die Kolonne geschickt, um eine 1-Alanin und N-Chloracety1-d-alanin enthaltende Lösung zu ergeben. 4- 1 des durch 80-stündiges Passieren aer Lösung erhaltenen Ablaufs wurden durch eine Harzkolonne geschickt, die mit 2 i der Η-Form eines stark sauren Ionenaustauschers von Diaion SK ^ 1 A gefüllt war (ein Handelsname eines Ionenaustauscherharzes, hergestellt durch Mitsubishi Kasei K.K., Tokio, Japan).

Die Eluierung wurde mit 2 η wässrigem Ammoniak ausgeführt. Das Eluat konzentrierte man unter reduziertem Druck, versetzte es mit Methanol und kühlte es. Lie Ausbeute betrug 22 g Kristalle des 1-Alanin, Schmelzpunkt 295 - 297⁰C (zersetzt),

(ttj D - + 14,2° (c - 5, 5 η HCl).

Der Ablauf wurde unter reduziertem Druck konzentriert·. Man erhielt 33 g li-Chloracetyl-d-alanin, Schmelzpunkt 90 - 91° C,

UxJ _D » + 42,3 (c - 2, Wasser).

Das in die Kolonne gefüllte Enzym behält noch genügend Aktivität, so daß damit weitere asymmetrische Hydrolysereaktionen aus- . geführt werden können.

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Beispiel 6:

Zellen eines Stammes von Pseudomonas cruciviae wurden zur Extraktion einer rohen Acylase gebrochen. Die rohe Acylase reagierte auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einem durch Diazotierung von Polyaminostyrolharz erhaltenen Diazoniumsalz. 1 g des gewonnenen unlöslichen Enzyms wurde der wässrigen Lösung zugesetzt, die 50 g N-Chloracetyl-dl-phenylalanin enthielt, wurde mit Ätznatron auf einen Ρττ-Wert von 7»5

±1

neutralisiert und mit Mangansulfat einer Konzentration von 10 Mol versetzt. Die Reaktion ließ man 3 Stunden lang bei 40⁰C laufen.

Das Enzym wurde durch Filtrieren abgetrennt. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, mit Azeton versetzt und zur Gewinnung von Kristallen gekühlt. Durch Filtrieren erhielt

.al«
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man 15 g !-Phenylalanin, Schmelzpunkt 281 - 282⁰C (zersetzt),

((ή D." ~ ³⁴'⁸° ^(c " ^{2) Wasser})· Das Filtrat wurde konzentriert, die erhaltenen rohen Kristalle wurden aus Azeton-Petroläther umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 21 g N-Chloracetyl-d-phenylalanin, der Schmelzpunkt lag bei 125 - 126° C,

jfpy - - 50,1° (c « 2, Äthanol).

Das vorher abgetrennte Enzym behält seine Aktivität vollständig und kann wiederholt verwendet werden.

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Claims

1H r$ 17761

Pa tentansprüche

1. Wasserunlösliches Enzym, hergestellt "durch Kupplung einer bakteriellen Acyläse mit einer hochmolekularen Verbindung, die eine funktionelle Gruppe enthält, welche imstande ist, sich mit einem Enzymprotein zu kuppeln, ohne daß die Aktivität der bakteriellen Acy läse absinkt. Inu^hi^ *>+■

2. Wasserunlösliches Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bakterielle Acylase aus der Klasse ausgewählt wird, die aus einer Acylase von Pseudomonas cruciviae und einer Acylase von Micrococcus glutamicus besteht^

3. Wasserunlösliches Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß die hochmolekulare Verbindung zur folgenden Gruppe gehört:

Carboxylgruppe der basischen Aminosäure, Carboxylgruppe der endständigen Aminosäure des Snzymproteins, Aminogruppe einer basischen Aminosäure, Phenolgruppe des Tyrosins, Imidazolgruppe des Histidins, Iminogruppe des Tryptophane, Thiolgruppe des Cysteins, Guanidingruppe des Arginins, Hydroxylgruppe des Serins, Hydroxylgruppe des Thereonins, Hydroxylgruppe des Oxyprolins, Methy1-mercaptogruppe des Methionins, Phenylgruppe des Phenylalanine, Amidgruppe des Glutamine, Amidgruppe des Asparagins. 4-e Wasserunlösliches Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hochmolekulare Verbindung eine/ Aminophenylgruppe enthält, die ein Diazoniumsalz bilden kann, welches mit der Phenolgruppe zur Diazokupplung befähigt ist.

5. Wasserunlöslichee Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hochmolekulare Verbindung ein Säureanhydrid, eine Chlorcarbonsäure, ein Isocyanat, ein Säureapid und/oder eine Nitrofluor-phenylgruppe enthält»

6. Wasserunlösliches Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Kupplung einer bakteriellen Acylase des Pseudomonas cruciviae oder des Micrococcus glutamicus mit einer natürlichen, hochmolekularen Verbindung, nämlich der Cellulose, aes Dextrans, Peptide und/oder Proteins, hexⁱgestellt ist.

7· Wasserunlösliches Enzym gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die hochmolekulare Verbindung aus Cellulose besteht.

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8. Wasserunlösliches Enzym gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die hochmolekulare Verbindung aus Dextran besteht.

9. Wasserunlösliches Enzym gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die hochmolekulare Verbindung aus einem Peptid besteht.

10. Wasserunlösliches Enzym gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dab die hochmolekulare Verbindung aus einem Protein besteht.

11. Wasserunlösliches Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Kupplung einer bakteriellen Acyläse des Pseudomonaa cruciviae oder des Micrococcus glutamicus mit einer hochmolekularen Verbindung, die eine funktioneile Gruppe, nämlich eine p-Aminogruppe oder eine Dinitrofluor-phenylgruppe enthält, hergestellt ist.

12. Wasserunlösliches Enzym gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, da.'i die fuiiKtionelle Gruppe aus einer p-Aminogruppe besteht.

13. Wasserunlösliches Enzym gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die funktioneile Gruppe aus einer Dinitrofluorphenylgruppe besteht.

14. Wasserunlösliches Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Kupplung einer bakteriellen Acylase aes Micrococcus glutamicus -e oder des Pseudomonas cruciviae mit einem synthetischen Polymeren, nämlich einem Styrolharz oder einem Acrylharz, hergestellt ist.

Yj, Wasserunlösliches Enzym nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Polymere aus einem Styrolharz besteht.

16. Wasserunlösliches Enzym nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dai: das synthetische Polymere aus einem Acrylharz bes t e η ΐ .

I". Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzyms, daiurch gekennzeichnet, daß man eine bakterielle Acylase des Fseudomonas cruciviae oder des liicrococcus glutamicus mit einer hochmolekularen Verbindung, die eine zur Kupplung mit einem Enzymprotein befähigte funktionelle Gruppe enthält, ohne die Aktivität der bakteriellen Acylase in einer Pufferlösung zu

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vermindern, die einen p„-\Vert von 6-9 hat, vermischt und
.2-10 Stunden bei Uxgebungstempera tür reagieren laut·
18, Verfahren zur optischen Spaltung einer dl-Aminosäure,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine K-Acyl-dl-Aminos&ure mit einem wasserunlöslichen ünzym hydrolysiert, das durch Kupplung einer bakteriellen Acylase des Fseudomonas cruciviae oder des Micrococcus glutamicus mit einer hochmolekularen Verbindung erhalten ist, die eine zur Kupplung mit einem Enzymprotein befähigte funktionelle Gruppe, ohne die Aktivität der bakteriellen Acylase zu vermindern, enthält«

Mc Verfahren nach Anspruch 18, daaurch gekennzeichnet, daß als Acylase eine Acylase des Fseudomonas cruciviae verwendet wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, daaurch gekennzeichnet, daß als Acylase eine Acylase des Micrococcus glutamicus verwendet wird.

21. Verfahren nach Anspruch 18, daaurch gekennzeichnet, daß als hochmolekulare Verbindung Diazoniumchlorid verwendet wird, aas aus p-Aminobenzylcellulose hergestellt ist.

22. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als hochmolekulare Verbindung ein Diazoniumsalz verwendet wird, das aus einem ίolyaminostyrolharz hergestellt ist«

23. Verfahren nach Anspruch 18, daaurch gekennzeichnet, daß als hochmolekulare Verbindung ein nitriertes ("nitrosated")
Mischpolymeres der Methacrylsäure oder e±a !.Iethacrylsäure-3-fluoranilidj verwendet wird.

BAD

SC9885/ 1 302