DE60211646T2

DE60211646T2 - Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Azabicycloheptanone-Derivaten

Info

Publication number: DE60211646T2
Application number: DE2002611646
Authority: DE
Inventors: Rohini Ramesh Pune 411 008 Joshi; Asmita Ashutosh Pune 411 008 Prabhune; Ramesh Anna Pune 411 008 Joshi; Mukund Keshav Pune 411 008 Gurjar
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2002-03-28
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2022-03-29
Also published as: DE60211646D1; EP1348765A1; EP1348765B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Azabicycloheptanonderivats der allgemeinen Formel III,
worin R₁ = H, X = CH₂, Y-Z = -CH=CH-, aus einem racemischen γ-Lactam der Formel I
worin R₁ = H, COR₂ (R₂ = C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Aryl oder Aryloxy)
X = O, CHR₃ (R₃ = F, OH, Br oder H)
Y-Z = -CH=CH-, CH₂-CH₂,
Optisch aktive Azabicycloheptanonderivate der allgemeinen Formel III, worin R₁ = H, X = CH₂, Y-Z = CH=CH₂, sind als Zwischenprodukte bei der Synthese von antiviralen Mitteln geeignet.
Hintergrund der Erfindung
Carbocyclische Analoga von Purinen sind bekannt als antivirale und antineoplastische Mittel. So z.B. ist von der Verbindung der Formel Π bekannt, daß sie eine starke Aktivität gegen das menschliche Immunschwäche-Virus (HIV) und das Hepatitis B-Virus (HBV) besitzt ( EP 0434450 ).
R₅ = Cyclopropylamino, =N-Cyclopropyl oder N-Methylamin.
Aus dem Stand der Technik ist die Herstellung von 9-substituiert-2-Aminopurinen ausgehend von einer Pyrimidinverbindung durch Kupplung mit enantiomerisch reinen Zucker/carbocyclischen analogen Resten und Zyklisierung unter Bildung des Imidazolringes unter nachfolgender Einführung eines geeigneten 6-Substituenten bekannt (WO 95/21161). Carbovir und bekannte Analoga werden aus dem bekannten γ-Lactam (Vince lactam) 2-Azabicyclo[2,2,1]hept-5-en-3-on (Formel I), worin X = -CH₂, -Y-Z- = -CH=CH- und R₁ = H, hergestellt.
Der Stand der Technik gibt an, daß das Endprodukt oder ein Zwischenprodukt oder der Ausgangsstoff mit bekannten Methoden gespalten werden können oder das racemische Gemisch des Produktes enzymatisch in eine chiral reine Verbindung umgewandelt werden kann. Das γ-Lactam kann durch Umsetzung von Cyclopentadien mit Tosylcyanid hergestellt werden (Vince J. Org. Chem. 1978, 43, 2311).
Es gibt mehrere Synthesewege, um die chemische Aufspaltung in das Enantiomer durchzuführen, aber die enzymatische Aufspaltung des γ-Lactams erwies sich als das wirtschaftlichste großtechnische Verfahren. Der Einsatz von γ-Lactamase beruht auf der enantiokomplementären Bioumwandlung. Die enzymatische Aufspaltung des bicyclischen Lactams unter Verwendung der Ganzzellkulturen ENZA1 und ENZA2 ergab beide optische Formen des Lactams (S. V. Teylor, J. C. S. Chem. Comm., 1121, 1190, Tet. Assy., 4,1117-1128). Das Verfahren wird im einzelnen in der Patentschrift EP 0424064 beschrieben. Das racemische Lactam wurde mit zellfreiem Extrakt von ENZA-1/2 bei 30°C unter Schütteln während 14 Tagen behandelt. Das rohe (+)/(–) Lactam wurde durch Extraktion mit Dichlormethan, das durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt worden war, isoliert. Das erhaltene (+) Lactam wies 88% ee auf und das (–) Lactam 98% ee.
Die enzymatische Aufspaltung des N-acylbicyclischen Lactams unter Verwendung von Acylase wird in der Patentschrift WO 00/03032 beschrieben, wobei eine Ausbeute von 31% mit 98% ee erzielt wurde. Die Umwandlung des optisch aktiven N-Acetyl-Lactams in (+)/(–) Lactam ist zeitraubend.
Taylor, S. J. C. et al. („Novel Screening Methods – The Key to Cloning Commercially Successful Biocatalysts" Bioorg. & Medic. Chem. 7 (1999) 2163–2168) beschreiben die mit der biokatalytischen Aufspaltung des 2-Aza-bicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-ons unter Verwendung von Pseudomonas cepaecia verbundenen Schwierigkeiten und schlagen als Alternative Comamonas acidovorans vor.
Die WO 99/10519 betrifft die enantiomere Aufspaltung von N-geschütztem (±)2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on unter Verwendung von Acylaseenzymen, insbesondere von Enzymen aus Bacillus sp.
Nakano, H. et al. („Lipase-Catalyzed Resolution of 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-ones", Tetrahedron Asymmetry 7 (1996) 2381–2386) berichten über die Lipase katalysierte enantioselektive Umesterung bzw. Hydrolyse von N-Hydroxymethyl-2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on zu chiralen 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-onen.
Mahmoudian et al. („A Practical Enzymatic Prodecure for the Resolution of N-substituted 2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-one", Tetrahedron Asymmetry 10 (1999) 1201–1206) beziehen sich auf bereits bekannte Techniken zur Aufspaltung von racemischem 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on unter Verwendung von γ-Lactamase aus Mikroorganismen wie Pseudomonas solanacearum und Rhodoccoccus sp., und berichten über das Screening verschiedener Esterasen, Lipasen und Proteasen aus Mikroorganismen und Säugern im Hinblick auf die Fähigkeit, die Lactambindung von (±)2-tert.-Butyl 3-oxo-2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2-carboxylat zu hydrolisieren.
Die bekannten Verfahren im Hinblick auf das Cyclopentanfragment von carbocyclischen Nucleosiden ausgehend von Nichtkohlenwasserstoffsynthonen oder leicht zugänglichen Mesoverbindungen umfassen im Allgemeinen eine Reihe von Stufen, sind schwer durchzuführen und ergeben nur geringe Ausbeuten, was die Herstellung in großtechnischem Umfang schwierig und unwirtschaftlich macht.
Aufgaben der Erfindung
Die Hauptaufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines optisch aktiven Azabicycloheptanonderivats unter Umgehung der Nachteile des Standes der Technik und unter Verwendung eines billigeren und leicht zugänglichen Enzyms aus Ganzzellen von Mikroben.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von (–)2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-ene-3-on der Formel (III), das wirtschaftlich und wirksam ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Herstellung von optisch aktiven Azabicycloheptanonderivaten unter Verwendung von Lactamasen, die mit dem racemischen γ-Lactam der Formel I unter Bildung eines Einzelenantiomers des Lactams (III) und der entsprechenden ringgeöffneten Verbindung der Formel IV in einer enanteomerisch reinen Form reagieren.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Azabicycloheptanonderivats der allgemeinen Formel III, worin R₁ = H, X = CH₂, Y-Z = -CH=CH
bereit, das die Kontaktierung von (±) 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on der Formel (I)
worin R¹ = H, COR² (R² = C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Aryl oder Aryloxy)
X = O, CHR₃ (R₃ = F, OH, Br oder H)
Y-Z = -CH=CH-, CH₂-CH₂,
mit einer ganzen Zelle von Kluyvera Citrophila (ATCC Nr. 21285) oder einem Zellextrakt,
oder mit einem aus Kluyvera Citrophila (ATCC Nr. 21285) extrahierten Lactamaseenzym in einem einen Puffer enthaltenden organischen Lösungsmittel,
das Extrahieren des Gemisches mit einem organischen Lösungsmittel,
das Abtrennen der organischen Schicht und
das Entfernen des Lösungsmittels zwecks Erhalts des Produktes umfaßt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird der verwendete Puffer ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphatpuffer (0,05 M–0,1 M, 6–8 pH), einem Citratpuffer (0,05 M–0,1 M, 6–7,5 pH) und einem Tris-Puffer (0,05 M–0,2 M, 7–8 pH).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete Puffer Phosphatpuffer (0,2 M, 7,4 pH).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das zusammen mit dem Puffer verwendete organische Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkoholen, Alkylacetaten, Ketonen und Sulfoxiden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das organische Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Butanol, Ethylacetat, Aceton, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das organische Lösungsmittel Aceton.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegt der Prozentgehalt des für die Reaktion zusammen mit dem Puffer verwendeten organischen Lösungsmittels im Bereich zwischen 5% und 50% (V/V).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung beträgt der Prozentgehalt des für die Reaktion zusammen mit dem Puffer verwendeten organischen Lösungsmittels 10% (V/V).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das für die Extraktion verwendete Lösungsmittel ein chloriertes Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chloroform, Ethylendichlorid, Methylendichlorid und einem Alkylacetat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das für die Extraktion verwendete Alkylacetat Ethylacetat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das für die Extraktion verwendete Lösungsmittel Methylendichlorid.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kontaktierung der Verbindung der Formel I mit dem Enzym oder der (ganzen) Zelle bei einer Temperatur im Bereich zwischen 25 und 30°C.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kontaktierung der Verbindung der Formel I mit dem Enzym oder der (ganzen) Zelle während einer Zeitdauer im Bereich von 10 bis 24 Stunden.
Gemäß einem Merkmal der Erfindung betragen die chemische Ausbeute an (–)2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-ene-3-on 39% und die optische Reinheit 98%.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren ist hochwirksam und maximiert die Kostenwirksamkeit durch rasche Aufspaltung unter Gewinnung des (–) Lactamenantiomers, eines wichtigen Ausgangsstoffes für die Herstellung des Anti-HIV-Mittels (–) Carbovir und von Abacavir.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben, die lediglich illustrierenden Charakter haben und den Umfang der vorliegenden Erfindung keinerlei einschränken sollen.
Beispiel 1
Das vorliegende Beispiel beschreibt das allgemeine Verfahren zur Herstellung der Zellbiomasse.
Das (Ganzzell)/Enzym-Präinokulat (5–10 ml) wurde durch Züchten der Mikroorganismen in einem Medium hergestellt, das Hefeextrakt (0,5%), Pepton (1%), Natriumchlorid (0,2%), Natriumglutamat (0,5%) und Phenylessigsäure (15 mM) bei pH 7,2–7,3 enthielt, während 24 Stunden unter Schütteln bei 150 U/min. Das Ganze wurde dann in einen 1 l-Kolben überführt, der 300 ml des obigen Wachstumsmediums enthielt, und bei 28–30°C während 24 Stunden an einer Umlaufschüttelmaschine (150 U/min) inkubiert. Die gezüchteten Zellen wurden abzentrifugiert und mit Phosphatpuffer bei einem pH von 6,8 gewaschen. Die erhaltene Biomasse wurde dann für die Umsetzung verwendet.
Beispiel 2
Allgemeines Verfahren zur enantioselektiven Hydrolyse von (±)-2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on (Vince's Lactam) (1)
0,1 g (0,00092 Molteile) (±)-2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on (1) wurden in Phosphatpuffer (5 Teile) suspendiert, wonach 50 mg der feuchten Zellmasse der Kultur (ATCC No.21285) zugesetzt wurden, wonach man 72 Stunden lang rührte. Die Zellmasse wurde dann durch Celite abfiltriert und das Filtrat mit Dichlormethan (5 × 10 Teile) extrahiert. Durch Einengung des Lösungsmittels erhielt man die optisch aktive Verbindung III bei einer Ausbeute von 31,8% und 58,2% ee.
Beispiel 3
Allgemeines Verfahren zur enantioselektiven Hydrolyse von (±)-2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on unter Verwendung der Zellmasse aus der Kultur (ATCC No.21285)
0,1 g (0,00092 Molteile) (±) wurden in Phosphatpuffer (5 Teile) suspendiert, wonach eine andere Menge an Zellmasse (wie in Tabelle 1 angegeben) zugesetzt wurde. Anschließend wurde während 24 Stunden gerührt. Die Zellmasse wurde dann durch Celite abfiltriert und das Filtrat mit Dichlormethan (5 × 10 Teile) extrahiert. Durch Einengung des Lösungsmittels erhielt man die optisch aktive Verbindung III. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Beispiel 4
Allgemeines Verfahren zur enantioselektiven Hydrolyse von (±)-2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on unter Verwendung der Zellmasse aus der Kultur (ATCC No.21285)
0,2 g (0,00184 Molteile) (±) wurden in Phosphatpuffer (10 Teile) und in einem organischen Lösungsmittel (wie in Tabelle 2 angegeben) suspendiert. Dann wurden 0,1 g feuchte Zellmasse zugesetzt, wonach man 24 Stunden rührte. Die Zellmasse wurde dann durch Celite abfiltriert und das Filtrat mit Dichlormethan (5 × 10 Teile) extrahiert. Durch Einengung des Lösungsmittels erhielt man die optisch aktive Verbindung III. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
Das Verhältnis von Phosphatpuffer (0,2 M, pH 7,4) zum organischen Lösungsmittel betrug 9:1.
Beispiel 5
Allgemeines Verfahren zur enantioselektiven Hydrolyse von (±)-2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on unter Verwendung der Zellmasse aus der Kultur (ATCC No.21285)
0,2 g (0,00184 Molteile) (±) wurden in Phosphatpuffer (10 Teile) und Aceton (wie in Tabelle 2 angegeben) suspendiert. Die Zellmasse wurde dann durch Celite abfiltriert und das Filtrat mit Dichlormethan (5 × 10 Teile) extrahiert. Durch Einengung des Lösungsmittels erhielt man die optisch aktive Verbindung III. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3
Beispiel 6
Allgemeines Verfahren zur enantioselektiven Hydrolyse von (±)-2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on unter Verwendung der Zellmasse aus der Kultur (ATCC No.21285)
0,10 g (0,918 Molteile) (±) wurden in einem Gemisch von 475 Teilen Phosphatpuffer und 25 Teilen Aceton in einem Liter-Kolben suspendiert. Anschließend wurden 5 Gew. Teile der feuchten Zellmasse zugesetzt, wonach das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur (28°C +/– 1) gerührt wurde. Nach Abschluß der Umsetzung (überwacht durch chirale HPLC) wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert, um die Zellmasse zu entfernen. Der flüssige Überstand wurde dann unter Verwendung einer kontinuierlich arbeitenden Extraktionsvorrichtung mit Dichlormethan extrahiert. Nach Abdampfen des Lösungsmittel unter vermindertem Druck erhielt man 3,93 g Endprodukt. Die Kristallisation mit Hilfe eines Gemisches aus Dichlormethan und Ether ergab ein Endprodukt mit einer optischen Dichte von 98%.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Azabicycloheptanonderivats der allgemeinen Formel III, worin R₁ = H, X = CH₂, Y-Z = -CH=CH-,
das die folgenden Verfahrensstufen umfaßt: Umsetzen von (±)2-Azabicyclo[2,2,1]hept-5-en-3-on der Formel I
worin R₁ = H, COR₂ (R₂ = C_1-4 Alkyl, C_1-4 Alkoxy, Aryl, Aryloxy)
mit einer ganzen Zelle von Kluyvera Citrophila (ATCC Nr. 21285), oder einem Zellextrakt, oder mit einem aus Kluyvera Citrophila (ATCC Nr. 21285) extrahierten Lactamaseenzym in einem einen Puffer enthaltenden organischen Lösungsmittel; Extrahieren des Gemisches mit einem organischen Lösungsmittel; Abtrennen der organischen Schicht; und Entfernen des Lösungsmittels zwecks Erhalts des Produktes.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der verwendete Puffer ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Phosphatpuffer (0,05 M–0,1 M, 6–8 pH), einem Citratpuffer (0,05 M–0,1 M, 6–7,5 pH) und einem Trispuffer (0,05 M–0,2 M, 7–8 pH).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der verwendete Puffer ein Phosphatpuffer (0,2 M, 7,4 pH) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das zusammen mit dem Puffer verwendete organische Lösungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Alkoholen, Alkylacetaten, Ketonen und Sulfoxiden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Butanol, Ethylacetat, Aceton, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das organische Lösungsmittel Aceton ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Prozentgehalt des für die Reaktion zusammen mit dem Puffer verwendeten organischen Lösungsmittels im Bereich zwischen 5% und 50% (V/V) liegt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Prozentgehalt des für die Reaktion zusammen mit dem Puffer verwendeten organischen Lösungsmittels 10% (V/V) beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das für die Extraktion verwendete Lösungsmittel ein chloriertes Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chloroform, Ethylendichlorid, Methylendichlorid und einem Alkylacetat, ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das für die Extraktion verwendete Alkylacetat Ethylacetat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das für die Extraktion verwendete Lösungsmittel Methylendichlorid ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Umsetzung der Verbindung der Formel I mit dem Enzym oder der (ganzen) Zelle bei einer Temperatur im Bereich zwischen 25 und 30°C erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Umsetzung der Verbindung der Formel I mit dem Enzym oder der (ganzen) Zelle während einer Zeitdauer im Bereich von 10 bis 24 Stunden erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei besagtes Enzym ein Lactamaseenzym oder besagte Zelle eine ein Lactamaseenzym exprimierende Zelle ist.