KR100882972B1 - 치환된 2-아미노-3-(2-아미노-페닐설파닐)-프로피온산을제조하기 위한 효소적 방법 - Google Patents

치환된 2-아미노-3-(2-아미노-페닐설파닐)-프로피온산을제조하기 위한 효소적 방법 Download PDF

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Abstract

하기 화학식 I의 화합물은 프로테아제, 인터루킨-1β-전환 효소, 엘라스타제 또는 안지오텐신 효소, GPCR 길항제(콜레시스토키닌, 안지오텐신 II 수용체)와 같은 효소 억제제로 유용한 1,5-벤조티아제핀의 제조에 유용하다. 본 발명은 유기 보조 용매를 함유하는 수성계내에서 하기 화학식 II의 화합물을 프로테아제와 반응시킴을 포함하는 하기 화학식 I의 화합물의 신규한 제조방법에 관한 것이다:
화학식 I
Figure 112004012020047-pct00038
화학식 II
Figure 112004012020047-pct00039
상기 식에서,
R1, R2, R3, n 및 R4는 명세서에서 기술된 바와 같다.

Description

치환된 2-아미노-3-(2-아미노-페닐설파닐)-프로피온산을 제조하기 위한 효소적 방법{ENZYMATIC PROCESS FOR THE PREPARATION OF SUBSTITUTED 2-AMINO-3-(2-AMINO-PHENYLSULFANYL)-PROPIONIC ACID}
본 발명은 하기 화학식 Iaa의 화합물을 제조하기 위한 신규한 효소적 방법에 관한 것이다:
Figure 112004012020047-pct00001
상기 식에서,
R1은 수소 또는 알킬이고;
R2는 아미노 보호기이고;
R3은 각각 독립적으로 할로겐, 카복실, 알콕시카보닐, 알케닐옥시카보닐 또는 벤질옥시카보닐이고;
n는 1 또는 2이다.
유럽 특허공개 제 0407033 A 호에는 2-할로 프로피온산 이외의 2-치환된 산의 에스테르의 라세미 혼합물을 상응하는 거울상 이성질체 산으로 효소적 입체선택성 가수분해시키는 방법이 기술되어 있다. 이 반응은 캐나다 루고사 리파아제 동질효소, 유기 용매(예: 톨루엔) 및 환원제의 존재하에 수행된다. 이 방법은 S-케토프로펜, S-이부프로펜, S-페노프로펜, S-2-페닐프로피온산 및 S-인도프로펜의 입체선택성 제조에 특히 유용하다.
유럽 특허공개 제 0178553 A 호에는 상응하는 알킬 에스테르를 키모트립신으로 선택적 가수분해시켜 방향족 치환된 L-아미노산을 제조하는 방법이 기술되어 있다.
독일 특허 제 2804892 호에는 N-아실-DL-트레오닌 에스테르를 세린 프로테아제, 특히 서브틸리신 칼스버그로 가수분해시켜 광학적으로 순수한 N-아실-L-트레오닌을 제조하는 방법이 기술되어 있다.
화학식 I의 화합물의 제조를 위한 효소 반응은 어떤 문헌에도 기술되어 있지 않았다.
화학적 가수분해에 의해 화학식 I의 화합물을 합성하고자 시도되었으나 산출량이 낮고 출발물질이 분해되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 치환된 2-아미노-3-(2-아미노-페닐설파닐)-프로피 온산의 신규한 제조방법을 제공하는 것이다.
하기 화학식 I의 화합물은 본 발명의 방법에 의해 제조되고, 이러한 본 발명은 유기 보조 용매를 함유하는 수성계내에서 하기 화학식 II의 화합물을 프로테아제와 반응시킴을 포함하는 하기 화학식 I의 치환된 2-아미노-3-(2-아미노-페닐설파닐)-프로피온산의 신규한 제조방법을 제공한다:
Figure 112004012020047-pct00002
Figure 112004012020047-pct00003
상기 식에서,
R1은 수소 또는 알킬이고;
R2는 아미노 보호기이고;
R3은 각각 독립적으로 할로겐, 카복실, 알콕시카보닐, 알케닐옥시카보닐 또는 벤질옥시카보닐이고;
n은 1 또는 2이고;
R4는 알킬 또는 벤질이다.
본원에 기술된 효소적 접근방법에 의해, 순한 반응 조건하에서 에스테르의 선택적 가수분해가 가능하다.
본원에 제시된 구조적 화학식에서 쐐기 모양(
Figure 112004012020047-pct00004
)의 결합은 치환체가 지면 위에 있음을 나타낸다.
본원에 사용되는 "알킬"이란 용어는 탄소수 1 내지 12의 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실 및 도데실(이들의 상이한 이성질체를 포함)을 나타낸다.
알킬쇄에 대한 적당한 치환체는 1 내지 3개의 할로겐(예: 불소 또는 염소) 및 C1-4 알콕시(예: 메톡시 또는 에톡시)로부터 선택된다. 치환된 알킬의 예로는 2-클로로에틸, 2-플루오로에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸 또는 2-메톡시에틸이 있다.
R1중의 알킬은 상기에서 정의된 바와 같고, 바람직하게는 탄소수 1 내지 7의 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기이다. R1중의 알킬로 보다 바람직한 것은 메틸, 에 틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸 또는 3급-부틸이다.
R4중의 알킬은 상기에서 정의된 바와 같고, 바람직하게는 탄소수 1 내지 7의 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기이다. 알킬쇄에 대한 적당한 치환체는 1 내지 3의 할로겐(예: 불소 또는 염소) 및 C1-4 알콕시(예: 메톡시 또는 에톡시)로부터 선택된다. 치환된 알킬의 예로는 2-클로로에틸, 2-플루오로에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸 또는 2-메톡시에틸이 있다. R4중의 알킬은 보다 바람직하게는 탄소수 1 내지 7 또는 1 내지 4의 직쇄 탄화수소 잔기이다. 예로는 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 및 n-헵틸이 있다. 바람직한 예로는 메틸, 에틸 또는 프로필이 있다. R4중의 알킬로 가장 바람직한 것은 메틸이다.
본원에 사용되는 "아미노 보호기"라는 용어는 문헌[Green T. Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 5, John Wiley and Sons, Inc. (1981), pp. 218-287]에 기술된 바와 같이 펩티드 화학에 사용되는 기, 예컨대 알릴옥시카보닐기(ALLOC), 저급 알콕시카보닐기(예: 3급-부톡시카보닐(t-BOC)), 치환된 저급 알콕시카보닐기(예: 트리클로로에톡시카보닐), 선택적으로 치환된 아릴옥시카보닐기(예: p-니트로벤질옥시카보닐, 벤질옥시카보닐(Z) 또는 페닐옥시카보닐), 알카노일기(예: 포르밀, 아세틸), 아로일기(예: 벤조일), 할로겐-알카노일기(예: 트리플루오로아세틸) 또는 실릴 보호기(예: 3급-부틸디메틸실릴)를 지칭한다. 바람직한 아미노 보호기는 벤질옥시카보닐, 3급-부톡시카보닐, 알릴옥시카보닐 또는 벤조일이 고, 특히 바람직한 아미노 보호기는 3급-부톡시카보닐이다.
"알콕시카보닐"이라는 용어는 카보닐기(>C=O)에 부착된 C1-7-알콕시 잔기를 나타낸다. 알콕시기에 대한 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로필옥시, 이소프로필옥시, n-부틸옥시, 1-2급-부틸옥시, 이소-부틸옥시, 3급-부틸옥시, 펜틸옥시, 헥실옥시 및 헵틸옥시(이들의 상이한 이성질체를 포함)가 있다. 알콕시카보닐기에 대한 예로는 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 프로폭시카보닐, 3급-부톡시카보닐 등이 있다. 더욱 바람직한 저급 알콕시카보닐은 3급-부톡시카보닐이다.
"알케닐옥시카보닐"이라는 용어는 카보닐기(>C=O)에 부착된 알케닐-옥시 잔기를 나타낸다. 본원에 사용되는 "알케닐"이라는 용어는 탄소수가 2 내지 8, 바람직하게는 2 내지 4이고 하나 이상의 올레핀계 이중결합을 갖는 치환되지 않은 또는 치환된 탄화수소쇄 라디칼(이들의 상이한 이성질체를 포함)을 나타낸다. 예로는 비닐, 알릴 또는 이소프로페닐이 있다.
R3에 대한 "알케닐옥시카보닐"로 바람직한 것은 알릴옥시카보닐 또는 이소프로페닐옥시카보닐이고, 더욱 바람직한 것은 알릴옥시카보닐이다.
"할로겐"이라는 용어는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다. 바람직한 할로겐은 브롬이다.
수 n은 1 또는 2, 바람직하게는 1이다.
치환체 R3은 페닐 고리에 부착된 임의의 가능한 위치로 존재할 수 있다. n 이 1인 경우, R3은 페닐 고리의 3, 4, 5 또는 6 위치로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 치환체 R3은 4 위치로 존재한다. n이 2인 경우, 치환체 R3은 둘다 페닐 고리의 3, 4, 5 또는 6 위치에 서로 독립적으로 존재할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태는 화학식 II의 화합물이 하기 화학식 IIaa로 표시되는 화학식 I의 화합물의 제조방법이다:
Figure 112004012020047-pct00005
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4 및 n은 상기에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 더욱더 바람직한 양태에서, R1은 수소 또는 알킬, 보다 바람직하게는 R1은 수소이고; R2는 아미노 보호기, 보다 바람직하게는 R2는 아미노 보호기이고; R3은 각각 독립적으로 할로겐, 카복실 또는 알케닐옥시카보닐이고; R4는 알킬 또는 벤질, 보다 바람직하게는 R4는 알킬이고; n은 1 또는 2, 보다 바람직하게는 n은 1이다.
본 발명의 또하나의 바람직한 양태에서, 방법은 pH 4.0 내지 10, 바람직하게 는 6.0 내지 8.5에서 유기 보조 용매를 함유하는 수성계내에서 프로테아제를 사용하여 수행된다.
화학식 II의 기질의 효소적 가수분해 후, 화학식 I의 거울상 이성질체 순수 생성물은 산성화 및 후속적인 추출에 의해 분리된다.
화학식 II의 화합물은 L 또는 D 거울상 이성질체의 임의의 가능한 혼합물로 사용될 수 있다. 전환은 라세미 혼합물 또는 L-이성질체만 함유하는 혼합물을 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.
이성질체의 혼합물을 사용한 경우, 반응하지 않은 남은 D-에스테르는 반응 매질의 산성화 및 후속적인 L-산의 추출 이전의 추출 단계에서 제거된다.
반응에 대한 촉매로서 적당한 효소는 프로테아제, 바람직하게는 미생물 유래의 값싼 대량 프로테아제, 더욱 바람직하게는 바실러스 프로테아제(예: 노보 노르디스크(Novo Nordisk)제 사비나제(Savinase)), 서브틸리신(예: 노보 노르디스크제 서브틸리신 칼스버그(subtilisin Carlsberg)(알칼라제, Alkalase) 또는 솔베이(Solvay)제 프로테아제(Protease)-L), 아스페르질러스 프로테아제(예: 아마노(Amano)제 프로자임(Prozyme) 6) 또는 트리타치움 프로테아제(예: 플루카(Fluka)제 프로테이나제(Proteinase) K)이다. 반응에 대한 촉매로서 가장 바람직한 효소는 서브틸리신 칼스버그(예: 노보 노르디스크제 알칼라제)이다.
다르게는, 효소는 고정된 형태로 사용될 수 있다.
반응은 수-불혼화성 용매 또는 수-혼화성 유기 보조 용매와 같은 유기 보조 용매를 함유하는 수성계내에서 수행된다. 수-불혼화성 용매는 수성상과 임의의 비 율, 바람직하게는 25 내지 75%(부피/부피)의 비율로 사용될 수 있다. 수-혼화성 유기 보조 용매는 효소에 의해 견딜수 있는 한 많은 양으로 사용될 수 있고, 전형적으로는 5 내지 25%(부피/부피)이지만, 예컨대 서브틸리신 칼스버그의 경우에는 50%(부피/부피)를 초과할 수도 있다.
반응은 0℃ 내지 50℃, 바람직하게는 15℃ 내지 40℃, 가장 바람직하게는 15℃ 내지 25℃의 반응 온도에서 수행된다.
수성상으로는, 생화학적 전환에 대해 당해분야에 공지된 통상적인 완충액, 예컨대 인산나트륨 또는 인산칼륨이 1M 이하, 바람직하게는 약 5mM 내지 약 50mM의 농도로 사용될 수 있다. 이러한 완충액은 하나의 통상적인 염(예: 염화나트륨 또는 염화칼륨) 및 LiSCN, Na2SO4 또는 다가 알콜(예: 설탕)을 1M 이하의 농도로 추가로 포함할 수 있다.
적당한 유기 보조 용매는 기술적으로 통상적인 용매이다. 예를 들어 에테르(예: 테트라하이드로푸란(THF), 디옥산 또는 3급-부틸 메틸 에테르(TBME)), 저급 알콜, 에스테르(예: 에틸 아세테이트) 및 극성 비양자성 용매(예: 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸아세트아미드, N,N-디메틸포름아미드(DMF) 또는 아세톤)가 있다. 바람직한 유기 보조 용매는 테트라하이드로푸란(THF), 3급-부틸 메틸 에테르(TBME) 및 에틸 아세테이트이다.
본원에 사용되는 "저급 알콜"이란 용어는 하나의 하이드록시기를 가지는 탄소수 1 내지 8의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 잔기, 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올, 3급-부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올 또는 옥탄올, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올 또는 3급-부탄올, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 나타낸다.
기질은 총 농도(중량/중량)가 0.1 내지 25%인 용액으로서 적당히 이용된다. 더욱 바람직한 총 농도는 1 내지 10%이다.
효소를 첨가한 후, 반응 혼합물의 pH는 염기를 제어 첨가함으로써 선택된 pH에서 격렬한 교반하에 유지된다. 바람직한 염기는 수산화나트륨 수용액 또는 수산화칼륨 수용액이다.
반응의 종결 후, 화학식 I의 거울상 이성질체 순수 생성물은 수성상을 적당한 산으로 산성화시킨 후 적당한 유기 용매로 추출함으로써 상 분리후 통상적으로 후처리된다.
화학식 I의 화합물은 본 발명에 따라서 높은 거울상 이성질체 순도로 합성되며, 이는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 거울상 이성질체 과량이 달성될 수 있음을 의미한다.
화학식 II의 화합물은 하기 반응식 1 또는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 따라서 제조된다:
Figure 112004012020047-pct00006
상기 식에서,
R1, R2, R3 및 R4는 화학식 I 및 화학식 II의 화합물에 대해 기술한 바와 같다.
반응식 1에서, 화학식 a의 치환된 2-니트로 플루오로-방향족은 화학식 b의 보호된 시스테인(예: BOC-시스테인-메틸에스테르)과 반응하여 화학식 c의 상응하는 니트로-페닐 치환된 보호된 시스테인을 얻는다. 이 반응은 통상적으로 헥산, 디이소프로필에테르, 에틸 아세테이트, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 디클로로메탄, DMF 또는 DMSO와 같은 적당한 유기 용매중에서 염기성 조건(디이소프로필아민, 예컨대 에틸디이소프로필아민)하에서 수행된다. 반응 온도는 바람직하게는 -30℃ 내지 +150℃이다. 가장 바람직하게는, 반응은 110℃의 온도에서 에틸디이소프로필아민의 존재하에 에탄올중에서 BOC-시스테인-메틸에스테르를 사용하여 수행된다.
화학식 a의 화합물 및 화학식 b의 보호된 시스테인(예: BOC-시스테인-메틸에스테르)은 시판되거나 또는 유기화학에 관한 교과서, 예컨대 문헌[J. March(1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure", 4thed. John Wiley & Sons]에 공지된 방법에 따라서 합성된다.
반응의 두 번째 단계는 화학식 c의 니트로-페닐 치환된 보호된 시스테인의 니트로기가 상응하는 화학식 II의 아미노-페닐 치환된 보호된 시스테인으로 환원되어 수행된다. 환원 반응은 당해 분야에 공지된, 예컨대 유기화학에 대한 교과서, 예컨대 문헌[J. March(1992), "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure", 4thed. John Wiley & Sons]에 공지된 방법에 따라 수행된다. 반응은 통상적으로 헥산, 디이소프로필에테르, 에틸 아세테이트, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 디클로로메탄, DMF, DMSO, 바람직하게는 메탄올과 같은 유기 용매를 함유한 산성 매질중에서 적당한 환원제(예: 아연 및 선택적으로 NH4Cl)를 사용하여 수행된다. 반응 온도는 바람직하게는 -30℃ 내지 +150℃이다.
화학식 II의 아미노-페닐 치환된 보호된 시스테인의 화합물의 NH2-기는 R1Hal(식중, R1은 상기에서 정의된 바와 같고; Hal은 염소 또는 브롬이다)에 의해 알킬화될 수 있다.
하기 화학식 II-a 및 II-b의 화합물은 신규한 중간체이고, 따라서 또한 본 발명의 주제이다:
Figure 112004012020047-pct00007
Figure 112004012020047-pct00008
화학식 I의 화합물은 1,5-벤조티아제핀의 합성을 위한 다목적 기초 재료이다. 이러한 벤조티아제핀 골격은 다양한 효소 저해제, 예컨대 프로테아제, 인터루킨-1β-전환 효소, 엘라스타제, 안지오텐신-전환 효소 및 GPCR 길항제(콜레시스토키닌, 안지오텐신 II 수용체)에서 구속된 디펩티드 유사체로 사용되어 왔다. 가능한 다른 용도는 문헌[G.C. Morton et al., Tet. Lett., 41(2000) 3029-3033]에 기술되어 있다.
벤조티아제핀은 하기 반응식 2에 따라서 제조된다:
Figure 112004012020047-pct00009
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4 및 n은 화학식 I 및 II의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
화학식 III의 벤조티아제핀을 얻기 위한 화학식 I의 화합물의 고리화 반응은 가열에 의해 또는 예컨대 문헌[G.C. Morton et al., Tet. Lett., 41(2000) 3029-3033]에 기술된 적절한 시약의 존재하에 수행된다. 이 반응은 통상적으로 헥산, 자일렌, 디이소프로필에테르, 에틸 아세테이트, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 디클로로메탄, DMF 또는 DMSO와 같은 적당한 용매중에서 카보디이미드를 사용하여 수행된다. 반응 온도는 바람직하게는 -30℃ 내지 +150℃이다. 반응은 바람직하게는 실온에서 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드)의 존재하에 DMF중에서 수행된다.
하기 실시예에서 사용되는 축약어는 다음 의미를 가진다:
ISP-MS는 이온 분사 양성 질량 분광기;
ISN-MS는 이온 분사 음성 질량 분광기;
EI-MS는 전자 효과 질량 분광기;
SFC는 초임계 유동 크로마토그래피;
NMR은 핵자기공명 분광기;
IR은 적외선 분광기;
HV는 고 진공; 및
min은 분.
실시예 1 (출발 물질의 제조)
(S)-3-(4-브로모-2-니트로-페닐설파닐)-2-3급-부톡시카보닐아미노-프로피온산 메틸 에스테르
Figure 112004012020047-pct00010
문헌[M. K. Schwarz et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 2219-2231]에 기술된 바와 같이 반응을 수행하였다. 에탄올(310㎖)중의 시판되는 BOC-시스테인-메틸에스테르(27.38g, 116.35mmol, 1eq) 및 N-에틸디이소프로필아민(DIPEA)(4.4㎖, 25.75mmol, 2.5eq)의 용액에 5-브로모-2-플루오로니트로벤젠(25.62g; 116,45mmol; 1eq)을 첨가하고 110℃에서 3시간동안 가열하였다. 반응 과정을 HPLC로 감독하였다. 용매를 적-갈색 오일로 증발시키고 이것을 물(600㎖)과 에틸 아세테이트(3X300㎖) 사이에 분배시켰다. 건조(Na2SO4) 및 증발시켜 조생성물을 얻고 사이클로헥산으로 재결정화시켜 황색 결정(38.75g, 77%)을 수득하였다.
분석 데이터:
Figure 112004012020047-pct00011
MS: m/z=452.3 [M+NH4 +] (79Br); m/z=454.3 [M+NH4 +] (81Br); m/z=457.3 [M+Na+] (79Br); m/z=459.3 [M+Na+] (81Br).
SiO2상에 에틸 아세테이트/헥산 1:2 내에서 Rf=0.38.
실시예 2
(S)-3-(2-아미노-4-브로모-페닐설파닐)-2-3급-부톡시카보닐아미노-프로피온산 메틸 에스테르
Figure 112004012020047-pct00012
문헌[J. Slade et.al., J. Med. Chem. 1985, 28, 1517-1521]에 기술된 바와 같이 반응을 수행하였다. 상기에서 수득된 니트로 화합물(40.34g, 92.6mmol, 1eq) 및 NH4Cl(19.81g, 370.6mmol, 4eq)의 혼합물을 첨가하고 메탄올(950㎖)중의 아연(79.37g, 1.204mmol, 13eq)을 16시간동안 환류하에 가열하고, 생성 혼합물을 셀라이트(Celite)로 여과하고, 끓는 메탄올로 세척하였다. 농축 후, 조생성물을 에틸 아세테이트와 NaHCO3(수성) 사이에 분배시켰다. 생성 오일을 에틸 아세테이트/헥산/3% 트리에틸아민을 사용하여 크로마토그래피함으로써 생성물(21.11g, 56%)을 얻었다.
분석 데이터:
Figure 112004012020047-pct00013
MS: m/z=405.3 [M+H+] (79Br); m/z=407.3 [M+H+] (81Br).
SiO2상에 에틸 아세테이트/헥산 1:2 내에서 Rf=0.47.
실시예 3.1(대규모 효소 가수분해)
(S)-3-(2-아미노-4-브로모-페닐설파닐)-2-3급-부톡시카보닐아미노-프로피온산
Figure 112004012020047-pct00014
N-3급-부톡시카보닐-3-(2-아미노-4-브로모페닐티오)-L-알라닌 메틸 에스테르(97.8%) 19.9g(48.02mmol)을 TBME 750㎖중에 용해시키고, 격렬한 교반하에 완충액(0.1M 염화나트륨, 20mM 인산나트륨, pH 7.5) 3ℓ중에 유탁화시켰다. 알칼라제 2.4L 12.0㎖ 및 서브틸리신 A 30mg[이들 효소 제제 둘다 노보 노르디스크제 서브틸리신 칼스버그이다]을 첨가하고, 격렬한 교반하에서 1.0N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.5로 유지하였다. 7일 후, 1.0N 수산화나트륨 용액 44.75㎖가 소모되었고, 전환도는 99% 초과(HPLC 분석)였다. 2상 반응 혼합물 을 분리하였다. 수성상을 TBME 1ℓ로 간단히 세척하여 소량의 친유성 불순물 및 미량의 잔류 기질을 분리하였다. 합한 유기상을 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.6) 1X250㎖로 추출하였다. 합한 수성상을 32% 염산으로 pH 2가 되도록 산성화시키고, 에틸 아세테이트 1.5ℓ로 추출하였다. 생성 유탁액을 교반 및 후속적인 여과하에서 10% 데칼리트(Decalite)를 첨가해서 분리하였다. 수성상을 에틸 아세테이트 2X1ℓ로 추출하였다. 합한 에틸 아세테이트상을 무수 황산나트륨으로 건조하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고 HV에서 증발 건조하여 옅은 황색 고체(수율: 81.8%)로서 N-3급-부톡시카보닐-3-(2-아미노-4-브로모페닐티오)-L-알라닌 18.79g을 얻었다.
분석 데이터:
Figure 112004012020047-pct00015
MS(ESI-양성 이온화) m/z=391.1 [M+H+] (79Br); m/z=393.1 [M+H+] (81 Br); m/z=413.2 [M+Na+] (79Br); m/z=415.2 [M+Na+] (81Br).
OR [α]D=+53.3o(CHCl3; c=1.0).
HPLC 분석: 칼럼: ABZ+플러스; 이동상: A: H20중의 0.1% TFA; B: MeCN; 구배 B: 30 내지 80% 0 내지 15분, 80 내지 30% 15 내지 16분, 30% 16 내지 19.5분; 유속: 1㎖/분; 압력: 50 내지 80bar; 검출: UV, 300nm; 체류 시간: 12.1분(생성물-산) 13.5분(기질-에스테르).
실시예 3.2 (소규모 효소 가수분해)
(S)-3-(2-아미노-4-브로모-페닐설파닐)-2-3급-부톡시카보닐아미노-프로피온산
N-3급-부톡시카보닐-3-(2-아미노-4-브로모페닐티오)-L-알라닌 메틸 에스테르(98%) 1.65g(3.99mmol)을 TBME 65㎖중에 용해시키고, 격렬한 교반하에서 완충액(0.1M 염화나트륨; 20mM 인산나트륨, pH 7.5) 240㎖에 유탁화시켰다. 알칼라제 2.4L[노보 노르디스크제 서브틸리신 칼스버그] 0.75㎖를 첨가하고, 격렬한 교반하에서 1.0N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.5로 유지하였다. 33시간 후 1.0N 수산화나트륨 용액 4.23㎖를 소모하였고 전환도가 99% 초과(HPLC 분석)였다. 반응 혼합물을 32% 염산으로 pH 2가 되도록 산성화시키고 데칼리트로 여과하였다. 상 분리후 수성상을 3X275㎖ 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조 및 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고 HV하에서 증발 건조하여 옅은 황색 고체로서 3급-부톡시카보닐-3-(2-아미노-4-브로모페닐티오)-L-알라닌 1.56g(수율: 99.8%)을 얻었다.
실시예 3.3 (다른 용매를 이용한 효소 가수분해)
(S)-3-(2-아미노-4-브로모-페닐설파닐)-2-3급-부톡시카보닐아미노-프로피온산
N-3급-부톡시카보닐-3-(2-아미노-4-브로모페닐티오)-L-알라닌 메틸 에스테르(98%) 100mg(0.242mmol)을 20% 유기 보조 용매(하기 표 참조) 및 80% 완충 액 (0.1M 염화나트륨; 3mM 인산나트륨, pH 7.5)으로 구성된 계에 격렬한 교반하에서 첨가하였다. 알칼라제 2.4L[노보 노르디스크제 서브틸리신 칼스버그] 100㎕ 를 첨가하고 격렬한 교반하에서 0.1N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.5로 유지하였다. 반응의 종결 후 전환도를 HPLC에 의해 결정하였다.
Figure 112004012020047-pct00016
실시예 3.4(다른 효소를 이용한 효소 가수분해)
(S)-3-(2-아미노-4-브로모-페닐설파닐)-2-3급-부톡시카보닐아미노-프로피온산
N-3급-부톡시카보닐-3-(4-브로모-2-아미노페닐티오)-L-알라닌 메틸 에스테르(93.8%) 200mg(0.493mmol)을 TBME 5㎖ 및 완충액(0.1M 염화나트륨; 3mM 인산나트륨, pH 7.0) 20㎖로 구성된 계에 격렬한 교반하에서 첨가하였다. 효소[하기 표 참조]를 첨가하고, 격렬한 교반하에서 0.1N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.0으로 유지하였다. 반응 종결 후, 반응 혼합물을 TBME 25㎖로 2회 세척하고, 25% HCl로 pH 2.5가 되도록 산성화시키고, 에틸 아세테이트 3X25㎖로 추출하였다. 합한 유기상을 황산나트륨으로 건조하고, 용매를 증발시키고, 잔류물 을 고진공하에서 건조하였다.
Figure 112004012020047-pct00017
실시예 4
(S)-(7-브로모-4-옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-벤조[b][1,4]티아제핀-3-일)-카밤산 3급-부틸 에스테르
Figure 112004012020047-pct00018
문헌[C.G. Morton et al., Tet. Lett., 41(2000) 3029-3033]에 기술된 바와 같이 반응을 수행하였다. DMF(500㎖)중의 효소 가수분해 생성물(15.2g, 38.8mmol, leq) 및 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드)(7.44g, 38.8mmol, 1eq)를 실온에서 16시간동안 교반하고, 농축하고, 잔류물을 에틸 아세테이트(500㎖)중에 용해시키고, NaHCO3(수성)(1M)(500㎖) 및 물(500㎖)로 추출하였다. 건조(NaSO4) 및 농축하여 생성물(14.5g, 정량적)을 얻었다.
분석 데이터:
Figure 112004012020047-pct00019
MS: m/z=373.3 [M+H+] (79Br); m/z=375.3 [M+H+] (81Br), m/z=395 [M+Na+] (79Br); m/z=397 [M+Na+] (81Br).
SiO2상에 에틸 아세테이트/헥산 1:2 내에서 Rf=0.23.
실시예 5
(S)-4-(2-3급-부톡시카보닐아미노-2-메톡시카보닐-에틸설파닐)-3-니트로-벤조산 알릴 에스테르
Figure 112004012020047-pct00020
4-플루오로-3-니트로벤조산(49.95g, 269.8mmol, 1eq)을 메탄올(350㎖)중에 용해시키고, Cs2CO3(44.06g, 135.2mmol, 0.5eq)을 첨가하고, 용매를 증발시켰다. 이어서, 세슘염을 DMF에 용해시키고, 50℃로 가열하고, 알릴브로마이드(22.8㎖, 269.8mmol, 1eq)로 처리하였다. 5분 후, 용매를 증발시키고, 생성 고체를 Et2O중에 서 분쇄하였다. 여과 및 증발시켜 조질 알릴 에스테르를 정량적으로 얻었다. 다음 단계는 문헌[M. K. Schwarz et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 2219-2231]에 따라서 수행한다. 알릴 에스테르(30g, 133.2mmol, 1eq), BOC-시스테인-메틸에스테르(31.35g, 133.2mmol, 1eq) 및 DIPEA(68.3 mL, 399.6mmol, 3eq)를 에탄올중에 천천히(발열반응이 관찰됨) 첨가하고, 실온에서 3시간동안 교반하고 농축하고, 디이소프로필에테르에서 결정화시켜 고체를 얻었다(46.16g, 79%).
분석 데이터:
Figure 112004012020047-pct00021
MS: m/z=441.3 [M+H+]; m/z=458.4 [M+NH4 +]; m/z=463.2 [M+Na+].
SiO2상에 에틸 아세테이트/헥산 1:2 내에서 Rf=0.40.
실시예 6
(S)-3-아미노-4-(2-3급-부톡시카보닐아미노-2-메톡시카보닐-에틸설파닐)-벤조산 알 릴 에스테르
Figure 112004012020047-pct00022
문헌[J. Slade et.al., J. Med. Chem. 1985, 28, 1517-1521]에 기술된 바와 같이 반응을 수행하였다. DME(15㎖)중의 상기 생성물(506mg, 1.15mmol, 1eq), 수성 NH4Cl(20㎖) 및 아연(976mg, 14.9mmol, 13eq)을 교반하였고 16시간동안 80℃로 가열하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(250㎖)에 용해시키고, 수성 나트륨 NaHCO3(1M)(3X50㎖)으로 추출하였다. 유기상을 NaSO4로 건조하고 증발시켜 황색 오일을 얻고 며칠후에 결정화시켰다(276mg, 60%).
분석 데이터:
Figure 112004012020047-pct00023
MS: m/z=411.3 [M+H+]; m/z=433.3 [M+Na+].
SiO2상에 에틸 아세테이트/헥산 1:2 내에서 Rf=0.27.
실시예 7.1(대규모 효소 가수분해)
(S)-3-아미노-4-(2-3급-부톡시카보닐아미노-2-카복시-에틸설파닐)-벤조산 알릴 에스테르
Figure 112004012020047-pct00024
N-3급-부톡시카보닐-3-(4-알록시카보닐-2-아미노페닐티오)-L-알라닌 메틸 에스테르(99%) 6.4g(15.658mmol)을 TBME 480㎖에 용해시키고, 격렬한 교반하에서 완충액(0.1M 염화나트륨; 160mM 인산나트륨, pH 7.5) 1.5ℓ에 유탁화하였다. 알칼라제 2.4L[노보 노르디스크제 서브틸리신 칼스버그] 12.0㎖를 첨가하고, 격렬한 교반하에 1.0N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.5가 되도록 유지하였다. 48.5시간 후, 1.0N 수산화나트륨 용액 16.6㎖를 소모하고, 전환도는 97% 초과(HPLC 분석)였다. 상 분리후 수성상을 TBME 1ℓ로 1회 추출하였다. 합한 TBME상을 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.6) 2X0.4ℓ로 추출하였다. 합한 수성상을 32% 염산으로 pH 2가 되도록 산성화시키고, 3X0.5ℓ에틸 아세테이트로 추출하였다. 안정된 유탁액이 형성된 경우 데칼리트로 여과시켜 상 분리하였다. 합한 에틸 아세테이트상을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 증발시켰다. 잔류물을 디클로메탄중에 용해시키고, HV에서 증발 및 건조하여 황색의 높은 점도를 가지는 오일(수율: 94.6%)로서 N-3급-부톡시카보닐-3-(4-알록시카보닐-2-아미노페닐티오)-L-알라닌 5.85g을 얻었다.
분석 데이터:
Figure 112004012020047-pct00025
MS(ESI-양성 이온화) m/z=397.1 [M+H+]; m/z=419.4 [M+Na+].
OR[α]D=+16.6o(CHCl3; c=1.0).
HPLC 분석: 칼럼: ABZ+플러스; 이동상: A: H20중의 0.1% TFA; B: MeCN; 구배 B: 30 내지 80% 0 내지 15분, 80 내지 30% 15 내지 16분, 30% 16 내지 19.5분; 유속: 1㎖/분; 압력: 50 내지 80bar; 검출: UV, 300nm; 체류 시간: 11.2분(생성물-산) 12.7분(기질-에스테르).
실시예 7.2(소규모 효소 가수분해)
(S)-3-아미노-4-(2-3급-부톡시카보닐아미노-2-카복시-에틸설파닐)-벤조산 알릴 에스테르
N-3급-부톡시카보닐-3-(4-알록시카보닐-2-아미노페닐-티오)-L-알라닌 메틸 에스테르 0.769mg(1.658mmol)을 TBME 40㎖중에 용해시키고, 0.1M 염화나트륨 용액 220㎖: 3mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5)중에 격렬한 교반하에서 유탁화시켰다. 알칼라제 2.4L[노보 노르디스크제 서브틸리신 칼스버그] 1.0㎖를 첨가하고, 격렬한 교반하에서 1.0N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.5로 유지하였다. 45.4시간 후, 1.0N 수산화나트륨 용액 23.6㎖를 소모하고, 전환도는 97% 초과(HPLC 분석)였다. 반응 혼합물을 TBME 100㎖로 추출하였다. 상 분리 후 수성상을 32% 염산으로 pH 2.3이 되도록 산성화시키고, 에틸 아세테이트 3X250㎖로 추출하였다. 안정된 유탁액이 형성된 경우, 데칼리트로 여과시켜 상 분리하였다. 합한 에틸 아세테이트 추출물을 무수 황산나트륨으로 건조하고 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고 HV에서 증발 및 건조하여 옅은 황색 고체(수율: 93.9%, 순도: 95%)로서 같은 N-3급-부톡시카보닐-3-(4-알록시카보닐-2-아미노페닐티오)-L-알라닌 604mg을 얻었다.
실시예 7.3(다른 용매를 이용한 효소 가수분해)
(S)-3-아미노-4-(2-3급-부톡시카보닐아미노-2-카복시-에틸설파닐)-벤조산 알릴 에스테르
N-3급-부톡시카보닐-3-(4-알록시카보닐-2-아미노페닐티오)-L-알라닌 메틸 에스테르(96.7%) 200mg(0.487mmol)을 유기 보조 용매(하기 표 참조) 2 내지 5㎖ 및 완충액(0.1M 염화나트륨; 3mM 인산나트륨, pH 7.0) 20㎖로 구성된 계에 격렬한 교반하에서 첨가하였다. 알칼라제 2.4L[노보 노르디스크제 서브틸리신 칼스버그, 양은 하기 표 참조]을 첨가하고, 격렬한 교반하에서 0.1N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.0으로 유지하였다. 반응은 적정화제의 소모로 검사하였 고, 생성물의 형성은 HPLC로 확인하였다.
Figure 112004012020047-pct00026
실시예 7.4 (다른 효소를 이용한 효소 가수분해)
(S)-3-아미노-4-(2-3급-부톡시카보닐아미노-2-카복시-에틸설파닐)-벤조산 알릴 에스테르
N-3급-부톡시카보닐-3-(4-알록시카보닐-2-아미노페닐티오)-L-알라닌 메틸 에스테르(96.7%) 200mg(0.487mmol)을 격렬한 교반하에서 TBME 5㎖ 및 완충액(0.1M 염화나트륨; 3mM 인산나트륨, pH 7.0) 20㎖로 구성된 계에 첨가하였다. 효소[하기 표 참조]를 첨가하고, 격렬한 교반하에서 0.1N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.0으로 유지하였다. 반응은 적정화제의 소모로 검사하고 생성물의 형성은 HPLC로 확인하였다.
Figure 112004012020047-pct00027
실시예 7.5 (고온에서 효소 가수분해)
(S)-3-아미노-4-(2-3급-부톡시카보닐아미노-2-카복시-에틸설파닐)-벤조산 알릴 에스테르
N-3급-부톡시카보닐-3-(4-알록시카보닐-2-아미노페닐티오)-L-알라닌 메틸 에스테르(96.7%) 200mg(0.487mmol)을 격렬한 교반하에 40℃에서 TBME 5㎖ 및 완충액(0.1M 염화나트륨; 3mM 인산나트륨, pH 7.0) 20㎖로 구성된 계에 첨가하였다. 알칼라제 2.4L[노보 노르디스크제 서브틸리신 칼스버그]을 첨가하고, 격렬한 교반하에 40℃에서 0.1N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.0으로 유지하였다. 적정화제 5.44㎖를 소모한 후(이론치 112%; 17.4시간 후), 반응 혼합물을 TBME 25㎖로 세척하고, 1N 염산으로 pH 2.5가 되도록 산성화시키고, 에틸 아세테이트 3X25㎖로 추출하였다. 합한 유기상을 황산나트륨으로 건조하고 용매를 증발시키고 잔류물을 고진공하에서 건조하여 94.5% HPLC-순도(면적-%)로 생성물 산 190mg(0.479mmol; 98%)을 얻었다.
실시예 8
(S)-3-3급-부톡시카보닐아미노-4-옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-벤조[b][1,4]티아제핀-7-카복실산 알릴 에스테르
Figure 112004012020047-pct00028
문헌[G. C. Morton et al., Tet. Lett., 41(2000) 3029-3033]에 기술된 바와 같이 반응을 수행하였다. 효소 가수분해 생성물(5.6g, 14.1mmol, 1eq)을 DMF(75㎖)에 용해시키고 EDAC(2.70g, 14.1mmol, 1eq)로 처리하고 실온에서 16시간동안 교반하였다. 농축 후, 잔류물을 에틸 아세테이트(500㎖)에 용해시키고, (수성) NaHCO3(1M)(3X150㎖) 및 물(3X150㎖)로 추출하였다. 유기상을 건조(Na2SO4)하고, 증발시켜 황색 오일을 얻었다. 에틸 아세테이트/헥산 1:2를 사용하여 크로마토그래피한 후, 황색 결정(4.96g, 93%)을 얻었다.
분석 데이터:
Figure 112004012020047-pct00029
MS: m/z=379.3 [M+H+]; m/z=401.4 [M+Na+].
SiO2상에 에틸 아세테이트/헥산 1:2 내에서 Rf=0.36.
실시예 9
(S)-3-아미노-4-(2-3급-부톡시카보닐아미노-2-카복시-에틸설파닐)-벤조산
Figure 112004012020047-pct00030
N-3급-부톡시카보닐-3-(4-카복시-2-아미노페닐티오)-L-알라닌 메틸 에스테르 200mg(0.540mmol)을 격렬한 교반하에서 TBME 5㎖ 및 완충액(0.1M 염화나트륨; 3mM 인산나트륨, pH 7.0) 12㎖로 구성된 계에 첨가하였다. 알칼라제 2.5L[노보 노르디스크제 서브틸리신 칼스버그] 100㎕를 첨가하고, 격렬한 교반하에 0.1N 수산화나트륨 용액을 제어 첨가(pH-고정)하여 pH를 7.0으로 유지하였다. 적정화제 5.847㎖를 소모한 후(이론치 108%; 1.5시간 후), 반응 혼합물을 TBME 25㎖로 2회 세척하고, 25% 염산을 사용하여 pH 2.5가 되도록 산성화시키고, 에틸 아세테이트 3X25㎖로 추출하였다. 합한 유기상을 황산나트륨으로 건조하고 용매를 증발시키고, 잔류물을 HV에서 건조하여 황색 결정(수율: 93.4%)으로서 N-3급-부톡시카보닐-3-(2-아미노-4-카복시페닐티오)-L-알라닌 187mg(0.479mmol)을 얻었다.
분석 데이터:
HPLC-순도: 96.4% (면적)
Figure 112004012020047-pct00031

Claims (9)

  1. 유기 보조 용매를 함유하는 수성계내에서 하기 화학식 II의 화합물을 프로테아제와 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 I의 화합물의 제조방법:
    화학식 I
    Figure 112004012020047-pct00032
    화학식 II
    Figure 112004012020047-pct00033
    상기 식에서,
    R1은 수소 또는 알킬이고;
    R2는 아미노 보호기이고;
    R3은 각각 독립적으로 할로겐, 카복실, 알콕시카보닐, 알케닐옥시카보닐 또는 벤질옥시카보닐이고;
    n은 1 또는 2이고;
    R4는 알킬 또는 벤질이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    화학식 II의 화합물이 하기 화학식 IIaa로 표시되는 방법:
    화학식 IIaa
    Figure 112004012020047-pct00034
    상기 식에서,
    R1, R2, R3, R4 및 n은 제 1 항에서 정의된 바와 같다.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    R1이 수소 또는 알킬이고;
    R2가 아미노 보호기이고;
    R3이 각각 독립적으로 할로겐, 카복실 또는 알케닐옥시카보닐이고;
    R4가 알킬 또는 벤질이고;
    n이 1 또는 2인 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    R1이 수소이고;
    R2가 아미노 보호기이고;
    R3이 각각 독립적으로 할로겐, 카복실 또는 알케닐옥시카보닐이고;
    R4가 알킬이고;
    n이 1인 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    반응이 pH 6.0 내지 pH 8.5에서 수행되는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    프로테아제가 바실러스 프로테아제, 서브틸리신, 아스페르질러스 프로테아제 또는 트리타치움 프로테아제인 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    유기 보조 용매가 테트라하이드로푸란, 디옥산, 3급-부틸 메틸 에테르, C1-8-알콜, 에틸 아세테이트, 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아미드 또는 아세톤인 방법.
  8. 하기 화학식 II-a 또는 II-b의 화합물:
    화학식 II-a
    Figure 112004012020047-pct00035
    화학식 II-b
    Figure 112004012020047-pct00036
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    화학식 I의 화합물이 하기 화학식 III의 벤조티아제핀으로 추가로 가공되는 방법:
    화학식 III
    Figure 112007064236192-pct00037
    상기 식에서,
    R1, R2, R3, R4 및 n은 화학식 I 및 II의 화합물에 대해 기술한 바와 같다.
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