CN105392891B - 具有硫醇基的d-型或l-型氨基酸衍生物的制造方法 - Google Patents

具有硫醇基的d-型或l-型氨基酸衍生物的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明解决了提供以高收率制造在侧链有硫醇基的光学活性D‑型及/或L‑型氨基酸的简易的方法这一问题。本发明提供的是：在侧链有硫醇基的氨基酸衍生物的制造方法及该氨基酸衍生物的中间体，该制造方法的特征在于制造包含在β位有硫醇基的D‑型及L‑型氨基酸衍生物的中间体组合物，使D‑或L‑氨基酸选择性水解酶反应，分离经水解的D‑或L‑氨基酸衍生物。

Description

具有硫醇基的D-型或L-型氨基酸衍生物的制造方法
技术领域
本发明是关于侧链有硫醇基的D-型或L-体氨基酸衍生物的制造方法。此外，本发明是关于在侧链有硫醇基的D-型或L-体氨基酸衍生物的制造方法所使用的中间体。
背景技术
近年，生物医药的研究开发的进展，由合成肽及蛋白质进行构造及机能的解析之例，及将肽及蛋白质作为医药使用之例正增加。肽及蛋白质是由氨基酸构成，构成蛋白质的α-氨基酸除了侧链取代基是氢原子的情况外，α碳原子是不对称原子之故，有称为D-型及L-体的镜像异构物存在。在生物体内存在的肽及蛋白质，由L-氨基酸所构成，所以要合成在生物体内存在的肽及蛋白质，其原料需要是有光学活性的L-氨基酸。此外，近年来，在蛋白质的构造解析上，期待提高蛋白质的结晶化效率，而使用消旋蛋白质的X射线结晶构造解析受到注目。其中，消旋蛋白质就是作为仅由D-氨基酸所组成的蛋白质与仅由L-氨基酸所组成的蛋白质的等量混合物的蛋白质。解析蛋白质的构造是理解蛋白质机能的重要的知识。为了由这种消旋蛋白质的结晶化而进行构造解析起见，合成D-蛋白质及L-蛋白质的双方的需要性提高。要将这种D-蛋白质及/或L-蛋白质制造并安定的供给，则有必要将作为原料的光学活性D-氨基酸、L-氨基酸各分别大量以高效率制造。特别是，D-蛋白质为天然不存在，只有由化学合成才有合成的可能，成为原料的D-氨基酸的工业生产是必要不可欠的。
此外，要合成高分子的蛋白质时，以固相合成等制造肽的方法，则能制造的肽的长度有限，所以需要将所制造的肽连结起来。肽结合法而言，是采用名为自然化学接合法NCL(Native Chemical Ligation)的方法。在NCL中，将N末端具有在侧链有硫醇基的氨基酸的肽，与其他肽的C末端，利用硫醇基的反应性而结合。因而，在NCL中，主要是在侧链有硫醇基的氨基酸的半胱氨酸作为结合部位而设计蛋白质合成。此外，在使用硫醇基的结合反应后将构造改变为其他的氨基酸，而想出以丙氨酸等作为结合部位的方法等。但是，虽然如此，可能作为结合部位的氨基酸仍旧是非常有限，这一点成为蛋白质合成的限制因素。
因而，高分子的D-或L-蛋白质的制造上，要制造可作为NCL的结合部位的氨基酸的话，需要制造在侧链经导入硫醇基的光学活性D-或L-氨基酸。但是，这种氨基酸的制造方法而言，以D-或L-氨基酸作为原料，有尝试不要发生异构化而经由多数的复杂的步骤而在侧链导入硫醇基的方法，但由这种方法要以高收量及高收率制造目的之氨基酸是非常困难。并且，制造光学活性氨基酸的方法而言，亦存在有关使用立体选择性的酶的方法等的报告(参照专利文献1，2)。但是，在这些中，没有特别述及在侧链有硫醇基等的所希望的取代基的氨基酸的制造等。此外，酶有基质特异性，所以对于在β位有例如经保护的硫醇基之容积大的取代基的氨基酸衍生物也不能说酶有效。随后高分子的D-或L-蛋白质的制造上，可作为NCL的结合部位使用之光学活性β-硫代氨基酸衍生物，至今为止，还没有达到以可使D-或L-蛋白质的工业生产的实施方案而制造的程度。
[先前技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]日本专利特开平6-125786
[专利文献2]日本专利特开平11-69992
发明内容
[发明要解决的课题]
本发明的课题是提供在侧链有硫醇基的光学活性的D-型及/或L-型氨基酸，能以简易的方法，以高收率制造的方法为课题。特别是，本发明人，为了要增加可作为由NCL的结合部位的氨基酸的变化，将侧链有硫醇基的天然型或非天然型的各种D-或L-氨基酸，以高收率制造作为课题。
[解决课题的手段]
本发明人为了要解决前述课题精心进行研究。根据光学活性D-或L-氨基酸作为原料的以往方法，不对称碳原子的立体异构的调控非常困难。于是，本发明人刻意将有硫醇基的氨基酸衍生物作为立体异构物混合存在的中间体组合物而制造之后，使用酶将α碳原子的D-型与L-型分离，惊讶的是发现以比以往较少的步骤数的简易方法，以高收率，而可制造在侧链有硫醇基的光学活性氨基酸衍生物。即，本发明人着眼于，在NCL法中，可使用将用于肽结合反应的硫醇基在结合反应后除去的方法。本发明人想到，将在β位有硫醇基的氨基酸衍生物(β-硫代氨基酸衍生物)，不实施α及β碳原子的立体异构的调控，在最后作为α碳原子以光学活性体精制所得者可用于NCL的结合部位。即，α及β碳原子是不对称原子的β-硫代氨基酸衍生物的D-型或L-型，由在NCL反应后除去硫醇基，则可变成只有α碳原子为不对称碳原子的α碳原子的光学活性D-型或L-型，而可合适当作用于NCL结合部位的氨基酸而使用。
再者，本发明人，为了要制造对天然型或非天然型的各种的氨基酸经导入硫醇基的光学活性衍生物，精心检讨作为中间体的立体异构物混合存在的氨基酸衍生物组合物的制造方法。其结果，本发明人发现，由使用芳族氨基酸或甘氨酸作为原料，对包括天然型氨基酸的各种的氨基酸在侧链经导入硫醇基的非天然型氨基酸，可简易且以高收率制造成为D-型或L-型氨基酸。
即，本发明是提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基的D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法。该制造方法的特征在于，制造包括D-型及L-型之在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物，对所得的氨基酸衍生物使D-或L-氨基酸选择性水解酶中的任一种酶反应，随后分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物。
此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基的D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，其特征是含有以下的步骤，
(I)对氨基酸衍生物，实施以下的反应，而制造含有D-型及L-型，在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
(A)在该氨基酸衍生物的β碳原子导入保护或无保护的硫醇基的反应，
以及，
(B)将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，转变为要成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，
以及，
(II)对(I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶中的任一种酶反应，随后分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基及取代基R1的D-或L-非天然型氨基酸衍生物[其中，R1是指构成氨基酸的侧链的取代基中，结合在β碳原子的取代基部分而言(但，氢原子的情况除外)。]的制造方法。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于前述”在β位有经保护或未经保护的硫醇基及取代基R1的D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法”中，
在前述步骤(I)中，前述反应(A)之前，包含作为步骤(P)之制造在β碳原子有取代基R1及脱离基L的氨基酸衍生物的步骤，
前述反应(A)是与使前述脱离基L脱离氨基酸衍生物的β碳原子的反应一起实施。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于前述取代基R1是芳族取代基，前述步骤(P)包含作为步骤(P-1)之对在β碳原子有取代基R1的氨基酸衍生物，在β碳原子导入脱离基L的步骤。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于前述步骤(P)，包含作为步骤(P-2)之使甘氨酸与以R1CHO代表的醛化合物反应的步骤。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于前述步骤(B)是，将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基变换为酰基氨基的反应，在前述步骤(II)中的D-或L-氨基酸选择性水解酶是D-或L-氨基酰化酶(aminoacylase)。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在前述步骤(II)中，分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤，含有对经水解的D-或L-氨基酸衍生物导入脂溶性保护基的步骤，由因脂溶性保护基的有无而产生的疏水性的差异，分离经导入脂溶性保护基的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在β位有经保护或未经保护的硫醇基的D-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，在前述步骤(II)中，使用D-氨基酸选择性水解酶，随后分离经水解的D-氨基酸衍生物。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在β位有经保护或未经保护的硫醇基的L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，在前述步骤(II)中，使用L-氨基酸选择性水解酶，随后分离经水解的L-氨基酸衍生物。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在前述步骤(A)中导入的硫醇基是经从PMB(对甲氧基苄基)、Acm(乙酰氨基甲基)、苄基、Trt(三苯甲基)、二硫代、叔丁基选出的保护基所保护的硫醇基。
此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基的经光学拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，该制造方法含有以下步骤，
(I)对氨基酸衍生物，实施以下的反应，而制造含有D-型及L-型，在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
(A)在该氨基酸衍生物的β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基的反应，
以及，
(B)将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，变换为要成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，
(II)对于(I)所得的氨基酸衍生物，使D-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经水解的D-氨基酸衍生物的步骤，
以及，
(III)水解在(II)未经水解的L-氨基酸衍生物，随后获得经水解的L-氨基酸衍生物的步骤。
此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基的经光学拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，该制造方法包含以下的步骤，
(I)对氨基酸衍生物，实施以下的反应，制造包含D-型及L-型之在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
(A)在该氨基酸衍生物的β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基的反应，
以及，
(B)将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，变换为要成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，
(II)对于(I)所得的氨基酸衍生物，使L-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经水解的L-氨基酸衍生物的步骤，
以及，
(III)水解在(II)未经水解的D-氨基酸衍生物，随后获得经水解的D-氨基酸衍生物的步骤。
此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基之经光学拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，
前述步骤(B)是将在该氨基酸衍生物的α碳原子结合的氨基，变换为酰基氨基的反应，
在步骤(II)所述的”(I)所得的氨基酸衍生物”是包含以下的式所代表之关于α碳原子的D-型及L-型的组合物
Figure BDA0000853236850000061
[其中，R2代表氢原子或硫醇基的保护基，X代表经保护或未经保护的羧基，Acyl表示酰基，R1表示构成氨基酸的侧链的取代基中，结合在β碳原子的取代基部分(但，氢原子的情况除外)。]，
前述步骤(II)中，D-或L-氨基酸选择性水解酶是D-或L-氨基酰化酶。
此外，本发明的另外的实施实施方案，提供包含以下式所代表之关于氨基酸衍生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物
Figure BDA0000853236850000062
[其中，R2代表氢原子或硫醇基的保护基，X代表经保护或未经保护的羧基，Acyl表示酰基，R1表示构成天然型氨基酸的侧链的取代基中，在β碳原子结合的取代基部分(但，氢原子的情况除外)。]。此外，这种氨基酸衍生物亦可为前述式所代表的化合物的盐。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物中，前述取代基R1是结合在由Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Trp、及Tyr所成的群选出的氨基酸的β碳原子的取代基部分(但，不是氢原子)。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物中，前述取代基R2是硫醇基的保护基。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物中，前述取代基X是COOH。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物中，前述取代基R1是结合在由Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Trp、及Tyr所成之群选出的氨基酸的β碳原子的取代基部分(但，不是氢原子)，前述取代基R2是硫醇基的保护基，前述取代基X是COOH。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于包含前述式所代表之关于氨基酸衍生物的α碳原子的D-型及L-型的组合物是前述D-型及L-型的等量混合物。
此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基及取代基R1之D-或L-非天然型氨基酸衍生物[其中，R1是指芳族取代基而言。]的制造方法，而含有以下的步骤，
(I)对氨基酸衍生物，实施以下的步骤，制造含有D-型及L-型，在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
(P-1)对于在β碳原子有取代基R1的氨基酸衍生物，在该β碳原子导入脱离基L，制造在β碳原子有取代基R1及脱离基L的氨基酸衍生物的步骤，
(A)由该氨基酸衍生物的β碳原子使前述脱离基L脱离，且，在该β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基的步骤，
以及，
(B)将该氨基酸衍生物之α碳原子结合的氨基或羧基，变换成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基步骤，
以及，
(II)对于(I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
此外，本发明的一实施实施方案中，提供在β位有经保护或未经保护的硫醇基及取代基R1之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法[其中，R1是指构成氨基酸的侧链的取代基中，结合在β碳原子的取代基部分而言(但，除氢原子的情况)。]，而含有以下的步骤，
(I)对氨基酸衍生物，实施以下的步骤，制造含有D-型及L-型之在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
(P-2)使甘氨酸与以R1CHO代表的醛化合物反应，制造在β碳原子有取代基R1及脱离基L的氨基酸衍生物的步骤，
(A)由该氨基酸衍生物的β碳原子使前述脱离基L脱离，且，在该β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基的步骤，
以及，
(B)将该氨基酸衍生物的α碳原子结合的氨基或羧基，变换成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的步骤，
以及，
(II)对于(I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在β位有经保护或未经保护的硫醇基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法中，原料是使用包含关于α碳原子的D-型及L-型的氨基酸衍生物，或，α碳原子不是不对称碳原子的氨基酸衍生物。
此外，本发明的一实施实施方案中，特征在于在β位有经保护或未经保护的硫醇基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法中，原料是使用关于α碳原子的D-体及L-型的等量混合物之氨基酸衍生物，或，α碳原子不是不对称碳原子的氨基酸衍生物。
以上所述的本发明之一个或多数个的特征任意组合的发明，本领域技术人员应可理解，也包括在本发明的范围。
[发明效果]
依照本发明的制造方法，则比使用光学活性氨基酸为原料的以往方法，可以用较简易方法而且以高收率制造在侧链有硫醇基之非天然型氨基酸的D-型或L-型氨基酸。即，依照以往的D-型或L-型的氨基酸为原料的制造方法，则为了不产生α不对称碳原子的立体异构化，不能使用加热条件，及不能使用强碱性或强酸性条件的反应。与此相比，依照本发明的制造方法，则在含导入硫醇基的所希望的氨基酸的制造步骤中，可以使用这些过分激烈的条件，反应效率优异的，更简便的制造步骤。
此外，依照本发明的制造方法，对于包括天然型氨基酸的各种氨基酸，在侧链经导入硫醇基的非天然型氨基酸，可简易且以高收率作为D-型或L-型氨基酸而制造。
使用依照本发明的制造方法所得的氨基酸衍生物，则可将半胱氨酸以外的天然型及非天然型的各种氨基酸作为肽结合法中的结合部位而使用。即，在蛋白质合成上不需要为了肽结合而变更氨基酸序列，此外，就可以在氨基酸序列中的各种氨基酸作为结合部位而设计蛋白质合成之点而言，本发明的制造方法，扩大蛋白质合成上的肽结合法的利用可能性，利用价値高。
此外，依照本发明的制造方法，将目的之氨基酸的D-型及L-型衍生物不需区别异构物而同时合成，所以作为本发明的一实施方案，可以分离作为目的之氨基酸衍生物的D-型及L-型，并且，将D-型及L-型的双方作为光学活性体而可分别同时得到。这种方法作为回应合成D-型及L-型的双方的蛋白质的需求的原料的提供方法而有高的利用价値。
依照本发明的制造方法，则可合成对应于几乎所有的氨基酸残基的β-硫代氨基酸。如前所述，在利用NCL法的肽结合法，可作为结合部位的氨基酸非常有限的限制，但使用本发明的制造方法的β-硫代氨基酸，则可解消NCL法的肽结合部位的限制。如此，在多肽(或蛋白质)的化学合成上，可显著节省贵重的氨基酸的消费量。
例如，贵重的氨基酸是糖链-氨基酸的情况时，在以往的糖肽合成中，将糖链-氨基酸利用于肽固相合成，所以消费过多量的糖链-氨基酸作为原料。但是，如上述，依照本发明的制造方法，由于可合成对应于几乎所有氨基酸残基的β-硫代氨基酸衍生物，所以可以合成包含糖链-氨基酸，在N末端有β-硫代氨基酸，C末端有硫代酯等活性化基的若干残基程度的短链肽而使用于NCL法等(液相反应)的肽结合反应。即，以贵重的糖链-氨基酸为中心向N末端侧，C末端侧的方向以高效率延长肽。如此，比以往的固相合成法，可以显著节省贵重的糖链氨基酸及修饰氨基酸的消费量。例如，贵重的氨基酸是有糖链的氨基酸，短链肽是β-硫代氨基酸及糖链-Asn所构成的2氨基酸单元时的反应的示意图示于图2。
附图说明
图1显示本发明的制造方法的一实施方案的示意图。
图2显示依照本发明的制造方法的一实施方案制造的关于β-硫代氨基酸的应用例的示意图。
具体实施方式
“氨基酸”一般是指有氨基及羧基二者的有机化合物。该羧基结合的碳原子称为α碳原子，由α碳原子起有碳原子结合时，由α碳原子邻接的碳原子起依序称为β碳原子、γ碳原子。α碳原子也称为α位碳原子，或，为了显示取代基的结合位置也单称为α位。关于β碳原子等也是同样情形。
在本发明中，“氨基酸”就是以其最广义的意义使用，天然的氨基酸，例如，不只是丝氨酸(Ser)，天冬酰胺(Asn)，缬氨酸(Val)，白氨酸(Leu)，异白氨酸(Ile)，丙氨酸(Ala)，酪氨酸(Tyr)，甘氨酸(Gly)，离氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)，组氨酸(His)，天冬酰氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，谷酰胺(Gln)，苏氨酸(Thr)，半胱氨酸(Cys)，蛋氨酸(Met)，苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)，脯氨酸(Pro)，也包括氨基酸变异体及衍生物等非天然氨基酸。如为本领域技术人员，考虑此广义的定义，应可理解作为本发明的氨基酸，例如可举L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体及衍生物等经化学修饰的氨基酸；正白氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等不会在生物体内成为蛋白质的构成材料的氨基酸；及本技术领域中具有通常知识者公知的有氨基酸特性的化学合成的化合物等。
在本发明的制造方法中作为目的化合物而制造的氨基酸，只要α碳原子是不对称碳原子则无特别的限定，但在本发明的一实施方案中，在α碳原子有氨基结合的α-氨基酸为优选。在本发明的一实施方案中，在制造用于合成肽或蛋白质的氨基酸衍生物之观点上，氨基酸是天然型或非天然型的蛋白质构成氨基酸为优选。本发明的一实施方案中，由制造实质上与在生物体存在的蛋白质有大致相同的氨基酸序列的氨基酸之观点而言，氨基酸是天然型的氨基酸为优选。
在本说明书中，氨基酸衍生物，包括氨基酸的侧链取代基再经其他的取代基所取代的化合物，及对氨基或羧基等官能基，由结合保护基或其他的取代基而衍生物化的化合物。即，本说明书中，氨基酸衍生物是，用以总称包括如这些的实例之经衍生物化的氨基酸，不是要排除没有衍生物化的氨基酸的意思。
氨基酸在氨基酸的α碳原子有氨基结合的α氨基酸的情况时，α碳原子结合的其他2个取代基只要是不相同的取代基(例如，氢原子)，α碳原子是不对称原子，有称为D-型，L-型的镜像异构物存在。本说明书中，D-型的氨基酸称为”D-氨基酸”，或”D-型氨基酸”等，L-型的氨基酸称为”L-氨基酸”，或”L-型氨基酸”等。
β碳原子也是不对称碳原子的氨基酸衍生物的情况时，以β碳原子为掌性中心的光学异构物也会存在。本说明书中，就α碳原子而说D-型或L-型的情况时，有关β碳原子的光学异构物的存在比可以是任意的。即，有关β碳原子的光学异构物，可为经光学拆分的状态，但有关β碳原子的光学异构物亦可为以任意的比率含有的化合物。即，本说明书中指称光学活性氨基酸衍生物的场合时，至少有关α碳原子的光学异构物是经光学拆分的光学活性体即可。
此外，本说明书中，有关α碳原子的D-型及L-型的等量混合物的情况时，亦称为氨基酸衍生物是消旋体，或，消旋体氨基酸衍生物。消旋体就是，如通常广泛所解释，D-型及L-型的实质上是等量混合物即可，此外，亦可为被称为消旋混合物，消旋化合物，消旋固溶体的形状而存在的化合物。
本发明的一实施方案中，本发明是关于在β位有经保护或未经保护的硫醇基之D-或L-氨基酸衍生物的制造方法。其中，在β位的取代基R，与β碳原子结合取代基R是相同的意思。
本说明书中，”经保护或未经保护的”取代基R意指由保护基受到保护的取代基R，或，没有受到保护的取代基R。例如，”经保护或未经保护的硫醇基”意指由保护基受到保护的硫醇基，或没有受到保护的硫醇基。硫醇基的保护基而言，可作为硫醇基的保护基使用的化合物没有任何限定。硫醇基的保护基而言，例如，可举PMB(对甲氧基苄基)、Acm(乙酰氨基甲基)、苄基、Trt(三苯甲基)、二硫代、叔丁基等。
本说明书中，指称”在β位有经保护或未经保护的硫醇基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物”时，意指在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸的状态下之非天然型氨基酸。即，公知的天然型氨基酸的半胱氨酸是在β位有未经保护的硫醇基的氨基酸，为在β位有硫醇基的状态下的天然型氨基酸。”在β位有经保护或未经保护的硫醇基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物”意指不含这种天然型的半胱氨酸。即，”在β位有经保护或未经保护的硫醇基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物”不是排除”在天然型氨基酸的β位经导入经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸”或其衍生物的意思。此外，本说明书中，在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物，也称为”β-硫代氨基酸衍生物”。
本发明的一实施方案中，由可以得到用以合成由天然型氨基酸构成的蛋白质而可用于NCL结合部位的氨基酸之观点而言，在本发明中的目的化合物的β-硫代氨基酸衍生物，较佳为代替在天然型氨基酸的β碳原子结合的1个氢原子，有经保护或未经保护的硫醇基结合的氨基酸或其衍生物。
这种β-硫代氨基酸衍生物的一例，相应于各分别天然型氨基酸，可由以下的化学式所述的化合物表示。
Figure BDA0000853236850000121
在该化学式中，没有区别D-型及L-型的立体异构物而记述，但如以D-型及L-型的立体异构物记述时，该化学式所述的化合物，例如，以天然型氨基酸是苯丙氨酸的情况为例，则可由如以下的2个化学式来表示。以下的2个化学式中，左侧为L-型，右侧为D-型。在上述化学式所述的其他化合物也是同样，可作为D-型，L-型而记述。
Figure BDA0000853236850000131
此外，上述的，相应于各分别的天然型氨基酸，β-硫代氨基酸衍生物的一例的上述化学式中，最单纯化，而记述氨基，羧基，以及，其他的侧链取代基没有保护也没有取代的实例，但就“在β位有经保护或未经保护的硫醇基之非天然型氨基酸衍生物”而言，也包括该氨基，羧基，以及，其他的侧链取代基是由保护基或其他的取代基取代的化合物。
本发明的一实施方案中，作为本发明中的目的化合物的β-硫代氨基酸衍生物也可称为在β位有经保护或未经保护的硫醇基，并且，在β位也有取代基R1的氨基酸衍生物。其中，R1是构成氨基酸的侧链的取代基中，β碳原子结合的取代基部分，而不是氢原子。以上述的苯丙氨酸的实例而言，苯丙氨酸是在β位结合氢原子2个及苯基的氨基酸，所以R1是苯基。同样，对天然型的氨基酸，各分别可理解取代基R1。例如，天然型的氨基酸是Asn，Gln时，取代基R1各分别为-CO-NH2，-CH2-CO-NH2。天然型的氨基酸是Trp，Tyr，His时，取代基R1各分别为，吲哚-3-基，-对羟苯基，1H-咪唑-4-基。天然型的氨基酸是Asp，Glu时，取代基R1各分别为，-COOH，-CH2-COOH。天然型的氨基酸是Arg，Lys时，取代基R1各分别为，-(CH2)2-NH-C(NH2)2，-(CH2)3-NH2。天然型的氨基酸是Met，Leu时，取代基R1各分别为，-CH2-SCH3，-CH(CH3)2。在取代基R1所含的羧基或氨基等，可为游离的酸或碱，也可为盐。此外，本技术领域中具通常知识者，在不是天然型的氨基酸时，同样地，由该氨基酸的构造式，可理解结合β碳原子的取代基部分，不是氢原子，取代基部分为个别的取代基R1。此外，取代基R1是含有官能基等反应性高的基团时，较佳为将这些基团先由保护基保护，或以其他的取代基取代，或变换为其他的取代基。
本说明书中，在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物有时称为β-硫代氨基酸衍生物。此外，天然型氨基酸之有侧链取代基的氨基酸，代替其在β碳原子结合的氢原子而导入经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物，有时将其称为天然型氨基酸之β-硫代氨基酸衍生物。例如，以苯丙氨酸为例，以上述构造式代表的氨基酸衍生物，可称为苯丙氨酸的β-硫代氨基酸衍生物。此外，作为D-型及L-型的等量混合物的氨基酸衍生物，有时称为D,L-β-硫代氨基酸衍生物。
作为本发明的一实施方案，本发明的制造方法是关于在β位有经保护或未经保护的硫醇基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法。该制造方法中，在β位有硫醇基的氨基酸衍生物作为含有D-型及L-型的中间体组合物而制造后，使D-或L-氨基酸选择性水解酶反应，分离D-或L-氨基酸衍生物。因上述中间体组合物，作为D-或L-型选择性水解酶的基质的部位的氨基酸衍生物而制造，所以也可说是有D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质部位之包含β-硫代氨基酸衍生物的D-型及L-型的组合物。
有D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质部位的β-硫代氨基酸衍生物，亦可对有D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质部位的氨基酸衍生物，由在β位导入硫醇基制造。或者，亦可对β-硫代氨基酸衍生物，以具有D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质部位的方式由变换取代基而制造。此外，β-硫代氨基酸衍生物，也可对氨基酸衍生物，由在β位导入硫醇基而制造，或者，也可由将氨基酸衍生物与含有硫醇基的化合物缩合的方法等而制造。以成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质部位的方式而变换取代基的方法而言，可以氨基酸的α碳原子结合的氨基或羧基变换成为D-或L-型选择性水解酶的基质的方式进行。该反应中，进行变换反应前的氨基或羧基，可为没有受保护的氨基或羧基，也可为由其他的保护基而受保护的氨基或羧基。
作为上述的中间体之有D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质部位的β-硫代氨基酸衍生物，可由对α碳原子的立体异构性不加控制的制造方法而制造。由对α碳原子的立体异构性不加控制，上述之有D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质部位的β-硫代氨基酸衍生物，可以成为含有D-型及L-型的组合物而得到。
对于包含D-型及L-型之上述有D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质部位的β-硫代氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶反应，则D-或L-氨基酸衍生物被选择性水解。由水解产生的氨基或羧基，直接以未保护的状态或以经保护基保护的状态，利用其疏水性等的差异，可分离经水解之D-或L-氨基酸衍生物以及未经水解之其他的氨基酸衍生物。
本发明，作为其一实施方案，可表示为含有以下的步骤(I)及(II)的制造方法。
(I)制造包含D-型或L-型之在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤，以及，
(II)对于(I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶的任一种酶反应，随后分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
本说明书中，“包含D-型及L-型”的情况，意指作为α碳原子的光学异构物包含D-型及L-型，没有特定时，并不特定其量的比率。本发明的优选的一实施方案中，意指实质上包含有D-型及L-型二者之意。此外，本发明的一实施方案中，可为D-型及L-型的等量混合物。
本发明的一实施方案中，可表现为步骤(I)是对于氨基酸衍生物，实施以下的反应(A)及(B)，制造包含D-型及L-型之在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤：
(A)在氨基酸衍生物的β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基的反应，以及，
(B)将在氨基酸衍生物的α碳原子结合的氨基或羧基，变换成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应。
其中，上述反应(A)及(B)的顺序，可以(A)、(B)的顺序实施，或者，也可以(B)、(A)的顺序实施。或者，在(A)及(B)以外，对氨基酸衍生物的官能基或取代基亦可适宜进行保护，脱保护等其他的反应。此外，本说明书中，记述为反应(A)，(B)的反应，也可以称呼为步骤(A)，(B)等。
步骤(I)的”对氨基酸衍生物，实施以下的反应，制造包含D-型及L-型之在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤”，在实施步骤(I)所含的反应之后，实现包含D-型及L-型的状态即可，成为原料的氨基酸，可为实质上由D-型或L-型的一方所构成的氨基酸或其衍生物，或者，亦可为如甘氨酸方式之α碳原子不是不对称碳原子的氨基酸或其衍生物。此外，本发明的一实施方案中，要将在步骤(I)所得的氨基酸衍生物有效率的再结晶化之观点而言，含有等量的D-型及L-型为优选。含有等量的D-型及L-型，意指实质上的等量即可。换言之，在本发明的一实施方案中，在步骤(I)所得的氨基酸衍生物的中间体组合物是消旋体为优选。
在氨基酸衍生物的β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基的反应，只要在氨基酸衍生物的β碳原子，导入经保护或未经保护的硫醇基的反应即可，没有特别的限制。也可在氨基酸衍生物的β碳原子导入脱离基之后，与脱离基做交换反应而导入。
例如，该反应可对于氨基酸衍生物，使硫醇化合物反应而可实施。由导入经保护的硫醇基的观点而言，使用在硫原子结合有保护基及氢原子的硫醇化合物为优选。作为硫醇化合物而言，在苯环上的任意的位置上，有任意数的氟、氯、溴、碘等卤原子，甲基、乙基等碳数1至4的低级烷基，甲氧基、乙氧基等碳数1至4的烷氧基，可以有硝基等取代基的苄硫醇类或三苯甲硫醇类，甲烷硫醇、乙烷硫醇、三级丁烷硫醇等烷硫醇类，乙酰氨基甲基、三苯甲基、可容易变换为二硫代的酰硫醇类等。本发明的一实施方案，苄基硫醇类为优选，此外，对甲氧基苄基硫醇更优选。
硫醇化合物的使用量而言，对成为原料的氨基酸衍生物1当量为1至100当量，优选是2至20当量，更优选是3至10当量即可。所使用的溶剂而言，例如可举THF、DCM、DMSO、DMF等，但它们中也以DMF为优选。反应条件而言，例如，可在1至100℃，优选是10至80℃，更优选是15至35℃，实施反应30分钟至24小时，优选是1至12小时，更优选是2至6小时。
该反应的原料化合物是，可在β位导入硫醇基的氨基酸或氨基酸衍生物即可。亦即，原料化合物可为氨基酸，也可为氨基酸的氨基、羧基、侧链取代基等受保护或被取代基所取代的氨基酸衍生物。本发明的一实施方案中，由有效率实施反应之观点而言，优选是在β位有脱离基的氨基酸衍生物，更优选是在β位有卤原子的氨基酸衍生物。此外，本发明的一实施方案中，防止副反应而提高收率之观点而言，氨基酸的氨基及羧基经保护的氨基酸衍生物为优选。
将在氨基酸衍生物的α碳原子结合的氨基或羧基，变换成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，只要在反应后，可得在α碳原子经结合成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的氨基酸衍生物的反应则没有特别的限制。反应的起始原料的”经结合在氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基”，可为经保护或未经保护的氨基或羧基都可以。亦即，可为没有受保护的游离的氨基或羧基，或者，可为经保护基保护的氨基或羧基。在本发明的一实施方案中，在氨基酸衍生物的β位经导入硫醇基之后，实施本反应时，在β位经导入硫醇基的氨基酸衍生物作为原料，或者，为了硫醇化的目的而将氨基及羧基经保护时，可将这些经保护的氨基酸衍生物作为原料而实施。
氨基的保护基而言，可使用一般可用于氨基的保护基的基团，例如，可用后述的脂溶性保护基等。本发明的一实施方案，例如，可举9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)或三级丁氧基羰基(Boc)、烯丙基氧基碳酸酯基(Alloc)等含有碳酸酯基的基、乙酰基(Ac)等酰基、芳基、苄基等保护基等。要导入保护基时，例如，要导入Boc基时，可在反应系添加Boc2O的THF溶液的方法等而实施。氨基的保护基的导入，根据保护基，在上述的方法之外，可用公知的方法而实施。此外，氨基的保护基的脱保护，可用酸或碱处理而实施。例如，保护基是Boc基时，可使用三氟乙酸(TFA)等酸。这时，在溶剂的存在下实施为优选，例如可举DCM及THF，乙腈等。氨基的保护基的脱保护，上述的方法之外，可使用通常的方法实施。
羧基的保护基而言，可使用一般可用于羧基的保护基的基团，例如，可使用后述的脂溶性保护基等。本发明的一实施方案中，例如，可举由甲基、乙基、叔丁基等烷基，苄基等芳烷基的酯而保护。羧基的保护基是甲基时，可以添加亚磺酰氯及甲醇的方法等而甲酯化。羧基的保护基的导入，根据保护基，上述的方法之外，可使用公知的方法而实施。此外，羧基的保护基的脱保护，以酸或碱处理而实施。例如，保护基是甲基时，可使用氢氧化钠等碱。这时，在溶剂的存在下实施为优选，例如可举THF、二恶烷、乙腈等。羧基的保护基的脱保护，上述的方法之外，可使用通常的方法而实施。
“D-或L-氨基酸选择性水解酶”而言，只要进行D-型氨基酸选择性水解的酶，或，进行L-型氨基酸选择性水解的酶则没有特别的限制。例如，水解酶可举酰胺酶、蛋白酶、酯解酶、脂解酶等。这些酶的来源没有特别的限制，可为源自细菌等微生物，亦可为源自哺乳动物。这些D-或L-氨基酸选择性水解酶，除了使用市售的分解酶之外，也可依照公知的方法调制。市售的分解酶而言，例如，可举酰酶“Amano”(L-酰体选择性氨基酰化酶)(Amano Enzyme(天野酵素)公司制)、D-氨基酰化酶“Amano”(D-酰体选择性氨基酰化酶)(Amano Enzyme(天野酵素)公司制)等。
本发明的一实施方案中，由使酶反应后的分离容易，并且，以高收率可得D-型或L-型的观点而言，作为“D-或L-氨基酸选择性水解酶”，使用D-氨基酰化酶或L-氨基酰化酶为优选。本发明的制造方法中，以水解酶经水解的D-型及L-型的分离方法，只要可以分离则没有特别的限制，但在本发明的一实施方案中，对于经水解的氨基或羧基导入脂溶性保护基，可将经水解的D-或L-氨基酸衍生物与未经水解的其他氨基酸衍生物以高效率分离。在这样的分离中，酰基氨基，与由1个或2个脂溶性氨基保护基所保护的氨基，以疏水性的差异的程度成为比较大，可高收率分离之点，作为水解酶而选用氨基酰化酶为优选。此外，有关使用这种保护基的分离步骤则将在后面说明。
“D-或L-氨基酸选择性”，只要对D-型或L-型有选择性就可以，并不限定于100％或可比照100％选择性。本发明中，由制造D-型或L-型的纯度高的光学活性氨基酸之观点而言，对D-型或L-型的选择性高者为优选，实质上，只与D-型或L-型的任一方反应者更优选。
“变换成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应”而言，根据上述酶的选择，以成为所选择酶的基质的方式，可将与α碳原子结合的经保护或未经保护的氨基或羧基变换。亦即，根据作为目的之取代基的种类及构造，使用通常的方法，可将经保护或未经保护的氨基或羧基变换。例如，作为酶而使用氨基酰化酶时，由将经保护或未经保护的氨基酰化，可变换成为酶的基质的氨基酰基。
例如，将氨基加以酰化的方法而言，可由将有经保护或未经保护的氨基的氨基酸衍生物，与羧酸卤化物或羧酸酐反应的方法等而可实施。此外，例如，将氨基乙酰化时，在含有经保护或未经保护的氨基的氨基酸衍生物的反应系中，由添加乙酸酐(Ac2O)而反应的方法等而实施。溶剂而言，只要为氨基酰基化会进行的溶剂则没有特别的限制，例如，可使用水或甲醇、乙醇，THF、DCM等，或它们的混合溶剂等。反应温度只要为氨基酰基化能进行的温度则没有特别的限制，例如，可设定为0至40℃等，可在通常的室温中实施。反应时间，只要为进行氨基酰基化足够的时间即可，例如可设定为1分钟至10小时，优选是5分钟至1小时等。
作为酶而使用氨基酰化酶时之外，使用酰胺酶，蛋白酶，酯解酶，脂解酶等时，也可依照公知的方法而实施。使用酰胺酶时，可由将经保护或未经保护的氨基酰胺化的反应，将经保护或未经保护的羧基酰胺化的反应而实施。此外，使用酯解酶时，可由将经保护或未经保护的羧基酯化的反应而可实施。如是本领域技术人员，应可参照本说明书的记述，在使用其他的水解酶时也可比照这些记述而同样实施。
氨基或羧基由保护基保护时，由保护基经保护的氨基或羧基也有可能直接成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质。这种情况时，也可将氨基或羧基由保护基保护的步骤，称为变换成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应。本发明的一实施方案中，由减少在本发明的制造方法的步骤数之观点而言，较佳为先进行变换成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，在氨基及羧基经保护之后，在β位导入硫醇基。
本发明的一实施方案中，成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基，而使用若干程度反应性高的取代基时，变换成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，在使用酶的水解反应之前先实施为优选。此外，这种情况时，在β位导入硫醇基的反应时，氨基及羧基由另外的保护基保护为优选。
这时，上述步骤(I)也可以表现如下。亦即，也可表现为步骤(I)是准备成为原料的氨基酸所含的氨基及羧基由保护基经保护的氨基酸衍生物，对该氨基酸衍生物，实施以下的反应，而制造含有D-型及L-型之在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤
(A)在该氨基酸衍生物的β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基反应，以及，
(B)将在该氨基酸衍生物的α碳原子结合的经保护氨基或经保护羧基，变换成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应。
此外，成为原料的氨基酸中，有其他的官能基存在时，也可为准备将成为原料的氨基酸所含的氨基，羧基，及其他的官能基由保护基经保护的氨基酸衍生物的步骤。
本发明的一实施方案中，D-或L-氨基酸选择性水解酶，可根据立体选择性的高低，入手容易性，变换成为氨基酸衍生物的氨基或羧基的基质的容易性等各种考量要素而选择。将氨基酸衍生物的氨基或羧基保护的步骤，及变换为酶的基质的步骤为分开的，即使是在成为酶的基质的取代基的反应性高的情况下，也由于可以选择这种取代基作为基质的水解酶之点而为优选。
本发明的一实施方案中，由上述反应，在β位导入硫醇基，并且，氨基或羧基经变换成为水解酶的基质的氨基酸衍生物，可由再结晶等方法分离精制后再用于其次的步骤。精制的方法而言，可由再结晶，硅凝胶管柱，使用有机溶剂的萃取等通常方法而实施。
本发明人发现，在本发明的制造方法的一实施方案中，在β位导入硫醇基，并且，氨基或羧基被变换成为水解酶的基质的氨基酸衍生物，在D-型及L-型的等量混合物的情况下，特别可将该中间体组合物有效率再结晶化。D-型及L-型的等量混合物的情况就是α碳原子的消旋体的情况，或，也可以简单地说是消旋体的情况。
将这种中间体组合物再结晶时，在其之前，可使用以有机溶剂的萃取等而得粗精制物。以有机溶剂的萃取，可用通常的方法实施。进行再结晶的情况时，溶剂可使用乙酸乙酯，甲醇，乙醇，醚等有机溶剂或其混合溶剂等，较佳可使用甲醇，醚等。
本发明的制造方法中，步骤(II)对于上述的步骤(I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶的任一方反应，随后实施分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
对于由上述步骤(I)所得的含有D-型及L-型的氨基酸衍生物，由使D-或L-氨基酸选择性水解酶的任一方反应，根据该酶的立体选择性，含有D-型及L-型的氨基酸衍生物中其中之任一方由上述水解酶被选择性的水解。例如，使D-氨基酸选择性水解酶反应，则D-型的氨基酸衍生物选择性的经水解。此外，使L-氨基酸选择性水解酶反应，则L-氨基酸选择性的经水解。
有关D-或L-氨基酸选择性水解酶如前所述。水解反应，可与一般性的酶反应同样实施。D-或L-氨基酸选择性水解酶，可由溶解于在酶反应通常使用的各种的缓冲液，而调制酶溶液。缓冲液而言，只要能进行酶反应的缓冲液则无特别的限定，可使用磷酸盐缓冲液，Tris盐酸盐等。pH可在6.0至10.0中进行，优选是7.0至9.0，更优选可为8.0。此外，用于水解反应的酶的量，只要是水解反应能有效率地进行的量则无特别的限定，例如，可使用对基质为触媒量或过多量。由有效率地进行水解反应之观点而言，例如对基质100mg可设定为0.1至10000单位，优选是1至1000单位。此外，反应温度是在10℃至60℃中进行，优选是20℃至55℃，更优选是可设定为30℃至50℃。反应时间是1小时至30日，优选是12小时至20日，更优选是可设定在2至14日。
在本发明的制造方法中，步骤(II)包含上述由酶的水解反应之后，将分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。在步骤(II)中，如实施水解反应，“继而”，实施分离的步骤的情况时，在水解反应之后，进行分离步骤即可，该水解反应与分离反应并不限定于直接进行或连续性的进行。例如，由水解所产生的游离的氨基或羧基可以不受保护的状态，直接进行分离步骤，或者，可在实施将游离的氨基或羧基以保护基保护的步骤等之后，实施分离步骤。本发明的一实施方案中，为了要将之后的分离步骤以高收率实施起见，以适当的保护基保护为优选。
在步骤(II)中，将分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤，能将经水解的一方的镜像异构物与未经水解的他方的镜像异构物互相分离的方法的话，没有任何限定。例如，可使用由反应系只取出一方的方法，由反应系除去一方的方法，在有机相及水相各分别溶存一方的方法，由反应系取出双方使用层析法等的分离精制手段将一方乃至双方各分别取出的方法等。
例如，在β位有硫醇基的D-非天然型氨基酸衍生物的制造方法而言，可实施对于在β位有硫醇基之包含D-型及L-型的中间体组合物，使D-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经水解的D-氨基酸衍生物。
相反地，在β位有硫醇基的L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法而言，可实施对于在β位有硫醇基之包含D-型及L-型的中间体组合物，使L-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经水解的L-氨基酸衍生物。
其中，例如，分离经水解的D-型时，不限定于将D-型由反应系取出的方法，也可为将未经水解的未反应物由反应系除去而将D-型加以分离的方法等。该类方法可依照例如，萃取，结晶化，硅凝胶管柱层析法，高速液体层析法(HPLC)等公知的方法实施。
在本发明的优选的一实施方案中，由将一方的镜像异构物分离之后，他方的镜像异构物也可利用的观点而言，将一方先分取后也分取他方的方法，或，使用硅凝胶管柱层析法等将双方各分别精制分取的方法为优选。此外，也可在萃取，结晶化等而得粗精制物后，再将D-型及L-型分取。
在本发明的一实施方案中，分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤，包含对经水解的D-或L-氨基酸衍生物导入脂溶性保护基的步骤，利用根据脂溶性保护基的有无及/或个数而产生的疏水性的差异，可以分离经导入脂溶性保护基的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
其中所用的脂溶性保护基而言，可用于氨基或羧基的保护基而有脂溶性，则没有特别限定。例如，氨基的脂溶性保护基而言，可举由氨基甲酸酯系、酰系、亚酰胺系、烷系、磺酰胺系选出的脂溶性保护基。氨基甲酸酯系保护基言，可举Boc基、Fmoc基、2,2,2-三氯乙氧基羰基(Troc)、苄氧基羰基(Cbz)、Alloc基等。酰系保护基而言，可举乙酰基(Ac)等，亚酰胺系保护基而言，酞酰(Pht)等，烷系保护基而言，可举三苯甲基(Trt)、苄基、芳基等，磺酰胺系保护基言，对甲苯磺酰基(Ts或Tos)、2-硝苯磺酰基(Ns)等。此外，羧基的脂溶性保护基而言，可举由酯系、酰胺系等选出的脂溶性保护基。例如，酯系保护基而言，可举甲酯、乙酯、三级丁酯等烷酯、苄酯等芳基烷酯等。
本发明的一实施方案中，利用由脂溶性保护基所产生的疏水性的差异，分离经导入脂溶性保护基的D-或L-氨基酸衍生物之观点而言，较佳为以与经变换为酶基质部位的氨基或羧基的疏水性变大的方式，选择作为酶基质部位的取代基及脂溶性保护基。作为本发明的一实施方案，使用氨基酰化酶作为水解酶时，水解后的氨基由氨基甲酸酯系的脂溶性保护基保护为优选，特别是Boc基、Fmoc基、Cbz基、Alloc基等为优选。
本发明的一实施方案中，使用脂溶性保护基时，利用由脂溶性的保护基的有无及/或个数所产生的疏水性的差异，可分离经导入脂溶性保护基的D-或L-氨基酸衍生物。例如，作为脂溶性保护基而使用Boc基时，对1个氨基导入1个保护基，则氨基成为-NHBoc基。此外，对1个氨基导入2个保护基，则氨基成为-N(Boc)2基，也可称为-N,N-diBoc基。在本发明的制造方法中分离的步骤而言，可在其中的任一状态下分离。此外，由水解所产生的基是羧基时也是同样，将游离的羧基直接分离的方法之外，也可将对构成羧基的1个氧原子，导入1个保护基而分离。此外，利用疏水性的差异，也可说是利用亲水性的差异。此外，本发明的一实施方案中，由导入脂溶性保护基，利用对萃取溶剂等溶剂的溶解度的差异，或者，使用管柱层析法等时，也可以称之为利用对管柱等固相的亲和性的差异。再者，根据分离方法，也可利用保护基的容积大小而分离。此外，也可利用主要根据保护基的有无所产生的化合物的电荷的差而分离。
本发明的一实施方案中，利用脂溶性保护基的有无及/或个数所产生的疏水性的差异，分离经导入脂溶性保护基的D-或L-氨基酸衍生物的方法而言，例如，可使用由萃取的方法，由硅凝胶管柱层析法的方法等。本发明的一实施方案中，由有效率地分离精制本发明的氨基酸的观点而言，使用硅凝胶管柱层析法为优选。由硅凝胶管柱层析法分离精制时，作为管柱而言，可使用将市售的硅凝胶装填于玻璃管而调制的管柱。用于管柱的硅凝胶，只要能根据脂溶性保护基的有无等而分离本发明的氨基酸衍生物则没有特别的限制，例如，可使用硅凝胶60(40至63μm)(默克(Merck)公司制)等。用于管柱的玻璃管，只要装填硅凝胶能分离氨基酸衍生物则没有特别的限制，例如，也可使用层析管(无滤嘴·付旋塞)(AS ONE公司制)等。作为展开溶剂而言，在硅凝胶管柱层析法中通常使用的溶剂即可，例如，可使用己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)、甲醇、乙腈等，或它们的混合溶剂等。本发明的一实施方案中，使用乙酸乙酯：己烷＝1：1至10的展开溶剂，含有1％甲酸的乙酸乙酯等为优选。本领域技术人员，依照本发明的记述，根据作为目的之氨基酸衍生物的构造等，可选择使用的展开溶剂。
本发明的一实施方案中，亦可获得在β位有硫醇基的氨基酸衍生物的D-型及L-型双方作为光学活性氨基酸衍生物。特别地，要得到在消旋蛋白质的合成等所用的D-型及L-型的氨基酸衍生物的观点而言，以获得D-型及L-型的双方作为光学活性氨基酸衍生物为优选。这时，各分别得到实质上同量的D-型及L-型的观点而言，作为原料化合物而使用消旋体氨基酸或甘氨酸为优选。
这时，例如，对包含D-型及L-型的中间体组合物，例如，可由使D-氨基酸选择性水解酶反应，随后实施将分离经水解的D-氨基酸衍生物的步骤同时，或者，在其前后，实施获得未经水解的L-氨基酸衍生物的步骤而可得。
相反地，对包含D-型及L-型的中间体组合物，例如，可由使L-氨基酸选择性水解酶反应，随后实施分离经水解的L-氨基酸衍生物的步骤同时，或者，在其前后，实施获得未经水解的D-氨基酸衍生物的步骤而可得。
其中，实施分离经水解的一方的氨基酸衍生物的步骤的同时要获得他方氨基酸衍生物的情况而言，可在硅凝胶管柱层析法中，实施获得各分开的部分。此外，分离经水解的一方氨基酸衍生物的步骤的前后要获得他方氨基酸衍生物时，可在萃取，再结晶等的方法中，分离一方的氨基酸衍生物之后，实施分离另一方的氨基酸衍生物。
本发明的一实施方案中，获得在β位有硫醇基的氨基酸衍生物的D-型及L-型双方要作为光学活性氨基酸衍生物的情况时，对于由D-或L-氨基酸选择性水解酶而未经水解的一方的氨基酸衍生物，亦可根据目的而水解。该水解是，亦可由对于包含有D-型或L-型的氨基酸衍生物组合物使D-或L-氨基酸选择性水解酶反应而实施。此外，经分离D-型及L-型的氨基酸衍生物之后，亦可由没有立体选择性的水解酶实施，此外，亦可不使用酶等，作为通常的化学反应而实施水解反应。
本发明的一实施方案中，作为D-型或L-型选择的酶，而使用氨基酰化酶的情况时，由步骤(I)所得的中间体，可以下述构造式表示。
Figure BDA0000853236850000241
此外，上述的化学式是没有区分α不对称碳原子及β不对称碳原子的立体异构物的存在而记述的。本发明的一实施方案中，以不区分这些不对称碳原子的立体异构物而可制造中间体的意思，可将中间体如此表示。实际上，由于存在α碳原子的光学异构及β碳原子的光学异构，亦可为由它们的组合而产生的4种的非镜像异构物以任意的比例含有者。
本发明的一实施方案中，作为包含D-型及L-型之有氨基酰化酶的基质部位的β-硫代氨基酸衍生物中间体组合物而言，可表示为以下的2化学式代表的包含D-型及L-型的组合物。以下的化学式中，左侧为L-型，右侧为D-型。
Figure BDA0000853236850000242
其中，R2-S表示在β碳原子导入的硫醇基。硫醇基可为未经保护的硫醇基，亦可为由保护基保护的硫醇基。硫醇基的保护基是如前所述。硫醇基的保护基的有无，以及，应该用的保护基，在本发明的制造法中，根据作为目的之化合物，可适当地决定。例如，从在本发明的制造方法中防止硫醇基进行反应的观点而言，硫醇基受保护为优选。此外，作为目的化合物，要得到具有经保护的硫醇基的D-或L-选择性氨基酸衍生物的情况时，硫醇基受保护为优选。
其中，X表示经保护或未经保护的羧基。羧基可为没有受保护的羧基，亦可为游离的酸构成盐。羧基的保护基是如上所述。羧基的保护及脱保护，以有机化学的通常的方法，根据目的而可适宜实施。例如，本发明的一实施方案中，在实施本发明的制造方法中从防止羧基的反应的观点而言，羧基受保护为优选。另一方面，本发明的一实施方案中，由要求作为氨基酰化酶的基质而需要迅速的反应的观点而言，由于考虑由羧基结合保护基而降低酶反应速度，在由酶的水解反应之前，亦期望经保护的羧基进行脱保护。
Acyl表示酰基。酰基也可以表示为R-CO-。R是氢原子，直链或分枝的烷基等，亦可由1或多数个的取代基取代。作为R的烷基，例如，可为碳数1至3，优选是可为碳数1至2的烷基。此外，R的取代基而言，不阻碍在本发明的制造方法的反应的话，可成为烷基的取代基的任何取代基都可以，例如，亦可为氯原子及氟原子等卤原子，羟基，经取代或未经取代的苯基等。R-CO-代表的酰基而言，例如，可举乙酰基、羟乙酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲酰基、丙酰基、苄酰基等。例如，本发明的一实施方案中，由氨基酰化酶的基质而有需要迅速的反应的观点而言，乙酰基、苄酰基等为优选。
R1是构成氨基酸的侧链的取代基中，表示在β碳原子结合的取代基部分(但，除氢原子的情况)。R1可以有官能基，官能基亦可受保护。官能基的保护及脱保护，也在本发明的制造方法中，可适宜实施。例如，氨基及羧基的保护及脱保护的同时，R1所含的官能基也可保护·脱保护，或，在其他的取代基的保护及脱保护之外，独立地，R1所含的官能基也可设有保护·脱保护的步骤。R1而言，例如是直链或分枝状的烷基、芳族取代基等，它们亦可取代。取代基而言，可为已知在氨基酸的侧链存在的取代基等，亦可为羟基、-CO-NH2基、羧基、氨基、-NH-C(NH2)2基、硫醇基、烷硫代等，它们的取代基可为游离的酸或碱，或它们的盐。此外，烷基，例如，可为碳数1至6，优选是可为碳数1至5的烷基，芳族取代基，苯基等芳基之外，可为吲哚基、咪唑基等杂芳基。
本发明的一实施方案中，由提供用于合成天然型蛋白质之可用于NCL结合部位的β-硫代氨基酸衍生物之观点而言，上述式中，前述取代基R1是由Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Trp、及Tyr所组成的组选出的氨基酸的β碳原子结合取代基部分(但，不是氢原子)为优选。此外，由同样的观点而言，前述取代基R2是硫醇基的保护基为优选，例如，可列举PMB(对甲氧基苄基)、Acm(乙酰氨基甲基)、苄基、Trt(三苯甲基)、二硫代、叔丁基等。此外，作为由水解酶的反应的基质的观点而言，在上述式中，Acyl是乙酰基，X是羧基为优选，羧基可为游离的酸也可为盐。
本发明的一实施方案中，本发明的β-硫代氨基酸衍生物，可由制造经由在β位有脱离基的氨基酸衍生物的方法有效率地制造。
本发明人，此外，作为本发明的一实施方案，为了能制造在β碳原子有取代基R1的β-硫代氨基酸衍生物，精心检讨的结果，发现作为一实施方案，而对在β位有作为取代基R1的芳族取代基的氨基酸的β-硫代氨基酸衍生物，利用光反应而在β位导入卤原子的方法，可有效率地制造在β位有脱离基L的氨基酸衍生物。
在β位有作为取代基R1的芳族取代基的氨基酸而言，以天然型而言，可列举苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸。此外，如是作为在β位有作为取代基R1的芳族取代基的氨基酸，亦可为非天然型。芳族取代基而言，可为芳基亦可为杂芳基，例如，可为苯基、萘基等芳基，咪唑基、吡咯基、噻唑基等杂芳基。
该方法的情况时，原料而言，在β位有作为取代基R1的芳族取代基的氨基酸可作为原料而实施。例如，天然型的实例而言，可以苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸为原料而实施。作为原料的这些芳族氨基酸，可使用市售品，或者，可以公知的方法调制。这些氨基酸是，根据入手的容易性及其他的事情，可使用成为α碳原子的D-型及L-型的混合物的氨基酸，或者，可使用实质上只有α碳原子的D-型或L-型的任一方所成的光学活性体。本发明的一实施方案中，作为原料，可使用α碳原子的D-型及L-型的等量混合物的氨基酸，在此情况下，可作为原料而使用消旋体氨基酸。作为原料而使用这些消旋体氨基酸时，反应直接以消旋体的状态进行，中间组合物也是成为消旋体而得，所以中间组合物的结晶化效率高，精制容易。此外，作为原料而使用光学活性体时，不实施控制α不对称碳原子的立体配置而不在意于产生消旋化而可进行反应。本发明的一实施方案中，由有效率进行中间组合物的精制的观点而言，原料化合物是使用结晶化效率高的消旋体氨基酸为优选。
由光反应导入卤原子的方法，可依照公知的方法而实施。一般而言，光的照射下，由使溶剂中的卤化剂反应而可实施。例如，在四氯化碳中，N-溴琥珀酰亚胺(NBS)作为溴化剂而使用200W灯的照射下反应一小时而实施。卤化剂而言，可使用N-溴琥珀酰亚胺等，在本发明的一实施方案中，以N-溴琥珀酰亚胺为优选。此外，反应时间，卤化反应能充分进行则没有特别的限制，可为30分钟至2小时，优选是1小时等。此外，由有效率进行光反应的观点而言，亦可将实验系以铝箔等覆盖。
亦即，该方法是于本发明的制造方法中，在前述步骤(I)中，作为反应(A)的导入硫醇基的反应之前，作为步骤(P)，实施“制造在β碳原子有取代基R1及脱离基L的氨基酸衍生物的步骤”的情况中的一实施方案。此外，特别地，取代基R1是芳族取代基时，可作为“对β碳原子有取代基R1的氨基酸衍生物，在β碳原子导入脱离基L的步骤”而实施，在本说明书中，为了方便可将此步骤称呼为(P-1)。这时，经导入的脱离基L，在作为反应(A)的硫醇基导入反应时，与脱离基L的脱离同时，进行硫醇基的导入。
此外，在步骤(I)中，(B)将羧基或氨基变换成为酶的基质的反应，根据该基质的反应性的程度等，作为上述步骤(P)，可在制造β位有脱离基L的氨基酸衍生物的步骤之前实施，或者，亦可在其步骤之后实施。成为酶反应的基质的构造，在其他的步骤中也有反应性高的构造的情况时，制造在β位有脱离基L的氨基酸衍生物，在β位导入硫醇基的反应间，由保护基保护，在之后，实施变换成为酶反应的基质的反应为优选。
本发明人，再进一步，作为本发明的一实施方案，为了要能制造不限定于芳族取代基的各种取代基R1的β-硫代氨基酸衍生物起见，精心检讨的结果，发现作为一实施方案，以甘氨酸作为原料，使用与以R1CHO代表的醛化合物反应的方法，可有效率地制造在β位有各种的构造的R1基，并且，在β位有作为脱离基L的羟基的氨基酸衍生物。依照这个方法，则使用相应于目的化合物的构造的醛，也能不限定于芳族氨基酸，可制造具有其他各种构造的各种氨基酸。
由甘氨酸与以R1CHO代表的醛化合物反应，甘氨酸的α碳原子，及构成R1CHO代表的醛化合物的醛基的碳原子之间产生共价键。因此，由此反应所产生的化合物中，构成醛基的碳原子就成为相当于氨基酸的β碳原子，生成在β碳原子有取代基R1、羟基、及氢原子的氨基酸衍生物。
因而，使用该方法，相对于β碳原子有2个氢原子的天然型或非天然型的氨基酸，可以制造、代替在β碳原子结合的氢原子1个而有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物。
例如，对天然型氨基酸在β位经导入经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的制造而言，作为在β碳原子有2个氢原子的氨基酸，而对由Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Trp、及Tyr所组成的组选出的氨基酸，可制造在β位经导入经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物。
此外，以上以天然型氨基酸为例而记述，但即使是非天然型的氨基酸，只要在β碳原子有2个氢原子的氨基酸，都可以同样制造。
将甘氨酸与醛反应的方法，例如，由该方法制造苯丙氨酸时，可实施由甘氨酸及苯甲醛在强碱条件下缩合的方法。作为溶剂而言，例如，可使用强碱水溶液，优选是可使用5NNaOH等。温度可自低温至室温程度下实施，优选是0至40℃，更优选是可为10至20℃程度。反应时间可为30分钟至3小时，优选是1小时。有关该方法，可参照例如，Nakagawa H等人,Chem.Pharm.Bull.2003,51,1363-1367的方法而实施。
在该方法中所用的以R1CHO代表的醛化合物，可依照作为目的之氨基酸衍生物的构造而决定。
如依照甘氨酸作为原料而制造在β位有羟基的氨基酸衍生物的方法，则作为原料的甘氨酸，由于α碳原子有2个氢原子结合的构造而不是不对称碳原子。以此甘氨酸作为原料，而实施上述反应，在β位有羟基的氨基酸衍生物，通常可成为消旋体而得到。
亦即，此方法可说是在本发明的制造方法中，在前述步骤(I)中，作为反应(A)的硫醇基的导入反应之前，作为步骤(P)，实施“制造在β碳原子有取代基R1及脱离基L的氨基酸衍生物的步骤”的情况中的一实施方案。此外，特别地，将甘氨酸与以R1CHO代表的醛化合物反应的步骤，本说明书中，为了方便可称为步骤(P-2)。
由该方法，可得在β位有羟基的氨基酸衍生物。在此β位有羟基的氨基酸衍生物，与已在前述的(P-1)的方法所得的化合物同样，由使β位的脱离基脱离而在β位导入硫醇基的反应，可变换为在β位有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物。此时，作为β位的脱离基而言，可将羟基直接作为脱离基，也可将羟基变换为更容易脱离的取代基之后脱离。亦即，亦可再含有将羟基变换为脱离基的步骤。例如，由羟基甲酰化，变成MsO基，可更容易脱离。这时，MsO成为脱离基。依此方式，将羟基变换为脱离基的步骤，可将羟基与甲酰氯、对甲基苯基磺酰氯(tosyl chloride)、三氟甲烷磺酸酐等反应的方法而实施。由它们的反应，MsO、TsO、TfO基各分别成为脱离基。
如此，即使以甘氨酸作为原料的方法，也可制造在β位有脱离基的氨基酸衍生物。
本发明的制造方法中，作为消旋体的芳族氨基酸或甘氨酸作为原料而实施时，在此导入硫醇基的步骤的原料化合物，可为α碳原子的D-型及L-型的等量混合物，也可说是消旋体氨基酸。此外，作为原料，而使用光学活性芳族氨基酸时，在β位导入硫醇基的步骤中，可以不控制立体异构而实施反应，考虑消旋化进行到某种程度，咸信在导入硫醇基的步骤的原料化合物为D体及L-型的混合物。
本发明的制造方法的一实施方案中，经由在β位有脱离基的氨基酸衍生物而实施时，在上述的反应之后，可实施在β位导入硫醇基的步骤。关于在β位导入硫醇基的步骤，如已在前面所述。
再者，以甘氨酸作为原料的方法的1例，如上述，将甘氨酸与醛化合物反应的方法之外，可使用将甘氨酸与酮化合物反应的方法。该方法是，对在β碳原子有1个氢原子结合，2个经取代或未经取代的烷基结合的氨基酸，有用于作为制造在氨基酸的β位经导入经保护或未经保护的硫醇基的方法。
例如，对天然型氨基酸在氨基酸的β位经导入经保护或未经保护的硫醇基衍生物的制造而言，作为在β碳原子有1个氢原子的氨基酸，而对由Val及Ile所组成的组选出的氨基酸，可制造在β位经导入经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物。
此外，以天然型氨基酸作为例而记述，但即使是非天然型的氨基酸，如在β碳原子有1个氢原子的氨基酸，则可同样地制造。
该甘氨酸与酮反应的方法，可比照例如，如已述的，甘氨酸与醛缩合的反应而实施。例如，将甘氨酸及丙酮在强碱条件下，在低温缩合等方法而可实施。
该方法中所用的酮化合物，可随作为目的之氨基酸衍生物的构造而决定。作为目的之氨基酸衍生物为在β碳原子有取代基R1之外之取代基R3的化合物时，使用R1-(C＝O)-R3代表的酮化合物而实施。其中，R1及R3是，表示经取代或未经取代的烷基。烷基而言，例如，可为甲基、乙基、丙基等碳数1至6的烷基等。取代基而言，可为在氨基酸侧链存在的各种取代基，它们亦可有保护。
由甘氨酸与R1-(C＝O)-R3代表的酮化合物反应，而在甘氨酸的α碳原子，与构成R1-(C＝O)-R3代表的酮化合物的酮基的碳原子之间产生双键，构成酮基的羰基氧则脱离。因此，由此反应所产生的化合物中，构成酮基的碳原子变成相当于氨基酸的β碳原子，而生成在β碳原子有取代基R1及取代基R3的氨基酸衍生物。对该反应中产生的α碳原子与β碳原子之间的双键，由在β碳原子加成经保护或未经保护的硫醇基，在α碳原子加成氢原子，而可在β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基。
这时在β碳原子加成硫醇基的反应，可依照公知的方法而实施。例如，将硫醇化合物在DMF等的有机溶剂中，可使用二氮杂双环十一烯(DBU)等碱实施求核反应的方法而实施。
将该方法，以制造天然型缬草氨酸的β位有硫醇基的氨基酸衍生物的作为例，可作为以下的化学反应式表示。
Figure BDA0000853236850000301
再者，也可制造在γ位有硫醇基的氨基酸衍生物作为在侧链有硫醇基的氨基酸。
作为以甘氨酸作为原料的方法的1例，对于甘氨酸，由使在α位有硫醇基的醛反应的方法，可制造在β位有羟基，在γ位有硫醇基的氨基酸衍生物。
该方法，以制造在天然型的苏氨酸(threonine)的γ位有硫醇基的氨基酸衍生物作为例，可表示为以下的化学反应式。
Figure BDA0000853236850000311
作为以甘氨酸作为原料的方法的1例，对于甘氨酸，由使在α位有硫醇基的酮反应的方法，可制造在β位有烷基，在γ位有硫醇基的氨基酸衍生物。
该方法，以制造在天然型的缬草氨酸的γ位有硫醇基的氨基酸衍生物作为例，可表示为以下的化学反应式。
Figure BDA0000853236850000312
如上述，应用使甘氨酸与醛化合物反应的方法，使甘氨酸与酮化合物反应的方法，可制造如上述的在γ位有硫醇基的氨基酸衍生物。
这些方法，有用于作为制造对在β碳原子有1个羟基结合的氨基酸，在氨基酸的γ位导入经保护或未经保护的硫醇基的方法。
本发明的方法所得的侧链有硫醇基的光学活性D-或L-氨基酸衍生物，根据目的，可直接作为氨基酸衍生物而用于各种的用途之外，可用于D-蛋白质或L-蛋白质的合成。特别地，可作为用于制造该等蛋白质之目的而在NCL作为结合部位而使用。特别地，可合适使用在β位有硫醇基的氨基酸衍生物，但在γ位有硫醇基的氨基酸衍生物也同样可合适使用。本发明的方法所得的氨基酸衍生物是，根据其目的、用途，也可对羧基，氨基，硫醇基，其他的侧链取代基等加以保护或脱保护而使用。例如，只将羧基或氨基的一方加以脱保护，而可用于肽的固相合成等。此外，本发明的方法所得之侧链有保护的硫醇基的氨基酸衍生物，以硫醇基由保护基经保护的状态直接实施肽合成，可实施NCL结合反应之点而有用。此外，在其NCL结合反应后，使用除去硫醇基部分的方法，则如依照以往方法时无法作为NCL结合部位的氨基酸，也可作为NCL结合部位，对D-或L-蛋白质合成中有用。
此外，在本说明书中所用的用语，用于说明特定的实施方案，而没有限定发明的意图。
此外，本说明书中所用的“包含”的用语，除开在文脉上明显应做不同的理解的情况，表示有所记述的事项(部材，步骤，要素，数字等)的存在的意图，并不排除其以外的事项(部材，步骤，要素，数字等)的存在。
如无不同的定义，这里所用的所有的用语(包括技术用语及科学用语。)，与本发明所属技术领域中具通常知识者所广受理解的意思相同。这里所用的用语，如无明示不同的定义以外，应解释为与本说明书及关连技术领域的意思有整合性的意思，不应被理想化，或，不应被过度解释成为形式上的意思。
第一的，第二等用语有被用于表现各种的要素的情况，这些要素可理解为不应被这些用语所限定。这些用语只是要将一个要素与其他的要素加以区别之目的而使用，例如，将第一要素作为第二要素而叙述，同样的，将第二要素作为第一要素而叙述，不脱离本发明的范围。
以下，以实施例将本发明更具体的说明，但是，本发明可以使用各种的形态而实现化，不应被解释为限定于这里所记述的实施例。
[实施例]
以芳族氨基酸作为起始原料，在β位有硫醇基的光学活性的芳族氨基酸衍生物的合成
如在以下的反应式所表示，以芳族氨基酸作为起始原料，实施在β位有硫醇基的D,L-苯丙氨酸的合成反应。在合成例中的化合物的名称之后所记述的化合物编号，表示下述的反应式所述的化合物编号。
Figure BDA0000853236850000331
(合成例1)D,L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(化合物6)
在氩气下，将D,L-苯丙氨酸(10.0g，60.5mmol)添加于甲醇(48.4mL)，将溶液冷却至0℃后，滴下亚磺酰氯(4.8ml，66.6mmol)。之后，在回流中搅拌1小时。将反应溶液减压浓缩后，使用甲醇5ml及二乙醚80mL的混合溶剂实施再结晶，得D,L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(化合物6)(11.8g)。
(合成例2)N,N-DiBoc-D,L-苯丙氨酸-甲酯(化合物7)
将化合物6(11.8g)悬浮于THF(292mL)后，冷却至0℃，添加溶解于水(164mL)的Na2CO3(7.0g，1.0eq.)。之后，滴下(Boc)2O(28.7g，2.0eq.)，在常温下搅拌2小时。由反应产生的化合物以乙酸乙酯萃取后，以饱和氯化铵水溶液、水、饱和食盐水清洗。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩而得，N-Boc-D,L-苯丙氨酸-甲酯的粗生成物。
再将此粗生成物溶解于乙腈(202mL)，作为触媒而添加4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(7.4g，1.0eq.)，随后添加(Boc)2O(39.6g，3.0eq.)，在室温下搅拌12小时。之后，减压浓缩，以乙酸乙酯萃取，以饱和氯化铵水溶液、水、饱和食盐水清洗。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。之后，以硅凝胶管柱层析法，使用乙酸乙酯：己烷＝1：3的展开溶剂，精制化合物7(19.8g)。、
(合成例3)N,N-DiBoc-β-溴-D,L-苯丙氨酸-甲酯(化合物8)
在氩气下，将化合物7(5.0g，13.2mmol)溶解于四氯化碳(264mL)，添加N-溴琥珀基亚酰胺(2.3g，1.0eq.)之后，回流下，在200W的白热电泡的光照射下，反应1小时。此外，由于强光，将实验系以铝箔覆盖。其次，反应后，放冷至室温，将琥珀基亚酰胺以过滤除去。再减压浓缩，而得化合物8(5.7g)。
C20H28BrNO6[M+Na]+：计算480.00实测480.16
1HNMR(400MHz)δ：7.55-7.24(m,5H),5.76(d,1H),5.74(d,1H),5.68(d,1H),5.61(d,1H),3.80(s,3H),3.59(s,3H),1.58(s,9H),1.38(s,9H)
(合成例4)N,N-DiBoc-β-甲氧基苄巯基-D,L-苯丙氨酸-甲酯(化合物9)
在化合物8(1.27g，2.78mmol)的DMF(7.9mL)溶液，在氩气，室温下滴下4-甲氧基-α-甲苯硫醇(1.5mL，12.5mmol)的DBU(1.9mL，9.7mmol)盐的DMF溶液(4mL)，反应3小时。之后，将反应生成的化合物以乙酸乙酯萃取，以饱和氯化铵水溶液、水、饱和食盐水清洗。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。以硅凝胶管柱层析法，使用乙酸乙酯：己烷＝1：7的展开溶剂，精制化合物9(1.0g)。
(合成例5)N-乙酰基-β-甲氧基苄巯基-D,L-苯丙氨酸-甲酯(化合物1)
将化合物9(2.4g，4.6mmol)溶解于DCM(46mL)，添加等量的TFA，在室温下反应5分钟后，减压浓缩，与甲苯共沸。之后，溶解于DCM(46mL)，添加吡啶(1.1ml，13.8mmol)，Ac2O(1.2ml，13.8mmol)，在室温下反应30分钟。反应后，添加少量的甲醇停止反应，减压浓缩，而得化合物1(1.1g)。
C18H21NO3S[M+H]+：计算332.12实测331.13
(合成例6)N-乙酰基-β-甲氧基苄巯基-D,L-苯丙氨酸(化合物3)
将化合物1(1.0g)溶解于THF(5.5mL)，在室温添加1N NaOH(5.5mL)，反应30分钟。随后将反应系以1N HCl成为pH2至3的酸性之后，以乙酸乙酯萃取3次。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。再将所得的粗成生物以乙酸乙酯再结晶，得化合物3(0.65g)。
1HNMR(400MHz)δ：7.40-7.22(m,5H),7.40-7.22(m,5H),7.12(d,2H),7.07(d,2H),6.82(d,2H),6.80(d,2H),4.96(d,1H),4.85(d,1H),4.23(d,1H),4.10(d,1H),3.77(s,3H),3.76(s,3H),3.54(q,2H),3.47(q,2H),1.96(s,3H),1.80(s,3H)
由在β位有硫醇基的D,L-氨基酸衍生物，制造光学活性氨基酸衍生物
如以下的反应式所表示，对于在β位有硫醇基的D,L-氨基酸衍生物使酶作用，实施在β位有硫醇基的光学活性氨基酸衍生物的合成反应。在合成例中的化合物的名称后所记述的化合物编号，表示下述的反应式所述的化合物编号。
Figure BDA0000853236850000351
(合成例7-1)N-Boc-β-甲氧基苄巯基-L-苯丙氨酸(化合物5)
将化合物3(100mg，0.28mmol)溶解于磷酸缓冲溶液(pH8.0，14mL)后，添加L-氨基酰化酶(源自Aspergillus种)(111mg，30U/mg；商品名酰酶“Amano”，天野酵素公司制)的磷酸盐缓冲溶液(pH8.0，14mL)，在37℃反应2日。之后，在室温下，在反应系添加Boc2O(3.0eq.)的THF(28mL)溶液，反应1小时，实施Boc化。随后将反应系以1N HCl成为pH2至3的酸性之后，以乙酸乙酯萃取3次。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。以硅凝胶管柱层析法，使用含有1％甲酸的乙酸乙酯的展开溶剂精制化合物5，以39％的单离收率得化合物5。
C22H27NO5S[M+Na]+：计算440.15实测440.18
此外，在合成例7中，将没有被L-氨基酰化酶分解的N-乙酰基-β-甲氧基苄巯基-D,L-苯丙氨酸，在合成例7中以硅凝胶管柱层析法精制时同样方式精制，以50％的收率得到(50mg)。这是成为使用D-氨基酰化酶的，N-Boc-β-甲氧基苄巯基-D-苯丙氨酸合成的原料。
(合成例7-2)N-Boc-β-甲氧基苄巯基-D-苯丙氨酸
此外，在上述合成例7中，除了L-氨基酰化酶改变为D-氨基酰化酶以外是以同样的方法实施合成，也合成N-Boc-β-甲氧基苄巯基-D-苯丙氨酸。
C22H27NO5S[M+Na]+：计算440.15实测440.18
由以上的合成例，以芳族氨基酸作为原料，在β位导入经保护的硫醇基，各分别使用L-型选择性的氨基酰化酶，以及，D-选择性的氨基酰化酶，各分别简易且以高收率得到在β位有受保护的硫醇基的L-氨基酸，以及，在β位有受保护的硫醇基的D-氨基酸。如依照以往的方法则以L-氨基酸作为原料在抑制α位的立体的异构化下，或每次都分离异构化的D-型，因此不只是提高收率很难，工业生产也不容易。与此相比，如依照本发明则将D,L混合氨基酸作为原料或中间体而不需要前述的注意。此外，D,L混合氨基酸是结晶化效率高，精制也简便，所以可实现步骤的大幅的缩短。本发明技术是可利用于NCL的在β位有硫醇基的非天然型氨基酸的可工业生产的实用化的方法。
如以下的反应式所表示，实施以芳族氨基酸作为起始原料，在β位有硫醇基的D,L-酪氨酸的合成反应。在合成例中的化合物的名称的后所记述的化合物编号，表示下述的反应式所述的化合物编号。
在β位有硫醇的酪氨酸衍生物合成路径
Figure BDA0000853236850000361
(合成例8)D,L-酪氨酸甲酯盐酸盐(化合物10)
在氩气下，将D,L-酪氨酸(10.0g，55.1mmol)添加于甲醇(88mL)，将溶液冷却至0℃后，滴下亚磺酰氯(3.97ml，60.6mmol)。之后，在回流下搅拌一小时。将反应溶液减压浓缩之后，使用甲醇5mL及二乙醚80mL的混合溶剂进行再结晶，得化合物10(10.8g)。
(合成例9)N,N-DiBoc-O-Boc-D,L-酪氨酸-甲酯(化合物11)
将化合物10(10.8g)悬浮于THF(184mL)之后，冷却至0℃，添加溶解于水(92mL)的Na2CO3(5.9g，1.0eq)。之后，滴下(Boc)2O(24g，2.0eq.)，在常温下搅拌2小时。以乙酸乙酯萃取后，以饱和氯化铵水溶液、水、饱和食盐水清洗。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩而得N-Boc-D,L-酪氨酸-甲酯的粗生成物。再将此生成物溶解于乙腈(184mL)，添加DMAP(6.7g，1.0eq.)，随后添加(Boc)2O(36.2g，3.0eq.)，搅拌12小时。之后，减压浓缩，以乙酸乙酯萃取，以饱和氯化铵水溶液、水、饱和食盐水清洗。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。以硅凝胶管柱层析法，使用乙酸乙酯：己烷＝1：3的展开溶剂，精制化合物11(22.9g)。
1HNMR(400MHz)δ：7.28-7.04(m,5H),5.15(dd,1H),3.43(dd,1H),3.20(dd,1H),1.55(s,9H),1.40(s,18H)
(合成例10)N,N-DiBoc-β-溴-O-Boc-D,L-酪氨酸-甲酯(化合物12)
在氩气下，将化合物11(6.0g，12mmol)溶解于四氯化碳(120mL)，添加N-溴琥珀基亚酰胺(2.1g，1.0eq.)之后，在回流下，在200W的白热电泡光照射下，反应一小时。这时，由于强光，将实验系以铝箔覆盖。反应后，放冷至室温，将琥珀基亚酰胺以过滤除去。再减压浓缩而得化合物12(6.6g)。
(合成例11)N,N-DiBoc-β-甲氧基苄巯基-O-Boc-D,L-酪氨酸-甲酯(13)
在化合物12(2.9g，5.1mmol)的DMF(23mL)溶液在氩气下、室温下滴下4-甲氧基-α-甲苯硫醇(1.4mL，10.2mmol)的DBU(1.5mL，10.2mmol)盐的DMF溶液(11.5mL)反应3小时。之后，以乙酸乙酯萃取，以饱和氯化铵水溶液、水、饱和食盐水清洗。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。以硅凝胶管柱层析法，使用乙酸乙酯：己烷＝1：7的展开溶剂，精制化合物13(1.2g)。
(合成例12)N-乙酰基-β-甲氧基苄巯基-D,L-酪氨酸-甲酯(化合物14)
将化合物13(1.3g，2.1mmol)溶解于DCM(21mL)，添加等量的TFA，在室温下反应5分钟后，减压浓缩，与甲苯共沸。之后，溶解于DCM(21mL)，添加吡啶(0.8ml，10.5mmol)，Ac2O(0.9ml，10.5mmol)，在室温下反应30分钟。反应后，添加少量的甲醇而停止反应，以减压浓缩，作为粗成生物得到化合物14(441mg)。
C18H22NO4S[M+H]+：计算348.12，实测348.17
(合成例13)N-乙酰基-β-甲氧基苄巯基-D,L-酪氨酸(化合物15)
将粗成生物14(441mg)溶解于THF(10.5mL)，在室温下添加1N NaOH(10.5mL)，反应30分钟。随后将反应以1N HCl成为pH2至3的酸性之后，以乙酸乙酯萃取3次。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。以硅凝胶管柱层析法，使用含有1％甲酸的乙酸乙酯：己烷＝1：2的展开溶剂，精制化合物15(301mg)。
(合成例14-1)N-Boc-β-甲氧基苄巯基-L-酪氨酸(化合物17)
将化合物15(72mg，0.19mmol)溶解于磷酸缓冲溶液(pH8.0，9mL)后，添加L-氨基酰化酶(源自Aspergillus种)(111mg，30U/mg；商品名酰酶“Amano”，天野酵素公司制)的磷酸缓冲溶液(pH8.0，10mL)，在37℃反应2日间。之后，在室温下，在反应系添加Boc2O(124mg，3.0eq.)的THF(19mL)溶液，反应一小时实施Boc化。随后将反应系以1N HCl成为pH2至3的酸性之后，以乙酸乙酯萃取3次。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。以硅凝胶管柱层析法，使用含有1％甲酸乙酸乙酯：己烷＝4：1的展开溶剂，得29mg的化合物17。
(合成例14-2)N-Boc-β-甲氧基苄巯基-D-酪氨酸
此外，在上述合成例14-1中，除了L-氨基酰化酶改换为D-氨基酰化酶以外以同样的方法实施合成，也合成N-Boc-β-甲氧基苄巯基-D-酪氨酸。
C22H27NO5S[M+Na]+：计算440.15实测440.18
由以上的合成例，以芳族氨基酸作为原料，在β位导入经保护的硫醇基，使用L-型选择性氨基酰化酶，在β位有经保护的硫醇基的L-酪氨酸衍生物，以及，在β位有经保护的硫醇基的D-氨基酸，各分别简易且以高收率得到。
以甘氨酸作为起始原料的，在β位有硫醇基的各种光学活性氨基酸衍生物的制造
如在以下的反应式所表示，以甘氨酸作为起始原料而实施合成反应。在合成例中的化合物的名称后所记述的化合物编号，表示下述的反应式所述的化合物编号。
Figure BDA0000853236850000381
(合成例15)β-羟基-D,L-苯丙氨酸(化合物18)
将甘氨酸(7.0g)溶解于5N NaOH(63.7mL)，在0℃冷却下，将苯甲醛(9.24mL)每隔10分钟分3次加入。之后，在室温下反应1小时。随后使用5N HCl(93.2mL)成为pH2至3的酸性之后，在60℃减压浓缩。在所得的粗生成物，在室温下，添加甲醇(120mL)。将不溶于甲醇的盐(氯化钠)过滤，将溶液减压浓缩。之后，再度溶解于甲醇(100mL)，以三乙胺将pH成为6至7而再结晶，得化合物18(7.0g)。
C9H11NO3[M+H]+：计算182.07实测182.20
(合成例16)N-乙酰基-β羟基-D,L-苯丙氨酸(化合物19)
将β-羟基-D,L-苯丙氨酸(3.0g)溶解于5N氢氧化钠水溶液(10ml)，将乙酸酐(1.0eq)以及，5N氢氧化钠水溶液(2mL)每隔15分钟分3次添加。然后最后以5N的HCl成为pH2至3的酸性之后，以乙酸乙酯萃取3次。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得化合物19(1.0g)。
C11H13NO4[M+H]+：计算224.08实测224.20
(合成例17)N-乙酰基-β-O-甲酰基-D,L-苯丙氨酸(化合物2)
将以合成例16的方法所得的化合物19(15.0mg)在氩气下，溶解于乙腈(350μL)，添加三乙胺(14.6μL)及甲基磺酰氯(mecyl chloride)(6.5μL)，在常温下反应2小时。将反应所生成的化合物以乙酸乙酯萃取后，以饱和氯化铵水溶液、水、饱和食盐水清洗。将有机层以硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得化合物2。这里，以质量分析确认所得的化合物是在β位的羟基有甲磺酰化(mesylated)的化合物2。
C12H15NO6S[M+Na]+：计算324.05实测324.1
(合成例18)N-乙酰基-β-甲氧基苄巯基-D,L-苯丙氨酸(化合物3)
以与合成例11同样的方法，在化合物2的DMF溶液，在氩气，室温下滴下4-甲氧基-α-甲苯硫醇的DBU盐的DMF溶液，反应3小时，以同样方法实施萃取，清洗等，得化合物3。
由以上的合成例，以甘氨酸为原料，合成β-羟基-氨基酸衍生物，代替在β位的羟基，由在β位导入经保护的硫醇基，而可得在β位经保护的硫醇基的D,L-氨基酸衍生物。本领域技术人员，参照本说明书所述的方法，由此方法，不限于芳族氨基酸，应可合成在β位有经保护的硫醇基的各种构造的D,L-氨基酸衍生物。随后对所得的D,L-氨基酸衍生物，以与合成例7同样的方法，可以简易的方法以更高收率获得在β位有经保护的硫醇基的各种构造的光学活性氨基酸衍生物。
β位有硫醇基的D-氨基酸衍生物的制造
如在以下的反应式所表示，使用D-氨基酰化酶实施在β位有硫醇基的D-氨基酸衍生物的合成反应。在合成例中的化合物的名称后所记述的化合物编号，表示下述的反应式所述的化合物编号。
在β位有硫醇基的D-氨基酸衍生物合成路径
Figure BDA0000853236850000401
(合成例19)β-甲氧基苄巯基-D-苯丙氨酸(20)
将化合物3(1mg，28μmol)溶解于磷酸缓冲溶液(pH8.0，140μL)后，添加另外调制的D-氨基酰化酶(源自大肠菌)(1mg，250U/mg；商品名D-氨基酰化酶“Amano”，天野酵素公司制)磷酸缓冲溶液(pH8.0，140μL)，在37℃反应2周。以HPLC实施分析，确认有α位氨基没有受保护的化合物20的生成。这里，HPLC是使用Cadenza C-18(75×4.6mm)管柱，以溶出条件0.1％TFA水溶液：90％乙腈水溶液(含有0.1％TFA)＝80：20→30：70(15分)，流速1mL/min实施。
C17H19NO3S[M+H]+：计算318.11实测318.73
此合成例19中，在酶反应终了后，也可与(合成例7-1)同样实施N-Boc化之后精制。
(合成例20)β-甲氧基苄巯基-D-酪氨酸(21)
将化合物15(1mg，27μmol)溶解于磷酸缓冲溶液(pH8.0，170μL)后，添加另外调制的D-氨基酰化酶(源自大肠菌)(1mg，250U/mg；商品名D-氨基酰化酶“Amano”，天野酵素公司制)的磷酸缓冲溶液(pH8.0，100μL)，在37℃反应3日。实施以HPLC的分析，确认有α位氨基未受保护的化合物21的生成。这里，HPLC是使用Cadenza C-18(75×4.6mm)管柱，以溶出条件0.1％TFA水溶液：90％乙腈水溶液(含有0.1％TFA)＝80：20→0：100(15分)，流速1mL/min实施。
C17H19NO4S[M+H]+：计算334.10实测334.66
在此合成例20中，也可在酶反应终了后与(合成例7-1)同样实施N-Boc化之后精制。
由以上的合成例，由在β位有经保护的硫醇基的D,L-氨基酸衍生物，可以高收率简易的方法得到D-型。即，依照以往的D-型或L-型的氨基酸作为原料的制造方法，则为避免发生α不对称碳原子的立体异构化，而不能使用加热条件，及强碱性或强酸性条件的反应，依照本发明的制造方法，则可以使用这些激烈的条件，反应效率优异，更简便的制造步骤。本领域技术人员，参照本说明书所述的方法，依照本发明的制造方法，不仅是L-氨基酸，D-氨基酸也可以有效率的合成。此外，作为起始化合物，如在合成例7所述，回收没有被L-型选择性水解酶水解的D,L-氨基酸衍生物而同样作为起始化合物，与D-型选择性水解酶反应，则将D-氨基酸及L-氨基酸作为D,L-氨基酸衍生物而同时合成之后，可有效率地同时获得D-型及L-型。此外，相反地，先与D-型选择性水解酶反应时也同样。这样做，可以稳定地供给在生物体内存在的L-蛋白质之外的、近年需求增多的D-蛋白质及消旋蛋白质的原料，对于这些蛋白质的工业化生产而言是有用的。
此外，在本实施例中作为β硫代消旋氨基酸的原料而显示使用芳族氨基酸或甘氨酸的实例，但并不是否定本发明的制造方法中其他的氨基酸衍生物作为起始原料的意图。本领域技术人员根据本案所述的方法，可以各种氨基酸衍生物作为起始原料而实施本发明。

Claims (10)

1.D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，该D-或L-非天然型氨基酸衍生物在β碳原子处有经保护或未经保护的硫醇基和取代基R1，其中，R1是指构成氨基酸的侧链的取代基中，结合在β碳原子的取代基部分，但排除氢原子的情况，R1是直链或分枝状的烷基，其不具有取代基，或被羟基、-CO-NH2基、羧基、氨基、-NH-C(NH2)2基、硫醇基、烷硫基取代，该制造方法包含下列步骤，
(I)对氨基酸衍生物实施下述反应(P)、(A)和(B)，制造包含D-型及L-型的在β碳原子处有经保护或未经保护的硫醇基的氨基酸衍生物的步骤：
(P)制造在β碳原子有取代基R1及脱离基L的氨基酸衍生物的步骤，其中前述步骤(P)包含下述步骤(P-2)：
(P-2)使甘氨酸与以R1CHO代表的醛化合物反应的步骤；
(A)在该氨基酸衍生物的β碳原子导入经保护或未经保护的硫醇基的反应，其中前述反应(A)是与使前述脱离基L脱离氨基酸衍生物的β碳原子的反应同时进行，及
(B)将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，变换为要成为D-或L-氨基酸选择性水解酶的基质的取代基的反应，
以及，
(II)对于(I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸选择性水解酶中的任一方反应，随后分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中
前述步骤(B)是：(B)将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基，变换为酰基氨基的反应，
在前述步骤(II)中的D-或L-氨基酸选择性水解酶是D-或L-氨基酰化酶。
3.如权利要求1所述的制造方法，其中
在前述步骤(II)中，分离经水解的D-或L-氨基酸衍生物的步骤包含：
向经水解的D-或L-氨基酸衍生物导入脂溶性保护基的步骤，
利用由于脂溶性保护基的有无所产生的疏水性的差异，而分离经导入脂溶性保护基的D-或L-氨基酸衍生物的步骤。
4.如权利要求1所述的制造方法，其为D-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，其中，
前述步骤(II)中，使用D-氨基酸选择性水解酶，随后分离经水解的D-氨基酸衍生物。
5.如权利要求1所述的制造方法，其为L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，其中，
前述步骤(II)中，使用L-氨基酸选择性水解酶，随后分离经水解的L-氨基酸衍生物。
6.如权利要求1所述的制造方法，其中
前述步骤(A)中导入的硫醇基是由从PMB(对甲氧基苄基)、Acm(乙酰氨基甲基)、苄基、Trt(三苯甲基)、二硫化物基、叔丁基选出的保护基所保护的硫醇基。
7.如权利要求1所述的制造方法，其中，
前述步骤(II)包括对于(I)所得的氨基酸衍生物，使D-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经水解的D-氨基酸衍生物的步骤，
并且所述制备方法还包括(III)水解在(II)未经水解的L-氨基酸衍生物，随后获得经水解的L-氨基酸衍生物的步骤。
8.如权利要求1所述的制造方法，其中，
前述步骤(II)包括对于(I)所得的氨基酸衍生物，使L-氨基酸选择性水解酶反应，随后分离经水解的L-氨基酸衍生物的步骤，
并且所述制备方法还包括(III)水解在(II)未经水解的D-氨基酸衍生物，随后获得经水解的D-氨基酸衍生物的步骤。
9.如权利要求1所述的制造方法，其中
前述步骤(B)是：(B)将结合在该氨基酸衍生物的α碳原子的氨基变换为酰氨基的反应，
步骤(II)中所述的“(I)所得的氨基酸衍生物”是包含以下述式所代表的关于α碳原子的D-型及L-型的组合物
Figure FDA0002777602290000031
其中，R2代表氢原子或硫醇基的保护基，X代表经保护或未经保护的羧基，Acyl表示酰基，R1表示构成氨基酸的侧链的取代基中，结合在β碳原子的取代基部分，但排除氢原子的情况，R1是直链或分枝状的烷基，其不具有取代基，或被羟基、-CO-NH2基、羧基、氨基、-NH-C(NH2)2基、硫醇基、烷硫基取代，
在前述步骤(II)中，D-或L-氨基酸选择性水解酶是D-或L-氨基酰化酶。
10.如权利要求1-9中任一项所述的制造方法，其中，使用含有关于α碳原子的D-型及L-型的氨基酸衍生物，或α碳原子不是不对称碳原子的氨基酸衍生物作为原料。
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