JP2005503830A - 置換２−アミノ−３−（２−アミノ−フェニルスルファニル）プロピオン酸の調製のための酵素的方法 - Google Patents
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Abstract
式（Ｉ）の化合物は、プロテアーゼ、インターロイキン−１β−変換酵素、エラスターゼ、またはアンジオテンシン酵素、ＧＰＣＲアンタゴニスト（コレシストキニン、アンジオテンシンIIレセプター）のような酵素阻害剤として役立つ１，５−ベンゾチアゼピンの調製のために有用である。本発明は、有機性共−溶媒を含む水性系中においてプロテアーゼとＲ1、Ｒ2、Ｒ3、ｎおよびＲ4が本明細書に記載されたとおりである、式（II）の化合物を反応することを含む方法であって、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびｎが本明細書に記載されたとおりである、式（Ｉ）の化合物を調製するための新規な方法に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は式Ｉ
【０００２】
【化７】
【０００３】
（式中、Ｒ1は水素またはアルキルであり；Ｒ2はアミノ保護基であり；それぞれのＲ3は、独立してハロゲン、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルであり；ｎは１または２である）の化合物の調製のための新規な酵素的方法に関する。
【０００４】
欧州特許０４０７０３３Ａには、２−ハロプロピオン酸以外の２−置換酸エステルのラセミ混合物の対応する鏡像異性の酸への酵素的立体選択的加水分解が記載されている。この反応は、カンジダルゴーサ（Candida rugosa）リパーゼのイソ酵素、有機溶媒（例えば、トルエン）および還元剤の存在下で実施される。この方法は、Ｓ−ケトプロフェン、Ｓ−イブプロフェン、Ｓ−フェノプロフェン、Ｓ−２−フェニルプロピオン酸およびＳ−インドプロフェンの立体選択的生産に対して特に有用である。
【０００５】
欧州特許０１７８５５３Ａには、キモトリプシンでの対応するアルキルエステルの選択的加水分解による芳香族置換Ｌ−アミノ酸の調製が記載されている。
【０００６】
独国特許２８０４８９２には、Ｎ−アシル−ＤＬ−スレオニンエステルをセリンプロテアーゼ、特にスブチリシンカールスバーグ（subtilisin Carlsberg）で加水分解することによる光学的に純粋なＮ−アシル−Ｌ−スレオニンの調製が記載されている。
【０００７】
式Ｉの化合物の調製のための酵素反応は、これまで刊行物に記載されていない。
【０００８】
化学的加水分解による式Ｉの化合物の合成の試みは、低収率で出発材料の分解におわった。
【０００９】
それゆえ本発明の目的は、置換２−アミノ−３−（２−アミノ−フェニルスルファニル）−プロピオン酸の調製のための新規な発明的な方法である。
【００１０】
式Ｉ
【００１１】
【化８】
【００１２】
（式中、Ｒ1は水素またはアルキルであり；Ｒ2はアミノ保護基であり；それぞれのＲ3は、独立してハロゲン、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルであり；ｎは１または２である）の置換２−アミノ−３−（２−アミノ−フェニルスルファニル）−プロピオン酸を調製するために、式II
【００１３】
【化９】
【００１４】
（式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3及びｎは先に定義した通りであり、Ｒ4はアルキル又はベンジルである）の化合物を有機性共−溶媒を含む水性系中においてプロテアーゼと反応させることを含む、新規な方法を提供する、本発明の方法により式Ｉの化合物を製造できる。
【００１５】
本明細書に記載する酵素的アプローチにより温和な反応条件下でのエステルの選択的加水分解が可能となる。
【００１６】
本明細書で示される構造式中の楔結合
【化１０】
は紙上の平面の上に置換基があることを意味する。
【００１７】
本明細書で使用される用語“アルキル”は、種々の異性体を含むメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert.−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルのような１〜１２個の炭素原子を含む、場合により置換された直鎖又は分枝鎖の炭化水素残基である。
【００１８】
アルキル鎖に対する適切な置換基はフッ素若しくは塩素のような１〜３個のハロゲン、またはメトキシもしくはエトキシのようなＣ1-4−アルコキシから選択できる。置換アルキルの例は、２−クロロエチル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチルまたは２−メトキシエチルである。
【００１９】
Ｒ1のアルキルは先に定義された通りであり、好ましくは１〜７個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の炭化水素残基である。Ｒ1のアルキルは、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、またはtert.−ブチルである。
【００２０】
Ｒ4のアルキルは先に定義された通りであり、好ましくは１〜７個の炭素原子を含む、場合により置換された直鎖または分枝鎖の炭化水素残基である。アルキル鎖に対する適切な置換基はフッ素若しくは塩素のような１〜３個のハロゲン、またはメトキシもしくはエトキシのようなＣ1-4−アルコキシから選択できる。置換アルキルの例は２−クロロエチル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチルまたは２−メトキシエチルである。Ｒ4のアルキルは、より好ましくは１〜７個または１〜４個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素残基である。たとえばメチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルである。好ましい例はメチル、エチル、プロピルである。Ｒ4の最も好ましいアルキルは、メチルである。
【００２１】
本明細書で使用される用語“アミノ保護基”は、アリルオキシカルボニル基（ＡＬＬＯＣ）、低級アルコシカルボニル基（たとえば、tert.−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ））、置換低級アルコシカルボニル基（たとえば、トリクロロエトキシカルボニル）、場合により置換アリールオキシカルボニル基（たとえば、ｐ−ニトロベンゼジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、またはフェニルオキシカルボニル）、アルカノイル基（たとえば、ホルミル、アセチル）、アロイル基（たとえば、ベンゾイル）、ハロゲン−アルカノイル基（たとえば、トリフルオロアセチル）またはシリル保護基（たとえば、tert.−ブチルジメチルシリル）のような、Green T.Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter5, John Wiley and Sons, Inc. (1981).pp.218〜287に記載されてるようなペプチド化学において用いられるような基を指す。好ましいアミノ保護基は、ベンジルオキシカルボニル、tert.−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルまたはベンゾイル、特に好ましいアミノ保護基は、tert.−ブトキシカルボニルである。
【００２２】
用語“アルコキシカルボニル”はカルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）と結合したＣ1-7のアルコキシ残基を意味する。アルコキシ基の例は、種々の異性体を含むメトキシ、エトキシ、ｎ−プロピロキシ、イソプロピロキシ、ｎ−ブチルオキシ、１−sec−ブチルオキシ、イソーブチルオキシ、tert.−ブチルオキシ、ペンチルオキシ、へキシルオキシ、ヘプチルオキシである。アルコキシカルボニル基の例は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、tert.−ブトキシカルボニル等である。好ましい低級アルコキシカルボニルはtert.−ブトキシカルボニルである。
【００２３】
用語“アルケニルオキシカルボニル”はカルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）と結合したアルケニル−オキシ残基を意味する。本明細書で使用される用語“アルケニル”は２〜８個、好ましくは２〜４個の炭素原子、及び少なくとも１つのオレフィン２重結合を有する非置換または置換炭化水素鎖ラジカル及びそれらの種々の異性体を意味する。たとえばビニル、アリルまたはイソプロペニルである。
【００２４】
Ｒ3に対する好ましい“アルケニルオキシカルボニル”はアリルオキシカルボニルまたはイソプロペニルオキシカルボニル、より好ましくはアリルオキシカルボニルである。
【００２５】
用語ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、またはヨードを示す。好ましいハロゲンは臭素である。
【００２６】
数ｎは、１または２のいずれかであり、好ましくは数ｎは１である。
【００２７】
置換基Ｒ3はフェニル環と結合するすべての可能な位置にある。ｎが１である場合、Ｒ3はフェニル環の３、４、５、または６位にある。好ましくは、Ｒ3置換基は４位にある。ｎが２である場合、両方のＲ3置換基は互いに独立してフェニル環の３、４、５、または６位にある。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様は、式IIの化合物が、
【００２９】
【化１１】
【００３０】
（式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4およびｎが先に定義した通りである）であることを特徴とする、式Ｉの化合物の調製のための方法である。
【００３１】
方法の発明の更に好ましい実施態様は、Ｒ1は水素またはアルキル、より好ましいＲ1は水素であり；Ｒ2はアミノ保護基、より好ましいＲ2はアミノ保護基であり；それぞれのＲ3は独立してハロゲン、カルボキシルまたはアルケニルオキシカルボニルであり；Ｒ4はアルキルまたはベンジル、より好ましいＲ4はアルキルであり；ｎは１または２、より好ましいｎは１である。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施態様においては、方法が４．０〜１０のpH、好ましくは６．０〜８．５で、有機性共−溶媒を含む水性系中のプロテアーゼと実施される。
【００３３】
式IIの基質の酵素的加水分解後に鏡像異性的に純粋な式Ｉの産物が酸性化、次いで抽出により分離される。
【００３４】
式IIの化合物はＬまたはＤ型の鏡像異性体のすべての可能な混合物において使用できる。変換は好ましくはラセミ混合またはＬ型−異性体のみを含む混合物で実施される。
【００３５】
異性体の混合物を用いた場合、未反応の残ったＤ型−エステルは抽出段階で除かれ、次いで反応溶媒は酸性化され、Ｌ型−酸が抽出される。
【００３６】
反応のための触媒として適切な酵素は、プロテアーゼ、好ましくは微生物起源の安価なバルクのプロテアーゼ、より好ましくはバチルスのプロテアーゼ（Novo NordiskからのSavinaseのような）またはスブチリシン、たとえばNovo Nordisk（Alkalase）もしくはSolvay(Protease-L）からのスブチリシンカールスバーグ、またはアスペルギルスのプロテアーゼ（AmanoからのProzyme6のような）、またはトリタチウム（Tritachium）のプロテアーゼ（FlukaからのProteaseK）である。反応のための触媒として最も好ましい酵素はスブチリシンカールスバーグ（たとえばNovo NordiskからのAlcalase）である。
【００３７】
代わりとして酵素は、固定化形態で使用できる。
【００３８】
反応は、水−非混合性の溶媒のような有機性共−溶媒または水−混合性の有機性共−溶媒と供に水性系中において実施される。水−非混合性の溶媒は、水相に対して任意の比率で使用できる、好ましい比率は２５〜７５％（ｖ/ｖ）である。水−混合性の有機性共−溶媒は、酵素により許容される高い量において使用できる、典型的は５〜２５％（ｖ/ｖ）であるがスブチリシンカールスバーグの場合のように５０％を超えることも出来る。
【００３９】
反応は０℃〜５０℃の反応温度、好ましくは１５℃〜４０℃の反応温度、そして最も好ましくは１５℃〜２５℃の反応温度で実施される。
【００４０】
水相に関しては、１Ｍまでの、好ましくは約５mM〜約５０mMの濃度のリン酸ナトリウムまたはカリウムのような、生化学的変換のために周知の一般の緩衝溶液を使用できる。そのような緩衝溶液は、たとえば塩化ナトリウムまたはカリウムのような通常の塩の１つ、そしてまたＬｉＳＣＮ、Ｎａ2ＳＯ4または多価アルコール、例えば糖を１Ｍまでの濃度で追加的に含むことも出来る。
【００４１】
適切な有機性共−溶媒は技術的に一般の溶媒である。たとえば、エーテル（たとえば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、またはtert.−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ））、低級アルコール、エステル（たとえば、酢酸エチル）、極性の非プロトン性溶媒（たとえば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはアセトン）である。好ましい有機性共−溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、tert.−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）および酢酸エチルである。
【００４２】
本明細書で使用される用語“低級アルコール”は１つの水酸基を有する１〜８個の炭素原子を含む直鎖または分枝のアルキル残基を意味し、たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、tert.−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールまたはオクタノール、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、tert.−ブタノールであり、そしてより好ましいアルコールはメタノールまたはエタノールである。
【００４３】
基質は、０．１〜２５％の全体的濃度（ｗ/ｗ）の溶液として適切に用いられる。より好ましい全体的濃度は１〜１０％である。
【００４４】
酵素の添加後、反応混合物のpHは、激しく攪拌しながら塩基の制御された添加により選択されたpH値を維持する。好ましい塩基はＮａＯＨまたはＫＯＨの水溶液である。
【００４５】
反応終了後、鏡像異性的に純粋な式Ｉの産物は従来どおりに相分離後、適切な酸での水相の酸性化、次いで適切な有機溶媒での抽出により完成される。
【００４６】
式Ｉの化合物は、本発明に従って、鏡像異性的に９０％またはそれ以上の過剰、好ましくは鏡像異性的に９５％またはそれ以上の過剰が達成されることを意味する、鏡像異性的に高純度で合成される。
【００４７】
式IIの化合物は、以下の反応スキームまたは当業者によく知られた従来の方法に従って調製される。
【００４８】
反応スキーム１：
【００４９】
【表１】
【００５０】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は式Ｉ及びIIの化合物に対して記載された通りである。
【００５１】
スキームＩの反応においては、式ａ）の置換２−ニトロフルオロ−芳香族が、式ｂ）の保護システイン（たとえば、ＢＯＣ−システイン−メチルエステル）と反応し、式ｃ）の対応するニトロ−フェニル置換保護システインを生じる。反応は、ヘキサン、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、プロパノール、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはＤＭＳＯのような適当な有機溶媒中において塩基条件下（ジイソプロピルアミン、たとえばエチルジイソプロピルアミンと供に）で都合よく実施される。反応温度は好ましくは−３０℃〜＋１５０℃である。最も好ましくは、反応は１１０℃の反応温度において、エチルジイソプロピルアミンの存在下エタノール中ＢＯＣ−システイン−メチルエステルと供に実施される。
【００５２】
式ａ）の化合物および式ｂ）の保護システイン（たとえば、ＢＯＣ−システイン−メチルエステル）は、商業的に入手でき、また有機化学についての教科書、たとえばJ.March(1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure"、4thed.John Wiley & Sons）から知られる方法に従って合成される。
【００５３】
反応の第２段階は、式ｃ）のニトロ−フェニル置換保護システインのニトロ基が式IIの対応するアミノ−フェニル置換保護システインに還元されることで実施される。この還元反応は、たとえば有機化学についての教科書、たとえばJ.March(1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure"、4thed.John Wiley & Sons）内で周知である方法に従って実施される。反応はヘキサン、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、プロパノール、ジクロロメタン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、好ましくはメタノールのような有機溶媒と供に酸性溶媒中において適切な還元剤（たとえば、亜鉛および、場合により塩化アンモニウム）で都合よく実施される。反応温度は好ましくは−３０℃〜＋１５０℃である。
【００５４】
式IIのアミノ−フェニル置換保護システイン化合物のＮＨ2−基は、Ｒ1が先に定義された通りでありＨａｌが塩素または臭素である、Ｒ1Ｈａｌでアルキル化できる。
【００５５】
式II−ａおよびII−ｂ（以下参照）の化合物は新規の中間体であり、従ってまた本発明の対象である。
【００５６】
【化１２】
または
【００５７】
【化１３】
【００５８】
式Ｉの化合物は１，５−ベンゾチアゼピンの合成のための多目的ビルディングブロックである。このようなベンゾチアゼピン骨格は、様々な酵素阻害剤（プロテアーゼ、インターロイキン−１β−変換酵素、エラスターゼまたはアンジオテンシン変換酵素、しかし、またＧＰＣＲアンタゴニスト（コレシストキニン、アンジオテンシンIIレセプター）として）において、強制されたジペプチド模倣物として使用されてきた。別の可能な使用は、G.C.Morton et al., Tet.Lett., 41(2000)3029〜3033）において記載されている。
【００５９】
ベンゾチアゼピンは反応スキーム２に従って調製される：
【００６０】
反応スキーム２：
【００６１】
【表２】
【００６２】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびｎは式Ｉ及びIIの化合物に対して記載された通りである。
【００６３】
式IIIのベンゾチアゼピンを得るための式Ｉの化合物の環化反応は、たとえばG.C.Morton et al., Tet.Lett., 41(2000)3029〜3033に記載のように、熱的にまたは適当な試薬の存在下で実施される。反応は、ヘキサン、キシレン、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、プロパノール、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはＤＭＳＯのような適当な有機溶媒におけるカルボジイミドと供に都合よく実施される。反応温度は、好ましくは−３０℃〜＋１５０℃である。反応は、好ましくはＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド）の存在下、ＤＭＦにおいて室温で実施される。
【００６４】
以下の実施例において使用される略号は以下の意味を有する。
【００６５】
ＩＳＰ−ＭＳ イオンスプレーポジティブマススペクトロスコピー
ＩＳＮ−ＭＳ イオンスプレーネガテォブマススペクトロスコピー
ＥＩ−ＭＳ エレクトロインパクトマススペクトロスコピー
ＳＦＣ 超臨海流体クロマトグラフィー
ＮＭＲ 核磁気共鳴スペクトロスコピー
ＩＲ 赤外線スペクトロスコピー
ＨＶ 高真空
ｍｉｎ 分
【００６６】
実施例１（出発材料の調製）
（Ｓ）−３−（４−ブロモ−２−ニトロ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸メチルエステル
【００６７】
【化１４】
【００６８】
反応をM.K.Schwarz et al., J.Org.Chem.1999, 64, 2219-2231.に記載のとおりに実施した。ＥｔＯＨ（３１０mL）中、商業的に入手可能なＢＯＣ−システイン−メチルエステル（２７．３８ｇ、１１６．３５mmol、１当量）、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）（４．４mL、２５．７５mmol、２．５当量）の溶液に、５−ブロモ−２−フルオロニトロベンゼン（２５．６２ｇ；１１６．４５mmol；１当量）を加え、３時間１１０℃で加熱した。反応の進行をＨＰＬＣによりモニターした。溶媒を蒸発し、赤−茶色の油状物とし、これを水（６００mL）と酢酸エチル（３×３００mL）間に分配した。乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）および蒸発により粗産物を生じ、シクロヘキサンでの再結晶化で黄色の結晶（３８．７５ｇ、７７％）を得た。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz): 1.430(s, 9H, O(CH 3)); 3.350(dd, 1H, H(4'), J4'-4"=5.2Hz, J4'-5=14.4Hz); 3.500(dd, 1H, H(4"), J4"-4'=5.2Hz, J4"-5=14.4Hz); 3.755(s, 3H, OCH 3); 4.621(m, 1H, H(5)); 5.301(d, 1H, H(6), J6-5=6.4Hz); 7.449(d, 1H, H(1), J1-2=8.8Hz); 7.670(dd, 1H, H(2), J1-2=8.8Hz, J2-3=2.0Hz); 8.278(d, 1H, H(3), J2-3=2Hz)。IR: 3353cm-1(NH); 1765cm-1(Ester-C=O); 1686cm-1(Carbamate-C=O); 1546cm-1(Amide-C=O); 1460および1329cm-1(NO2); 1220cm-1(Ester)。MS: m/z=79Brで452.3[M+NH4 +]; m/z=81Brで454.3 [M+NH4 +]; m/z=79Brで457.3 [M+Na+]; m/z=81Brで459.3 [M+Na+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．３８。
【００６９】
実施例２
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸メチルエステル
【００７０】
【化１５】
【００７１】
反応をJ.Slade et al. , J.Med.Chem.1985, 28, 1517-1521.に記載のとおりに実施した。上記からのニトロ化合物（４０．３４ｇ、９２．６mmol、１当量）、ＮＨ4Ｃｌ（１９．８１ｇ、３７０．６mmol、４当量）の混合物そしてＭｅＯＨ（９５０mL）中のＺｎ（７９．３７ｇ、１．２０４mmol、１３当量）を加え、１６時間、還流で加熱し、生じた混合物をセライト（Celite）に通してろ過し、沸騰ＭｅＯＨで洗浄した。濃縮後、粗産物を酢酸エチルとＮａＨＣＯ3（水性）間で分配した。生じた油状物は、酢酸エチル／ヘキサン／３％トリエチルアミン）を使用したクロマトグラフィーにかけ、産物（２１．１１ｇ、５６％）を得た。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz): 1.395(s, 9H, O(CH 3)); 3.185(d, 2H, H(4), J4-5=4Hz); 3.617(s, 3H, OCH 3); 4.446(s, 2H, H(7)); 4.528(m, 1H, H(5)); 5.502(d, 1H, H(6), J6-5=8Hz); 6.793(dd, 1H, H(3), J3-2=2Hz,J3-1=8.4Hz); 6.868(d, 1H, H(3), J3-2=2Hz), 7.225(d, 1H, H(1), J1-2=8.4Hz)。IR:3356cm-1(-NH2, -NH); 1744cm-1(Ester-C=O); 1707cm-1(Carbamate-C=O); 1504cm-1(Amide); 1250cm-1(Ester)。MS:m/z=79Brで405.3 [M+H+]; m/z=81Brで407.3 [M+H+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．４７。
【００７２】
実施例３．１（大規模の酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸
【００７３】
【化１６】
【００７４】
１９．９ｇ（４８．０２mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９７．８％）を７５０mlのＴＢＭＥに溶解し、３ｌの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０mMリン酸ナトリウムpH７．５）中において激しく攪拌しながら乳化する。１２．０mlアルカラーゼ（Alcalase）２．４Ｌおよび３０mgのスブスチリシン（Substilisin）Ａ〔両酵素の調製品はNovo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグである〕を加え、激しく攪拌しながら１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク（static））によりpHを７．５に維持した。７日後、４４．７５mlの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液が消費され、変換度は＞９９％（ＨＰＬＣ分析）であった。２相の反応混合物を分離した。少量のリン脂質性不純物および残った基質残渣を分離するために１ｌのＴＢＭＥで水相を簡単に洗浄した。合わせた有機相を１×２５０mlの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液pH７．６で抽出した。合わせた水相を３２％塩酸でpH２に酸性化し１．５ｌの酢酸エチルで抽出した。生じた乳化物を攪拌下で１０％のディカライト（Dicalite）の添加により分離し、次いでろ過した。水相を２×１ｌの酢酸エチルで抽出した。合わせた酢酸エチル相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発した。残留物をジクロロメタンに溶解し、蒸発し、ＨＶで乾燥し、１８．７９ｇのＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンを黄白色の固形物として得た。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz)1.399(s,9H,OC(CH 3)); 3.184(dd, 1H, SCH 2 , J=14.2Hz, J=6.6Hz); 3.235(dd, 1H, SCH 2 , J=14.2Hz, J=6.6Hz); 4.515(m, 1H, COCHNH); 5.517(d, 1H, CONHCH, J=6.8Hz); 6.796(dd, 1H, arom. , J=2Hz, J=8.4Hz); 6.876(d, 1H, arom. , J=2Hz); 7.250(d, 1H, arom. , J=8.4Hz)。IR(ATR-IR)3445および3355cm-1(-NH, -NH2); 2978および2929cm-1broad(-COOH); 1693cm-1(COOH-C=O, carbamate-C=O); 1508cm-1(amide-CO-NH); 1247および1157cm-1(COOH)。MS(ESI-ポジティブイオン化)m/z=79Brで391.1 [M+H+]; m/z=81Brで393.1[M+H+]; m/z=79Brで413.2 [M+Na+]; m/z=81Brで415.2[M+Na+]。OR[α]D=+53.3°(CHCl3;c=1.0)。ＨＰＬＣ分析：カラム：ＡＢＺ＋ｐｌｕｓ；移動相：Ａ：水中０．１％ＴＦＡ；Ｂ：ＭｅＣＮ；勾配Ｂ：３０〜８０％０〜１５分、８０〜３０％１５〜１６分、３０％１６〜１９．５分；流速：１ml／分；圧力：５０〜８０bar；検出：ＵＶ，３００nm；保持時間：１２．１分（産物−酸）１３．５分（基質−エステル）。
【００７５】
実施例３．２（小規模の酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸
【００７６】
１．６５ｇ（３．９９mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９８％）を６５mlのＴＢＭＥに溶解し、２４０mlの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；２０mMリン酸ナトリウムpH７．５）中において激しく攪拌しながら乳化する。０．７５mlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、激しく攪拌しながら１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．５に維持した。３３時間後、４．２３mlの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液が消費され、変換度は、＞９９％（ＨＰＬＣ分析）であった。反応混合物を３２％塩酸でpH２に酸性化し、デカライト（Decalite）上でろ過した。相分離後、水相を、３×２７５mlの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物をジクロロメタンに溶解し、蒸発させ、ＨＶで乾燥し、１．５６ｇのＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンを黄白色の固形物として得た。
【００７７】
実施例３．３（異なる溶媒での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸
【００７８】
１００mg（０．２４２mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９８％）を２０％有機性共−溶媒（以下の表を参照）および８０％緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．５）からなる系に激しく攪拌しながら加えた。１００μlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、激しく攪拌しながら０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．５に維持した。反応終了時、変換度をＨＰＬＣにより決定した。
【００７９】
【表３】
【００８０】
実施例３．４（他の酵素での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸
【００８１】
２００mg（０．４９３mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−ブロモ−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９３．８％）を５mlのＴＢＭＥおよび２０mlの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．０）からなる系に激しく攪拌しながら加えた。酵素〔以下の表を参照〕を加え、激しく攪拌しながら０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．０に維持した。反応終了後、反応混合物を２５mlＴＢＭＥで２回洗浄し、２５％ＨＣｌでpH２．５に酸性化し、３×２５mlの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させ、残留物を高真空において乾燥させた。
【００８２】
【表４】
【００８３】
実施例４
（Ｓ）−（７−ブロモ−４−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−ベンゾ[ｂ][１，４]チアゼピン−３−イル）−カルバミン酸tert.−ブチルエステル
【００８４】
【化１７】
【００８５】
反応は、G.C.Morton et al., Tet.Lett., 41(2000)3029〜3033）に記載のように実施される。ＤＭＦ（５００ml）中の酵素的加水分解からの産物（１５．２ｇ、３８．８mmol、１当量）およびＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（７．４４ｇ、３８．８mol、１当量）を１６時間、室温で攪拌し、濃縮し、残留物を酢酸エチルに溶解し、ＮａＨＣＯ3（１Ｍ）（５００ml）水溶液および水（５００ml）で抽出した。乾燥（ＮａＳＯ4）および濃縮により産物（定量で１４．５ｇ）を得た。分析データ：1Ｈ−ＮＭＲ（CDCl3, 400MHz): 1.409(s, 9H, O(CH 3)); 2.939(t, 1H, H(4'), J=11.6Hz); 3.794(dd, 1H, H(4'), J4"-5=11Hz, J4"-4'=6.4Hz); 4.439(m, 1H, H(5)); 5.567(d, 1H, H(6), J6-5=8Hz); 7.306(d, 1H, H(2), J2-1=8Hz, J2-3=2Hz); 7.337(d, 1H, H(3), J3-2=2Hz); 7.748(d, 1H, H(1), J1-2=8Hz); 8.042(s, 1H, H(7))。IR: 3284および3184cm-1(-NH); 1729cm-1(carbamate-C=O); 1678cm-1(Amide-C=O); 1574cm-1(Amide); 1251cm-1(Ester)。ＭＳ：ｍ/ｚ＝79Ｂｒで３７３．３[Ｍ+Ｈ+]；ｍ/ｚ＝81Ｂｒで３７５．３ [Ｍ+Ｈ+]；ｍ/ｚ＝79Ｂｒで３９５ [Ｍ+Ｎａ+]；ｍ/ｚ＝81Ｂｒで３９７ [Ｍ+Ｎａ+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．２３。
【００８６】
実施例５
（Ｓ）−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−メトキシカルボニル−エチルスルファニル）−３−ニトロ−安息香酸アリルエステル
【００８７】
【化１８】
【００８８】
４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸（４９．９５ｇ、２６９．８mmol、１当量）をメタノール（３５０ml）に溶解し、Ｃｓ2ＣＯ3（４４．０６ｇ、１３５．２mmol、０．５当量）を加え、溶媒を蒸発させた。次いで、Ｃｓ−塩をＤＭＦに溶解し、５０℃に過熱し、臭化アリル（２２．８mL、２６９．８mol、１当量）で処理した。５分後、溶媒を蒸発させ、生じた固形物をＥｔ2Ｏ中で粉砕した。ろ過及び蒸発により租アリルエステルを定量的に得た。次の工程を、M.K.Schwarz et al., J.Org.Chem.1999、64, 2219-2231に従って実施した。アリルエステル（３０ｇ、１３３．２mmol、１当量）、ＢＯＣ−システイン−メチルエステル（３１．３５ｇ、１３３．２mmol、１当量）およびＤＩＰＥＡ（６８．３mL、３９９．６mmol、３当量）をＥｔＯＨ中にゆっくり加え（発熱反応が観察された）、ｒｔで３時間攪拌し、濃縮し、固形物を得、ジイソプロピルエーテルから再結晶した（４６．１６ｇ、７９％）。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz)：1.443(s, 9H, O(CH 3)); 3.401(dd, 1H, H(7'), J7'-7"=2.4Hz, J7'-8=6Hz); 3.506(dd, 1H, H(7"), J7"-7'=2.4Hz, J7"-8=6Hz); 3.777(s, 3H, OCH 3); 4.608(m, 1H, H(8)); 4.860(dt、2H, H(3', 3"), J3-2=5.6Hz; J3-1=1.6Hz); 5.322(q, 1H, H(1'), J=0.8Hz); 5.347(t, 1H, H(1"), J=0.8Hz); 5.406(d, 1H, H(9), J9-8=1.6Hz); 6.032(m, 1H, H(2)); 7.625(d, 1H, H(5), J5-4=8.4Hz); 8.201(dd, 1H, H(4), J4-5=8.4Hz, J4-6=1.6Hz); 8.830(d, 1H, H(6), J6-4=1.6Hz)。IR: 3350cm-1(-NH); 1742cm-1(Ester-C=O); 1719cm-1(Conj.Ester-C=O); 1686cm-1(carbamate-C=O); 1523および1334cm-1(-NO2); 1245cm-1(Ester)。MS: m/z=441[M+H+]; m/z=458.4 [M+NH4 +]; m/z=463.2 [M+Na+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．４０。
【００８９】
実施例６
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−メトキシカルボニル−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【００９０】
【化１９】
【００９１】
反応を、J.Slade et al., J.Med.Chem.1985, 28, 1517-1521に記載のように実施する。ＤＭＥ（１５ml）中の先の産物（５０６mg、１．１５mmol、１当量）、ＮＨ4Ｃｌ水溶液（２０ml）およびＺｎ（９７６mg、１４．９mmol、１３当量）を攪拌し、８０℃で１６時間加熱した。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル（２５０ml）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（１Ｍ）（水溶液）（３×５０mL）で抽出した。有機相をＮａＳＯ4で乾燥し、蒸発させ、黄色の油状物を得、数日後に結晶化した（２７６mg、６０％）。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz): 1.380(s, 1H, O(CH 3)); 3.283(d, 2H, H(7', 7"), J7-8=4.4Hz; 3.579(s, 3H, OCH 3); 4.445(s, 2H, H(10', 10")); 4.554(m, 1H, H(8)); 4.787(ddd、2H, H(2'2"), J=1.2Hz); 5.283(dd, 1H, H(1'), J1'-2=10.6Hz, J1'-1"=1.2Hz); 5.390(dd, 1H, H(1"), J1"-2=17.8Hz, J1"-1'=1.2Hz); 5.506(d, 1H, H(9), J9-8=7.6Hz); 6.015(m, 1H, H(8)); 7.360(dd, 1H, H(2), J4-5=8Hz, J4-6=1.6Hz); 7.398(d, 1H, H(6), J6-4=1.6Hz); 7.425(d, 1H, H(5), J5-4=8Hz)。IR: 3378cm-1(-NH, NH2); 1751cm-1(Ester-C=O); 1713cm-1(Conj.Ester-C=O); 1685cm-1(Carbamate-C=O); 1511cm-1(Amide); 1220cm-1(Ester)。MS: m/z=411.3[M+H+]; m/z=433.3 [M+Na+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．２７。
【００９２】
実施例７．１（大規模での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【００９３】
【化２０】
【００９４】
６．４ｇ（１５．６５８mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９９％）を４８０mlのＴＢＭＥに溶解し、１．５ｌの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；１６０mMリン酸ナトリウムpH７．５）中において激しく攪拌しながら乳化する。１２．０mlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、激しく攪拌しながら１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．５に維持した。４８．５時間後、１６．６mlの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液が消費され、変換度は＞９７％（ＨＰＬＣ分析）であった。相分離後、水相を１ｌのＴＢＭＥで１回抽出した。合わせたＴＢＭＥ相を２×０．４ｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液pH７．６で抽出した。合わせた水相を３２％塩酸でpH２に酸性化し、３×０．５ｌの酢酸エチルで抽出した。安定な乳化物が形成された場合、相分離はディカライト（Dicalite）上でろ過により成された。合わせた酢酸エチルを無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物をジクロロメタンに溶解し、蒸発させ、ＨＶで乾燥し、５．８５ｇのＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンを黄色の高粘性の油状物として得た（収率：９４．６％）。分析データ：1H-NMR(DMSO, 400MHz)1.338(s, 9H, OC(CH 3)); 3.077(dd, 1H, SCH 2 , J=12.8Hz, J=6.8Hz); 3.238(dd, 1H, SCH 2 , J=13.8Hz, J=4.6Hz); 3.867(m, 1H, COCHNH); 4.753(d, 2H, COOCH 2 , J=5.2Hz); 5.526(d, 1H, CH=CH 2 , J=10Hz); 5.538(d, 1H, CH=CH 2 , J=17.6Hz); 5.595(m, 2H, NH 2 ); 6.018(ddtr, 1H, CH 2 CH=CH 2 , J=16.6Hz, J=10.6Hz, J=5.6Hz); 6.519(m, 1H, CONHCH); 6.876(d, 1H, arom. CSCH, J=8.4Hz); 7.330(d, 1H, arom. CSCHCH, J=8.4Hz); 7.338(s, 1H, arom. CHCNH2)。IR(ATR-IR)3420および3355cm-1(-NH, NH2); 2980および2935cm-1broad(-COOH); 1705cm-1(COOH-C=O、carbamate-C=O); 1510cm-1(amide-CO-NH); 1486cm-1 aromate; 1229および1160cm-1(COOH); 982および932cm-1(vinyl、-C=CH 2 )。MS(ESI-ポジティブイオン化)m/z=397.1 [M+H+]; m/z=419.4[M+Na+]。OR[α]D=+16.16°(CHCl3; c=1.0)。ＨＰＬＣ分析：カラム：ＡＢＺ＋Ｐｌｕｓ；移動相：Ａ：水に０．１％ＴＦＡ；Ｂ：ＭｅＣＮ；勾配Ｂ：３０〜８０％０〜１５分、８０〜３０％１５〜１６分、３０％１６〜１９．５分：流速：１ml／分；圧力：５０〜８０bar；検出：ＵＶ，３００nm；保持時間：１１．２分（産物−酸）；１２．７分（基質−エステル）。
【００９５】
実施例７．２（小規模での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【００９６】
０．７６９mg（１.６５８mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニル−チオ）−Ｌ−アラニンメチルエステルを４０mlのＴＢＭＥに溶解し、２２０mlの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液；３mMリン酸ナトリウム緩衝液pH７．５中において激しく攪拌しながら乳化する。１．０mlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、激しく攪拌しながら１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．５に維持した。４５．４時間後、２３．６mlの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液が消費され、変換度は＞９７％（ＨＰＬＣ分析）であった。反応混合物を、１００mlのＴＢＭＥで抽出した。相分離後、水相を３２％塩酸でpH２．３に酸性化し、３×２５０mlの酢酸エチルで抽出した。安定な乳化物が形成された場合、相分離はディカライト（Dicalite）上でろ過により成された。合わせた酢酸エチル抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物をジクロロメタンに溶解し、蒸発させ、ＨＶで乾燥し、６０４mgのＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンを黄白色の固形物として得た（収率：９３．９％、純度：９５％）。
【００９７】
実施例７．３（異なる溶媒での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【００９８】
２００mg（０．４８７mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９６．７％）を２から５mlの有機性共−溶媒（以下の表を参照）および２０ml緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．０）からなる系に激しく攪拌しながら加えた。アルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ、量は以下の表を参照〕を加え、激しく攪拌しながら０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．０に維持した。反応を滴定試薬の消費によりモニターし、産物の形成をＨＰＬＣにより確認した。
【００９９】
【表５】
【０１００】
実施例７．４（他の酵素での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【０１０１】
２００mg（０．４８７mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９６．７％）を５mlのＴＢＭＥおよび２０mlの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．０）からなる系に激しく攪拌しながら加えた。酵素〔以下の表を参照〕を加え、激しく攪拌しながら０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．０に維持した。反応を滴定試薬の消費によりモニターし、産物の形成をＨＰＬＣにより確認した。
【０１０２】
【表６】
【０１０３】
実施例７．５（高温度での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【０１０４】
２００mg（０．４８７mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９６．７％）を５mlのＴＢＭＥおよび２０mlの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．０）からなる系に激しく攪拌しながら４０℃で加えた。１００μlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、４０℃で０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）により激しく攪拌しながらpHを７．０に維持した。５．４４mlの滴定試薬（理論の１１２％；１７．４時間後）の消費後、反応混合物を２５mlのＴＢＭＥで洗浄し、１ＮのＨＣｌでpH２．５に酸性化し、そして３×２５mlの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させ、残留物を高真空上で乾燥し、９４．５％のＨＰＬＣ純度（領域−％）の産物酸１９０mg（０．４７９mmol；９８％）を得た。
【０１０５】
実施例８
（Ｓ）−３−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−４−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−ベンゾ[ｂ] [１，４]チアゼピン−７−カルボン酸アリルエステル
【０１０６】
【化２１】
【０１０７】
反応をG.C.Morton et al., Tet.Lett., 41(2000)3029〜3033に記載のように実施する。酵素加水分解からの産物（５．６ｇ、１４．１mmol、１当量）をＤＭＦ（７５mL）に溶解しＥＤＡＣ（２．７０ｇ、１４．１mmol、１当量）で処理し、室温で１６時間攪拌した。濃縮後、残留物を酢酸エチル（５００mL）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（１Ｍ）（水溶液）（３×１５０mL）および水（３×１５０mL）で抽出した。有機相を乾燥（ＮａＳＯ4）し、蒸発し、黄色の油状物を得た。酢酸エチル／ヘキサン１：２でのクロマトグラフィー後、黄色の結晶を得た（４．９６ｇ、９３％）。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz): 1.400(s, 1H, O(CH 3)); 3.014(t, 1H, H(7'or7"), J=12Hz); 3.815(dd, 1H, H(7'or7"), J7-8=12Hz、J7'-7"=6.4Hz); 4.466(m, 1H, H(8)); 4.835(d, 2H, H(3', 3"), J3-2=5.7Hz); 5.316(dd, 1H, H(1'), J1'-2=10.5Hz、J1'-1"=1.2Hz); 5.413(dd, 1H, H(1"), J1"-2=17.2Hz, J1"-1'=1.2Hz); 5.581(d, 1H, H(9), J9-8=8Hz); 6.013(m, 1H, H(8)); 7.338(d, 1H, H(5), J5-4=11.1Hz; 7.704(s, 1H, H(10)); 7.751(d, 1H, H(6), J5-4=1.8Hz); 7.338(dd, 1H, H(2), J4-5=11.1Hz, J4-6=1.8Hz)。IR: 3206cm-1(-NH); 1720cm-1(Carbamate-C=O); 1671cm-1(Amide-C=O); 1500cm-1(Amide-CO-NH); 1209cm-1(Ester)。MS: m/z=379.3[M+H+]; m/z=401.4 [M+Na+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．３６。
【０１０８】
実施例９
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸
【０１０９】
【化２２】
２００mg（０．５４０mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−カルボキシ−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステルを５mlのＴＢＭＥおよび２０mlの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．０）からなる系に激しく攪拌しながら加えた。１００μlのアルカラーゼ２．５Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）により激しく攪拌しながらpHを７．０に維持した。５．８４７mlの滴定試薬（理論値の１０８％；１．５時間後）の消費後、反応混合物を２５mlのＴＢＭＥで２回洗浄し、２５％ＨＣｌでpH２．５に酸性化し、そして３×２５mlの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させ、残留物をＨＶ上で乾燥し、１８７mg（０．４７９mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−カルボキシフェニルチオ）−Ｌ−アラニンを黄色の結晶として得た（収率：９３．４％）。分析データ：ＨＰＬＣ−純度：９６．４％％（領域）。1H-NMR(DMSO, 400MHz): 1.378(s, 9H, OC(CH 3)); 2.982(dd, 1H, SCH 2, J=13.2Hz, J=9.6Hz); 3.150(dd, 1H, SCH 2, J=13.2Hz, J=4.4Hz); 3.950(m, 1H, COCHNH); 5.542(m, 2H, -NH 2); 7.067(dd, 1H, CONHCH, J=8.0Hz, J=1.6Hz); 7.201(d, 1H, arom. SCCH, J=8.0Hz); 7.298(d, 1H, arom. SCCHCH, J=8.0Hz); 7.323(d, 1H, arom. CHCNH2, J=1.6Hz); 12.73(bs, 2H, 2-COOH)。IR: 3445および3347cm-1(-NH, -NH2); 2977および2930cm-1braod(-COOH); 1720および1692cm-1(COOH-C=O, carbamate-C=O); 1608cm-1(-COO-); 1509cm-1(amide-CO-NH); 1486cm-1(aromate); 1247および1163cm-1(COOH)。ISN-MS: m/z=355.1[M-H+]; OR[α]D=+13.00°(EtOH; c=1.0)。
【０００１】
本発明は式Ｉ
【０００２】
【化７】
（式中、Ｒ1は水素またはアルキルであり；Ｒ2はアミノ保護基であり；それぞれのＲ3は、独立してハロゲン、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルであり；ｎは１または２である）の化合物の調製のための新規な酵素的方法に関する。
【０００４】
欧州特許０４０７０３３Ａには、２−ハロプロピオン酸以外の２−置換酸エステルのラセミ混合物の対応する鏡像異性の酸への酵素的立体選択的加水分解が記載されている。この反応は、カンジダルゴーサ（Candida rugosa）リパーゼのイソ酵素、有機溶媒（例えば、トルエン）および還元剤の存在下で実施される。この方法は、Ｓ−ケトプロフェン、Ｓ−イブプロフェン、Ｓ−フェノプロフェン、Ｓ−２−フェニルプロピオン酸およびＳ−インドプロフェンの立体選択的生産に対して特に有用である。
【０００５】
欧州特許０１７８５５３Ａには、キモトリプシンでの対応するアルキルエステルの選択的加水分解による芳香族置換Ｌ−アミノ酸の調製が記載されている。
【０００６】
独国特許２８０４８９２には、Ｎ−アシル−ＤＬ−スレオニンエステルをセリンプロテアーゼ、特にスブチリシンカールスバーグ（subtilisin Carlsberg）で加水分解することによる光学的に純粋なＮ−アシル−Ｌ−スレオニンの調製が記載されている。
【０００７】
式Ｉの化合物の調製のための酵素反応は、これまで刊行物に記載されていない。
【０００８】
化学的加水分解による式Ｉの化合物の合成の試みは、低収率で出発材料の分解におわった。
【０００９】
それゆえ本発明の目的は、置換２−アミノ−３−（２−アミノ−フェニルスルファニル）−プロピオン酸の調製のための新規な発明的な方法である。
【００１０】
式Ｉ
【００１１】
【化８】
（式中、Ｒ1は水素またはアルキルであり；Ｒ2はアミノ保護基であり；それぞれのＲ3は、独立してハロゲン、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルであり；ｎは１または２である）の置換２−アミノ−３−（２−アミノ−フェニルスルファニル）−プロピオン酸を調製するために、式II
【００１３】
【化９】
（式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3及びｎは先に定義した通りであり、Ｒ4はアルキル又はベンジルである）の化合物を有機性共−溶媒を含む水性系中においてプロテアーゼと反応させることを含む、新規な方法を提供する、本発明の方法により式Ｉの化合物を製造できる。
【００１５】
本明細書に記載する酵素的アプローチにより温和な反応条件下でのエステルの選択的加水分解が可能となる。
【００１６】
本明細書で示される構造式中の楔結合
【化１０】
【００１７】
本明細書で使用される用語“アルキル”は、種々の異性体を含むメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert.−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルのような１〜１２個の炭素原子を含む、場合により置換された直鎖又は分枝鎖の炭化水素残基である。
【００１８】
アルキル鎖に対する適切な置換基はフッ素若しくは塩素のような１〜３個のハロゲン、またはメトキシもしくはエトキシのようなＣ1-4−アルコキシから選択できる。置換アルキルの例は、２−クロロエチル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチルまたは２−メトキシエチルである。
【００１９】
Ｒ1のアルキルは先に定義された通りであり、好ましくは１〜７個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の炭化水素残基である。Ｒ1のアルキルは、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、またはtert.−ブチルである。
【００２０】
Ｒ4のアルキルは先に定義された通りであり、好ましくは１〜７個の炭素原子を含む、場合により置換された直鎖または分枝鎖の炭化水素残基である。アルキル鎖に対する適切な置換基はフッ素若しくは塩素のような１〜３個のハロゲン、またはメトキシもしくはエトキシのようなＣ1-4−アルコキシから選択できる。置換アルキルの例は２−クロロエチル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチルまたは２−メトキシエチルである。Ｒ4のアルキルは、より好ましくは１〜７個または１〜４個の炭素原子を含む直鎖の炭化水素残基である。たとえばメチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルである。好ましい例はメチル、エチル、プロピルである。Ｒ4の最も好ましいアルキルは、メチルである。
【００２１】
本明細書で使用される用語“アミノ保護基”は、アリルオキシカルボニル基（ＡＬＬＯＣ）、低級アルコシカルボニル基（たとえば、tert.−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ））、置換低級アルコシカルボニル基（たとえば、トリクロロエトキシカルボニル）、場合により置換アリールオキシカルボニル基（たとえば、ｐ−ニトロベンゼジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、またはフェニルオキシカルボニル）、アルカノイル基（たとえば、ホルミル、アセチル）、アロイル基（たとえば、ベンゾイル）、ハロゲン−アルカノイル基（たとえば、トリフルオロアセチル）またはシリル保護基（たとえば、tert.−ブチルジメチルシリル）のような、Green T.Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter5, John Wiley and Sons, Inc. (1981).pp.218〜287に記載されてるようなペプチド化学において用いられるような基を指す。好ましいアミノ保護基は、ベンジルオキシカルボニル、tert.−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルまたはベンゾイル、特に好ましいアミノ保護基は、tert.−ブトキシカルボニルである。
【００２２】
用語“アルコキシカルボニル”はカルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）と結合したＣ1-7のアルコキシ残基を意味する。アルコキシ基の例は、種々の異性体を含むメトキシ、エトキシ、ｎ−プロピロキシ、イソプロピロキシ、ｎ−ブチルオキシ、１−sec−ブチルオキシ、イソーブチルオキシ、tert.−ブチルオキシ、ペンチルオキシ、へキシルオキシ、ヘプチルオキシである。アルコキシカルボニル基の例は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、tert.−ブトキシカルボニル等である。好ましい低級アルコキシカルボニルはtert.−ブトキシカルボニルである。
【００２３】
用語“アルケニルオキシカルボニル”はカルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）と結合したアルケニル−オキシ残基を意味する。本明細書で使用される用語“アルケニル”は２〜８個、好ましくは２〜４個の炭素原子、及び少なくとも１つのオレフィン２重結合を有する非置換または置換炭化水素鎖ラジカル及びそれらの種々の異性体を意味する。たとえばビニル、アリルまたはイソプロペニルである。
【００２４】
Ｒ3に対する好ましい“アルケニルオキシカルボニル”はアリルオキシカルボニルまたはイソプロペニルオキシカルボニル、より好ましくはアリルオキシカルボニルである。
【００２５】
用語ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、またはヨードを示す。好ましいハロゲンは臭素である。
【００２６】
数ｎは、１または２のいずれかであり、好ましくは数ｎは１である。
【００２７】
置換基Ｒ3はフェニル環と結合するすべての可能な位置にある。ｎが１である場合、Ｒ3はフェニル環の３、４、５、または６位にある。好ましくは、Ｒ3置換基は４位にある。ｎが２である場合、両方のＲ3置換基は互いに独立してフェニル環の３、４、５、または６位にある。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様は、式IIの化合物が、
【００２９】
【化１１】
（式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4およびｎが先に定義した通りである）であることを特徴とする、式Ｉの化合物の調製のための方法である。
【００３１】
方法の発明の更に好ましい実施態様は、Ｒ1は水素またはアルキル、より好ましいＲ1は水素であり；Ｒ2はアミノ保護基、より好ましいＲ2はアミノ保護基であり；それぞれのＲ3は独立してハロゲン、カルボキシルまたはアルケニルオキシカルボニルであり；Ｒ4はアルキルまたはベンジル、より好ましいＲ4はアルキルであり；ｎは１または２、より好ましいｎは１である。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施態様においては、方法が４．０〜１０のpH、好ましくは６．０〜８．５で、有機性共−溶媒を含む水性系中のプロテアーゼと実施される。
【００３３】
式IIの基質の酵素的加水分解後に鏡像異性的に純粋な式Ｉの産物が酸性化、次いで抽出により分離される。
【００３４】
式IIの化合物はＬまたはＤ型の鏡像異性体のすべての可能な混合物において使用できる。変換は好ましくはラセミ混合またはＬ型−異性体のみを含む混合物で実施される。
【００３５】
異性体の混合物を用いた場合、未反応の残ったＤ型−エステルは抽出段階で除かれ、次いで反応溶媒は酸性化され、Ｌ型−酸が抽出される。
【００３６】
反応のための触媒として適切な酵素は、プロテアーゼ、好ましくは微生物起源の安価なバルクのプロテアーゼ、より好ましくはバチルスのプロテアーゼ（Novo NordiskからのSavinaseのような）またはスブチリシン、たとえばNovo Nordisk（Alkalase）もしくはSolvay(Protease-L）からのスブチリシンカールスバーグ、またはアスペルギルスのプロテアーゼ（AmanoからのProzyme6のような）、またはトリタチウム（Tritachium）のプロテアーゼ（FlukaからのProteaseK）である。反応のための触媒として最も好ましい酵素はスブチリシンカールスバーグ（たとえばNovo NordiskからのAlcalase）である。
【００３７】
代わりとして酵素は、固定化形態で使用できる。
【００３８】
反応は、水−非混合性の溶媒のような有機性共−溶媒または水−混合性の有機性共−溶媒と供に水性系中において実施される。水−非混合性の溶媒は、水相に対して任意の比率で使用できる、好ましい比率は２５〜７５％（ｖ/ｖ）である。水−混合性の有機性共−溶媒は、酵素により許容される高い量において使用できる、典型的は５〜２５％（ｖ/ｖ）であるがスブチリシンカールスバーグの場合のように５０％を超えることも出来る。
【００３９】
反応は０℃〜５０℃の反応温度、好ましくは１５℃〜４０℃の反応温度、そして最も好ましくは１５℃〜２５℃の反応温度で実施される。
【００４０】
水相に関しては、１Ｍまでの、好ましくは約５mM〜約５０mMの濃度のリン酸ナトリウムまたはカリウムのような、生化学的変換のために周知の一般の緩衝溶液を使用できる。そのような緩衝溶液は、たとえば塩化ナトリウムまたはカリウムのような通常の塩の１つ、そしてまたＬｉＳＣＮ、Ｎａ2ＳＯ4または多価アルコール、例えば糖を１Ｍまでの濃度で追加的に含むことも出来る。
【００４１】
適切な有機性共−溶媒は技術的に一般の溶媒である。たとえば、エーテル（たとえば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、またはtert.−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ））、低級アルコール、エステル（たとえば、酢酸エチル）、極性の非プロトン性溶媒（たとえば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはアセトン）である。好ましい有機性共−溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、tert.−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）および酢酸エチルである。
【００４２】
本明細書で使用される用語“低級アルコール”は１つの水酸基を有する１〜８個の炭素原子を含む直鎖または分枝のアルキル残基を意味し、たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、tert.−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールまたはオクタノール、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、tert.−ブタノールであり、そしてより好ましいアルコールはメタノールまたはエタノールである。
【００４３】
基質は、０．１〜２５％の全体的濃度（ｗ/ｗ）の溶液として適切に用いられる。より好ましい全体的濃度は１〜１０％である。
【００４４】
酵素の添加後、反応混合物のpHは、激しく攪拌しながら塩基の制御された添加により選択されたpH値を維持する。好ましい塩基はＮａＯＨまたはＫＯＨの水溶液である。
【００４５】
反応終了後、鏡像異性的に純粋な式Ｉの産物は従来どおりに相分離後、適切な酸での水相の酸性化、次いで適切な有機溶媒での抽出により完成される。
【００４６】
式Ｉの化合物は、本発明に従って、鏡像異性的に９０％またはそれ以上の過剰、好ましくは鏡像異性的に９５％またはそれ以上の過剰が達成されることを意味する、鏡像異性的に高純度で合成される。
【００４７】
式IIの化合物は、以下の反応スキームまたは当業者によく知られた従来の方法に従って調製される。
【００４８】
反応スキーム１：
【００４９】
【表１】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は式Ｉ及びIIの化合物に対して記載された通りである。
【００５１】
スキームＩの反応においては、式ａ）の置換２−ニトロフルオロ−芳香族が、式ｂ）の保護システイン（たとえば、ＢＯＣ−システイン−メチルエステル）と反応し、式ｃ）の対応するニトロ−フェニル置換保護システインを生じる。反応は、ヘキサン、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、プロパノール、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはＤＭＳＯのような適当な有機溶媒中において塩基条件下（ジイソプロピルアミン、たとえばエチルジイソプロピルアミンと供に）で都合よく実施される。反応温度は好ましくは−３０℃〜＋１５０℃である。最も好ましくは、反応は１１０℃の反応温度において、エチルジイソプロピルアミンの存在下エタノール中ＢＯＣ−システイン−メチルエステルと供に実施される。
【００５２】
式ａ）の化合物および式ｂ）の保護システイン（たとえば、ＢＯＣ−システイン−メチルエステル）は、商業的に入手でき、また有機化学についての教科書、たとえばJ.March(1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure"、4thed.John Wiley & Sons）から知られる方法に従って合成される。
【００５３】
反応の第２段階は、式ｃ）のニトロ−フェニル置換保護システインのニトロ基が式IIの対応するアミノ−フェニル置換保護システインに還元されることで実施される。この還元反応は、たとえば有機化学についての教科書、たとえばJ.March(1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure"、4thed.John Wiley & Sons）内で周知である方法に従って実施される。反応はヘキサン、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、プロパノール、ジクロロメタン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、好ましくはメタノールのような有機溶媒と供に酸性溶媒中において適切な還元剤（たとえば、亜鉛および、場合により塩化アンモニウム）で都合よく実施される。反応温度は好ましくは−３０℃〜＋１５０℃である。
【００５４】
式IIのアミノ−フェニル置換保護システイン化合物のＮＨ2−基は、Ｒ1が先に定義された通りでありＨａｌが塩素または臭素である、Ｒ1Ｈａｌでアルキル化できる。
【００５５】
式II−ａおよびII−ｂ（以下参照）の化合物は新規の中間体であり、従ってまた本発明の対象である。
【００５６】
【化１２】
【００５７】
【化１３】
式Ｉの化合物は１，５−ベンゾチアゼピンの合成のための多目的ビルディングブロックである。このようなベンゾチアゼピン骨格は、様々な酵素阻害剤（プロテアーゼ、インターロイキン−１β−変換酵素、エラスターゼまたはアンジオテンシン変換酵素、しかし、またＧＰＣＲアンタゴニスト（コレシストキニン、アンジオテンシンIIレセプター）として）において、強制されたジペプチド模倣物として使用されてきた。別の可能な使用は、G.C.Morton et al., Tet.Lett., 41(2000)3029〜3033）において記載されている。
【００５９】
ベンゾチアゼピンは反応スキーム２に従って調製される：
【００６０】
反応スキーム２：
【００６１】
【表２】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびｎは式Ｉ及びIIの化合物に対して記載された通りである。
【００６３】
式IIIのベンゾチアゼピンを得るための式Ｉの化合物の環化反応は、たとえばG.C.Morton et al., Tet.Lett., 41(2000)3029〜3033に記載のように、熱的にまたは適当な試薬の存在下で実施される。反応は、ヘキサン、キシレン、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、プロパノール、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはＤＭＳＯのような適当な有機溶媒におけるカルボジイミドと供に都合よく実施される。反応温度は、好ましくは−３０℃〜＋１５０℃である。反応は、好ましくはＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド）の存在下、ＤＭＦにおいて室温で実施される。
【００６４】
以下の実施例において使用される略号は以下の意味を有する。
【００６５】
ＩＳＰ−ＭＳ イオンスプレーポジティブマススペクトロスコピー
ＩＳＮ−ＭＳ イオンスプレーネガテォブマススペクトロスコピー
ＥＩ−ＭＳ エレクトロインパクトマススペクトロスコピー
ＳＦＣ 超臨海流体クロマトグラフィー
ＮＭＲ 核磁気共鳴スペクトロスコピー
ＩＲ 赤外線スペクトロスコピー
ＨＶ 高真空
ｍｉｎ 分
【００６６】
実施例１（出発材料の調製）
（Ｓ）−３−（４−ブロモ−２−ニトロ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸メチルエステル
【００６７】
【化１４】
反応をM.K.Schwarz et al., J.Org.Chem.1999, 64, 2219-2231.に記載のとおりに実施した。ＥｔＯＨ（３１０mL）中、商業的に入手可能なＢＯＣ−システイン−メチルエステル（２７．３８ｇ、１１６．３５mmol、１当量）、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）（４．４mL、２５．７５mmol、２．５当量）の溶液に、５−ブロモ−２−フルオロニトロベンゼン（２５．６２ｇ；１１６．４５mmol；１当量）を加え、３時間１１０℃で加熱した。反応の進行をＨＰＬＣによりモニターした。溶媒を蒸発し、赤−茶色の油状物とし、これを水（６００mL）と酢酸エチル（３×３００mL）間に分配した。乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）および蒸発により粗産物を生じ、シクロヘキサンでの再結晶化で黄色の結晶（３８．７５ｇ、７７％）を得た。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz): 1.430(s, 9H, O(CH 3)); 3.350(dd, 1H, H(4'), J4'-4"=5.2Hz, J4'-5=14.4Hz); 3.500(dd, 1H, H(4"), J4"-4'=5.2Hz, J4"-5=14.4Hz); 3.755(s, 3H, OCH 3); 4.621(m, 1H, H(5)); 5.301(d, 1H, H(6), J6-5=6.4Hz); 7.449(d, 1H, H(1), J1-2=8.8Hz); 7.670(dd, 1H, H(2), J1-2=8.8Hz, J2-3=2.0Hz); 8.278(d, 1H, H(3), J2-3=2Hz)。IR: 3353cm-1(NH); 1765cm-1(Ester-C=O); 1686cm-1(Carbamate-C=O); 1546cm-1(Amide-C=O); 1460および1329cm-1(NO2); 1220cm-1(Ester)。MS: m/z=79Brで452.3[M+NH4 +]; m/z=81Brで454.3 [M+NH4 +]; m/z=79Brで457.3 [M+Na+]; m/z=81Brで459.3 [M+Na+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．３８。
【００６９】
実施例２
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸メチルエステル
【００７０】
【化１５】
反応をJ.Slade et al. , J.Med.Chem.1985, 28, 1517-1521.に記載のとおりに実施した。上記からのニトロ化合物（４０．３４ｇ、９２．６mmol、１当量）、ＮＨ4Ｃｌ（１９．８１ｇ、３７０．６mmol、４当量）の混合物そしてＭｅＯＨ（９５０mL）中のＺｎ（７９．３７ｇ、１．２０４mmol、１３当量）を加え、１６時間、還流で加熱し、生じた混合物をセライト（Celite）に通してろ過し、沸騰ＭｅＯＨで洗浄した。濃縮後、粗産物を酢酸エチルとＮａＨＣＯ3（水性）間で分配した。生じた油状物は、酢酸エチル／ヘキサン／３％トリエチルアミン）を使用したクロマトグラフィーにかけ、産物（２１．１１ｇ、５６％）を得た。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz): 1.395(s, 9H, O(CH 3)); 3.185(d, 2H, H(4), J4-5=4Hz); 3.617(s, 3H, OCH 3); 4.446(s, 2H, H(7)); 4.528(m, 1H, H(5)); 5.502(d, 1H, H(6), J6-5=8Hz); 6.793(dd, 1H, H(3), J3-2=2Hz,J3-1=8.4Hz); 6.868(d, 1H, H(3), J3-2=2Hz), 7.225(d, 1H, H(1), J1-2=8.4Hz)。IR:3356cm-1(-NH2, -NH); 1744cm-1(Ester-C=O); 1707cm-1(Carbamate-C=O); 1504cm-1(Amide); 1250cm-1(Ester)。MS:m/z=79Brで405.3 [M+H+]; m/z=81Brで407.3 [M+H+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．４７。
【００７２】
実施例３．１（大規模の酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸
【００７３】
【化１６】
１９．９ｇ（４８．０２mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９７．８％）を７５０mlのＴＢＭＥに溶解し、３ｌの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム、２０mMリン酸ナトリウムpH７．５）中において激しく攪拌しながら乳化する。１２．０mlアルカラーゼ（Alcalase）２．４Ｌおよび３０mgのスブスチリシン（Substilisin）Ａ〔両酵素の調製品はNovo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグである〕を加え、激しく攪拌しながら１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク（static））によりpHを７．５に維持した。７日後、４４．７５mlの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液が消費され、変換度は＞９９％（ＨＰＬＣ分析）であった。２相の反応混合物を分離した。少量のリン脂質性不純物および残った基質残渣を分離するために１ｌのＴＢＭＥで水相を簡単に洗浄した。合わせた有機相を１×２５０mlの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液pH７．６で抽出した。合わせた水相を３２％塩酸でpH２に酸性化し１．５ｌの酢酸エチルで抽出した。生じた乳化物を攪拌下で１０％のディカライト（Dicalite）の添加により分離し、次いでろ過した。水相を２×１ｌの酢酸エチルで抽出した。合わせた酢酸エチル相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発した。残留物をジクロロメタンに溶解し、蒸発し、ＨＶで乾燥し、１８．７９ｇのＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンを黄白色の固形物として得た。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz)1.399(s,9H,OC(CH 3)); 3.184(dd, 1H, SCH 2 , J=14.2Hz, J=6.6Hz); 3.235(dd, 1H, SCH 2 , J=14.2Hz, J=6.6Hz); 4.515(m, 1H, COCHNH); 5.517(d, 1H, CONHCH, J=6.8Hz); 6.796(dd, 1H, arom. , J=2Hz, J=8.4Hz); 6.876(d, 1H, arom. , J=2Hz); 7.250(d, 1H, arom. , J=8.4Hz)。IR(ATR-IR)3445および3355cm-1(-NH, -NH2); 2978および2929cm-1broad(-COOH); 1693cm-1(COOH-C=O, carbamate-C=O); 1508cm-1(amide-CO-NH); 1247および1157cm-1(COOH)。MS(ESI-ポジティブイオン化)m/z=79Brで391.1 [M+H+]; m/z=81Brで393.1[M+H+]; m/z=79Brで413.2 [M+Na+]; m/z=81Brで415.2[M+Na+]。OR[α]D=+53.3°(CHCl3;c=1.0)。ＨＰＬＣ分析：カラム：ＡＢＺ＋ｐｌｕｓ；移動相：Ａ：水中０．１％ＴＦＡ；Ｂ：ＭｅＣＮ；勾配Ｂ：３０〜８０％０〜１５分、８０〜３０％１５〜１６分、３０％１６〜１９．５分；流速：１ml／分；圧力：５０〜８０bar；検出：ＵＶ，３００nm；保持時間：１２．１分（産物−酸）１３．５分（基質−エステル）。
【００７５】
実施例３．２（小規模の酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸
【００７６】
１．６５ｇ（３．９９mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９８％）を６５mlのＴＢＭＥに溶解し、２４０mlの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；２０mMリン酸ナトリウムpH７．５）中において激しく攪拌しながら乳化する。０．７５mlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、激しく攪拌しながら１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．５に維持した。３３時間後、４．２３mlの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液が消費され、変換度は、＞９９％（ＨＰＬＣ分析）であった。反応混合物を３２％塩酸でpH２に酸性化し、デカライト（Decalite）上でろ過した。相分離後、水相を、３×２７５mlの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物をジクロロメタンに溶解し、蒸発させ、ＨＶで乾燥し、１．５６ｇのＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンを黄白色の固形物として得た。
【００７７】
実施例３．３（異なる溶媒での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸
【００７８】
１００mg（０．２４２mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（２−アミノ−４−ブロモフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９８％）を２０％有機性共−溶媒（以下の表を参照）および８０％緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．５）からなる系に激しく攪拌しながら加えた。１００μlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、激しく攪拌しながら０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．５に維持した。反応終了時、変換度をＨＰＬＣにより決定した。
【００７９】
【表３】
実施例３．４（他の酵素での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルスルファニル）−２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸
【００８１】
２００mg（０．４９３mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−ブロモ−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９３．８％）を５mlのＴＢＭＥおよび２０mlの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．０）からなる系に激しく攪拌しながら加えた。酵素〔以下の表を参照〕を加え、激しく攪拌しながら０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．０に維持した。反応終了後、反応混合物を２５mlＴＢＭＥで２回洗浄し、２５％ＨＣｌでpH２．５に酸性化し、３×２５mlの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させ、残留物を高真空において乾燥させた。
【００８２】
【表４】
実施例４
（Ｓ）−（７−ブロモ−４−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−ベンゾ[ｂ][１，４]チアゼピン−３−イル）−カルバミン酸tert.−ブチルエステル
【００８４】
【化１７】
反応は、G.C.Morton et al., Tet.Lett., 41(2000)3029〜3033）に記載のように実施される。ＤＭＦ（５００ml）中の酵素的加水分解からの産物（１５．２ｇ、３８．８mmol、１当量）およびＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（７．４４ｇ、３８．８mol、１当量）を１６時間、室温で攪拌し、濃縮し、残留物を酢酸エチルに溶解し、ＮａＨＣＯ3（１Ｍ）（５００ml）水溶液および水（５００ml）で抽出した。乾燥（ＮａＳＯ4）および濃縮により産物（定量で１４．５ｇ）を得た。分析データ：1Ｈ−ＮＭＲ（CDCl3, 400MHz): 1.409(s, 9H, O(CH 3)); 2.939(t, 1H, H(4'), J=11.6Hz); 3.794(dd, 1H, H(4'), J4"-5=11Hz, J4"-4'=6.4Hz); 4.439(m, 1H, H(5)); 5.567(d, 1H, H(6), J6-5=8Hz); 7.306(d, 1H, H(2), J2-1=8Hz, J2-3=2Hz); 7.337(d, 1H, H(3), J3-2=2Hz); 7.748(d, 1H, H(1), J1-2=8Hz); 8.042(s, 1H, H(7))。IR: 3284および3184cm-1(-NH); 1729cm-1(carbamate-C=O); 1678cm-1(Amide-C=O); 1574cm-1(Amide); 1251cm-1(Ester)。ＭＳ：ｍ/ｚ＝79Ｂｒで３７３．３[Ｍ+Ｈ+]；ｍ/ｚ＝81Ｂｒで３７５．３ [Ｍ+Ｈ+]；ｍ/ｚ＝79Ｂｒで３９５ [Ｍ+Ｎａ+]；ｍ/ｚ＝81Ｂｒで３９７ [Ｍ+Ｎａ+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．２３。
【００８６】
実施例５
（Ｓ）−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−メトキシカルボニル−エチルスルファニル）−３−ニトロ−安息香酸アリルエステル
【００８７】
【化１８】
４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸（４９．９５ｇ、２６９．８mmol、１当量）をメタノール（３５０ml）に溶解し、Ｃｓ2ＣＯ3（４４．０６ｇ、１３５．２mmol、０．５当量）を加え、溶媒を蒸発させた。次いで、Ｃｓ−塩をＤＭＦに溶解し、５０℃に過熱し、臭化アリル（２２．８mL、２６９．８mol、１当量）で処理した。５分後、溶媒を蒸発させ、生じた固形物をＥｔ2Ｏ中で粉砕した。ろ過及び蒸発により租アリルエステルを定量的に得た。次の工程を、M.K.Schwarz et al., J.Org.Chem.1999、64, 2219-2231に従って実施した。アリルエステル（３０ｇ、１３３．２mmol、１当量）、ＢＯＣ−システイン−メチルエステル（３１．３５ｇ、１３３．２mmol、１当量）およびＤＩＰＥＡ（６８．３mL、３９９．６mmol、３当量）をＥｔＯＨ中にゆっくり加え（発熱反応が観察された）、ｒｔで３時間攪拌し、濃縮し、固形物を得、ジイソプロピルエーテルから再結晶した（４６．１６ｇ、７９％）。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz)：1.443(s, 9H, O(CH 3)); 3.401(dd, 1H, H(7'), J7'-7"=2.4Hz, J7'-8=6Hz); 3.506(dd, 1H, H(7"), J7"-7'=2.4Hz, J7"-8=6Hz); 3.777(s, 3H, OCH 3); 4.608(m, 1H, H(8)); 4.860(dt、2H, H(3', 3"), J3-2=5.6Hz; J3-1=1.6Hz); 5.322(q, 1H, H(1'), J=0.8Hz); 5.347(t, 1H, H(1"), J=0.8Hz); 5.406(d, 1H, H(9), J9-8=1.6Hz); 6.032(m, 1H, H(2)); 7.625(d, 1H, H(5), J5-4=8.4Hz); 8.201(dd, 1H, H(4), J4-5=8.4Hz, J4-6=1.6Hz); 8.830(d, 1H, H(6), J6-4=1.6Hz)。IR: 3350cm-1(-NH); 1742cm-1(Ester-C=O); 1719cm-1(Conj.Ester-C=O); 1686cm-1(carbamate-C=O); 1523および1334cm-1(-NO2); 1245cm-1(Ester)。MS: m/z=441[M+H+]; m/z=458.4 [M+NH4 +]; m/z=463.2 [M+Na+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．４０。
【００８９】
実施例６
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−メトキシカルボニル−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【００９０】
【化１９】
反応を、J.Slade et al., J.Med.Chem.1985, 28, 1517-1521に記載のように実施する。ＤＭＥ（１５ml）中の先の産物（５０６mg、１．１５mmol、１当量）、ＮＨ4Ｃｌ水溶液（２０ml）およびＺｎ（９７６mg、１４．９mmol、１３当量）を攪拌し、８０℃で１６時間加熱した。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル（２５０ml）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（１Ｍ）（水溶液）（３×５０mL）で抽出した。有機相をＮａＳＯ4で乾燥し、蒸発させ、黄色の油状物を得、数日後に結晶化した（２７６mg、６０％）。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz): 1.380(s, 1H, O(CH 3)); 3.283(d, 2H, H(7', 7"), J7-8=4.4Hz; 3.579(s, 3H, OCH 3); 4.445(s, 2H, H(10', 10")); 4.554(m, 1H, H(8)); 4.787(ddd、2H, H(2'2"), J=1.2Hz); 5.283(dd, 1H, H(1'), J1'-2=10.6Hz, J1'-1"=1.2Hz); 5.390(dd, 1H, H(1"), J1"-2=17.8Hz, J1"-1'=1.2Hz); 5.506(d, 1H, H(9), J9-8=7.6Hz); 6.015(m, 1H, H(8)); 7.360(dd, 1H, H(2), J4-5=8Hz, J4-6=1.6Hz); 7.398(d, 1H, H(6), J6-4=1.6Hz); 7.425(d, 1H, H(5), J5-4=8Hz)。IR: 3378cm-1(-NH, NH2); 1751cm-1(Ester-C=O); 1713cm-1(Conj.Ester-C=O); 1685cm-1(Carbamate-C=O); 1511cm-1(Amide); 1220cm-1(Ester)。MS: m/z=411.3[M+H+]; m/z=433.3 [M+Na+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．２７。
【００９２】
実施例７．１（大規模での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【００９３】
【化２０】
６．４ｇ（１５．６５８mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９９％）を４８０mlのＴＢＭＥに溶解し、１．５ｌの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；１６０mMリン酸ナトリウムpH７．５）中において激しく攪拌しながら乳化する。１２．０mlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、激しく攪拌しながら１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．５に維持した。４８．５時間後、１６．６mlの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液が消費され、変換度は＞９７％（ＨＰＬＣ分析）であった。相分離後、水相を１ｌのＴＢＭＥで１回抽出した。合わせたＴＢＭＥ相を２×０．４ｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液pH７．６で抽出した。合わせた水相を３２％塩酸でpH２に酸性化し、３×０．５ｌの酢酸エチルで抽出した。安定な乳化物が形成された場合、相分離はディカライト（Dicalite）上でろ過により成された。合わせた酢酸エチルを無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物をジクロロメタンに溶解し、蒸発させ、ＨＶで乾燥し、５．８５ｇのＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンを黄色の高粘性の油状物として得た（収率：９４．６％）。分析データ：1H-NMR(DMSO, 400MHz)1.338(s, 9H, OC(CH 3)); 3.077(dd, 1H, SCH 2 , J=12.8Hz, J=6.8Hz); 3.238(dd, 1H, SCH 2 , J=13.8Hz, J=4.6Hz); 3.867(m, 1H, COCHNH); 4.753(d, 2H, COOCH 2 , J=5.2Hz); 5.526(d, 1H, CH=CH 2 , J=10Hz); 5.538(d, 1H, CH=CH 2 , J=17.6Hz); 5.595(m, 2H, NH 2 ); 6.018(ddtr, 1H, CH 2 CH=CH 2 , J=16.6Hz, J=10.6Hz, J=5.6Hz); 6.519(m, 1H, CONHCH); 6.876(d, 1H, arom. CSCH, J=8.4Hz); 7.330(d, 1H, arom. CSCHCH, J=8.4Hz); 7.338(s, 1H, arom. CHCNH2)。IR(ATR-IR)3420および3355cm-1(-NH, NH2); 2980および2935cm-1broad(-COOH); 1705cm-1(COOH-C=O、carbamate-C=O); 1510cm-1(amide-CO-NH); 1486cm-1 aromate; 1229および1160cm-1(COOH); 982および932cm-1(vinyl、-C=CH 2 )。MS(ESI-ポジティブイオン化)m/z=397.1 [M+H+]; m/z=419.4[M+Na+]。OR[α]D=+16.16°(CHCl3; c=1.0)。ＨＰＬＣ分析：カラム：ＡＢＺ＋Ｐｌｕｓ；移動相：Ａ：水に０．１％ＴＦＡ；Ｂ：ＭｅＣＮ；勾配Ｂ：３０〜８０％０〜１５分、８０〜３０％１５〜１６分、３０％１６〜１９．５分：流速：１ml／分；圧力：５０〜８０bar；検出：ＵＶ，３００nm；保持時間：１１．２分（産物−酸）；１２．７分（基質−エステル）。
【００９５】
実施例７．２（小規模での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【００９６】
０．７６９mg（１.６５８mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニル−チオ）−Ｌ−アラニンメチルエステルを４０mlのＴＢＭＥに溶解し、２２０mlの０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液；３mMリン酸ナトリウム緩衝液pH７．５中において激しく攪拌しながら乳化する。１．０mlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、激しく攪拌しながら１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．５に維持した。４５．４時間後、２３．６mlの１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液が消費され、変換度は＞９７％（ＨＰＬＣ分析）であった。反応混合物を、１００mlのＴＢＭＥで抽出した。相分離後、水相を３２％塩酸でpH２．３に酸性化し、３×２５０mlの酢酸エチルで抽出した。安定な乳化物が形成された場合、相分離はディカライト（Dicalite）上でろ過により成された。合わせた酢酸エチル抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物をジクロロメタンに溶解し、蒸発させ、ＨＶで乾燥し、６０４mgのＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンを黄白色の固形物として得た（収率：９３．９％、純度：９５％）。
【００９７】
実施例７．３（異なる溶媒での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【００９８】
２００mg（０．４８７mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９６．７％）を２から５mlの有機性共−溶媒（以下の表を参照）および２０ml緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．０）からなる系に激しく攪拌しながら加えた。アルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ、量は以下の表を参照〕を加え、激しく攪拌しながら０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．０に維持した。反応を滴定試薬の消費によりモニターし、産物の形成をＨＰＬＣにより確認した。
【００９９】
【表５】
実施例７．４（他の酵素での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【０１０１】
２００mg（０．４８７mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９６．７％）を５mlのＴＢＭＥおよび２０mlの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．０）からなる系に激しく攪拌しながら加えた。酵素〔以下の表を参照〕を加え、激しく攪拌しながら０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）によりpHを７．０に維持した。反応を滴定試薬の消費によりモニターし、産物の形成をＨＰＬＣにより確認した。
【０１０２】
【表６】
実施例７．５（高温度での酵素的加水分解）
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸アリルエステル
【０１０４】
２００mg（０．４８７mmol）のＮ−tert.−ブトキシカルボニル−３−（４−アロキシカルボニル−２−アミノフェニルチオ）−Ｌ−アラニンメチルエステル（９６．７％）を５mlのＴＢＭＥおよび２０mlの緩衝溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム；３mMリン酸ナトリウムpH７．０）からなる系に激しく攪拌しながら４０℃で加えた。１００μlのアルカラーゼ２．４Ｌ〔Novo Nordiskからのスブチリシンカールスバーグ〕を加え、４０℃で０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の制御された添加（pH−スタティク）により激しく攪拌しながらpHを７．０に維持した。５．４４mlの滴定試薬（理論の１１２％；１７．４時間後）の消費後、反応混合物を２５mlのＴＢＭＥで洗浄し、１ＮのＨＣｌでpH２．５に酸性化し、そして３×２５mlの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させ、残留物を高真空上で乾燥し、９４．５％のＨＰＬＣ純度（領域−％）の産物酸１９０mg（０．４７９mmol；９８％）を得た。
【０１０５】
実施例８
（Ｓ）−３−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−４−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−ベンゾ[ｂ] [１，４]チアゼピン−７−カルボン酸アリルエステル
【０１０６】
【化２１】
反応をG.C.Morton et al., Tet.Lett., 41(2000)3029〜3033に記載のように実施する。酵素加水分解からの産物（５．６ｇ、１４．１mmol、１当量）をＤＭＦ（７５mL）に溶解しＥＤＡＣ（２．７０ｇ、１４．１mmol、１当量）で処理し、室温で１６時間攪拌した。濃縮後、残留物を酢酸エチル（５００mL）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（１Ｍ）（水溶液）（３×１５０mL）および水（３×１５０mL）で抽出した。有機相を乾燥（ＮａＳＯ4）し、蒸発し、黄色の油状物を得た。酢酸エチル／ヘキサン１：２でのクロマトグラフィー後、黄色の結晶を得た（４．９６ｇ、９３％）。分析データ：1H-NMR(CDCl3, 400MHz): 1.400(s, 1H, O(CH 3)); 3.014(t, 1H, H(7'or7"), J=12Hz); 3.815(dd, 1H, H(7'or7"), J7-8=12Hz、J7'-7"=6.4Hz); 4.466(m, 1H, H(8)); 4.835(d, 2H, H(3', 3"), J3-2=5.7Hz); 5.316(dd, 1H, H(1'), J1'-2=10.5Hz、J1'-1"=1.2Hz); 5.413(dd, 1H, H(1"), J1"-2=17.2Hz, J1"-1'=1.2Hz); 5.581(d, 1H, H(9), J9-8=8Hz); 6.013(m, 1H, H(8)); 7.338(d, 1H, H(5), J5-4=11.1Hz; 7.704(s, 1H, H(10)); 7.751(d, 1H, H(6), J5-4=1.8Hz); 7.338(dd, 1H, H(2), J4-5=11.1Hz, J4-6=1.8Hz)。IR: 3206cm-1(-NH); 1720cm-1(Carbamate-C=O); 1671cm-1(Amide-C=O); 1500cm-1(Amide-CO-NH); 1209cm-1(Ester)。MS: m/z=379.3[M+H+]; m/z=401.4 [M+Na+]。ＳｉＯ2上での酢酸エチル／ヘキサン１：２におけるＲｆ＝０．３６。
【０１０８】
実施例９
（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−tert.−ブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチルスルファニル）−安息香酸
【０１０９】
【化２２】
Claims (9)
- 式Ｉ
- 式IIの化合物が、
- Ｒ1が水素またはアルキルであり；Ｒ2がアミノ保護基であり；それぞれのＲ3は独立してハロゲン，カルボキシル，またはアルケニルオキシカルボニルであり；Ｒ4がアルキルまたはベンジルであり；ｎが１または２であることを特徴とする、請求項１および２に記載の方法。
- Ｒ1が水素であり；Ｒ2がアミノ保護基であり；Ｒ3がハロゲン、カルボキシル、またはアルケニルオキシカルボニルであり；Ｒ4がアルキルであり；ｎが１であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 反応を６．０〜８．５のpHで実施することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 反応をバチルスのプロテアーゼ、スブチリシン、アスペルギルスのプロテアーゼ、またはトリタチウムのプロテアーゼで実施することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 有機性共−溶媒が、テトラヒドロフラン、ジオキサン、tert.−ブチルメチルエーテル，Ｃ1-8−アルコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミドまたはアセトンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 式
- 式Ｉの化合物をさらに式III
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