EP1005563A1 - METHOD FOR PRODUCING CYCLIC alpha-AMINO ACIDS FREE FROM ENANTIOMERS OR THEIR N-PROTECTED DERIVATIVES BY MEANS OF A D-SPECIFIC AMINOACYLASE - Google Patents

METHOD FOR PRODUCING CYCLIC alpha-AMINO ACIDS FREE FROM ENANTIOMERS OR THEIR N-PROTECTED DERIVATIVES BY MEANS OF A D-SPECIFIC AMINOACYLASE

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EP1005563A1
EP1005563A1 EP98946316A EP98946316A EP1005563A1 EP 1005563 A1 EP1005563 A1 EP 1005563A1 EP 98946316 A EP98946316 A EP 98946316A EP 98946316 A EP98946316 A EP 98946316A EP 1005563 A1 EP1005563 A1 EP 1005563A1
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EP
European Patent Office
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protected
proline
microorganisms
amino acid
source
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Withdrawn
Application number
EP98946316A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Martin Sauter
Oleg Werbitzky
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Lonza AG
Original Assignee
Lonza AG
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture

Definitions

  • the present invention relates to microorganisms which are capable of one or more N-protected cyclic amino acid derivatives selected from the compounds of the general formula
  • a together with -N- and -CH represent an optionally substituted 4-, 5-, 6- or 7- membered saturated heterocyclic ring and R 1 each represents optionally substituted alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy, in the form of the racemate or one of the optically active isomers as the only C source, as the only N source or as the only C and N source, and / or are able to hydrolyze them.
  • R 1 each represents optionally substituted alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy, in the form of the racemate or one of the optically active isomers as the only C source, as the only N source or as the only C and N source, and / or are able to hydrolyze them.
  • D-amino acids such as D-Prohn are important intermediates for the manufacture of pharmaceuticals (J Org Chem 1994, 59, 7496-7498)
  • JP-A 01 005 488 encompasses a process for the preparation of D-amino acid acylases which, for example, hydrolyze N-benzyloxycarbonylmethionine in D-methionine, N-benzyloxycarbonyl-L-methionine being obtained.
  • JP-A 07 127 354 comprises a process for the preparation of D-proline starting from ornithine by means of microorganisms of the species Proteus mitajiri.
  • a disadvantage of this process is that on the one hand the educt ornithine is too expensive, and on the other hand that D-proline is inferior Yield is obtained
  • JP-A 92 183 399 discloses a process for the preparation of D-proline starting from (DL) -proline using microorganisms of the genus Candida or trichospora. This process also has the disadvantage that D-proline is obtained in low yield
  • the object of the present invention is to provide a simple and technically viable method for producing both N-protected cych L-amino acid derivatives and cych D-amino acids.
  • the corresponding products are to be isolated in good enantiomeric purity
  • microorganisms according to the invention can be isolated, for example, from soil samples, sludge or wastewater, in particular contaminated soil or clear sludge, with the aid of customary microbiological techniques cyclic amino acid derivatives of the general formula I, in the form of the racemate or one of the optically active isomers, __
  • the microorganisms are expediently first enriched in a corresponding liquid culture and the anaerobic or aerobic microorganisms are isolated from the culture obtained, the desired N-protected cychino amino acid derivatives as the only N source, as the only C source or as the only C and Can utilize the N source and / or are able to hydrolyze it
  • optionally substituted saturated 4-membered heterocyclic rings are azetidine.
  • optionally substituted saturated 5-membered heterocyclic rings are proline, hydroxyproline, pyrazolidine, methylpyrazolidine, imidazolidine, pyroglutamate, oxazolidine, isoxazolane, thiazolidine and triazolidine
  • optionally substituted saturated 6-membered heterocyclic rings are piperidine. 3-methylpiperidine, piperazine, pipecolin, 3-methylpiperazine, morpholine
  • R 1 in the N-protected cychino amino acid derivative of the general formula 1 means alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy
  • Alkyl here means a substituted or unsubstituted C 1 -C alkyl group, preferably a substituted or unsubstituted C 1 -C alkyl group. Suitable substituents are, for. B hydroxy or halogens such as F, Cl. Br or J Examples of a Ci-is-alkyl group are methyl, chloromethyl, trifluoromethyl, co-hydroxyalkyl, ethyl, propyl, butyl, iso-butyl, iso-propyl and stearyl ⁇ -hydroxyalkyl group in the following means a hydroxymethyl, hydroxyethyl, Hydroxypropyl or Hydroxybutyl Group Preferably alkyl means methyl
  • Alkoxy means a substituted or unsubstituted C 1 8 alkoxy group, preferably a substituted or unsubstituted C 4 alkoxy group. Suitable substituents are, for example, the substituents mentioned for alkyl. Examples of an alkoxy group are methoxy, chloromethoxy, trifluoromethoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, tert -butoxy, iso-butoxy and stearoxy
  • Aryloxy preferably means benzyloxy
  • the compounds of the general formula I are preferably N-protected cyclic D-amino acid derivatives
  • N-protected cyclic D-amino acid derivatives are N-protected D-proline derivatives, for example N-acetyl and / or N-benzyloxycarbonyl-D-proline (N-Z-D-proline), and N-protected D-pipecolinic acid derivatives
  • the microorganisms can use, for example, sugar, sugar alcohols, or carboxylic acids as a growth substrate as a suitable C source.
  • Hexose for example glucose and fructose, pentoses, for example ribose, or disaccharides, for example sucrose
  • Amino carboxylic acids, mono-, di - or tricarboxylic acids or their salts can be used.
  • mannitol or glycerin can be used as sugar alcohols.
  • proline, glutamate, lysine, glycine or their salts can be used as amino carboxylic acids.
  • Acetic acid, acetate, lactic acid can be used as mono-, di- or tricarboxylic acids. Lactate, succinic acid, succinate, malic acid, malate, citric acid, citrate or their salts are used
  • the microorganisms can, for example, ammonium, nitrate, urea as a suitable N source.
  • the media customary in the art for example the medium described in Table 1, can preferably be used as the selection and growth medium.
  • the medium described in Table 1 is preferably used
  • the active enzymes of the microorganisms are expediently induced during the cultivation and selection.
  • An N-protected cyclic amino acid derivative according to formula I, preferably its D-isomer, is expediently used as the enzyme inducer
  • the cultivation and selection is usually carried out at a temperature of 5 to 100 ° C., expediently from 10 to 75 ° C., preferably from 15 to 40 ° C., in particular from 20 to 35 ° C. and at a pH between pH 0 and pH 12, expediently from pH 4 to 10, preferably between pH 5 and pH 9
  • microorganisms are microorganisms corresponding to the microorganisms with the designation MIS1 12, MIS125, MIS132, MIS211, MIS213, MIS221, MIS222.
  • MIS231, MIS242, MIS253 Particularly preferred are microorganisms of the genus Arthrobacter, such as the species Arthrobacter oxydans GS121, Arthrobacter sp GS132, Arthrobacter pascens or ramosus GS131 (DSM 1 1637), Arthrobacter pascens or ramosus GS134, and their variant organisms and mutant mutants GS131 were deposited on 30.06.1997 with the German Collection of Microorganisms and Zellkultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, according to the Budapest Treaty under the deposit number DSM 1 1637 "Flinktionally equivalent ⁇ ⁇ arianten and mutants" are understood to mean microorganisms which are derived from the described original organisms and
  • a together with -N- and -CH and R 1 have the meaning given, comprises the reaction of a racemic N-protected cych aminosaur derivative of the general formula
  • a together with -N- and -CH and R 1 have the meaning given, by means of the microorganisms already described and / or an enzyme preparation thereof, into a cyclic D-amino acid (formula III) and / or the N- protected cychschen L-amino acid derivatives (formula II), and optionally isolation of these compounds
  • N-protected cyclic amino acid derivatives of the formula I are used as N-protected cyclic amino acid derivatives of the formula I.
  • the educts, the racemic N-protected cyclic amino acid derivatives of the general formula I such as, for example, NZ- (DL) -proline, are commercial compounds
  • biotransformation is possible with all microorganisms that utilize and / or hydrolyze an N-protected cyclic amino acid derivative in the form of the racemate or its optically active isomers as the only N source, as the only C source or as the only C and N source Enzyme extracts from these microorganisms are also suitable.
  • Biotransformation is preferably carried out with the microorganisms described above, in particular with the microorganisms described above of the species Arthrobacter pascens or ramosus GS131 (DSM 1 1637) or with their functions! equivalent variants and mutants
  • the biotransformation can be carried out with resting cells (non-growing cells which no longer require a carbon and energy source) or with growing cells under aerobic or anaerobic conditions.
  • the biotransformation is preferably carried out with resting cells under aerobic conditions
  • Biotransformation for example low-molar buffers such as low-molar phosphate buffer, Tris buffer or the medium described in Table 1.
  • the biotransformation is preferably carried out in the medium according to Table 1
  • the biotransformation is expediently carried out by adding an N-protected amino acid derivative so that the concentration does not exceed 50% by weight, preferably 20% by weight.
  • the N-protected amino acid derivative is expediently added once or continuously
  • the pH of the medium can be in a range from 3 to 12, preferably from 5 to 9.
  • the biotransformation is expediently carried out at a temperature of 10 to 70 ° C., preferably 20 to 50 ° C.
  • an N-protected cyclic amino acid derivative is converted into a cyclic D-amino acid.
  • An N-protected L-amino acid derivative is obtained.
  • the cyclic D-amino acid and the N-protected L-amino acid derivative can be obtained in good yield and Enantiomeric purity (ee greater than 98%) can be isolated
  • N-protected L-amino acid derivative obtained in this way and / or the D-amino acid obtained in this way can be isolated by customary workup methods, such as, for example, by extraction
  • Vitamin solution 1.0 ml / 1 pH 7.0
  • C and N sources were added to this basic medium
  • the isolates obtained with the method described in Example 1 (A) were multiplied in the medium described there.
  • the cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed after resuspending in saline solution the ability to hydrolysis of N-protected cych amino acids was tested with resting cells
  • a suitable amount of cells with 25 mM N-acetyl- (DL) -proline, NZ- (DL) -proline and NZ- (DL) -pipecolinic acid or 12.5 mM N-acetyl- (DL) -pipecolinic acid incubated in buffer solution (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) under rubble (30 ° C).
  • Figure 1 shows the reaction of MIS132 and MIS222 with N-Z- (DL) -pipecolinic acid
  • the isolates obtained with the method described in Example 1 (B) were multiplied in the medium described there.
  • the cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed. After resuspending in saline solution the ability to hydrolysis of N-protected cycho amino acids was tested with resting cells.
  • a suitable amount of cells with 100 mM NZ-DL-proline or 50 mM NZ-DL-pipecolic acid in buffer solution (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) below
  • GS131 In order to characterize bacterial strain GS131 in more detail, the growth of this strain was investigated with different C and N sources.
  • the basic medium described in Table 1 was used and the C sources were added to 10 g / 1 each and the N sources to a final concentration of 40 mM. The cultures were then incubated at 30 ° C. GS131 was able to utilize a wide variety of C and N sources and even showed good growth in most of the media examined.
  • Bacterial strain GS131 was grown under variation of different media components or their concentration at 30 ° C. The cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed. After resuspending in saline solution, the ability to hydrolyze N-Z-D-proline was examined with resting cells under aerobic conditions.
  • Bacterial strain GS131 was propagated in the medium described in Example 1 (B). The cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed. After resuspending in saline solution, the ability to Hydrolysis of N-protected cych amino acids was tested. A suitable amount of cells with the respective substrate (10 mM NZL-proline or NZD-proline or 5 mM NZL-pipecolic acid or N-ZD-pipecolic acid) in buffer solution (50 mM phosphate buffer , pH 7.0) (30 ° C.) Aliquots were removed at various times and the wetting of the substrates was monitored by HPLC
  • Figure 2 shows the enantioselectivity of D-aminoacylase from bacterial strain GS 131
  • Bacterial Strain GS131 was propagated in the medium described in Example 1 (B). The cells thus produced were harvested by centrifugation and then in saline solution (8.5 g / 1) Resuspended and washed After resuspending in saline solution, the ability to hydrolize N-protected cych amino acids was tested with resting cells.
  • NZL-pipecolic acid was then obtained by extraction three times (40 ml each) with butyl acetate. The organic phases were combined, dried over sodium sulfate and finally until evaporated to dryness After dissolving the solid in 10 ml of ethyl acetate and adding 9 ml of hexane, NZL-pipecolic acid was crystallized by cooling to a temperature ⁇ 10 ° C. After filtration and drying, 13.22 g of NZL-pipecolinic acid (64.9% of theory Th) received

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Abstract

The invention relates to new microorganisms capable of utilising a N-protected cyclic amino acid derivative, selected from the compounds of the general formula (I), in the form of the racemate or one of its optical isomers, where A together with -N- and -CH is a possibly substituted 4-, 5-, 6-, or 7-membered heterocyclic ring and R<1> is a possibly substituted alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy, and/or are capable of hydrolizing a N-protected cyclic amino acid derivative, selected from among the compounds of the general formula (I), as well as to enzyme extracts thereof. The invention also relates to a new method for producing N-protected cyclic L-amino acid derivatives and cyclic D-amino acids by using said microorganisms.

Description

Verfahren zur Herstellung enantiomerenreiner cyciischer α-A inosäuren bzw. deren N-geschiitzter Derivate mittels einer D-spezifischen Aminoacylase. Process for the preparation of enantiomerically pure cyclic α-amino acids or their N-protected derivatives using a D-specific aminoacylase.
Die voriiegende Erfindung betrifft Mikroorganismen, die befähigt sind, ein oder mehrere N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate ausgewählt aus den Verbindungen der allgemeinen FormelThe present invention relates to microorganisms which are capable of one or more N-protected cyclic amino acid derivatives selected from the compounds of the general formula
worin A zusammen mit -N- und -CH einen gegebenenfalls substituierten 4-, 5-, 6- oder 7- gliedrigen gesattigten heterocyciischen Ring bedeutet und R1 jeweils gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy bedeutet, in Form des Racemats oder eines der optisch aktiven Isomeren als einzige C-Quelle, als einzige N-Quelle oder als einzige C- und N- Quelle zu verwerten, und/oder befähigt sind, diese zu hydrolysieren Diese Mikroorganismen bzw die Enzymextrakte daraus werden für ein neues Verfahren zur Herstellung von N-ge- schützten cychschen L-Aminosaurederivaten und/oder cychschen D-Aminosauren eingesetztwherein A together with -N- and -CH represent an optionally substituted 4-, 5-, 6- or 7- membered saturated heterocyclic ring and R 1 each represents optionally substituted alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy, in the form of the racemate or one of the optically active isomers as the only C source, as the only N source or as the only C and N source, and / or are able to hydrolyze them. These microorganisms or the enzyme extracts therefrom are used for a new process for the production of N-protected cyclic L-amino acid derivatives and / or cyclic D-amino acids are used
D-Aminosauren wie z B D-Prohn sind wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von Pharmazeutika (J Org Chem 1994, 59, 7496-7498)D-amino acids such as D-Prohn are important intermediates for the manufacture of pharmaceuticals (J Org Chem 1994, 59, 7496-7498)
Zur Herstellung von D-Aminosauren sind mehrere Verfahren bekannt Die JP-A 01 005 488 umfasst ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosaureacylasen, die z B N-Benzyloxycarbonylmethionin in D-Methionin hvdroiysieren, wobei N-Benzyloxycarbonyl-L- methionin anfallt Diese D-Aminosaureacyiasen hydrolysieren zum einen keine cychschen N-geschutzten Aminosäuren, zum anderen wird die N-Benzyloxycarbonylgruppe (Z-Gruppe) von ihnen schlecht hydrolysiert Die JP-A 07 289 275 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von D-Prolin durch Umsetzen von L-Prohn mittels Mikroorganismen der Gattung Escherichia mit Racemaseaktivitat zum (DL)-Prolin, welches dann mittels Mikroorganismen, die das nicht geschützte L-Prolin verwerten, metabolisiert wird, um D-Prolin zu erhalten D-Proiin wird dabei in schlechter Aus- beute erhaltenSeveral processes are known for the preparation of D-amino acids. JP-A 01 005 488 encompasses a process for the preparation of D-amino acid acylases which, for example, hydrolyze N-benzyloxycarbonylmethionine in D-methionine, N-benzyloxycarbonyl-L-methionine being obtained. This D On the one hand, amino acid aciases do not hydrolyze cych N-protected amino acids, on the other hand, they badly hydrolyze the N-benzyloxycarbonyl group (Z group) JP-A 07 289 275 describes a process for the preparation of D-proline by reacting L-Prohn using microorganisms of the genus Escherichia with racemase activity to (DL) -proline, which is then used by microorganisms that utilize the unprotected L-proline, is metabolized to obtain D-proline D-proiin is obtained in poor yield
Die JP-A 07 127 354 umfasst ein Verfahren zur Herstellung von D-Prolin ausgehend von Ornithin mittels Mikroorganismen der Spezies Proteus mitajiri Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass zum einen das Edukt Ornithin zu kostspielig ist, zum anderen, dass D-Prolin in schlechter Ausbeute erhalten wirdJP-A 07 127 354 comprises a process for the preparation of D-proline starting from ornithine by means of microorganisms of the species Proteus mitajiri. A disadvantage of this process is that on the one hand the educt ornithine is too expensive, and on the other hand that D-proline is inferior Yield is obtained
Die JP-A 92 183 399 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von D-Prolin ausgehend von (DL)-Prolin mittels Mikroorganismen der Gattung Candida oαer Trichospora Auch dieses Verfahren hat den Nachteil, dass D-Prolin in geringer Ausbeute erhalten wirdJP-A 92 183 399 discloses a process for the preparation of D-proline starting from (DL) -proline using microorganisms of the genus Candida or trichospora. This process also has the disadvantage that D-proline is obtained in low yield
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches und technisch gangbares Verfahren zur Herstellung sowohl von N-geschutzten cychschen L-Aminosaurederivaten als auch von cychschen D-Aminosauren bereitzustellen Dabei sollen die entsprechenden Produkte in guter Enantiomeren-Reinheit isoliert werdenThe object of the present invention is to provide a simple and technically viable method for producing both N-protected cych L-amino acid derivatives and cych D-amino acids. The corresponding products are to be isolated in good enantiomeric purity
Diese Aufgabe wird mit den Mikroorganismen gemäss Anspruch 1 und dem Verfahren gemäss Anspruch 5 gelostThis object is achieved with the microorganisms according to claim 1 and the method according to claim 5
Die erfindungsgemassen Mikroorganismen können beispielsweise aus Bodenproben, Schlamm oder Abwasser, insbesondere kontaminierten Boden oder Klarschlmm, unter Zuhilfenahme üblicher mikrobiologischer Techniken isoliert werden Die Mikroorganismen sind aus derartigen Proben durch Selektion erhaltlich, insbesondere durch selektive Züchtung mit einem geeigneten Medium enthaltend ein oder mehrere N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate der allgemeinen Formel I, in Form des Racemats oder eines der optisch aktiven Isomeren, __The microorganisms according to the invention can be isolated, for example, from soil samples, sludge or wastewater, in particular contaminated soil or clear sludge, with the aid of customary microbiological techniques cyclic amino acid derivatives of the general formula I, in the form of the racemate or one of the optically active isomers, __
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die genannte Bedeutung haben, und zwarwherein A together with -N- and -CH and R 1 have the meaning given, namely
• als einziger C- und N-Quelle oder• as the only C and N source or
• als einziger N-Quelle mit einer geeigneten C-Quelle oder• as the only N source with a suitable C source or
• als einziger C-Quelle mit einer geeigneten N-Quelle• as the only C source with a suitable N source
Dabei werden die Mikroorganismen zweckmäßig zunächst in einer entsprechenden Flüssigkultur angereichert und aus der erhaltenen Kultur werden dann die anaeroben oder aeroben Mikroorganismen isolieπ, die die gewünschten N-geschutzten cychschen Aminosaurederivate als einzige N-Quelle, als einzige C-Quelle oder als einzige C- und N- Quelle verwerten können und/oder befähigt sind, diese zu hydrolysierenThe microorganisms are expediently first enriched in a corresponding liquid culture and the anaerobic or aerobic microorganisms are isolated from the culture obtained, the desired N-protected cychino amino acid derivatives as the only N source, as the only C source or as the only C and Can utilize the N source and / or are able to hydrolyze it
Beispiele für gegebenenfalls substituierte gesattigte 4-gliedrige heterocyclische Ringe sind Azetidin. Methylazetidin, DiazetidinExamples of optionally substituted saturated 4-membered heterocyclic rings are azetidine. Methyl azetidine, diazetidine
Beispiele für gegebenenfalls substituierte gesattigte 5-gliedrige heterocyclische Ringe sind Prolin, Hydroxyprolin, Pyrazolidin, Methylpyrazolidin, Imidazolidin, Pyroglutamat, Oxazolidin, Isoxazolan, Thiazolidin und TriazolidinExamples of optionally substituted saturated 5-membered heterocyclic rings are proline, hydroxyproline, pyrazolidine, methylpyrazolidine, imidazolidine, pyroglutamate, oxazolidine, isoxazolane, thiazolidine and triazolidine
Beispiele für gegebenenfalls substituierte gesättigte 6-gliedrige heterocyclische Ringe sind Piperidin. 3-Methylpιperidin, Piperazin, Pipecolin, 3-Methylpiperazin, MorpholinExamples of optionally substituted saturated 6-membered heterocyclic rings are piperidine. 3-methylpiperidine, piperazine, pipecolin, 3-methylpiperazine, morpholine
Beispiele für gegebenenfalls substituierte 7-gliedrige heterocyclische Ringe sind ε-Capiolactam und Azetin Der Rest R1 im N-geschutzten cychschen Aminosaurederivat der allgemeinen Formel 1 bedeutet Alkyl, Alkoxy, Aryl oder AryloxyExamples of optionally substituted 7-membered heterocyclic rings are ε-capiolactam and azetine The radical R 1 in the N-protected cychino amino acid derivative of the general formula 1 means alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy
Alkyl bedeutet dabei eine substituierte oder unsubstituierte Cι-ι_-Alkylgruppe, vorzugsweise eine substituierte oder unsubstituierte Cι- - Alkyl gruppe Geeignete Substituenten sind z. B Hydroxy oder Halogene wie F, Cl. Br oder J Beispiele für eine Ci-is-Alkylgruppe sind Methyl, Chlormethyl, Trifluormethyl, co-Hydroxyalkyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Iso-butyl, Iso-propyl und Stearyl ω-Hydroxyalkylgruppe bedeutet im folgenden eine Hydroxymethyl-, Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl- oder Hydroxybutylgruppe Vorzugsweise bedeutet Alkyl MethylAlkyl here means a substituted or unsubstituted C 1 -C alkyl group, preferably a substituted or unsubstituted C 1 -C alkyl group. Suitable substituents are, for. B hydroxy or halogens such as F, Cl. Br or J Examples of a Ci-is-alkyl group are methyl, chloromethyl, trifluoromethyl, co-hydroxyalkyl, ethyl, propyl, butyl, iso-butyl, iso-propyl and stearyl ω-hydroxyalkyl group in the following means a hydroxymethyl, hydroxyethyl, Hydroxypropyl or Hydroxybutyl Group Preferably alkyl means methyl
Alkoxy bedeutet eine substituierte oder unsubstituierte Cι.]8-Alkoxygruppe, vorzugsweise eine substituierte oder unsubstituierte Cι-4-Alkoxygruppe Geeignete Substituenten sind beispielsweise die für Alkyl genannten Substituenten Beispiele für eine Alkoxygruppe sind Methoxy, Chlormethoxy, Trifluormethoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy, Tert-butoxy, Iso-butoxy und StearoxyAlkoxy means a substituted or unsubstituted C 1 8 alkoxy group, preferably a substituted or unsubstituted C 4 alkoxy group. Suitable substituents are, for example, the substituents mentioned for alkyl. Examples of an alkoxy group are methoxy, chloromethoxy, trifluoromethoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, tert -butoxy, iso-butoxy and stearoxy
Als Aryl wird eine Phenyl- oder Benzylgruppe, substituiert oder unsubstituiert, beispielsweise 4-Methoxybenzyl oder 4-Methoxyphenyl, eingesetzt. Als Aryloxy wird eine Phenyloxy- oder Benzyloxygruppe, substituiert oder unsubstituiert, eingesetzt. Beispiele für eine Aryloxygruppe sind Benzvloxy, 4-Methoxybenzyloxy oder 4-Nitrobenzyloxy. Bevorzugt bedeutet Aryloxy BenzyloxyA phenyl or benzyl group, substituted or unsubstituted, for example 4-methoxybenzyl or 4-methoxyphenyl, is used as the aryl. A phenyloxy or benzyloxy group, substituted or unsubstituted, is used as aryloxy. Examples of an aryloxy group are benzyloxy, 4-methoxybenzyloxy or 4-nitrobenzyloxy. Aryloxy preferably means benzyloxy
Bevorzugt handelt es sich bei den Verbindungen der allgemeinen Formel I um N-geschutzte cyclische D-AminosaurederivateThe compounds of the general formula I are preferably N-protected cyclic D-amino acid derivatives
Besonders bevorzugte N-geschutzte cyclische D-Aminosaurederivate sind N-geschutzte D-Prolinderivate, beispielsweise N-Acetyl- und/oder N-Benzyloxycarbonyl-D-Prolin (N-Z-D- Prolin), und N-geschutzte D-PipecolinsaurederivateParticularly preferred N-protected cyclic D-amino acid derivatives are N-protected D-proline derivatives, for example N-acetyl and / or N-benzyloxycarbonyl-D-proline (N-Z-D-proline), and N-protected D-pipecolinic acid derivatives
Als geeignete C-Quelle können die Mikroorganismen beispielsweise Zucker, Zuckeralkohole, oder Carbonsauren als Wachstumssubstrat nützen Als Zucker können Hexose, beispielsweise Glucose und Fructose, Pentosen, beispielsweise Ribose, oder Disaccharide, beispielsweise Saccharose, verwendet werden Als Carbonsauren können Aminocarbonsauren, Mono-, Di- oder Tricarbonsauren bzw deren Salze verwendet werden Als Zuckeralkohole können beispielsweise Mannit oder Glycerin Verwendung finden Als Aminocarbonsauren können beispielsweise Prolin, Glutamat, Lysin, Glycin bzw deren Salze verwendet werden Als Mono-, Di- oder Tricarbonsauren können Essigsaure, Acetat, Milchsaure. Lactat, Bernsteinsaure, Succinat, Apfelsaure, Malat, Citronensaure, Citrat bzw deren Salze verwendet werdenThe microorganisms can use, for example, sugar, sugar alcohols, or carboxylic acids as a growth substrate as a suitable C source. Hexose, for example glucose and fructose, pentoses, for example ribose, or disaccharides, for example sucrose, can be used as sugars. Amino carboxylic acids, mono-, di - or tricarboxylic acids or their salts can be used. For example, mannitol or glycerin can be used as sugar alcohols. For example, proline, glutamate, lysine, glycine or their salts can be used as amino carboxylic acids. Acetic acid, acetate, lactic acid can be used as mono-, di- or tricarboxylic acids. Lactate, succinic acid, succinate, malic acid, malate, citric acid, citrate or their salts are used
Als geeignete N-Quelle können die Mikroorganismen beispielsweise Ammonium, Nitrat, Harnstoff. Glycin oder Lysin nutzenThe microorganisms can, for example, ammonium, nitrate, urea as a suitable N source. Use glycine or lysine
Als Selektions- und Anzuchtmedium können die in der Fachwelt üblichen Medien, beispielsweise das in Tabelle 1 beschriebene Medium verwendet werden Vorzugsweise wird das in Tabelle 1 beschriebene Medium verwendetThe media customary in the art, for example the medium described in Table 1, can preferably be used as the selection and growth medium. The medium described in Table 1 is preferably used
Wahrend der Anzucht und Selektion werden zweckmassig die wirksamen Enzyme der Mikroorganismen induziert Als Enzyminduktor wird zweckmassig ein N-geschutztes cyclisches Aminosaurederivat gemäss Formel I, bevorzugt dessen D-Isomeres, verwendetThe active enzymes of the microorganisms are expediently induced during the cultivation and selection. An N-protected cyclic amino acid derivative according to formula I, preferably its D-isomer, is expediently used as the enzyme inducer
Üblicherweise erfolgt die Anzucht und Selektion bei einer Temperatur von 5 bis 100 °C, zweckmassig von 10 bis 75°C, vorzugsweise von 15 bis 40°C, insbesondere von 20 bis 35 °C und bei einem pH-Wert zwischen pH 0 und pH 12, zweckmassig von pH 4 bis 10, vorzugsweise zwischen pH 5 und pH 9The cultivation and selection is usually carried out at a temperature of 5 to 100 ° C., expediently from 10 to 75 ° C., preferably from 15 to 40 ° C., in particular from 20 to 35 ° C. and at a pH between pH 0 and pH 12, expediently from pH 4 to 10, preferably between pH 5 and pH 9
Bevorzugte Mikroorganismen sind Mikroorganismen entsprechend den Mikroorganismen mit der Bezeichnung MIS1 12, MIS125, MIS132, MIS211 , MIS213, MIS221, MIS222. MIS231, MIS242, MIS253 Besonders bevorzugt sind Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, wie der Spezies Arthrobacter oxydans GS121, Arthrobacter sp GS132, Arthrobacter pascens oder ramosus GS131 (DSM 1 1637), Arthrobacter pascens oder ramosus GS134, sowie deren fünktionell äquivalente Varianten und Mutanten Die Mikroorganismen GS131 wurden am 30 06 1997 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapest er Vertrag unter der Hinterlegungsnummer DSM 1 1637 hinterlegt Unter "flinktionell äquivalenten λ^arianten und Mutanten" werden Mikroorganismen verstanden, die sich von den beschriebenen Ursprungsorganismen ableiten und in ihren erfindungswesentlichen Eigenschaften und Funktionen im wesentlichen mit diesen übereinstimmen Derartige Varianten und Mutanten können zufallig, z B durch UV-Be- Strahlung, gebildet werdenPreferred microorganisms are microorganisms corresponding to the microorganisms with the designation MIS1 12, MIS125, MIS132, MIS211, MIS213, MIS221, MIS222. MIS231, MIS242, MIS253 Particularly preferred are microorganisms of the genus Arthrobacter, such as the species Arthrobacter oxydans GS121, Arthrobacter sp GS132, Arthrobacter pascens or ramosus GS131 (DSM 1 1637), Arthrobacter pascens or ramosus GS134, and their variant organisms and mutant mutants GS131 were deposited on 30.06.1997 with the German Collection of Microorganisms and Zellkultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, according to the Budapest Treaty under the deposit number DSM 1 1637 "Flinktionally equivalent λ ^ arianten and mutants" are understood to mean microorganisms which are derived from the described original organisms and whose properties and functions essential to the invention essentially match them. Variants and mutants of this kind can be formed accidentally, for example by UV radiation become
Eigenschaften der Mikroorganismen Arthrobacter oxydans GS121Properties of the microorganisms Arthrobacter oxydans GS121
Charakterisierung Gram-positive, coryneforme Stabchen, strikt aerob, keine Saure- oder Gasbildung aus Glucose Beweglichkeit SporenCharacterization Gram-positive, coryne-shaped rods, strictly aerobic, no acid or gas formation from glucose mobility spores
Katalase + meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein Peptidoglycan-Typ A3α, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-AlaCatalase + meso-diaminopimelic acid in the cell wall no peptidoglycan type A3α, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala
16S rDNA Sequenz- Ah nlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 100,0 % mit Arthrobacter oxydans16S rDNA sequence similarity Sequencing of the area with the greatest variability gave 100.0% with Arthrobacter oxydans
Eigenschaften der Mikroorganismen Arthrobacter pascens bzw. ramosus GS131 (DSM 11637)Properties of the microorganisms Arthrobacter pascens or ramosus GS131 (DSM 11637)
Charakterisierung Gram-positive, coryneforme Stabchen, strikt aerob, keineCharacterization Gram-positive, coryne-shaped rods, strictly aerobic, none
Saure- oder Gasbildung aus Glucose Beweglichkeit SporenAcid or gas formation from glucose mobility spores
Katalase +Catalase +
Starkehydrolyse meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein Peptidoglycan-Typ A3α, L-Lys-L-Ala2.3 Strong hydrolysis meso-diaminopimelic acid in the cell wall no Peptidoglycan type A3α, L-Lys-L-Ala 2 . 3
16S rDNA Sequenz-Ähnlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 98,3 % mit Arthrobacter pascens / A ramosus (höchster Wert)16S rDNA sequence similarity Sequencing of the area with the greatest variability resulted in 98.3% with Arthrobacter pascens / A ramosus (highest value)
Eine einigermassen zuverlässige Artzuordnung ist bei der Gattung Arthrobacter in vielen Fallen nicht möglich Die Beschreibungen basieren meist nur auf den Typ-Stamm. Der Stamm gehört mit Sicherheit in die engere Arthrobacter globiformis / Arthrobacter ramosus Gruppe Die 16S rDNA Sequenzen sind identisch mit denen vom Stamm GS134A reasonably reliable species assignment is not possible in many cases with the genus Arthrobacter. The descriptions are usually based only on the type strain. The trunk belongs with certainty in the closer Arthrobacter globiformis / Arthrobacter ramosus group The 16S rDNA sequences are identical to those of the GS134 strain
Eigenschaften der Mikroorgansi en Arthrobacter oxydans GS132Properties of the microorganisms Arthrobacter oxydans GS132
Charakterisierung Gram-positive, coryneforme Stabchen, strikt aerob, keineCharacterization Gram-positive, coryne-shaped rods, strictly aerobic, none
Saure- oder Gasbildung aus Glucose Beweglichkeit SporenAcid or gas formation from glucose mobility spores
Katalase + meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein Peptidoglycan-Typ A3 . L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-AlaCatalase + meso-diaminopimeline acid in the cell wall no Peptidoglycan type A3. L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala
16S rDNA Sequenz-Ähnlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 97,2 % mit Arthrobacter nicotinovorans (höchster Wert)16S rDNA sequence similarity Sequencing of the area with the greatest variability resulted in 97.2% with Arthrobacter nicotinovorans (highest value)
Der gefundene Peptidoglycan-Typ wurde bisher nur für Arthrobacter oxydans beschrieben Zellwand und 16S rDNA Sequenzdaten deuten daraufhin, dass der Stamm einer bisher nicht beschriebene Art der Gattung Arthrobacter repräsentiertThe type of peptidoglycan found has hitherto been described only for Arthrobacter oxydans cell wall and 16S rDNA sequence data indicate that the strain represents a species of the genus Arthrobacter which has not previously been described
Eigenschaften der Mikroorganismen Arthrobacter pascens bzw. ramosus GS134Properties of the microorganisms Arthrobacter pascens or ramosus GS134
Charakterisierung Gram-positive, coryneforme Stabchen, strikt aerob, keineCharacterization Gram-positive, coryne-shaped rods, strictly aerobic, none
Saure- oder Gasbildung aus GlucoseAcid or gas formation from glucose
Beweglichkeitagility
SporenSpores
Katalase + meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand neinCatalase + meso-diaminopimeline acid in the cell wall no
Peptidoglycan-Typ A3 , L-Lys-L-Ala2-3 Peptidoglycan type A3, L-Lys-L-Ala 2-3
16S rDNA Sequenz- Ähnlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 98,3 % mit Arthrobacter pascens / Arthrobacter ramosus (höchster Wert)16S rDNA sequence similarity Sequencing of the area with the greatest variability resulted in 98.3% with Arthrobacter pascens / Arthrobacter ramosus (highest value)
Eine einigermassen zuverlässige Artzuordnung ist bei der Gattung Arthrobacter in vielen Fallen nicht möglich Die Beschreibungen basieren meist nur auf dem Typ-Stamm Der Stamm gehört mit Sicherheit in die engere Arthrobacter globiformis / Arthrobacter ramosus Gruppe Die 16S rDNA Sequenzen sind identisch mit denen von Stamm GS131A reasonably reliable species assignment is not possible in many cases with the genus Arthrobacter. The descriptions are usually based only on the type strain The strain belongs with certainty in the closer Arthrobacter globiformis / Arthrobacter ramosus group The 16S rDNA sequences are identical to those of strain GS131
Das erfindungsgemasse Verfahren zur Herstellung von N-geschutzten cychschen L-Amino- saurederivaten der allgemeinen Formel II und/oder von einer cychschen D-Aminosaure der allgemeinen Formel IIIThe process according to the invention for the preparation of N-protected cych L-amino acid derivatives of the general formula II and / or of a cych D-amino acid of the general formula III
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die genannte Bedeutung haben, umfasst die Umsetzung eines racemischen N-geschutzten cychschen Aminosaurederivats der allgemeinen Formelwherein A together with -N- and -CH and R 1 have the meaning given, comprises the reaction of a racemic N-protected cych aminosaur derivative of the general formula
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die genannte Bedeutung haben, mittels den bereits beschriebenen Mikroorganismen und/oder eines Enzympraparats davon, in eine cyclische D-Aminosaure (Formel III) und/oder die bei dieser Umsetzung anfallenden N-geschutzten cychschen L-Aminosaurederivate (Formel II), sowie gegebenenfalls Isolierung dieser Verbindungenwherein A together with -N- and -CH and R 1 have the meaning given, by means of the microorganisms already described and / or an enzyme preparation thereof, into a cyclic D-amino acid (formula III) and / or the N- protected cychschen L-amino acid derivatives (formula II), and optionally isolation of these compounds
Als N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate der Formel I werden die zuvor beschriebenen racemischen Verbindungen eingesetzt. Besonders bevorzugte N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate sind N-Z-Prolin (R = Benzyloxy), N-Acetyl-Prolin (R1 = Methyl) und N-Z-Pipecolinsaure Die Edukte, die racemischen N-geschutzten cychschen Aminosaurederivate der allgemeinen Formel I wie beispielsweise N-Z-(DL)-Prolin, sind kaufliche VerbindungenThe racemic compounds described above are used as N-protected cyclic amino acid derivatives of the formula I. Particularly preferred N-protected cyclic amino acid derivatives are NZ-proline (R = benzyloxy), N-acetyl-proline (R 1 = methyl) and NZ-pipecolinic acid. The educts, the racemic N-protected cyclic amino acid derivatives of the general formula I such as, for example, NZ- (DL) -proline, are commercial compounds
Prinzipiell ist die Biotransformation mit allen Mikroorganismen möglich, die ein N-geschutztes cyclisches Aminosaurederivat in Form des Racemats oder seiner optisch aktiven Isomere als einzige N-Quelle, als einzige C-Quelle oder als einzige C- und N-Quelle verwerten und/oder hydrolysieren Ebenfalls geeignet sind Enzymextrakte aus diesen Mikroorganismen Vor- zugsweise wird die Biotransformation mit den zuvor beschriebenen Mikroorganismen, insbesondere mit den zuvor beschriebenen Mikroorganismen der Spezies Arthrobacter pascens oder ramosus GS131 (DSM 1 1637) oder mit deren fünktionel! aequivalenten Varianten und Mutanten durchgeführtIn principle, biotransformation is possible with all microorganisms that utilize and / or hydrolyze an N-protected cyclic amino acid derivative in the form of the racemate or its optically active isomers as the only N source, as the only C source or as the only C and N source Enzyme extracts from these microorganisms are also suitable. Biotransformation is preferably carried out with the microorganisms described above, in particular with the microorganisms described above of the species Arthrobacter pascens or ramosus GS131 (DSM 1 1637) or with their functions! equivalent variants and mutants
Die Biotransformation kann nach üblichem Anzuchten der Mikroorganismen mit ruhenden Zellen (nicht wachsende Zellen, die keine Kohlenstoff- und Energiequelle mehr benotigen) oder mit wachsenden Zellen unter aeroben oder anaeroben Bedingungen durchgeführt werden Vorzugsweise wird die Biotransformation mit ruhenden Zellen unter aeroben Bedingungen durchgeführtAfter the microorganisms have been grown conventionally, the biotransformation can be carried out with resting cells (non-growing cells which no longer require a carbon and energy source) or with growing cells under aerobic or anaerobic conditions. The biotransformation is preferably carried out with resting cells under aerobic conditions
Für die Biotransformation können fachmannisch übliche Medien eingesetzt werden, beispielsweise niedermolare Puffer wie niedermolare Phosphatpuffer, Tris-Puffer, oder das in Tabelle 1 beschriebene Medium Vorzugsweise wird die Biotransformation in dem Medium gemäss Tabelle 1 durchgeführtMedia which are customary in the art can be used for the biotransformation, for example low-molar buffers such as low-molar phosphate buffer, Tris buffer or the medium described in Table 1. The biotransformation is preferably carried out in the medium according to Table 1
Zweckmassig wird die Biotransformation durch Zugabe eines N-geschutzten Amino- saurederivats so durchgeführt, dass die Konzentration 50 Gew %, vorzugsweise 20 Gew %, nicht übersteigt Zweckmäßig erfolgt die Zugabe des N-geschutzten Aminosaurederivats einmalig oder kontinuierlichThe biotransformation is expediently carried out by adding an N-protected amino acid derivative so that the concentration does not exceed 50% by weight, preferably 20% by weight. The N-protected amino acid derivative is expediently added once or continuously
Der pH- Wert des Mediums kann in einem Bereich von 3 bis 12, vorzugsweise von 5 bis 9 liegen Zweckmassig wird die Biotransformation bei einer Temperatur von 10 bis 70 °C, vorzugsweise von 20 bis 50 °C, durchgeführt Gemäss dem erfindungsgemassen Verfahrens wird ein N-geschutztes cyclisches Aminosaure- derivat in eine cyclische D-Aminosaure überführt Dabei fallt ein N-geschutztes L-Amino- saurederivat an Die cyclische D-Aminosaure und das N-geschutzte L-Aminosaurederivat können in guter Ausbeute und Enantiomeren-Reinheit (ee grosser als 98 %) isoliert werdenThe pH of the medium can be in a range from 3 to 12, preferably from 5 to 9. The biotransformation is expediently carried out at a temperature of 10 to 70 ° C., preferably 20 to 50 ° C. According to the method of the invention, an N-protected cyclic amino acid derivative is converted into a cyclic D-amino acid. An N-protected L-amino acid derivative is obtained. The cyclic D-amino acid and the N-protected L-amino acid derivative can be obtained in good yield and Enantiomeric purity (ee greater than 98%) can be isolated
Das auf diese Weise gewonnene N-geschutzte L-Aminosaurederivat und/oder die auf diese Weise gewonnene D-Aminosaure kann durch übliche Aufarbeitungsmethoden wie z B durch Extraktion isoliert werdenThe N-protected L-amino acid derivative obtained in this way and / or the D-amino acid obtained in this way can be isolated by customary workup methods, such as, for example, by extraction
BeispieleExamples
Beispiel 1: Selektion von N-Z-D-Prolin-verwertenden MikroorganismenExample 1: Selection of N-Z-D-Proline-utilizing microorganisms
Zunächst wurde ein Minimalmedium (vgl Tabelle 1 ) hergestellt, das die Wachstumsanspruche vieler Mikroorganismen erfülltFirst, a minimal medium (see Table 1) was produced that met the growth requirements of many microorganisms
Tabelle 1:Table 1:
MinimalmediumMinimal medium
Na2S04 0, 1 g/1Na 2 S0 4 0.1 g / 1
Na HP0 -2 H20 2,5 g/1Na HP0 -2 H 2 0 2.5 g / 1
KH P04 1 ,0 g/1KH P0 4 1.0 g / 1
NaCl 3,0 g/1NaCl 3.0 g / 1
MgClrό H20 0,4 g/1MgClrό H 2 0 0.4 g / 1
CaCl2-2 H20 14,5 mg/1CaCl 2 -2 H 2 0 14.5 mg / 1
FeCl3-6 H20 0,8 mg/1FeCl 3 -6 H 2 0 0.8 mg / 1
Spurenelementlosung 1 ,0 ml/1Trace element solution 1.0 ml / 1
Vitaminlosung 1 ,0 ml/1 pH 7,0 Um Mikroorganismen anzureichern, die in der Lage sind, N-geschutzte Formen cyclischer D- Aminosauren zu hydrolysieren, wurden diesem Grundmedium folgende C- und N-Quellen zugesetztVitamin solution 1.0 ml / 1 pH 7.0 To enrich microorganisms that are able to hydrolyze N-protected forms of cyclic D-amino acids, the following C and N sources were added to this basic medium
(A) N-Acetyl-D-Prohn (5 g/1), Ammoniumsulfat (2 g/1) (B) Fructose (10 g/1), N-Z-D-Prolin (2 g/1)(A) N-acetyl-D-Prohn (5 g / 1), ammonium sulfate (2 g / 1) (B) fructose (10 g / 1), N-Z-D-proline (2 g / 1)
Verschiedene Ansätze wurden dann jeweils mit Erdproben unterschiedlicher Standorte inokuliert und solange inkubiert (30 °C, 120 rpm), bis deutlich sichtbares Wachstum zu erkennen war Ein Aliquot dieser Kulturen wurde dann in ein gleich großes Volumen frischen Mediums ubeπmpft und erneut bis zu deutlicher Trübung inkubiert Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt Die angereicherten Mikroorganismen wurden anschließend auf einem Festmedium (gleiche Zusammensetzung wie Flussigmedium, nur Zusatz von 20 g/1 Agar-Agar) vereinzelt und gereinigt Auf diese Weise wurden jeweils etwa 20 verschiedene bakterielle Isolate erhalten, die befähigt waren,Different batches were then inoculated with soil samples from different locations and incubated (30 ° C, 120 rpm) until clearly visible growth could be seen. An aliquot of these cultures was then incubated in an equal volume of fresh medium and incubated again until it became cloudy This process was repeated three times. The enriched microorganisms were then separated and purified on a solid medium (same composition as liquid medium, only addition of 20 g / 1 agar agar). In this way, about 20 different bacterial isolates were obtained which were able to
(A) N-Acetyl-D-Prolin als einzige C-Quelle oder(A) N-acetyl-D-proline as the only C source or
(B) N-Z-D-Prolin als einzige N-Quelle(B) N-Z-D-proline as the only N source
zu verwertento recycle
Beispiel 2:Example 2:
Test der selektierten Mikroorganismen auf hydrolytische Aktivität gegenüber N-geschützten cychschen AminosäurenTest of the selected microorganisms for hydrolytic activity against N-protected cych amino acids
(A) Test mit Mikroorganismen, die N-Acetyl-D-Pro5in als einzige C-Quelle verwerten(A) Test with microorganisms that use N-acetyl-D-Pro5in as the only C source
Die mit der in Beispiel 1 (A) beschriebenen Methode erhaltenen Isolate wurden in dem dort beschriebenen Medium vermehrt Die so hergestellten Zellen wurden durch Zen- trifügation geerntet und anschliessend in Kochsalzlosung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlosung wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-geschutzten cychschen Aminosäuren getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit je 25 mM N-Acetyl-(DL)-Prolin, N-Z- (DL)-Prolin und N-Z-(DL)-Pipecolinsaure bzw 12,5 mM N-Acetyl-(DL)- Pipecolinsaure in Pufferlosung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) unter Schuttein in- kubiert (30 °C) Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über Dunnschichtchromatographie auf die Freisetzung von Prolin bzw Pipecolinsaure hin überprüft Da in Gegenwart von Luft-Sauerstoff die durch die Hydrolyse freigesetzte Prolin verstoffwechselt wurde, wurde die Mehrzahl der Versuche in Abwesenheit von Sauerstoff (Reaktion in gasdichten Rohrchen unter Stickstoff-Atmosphäre) durchgeführtThe isolates obtained with the method described in Example 1 (A) were multiplied in the medium described there. The cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed after resuspending in saline solution the ability to hydrolysis of N-protected cych amino acids was tested with resting cells For this purpose, a suitable amount of cells with 25 mM N-acetyl- (DL) -proline, NZ- (DL) -proline and NZ- (DL) -pipecolinic acid or 12.5 mM N-acetyl- (DL) -pipecolinic acid incubated in buffer solution (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) under rubble (30 ° C). At various times, aliquots were removed and checked for the release of proline or pipecolinic acid by thin layer chromatography. In the presence of air-oxygen the When the proline released by the hydrolysis was metabolized, the majority of the experiments were carried out in the absence of oxygen (reaction in gas-tight tubes under a nitrogen atmosphere)
Zehn Isolate (die Bakterienstamme MIS112, MIS125, MIS132, MIS211, MIS213, MIS221, MIS222, M1S231, MIS242, MIS253) zeigten grundsatzlich die Fähigkeit, verschiedene dieser Substrate zu hydrolysieren Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasstTen isolates (the bacterial strains MIS112, MIS125, MIS132, MIS211, MIS213, MIS221, MIS222, M1S231, MIS242, MIS253) basically showed the ability to hydrolyze various of these substrates. The results obtained are summarized in Table 2
Tabelle 2:Table 2:
Enzymatische Aktivität gegenüber N-geschützten Derivaten cyclischerEnzymatic activity towards N-protected derivatives of cyclic
Aminosäurenamino acids
Aktivität +++ sehr gut, ++ gut, + massig, (+) kaum, - keine, ng nicht getestet Die verschiedenen Stamme zeigten durchaus unterschiedliche Substrat-Muster Wahrend die meisten Stamme N-Z-Derivate bevorzugten, reagierte MIS221 nur mit N- Acetyl-Derivaten Auch anhand von makroskopischen (Koloniemorphologie und -far- bung), mikroskopischen (Zellmorphologie, Beweglichkeit) und physiologischen (API- Test der Firma BioMerieux) Analysen unterschieden sich alle diese Stamme voneinander Alle Stamme zeigten grundsatzlich höhere Aktivität in Gegenwart von Sauerstoff und bevorzugten Prolin- gegenüber Pipecolinsaure-DerivatenActivity +++ very good, ++ good, + massive, (+) hardly, - none, ng not tested The different strains showed quite different substrate patterns. While most strains preferred NZ derivatives, MIS221 reacted only with N-acetyl derivatives. Also on the basis of macroscopic (colony morphology and staining), microscopic (cell morphology, motility) and physiological (API - Test by the company BioMerieux) Analyzes all these strains differed from each other. All strains showed fundamentally higher activity in the presence of oxygen and preferred proline versus pipecolic acid derivatives
Anschiiessend wurde per HPLC (N-Z-Prolin, N-Z-Pipecolinsaure) bzw GC (Prolin, Pipecolinsaure, N-Acetyl-Proiin) die Enantiomeren-Reinheit sowohl der N-geschutzten als auch der freien Aminosäuren bestimmt Der Umsatz der einzelnen Reaktionen, bezogen auf das racemische Edukt, wurde anhand der Daten aus der Enantiomeren- Bestimmung abgeschätzt, wobei mit diesen Methoden keine exakte Quantifizierung möglich ist Die ee-Werte, die mit einigen Stammen erreicht werden konnten, sind in den Tabellen 3 und 4 wiedergegebenThe enantiomeric purity of both the N-protected and the free amino acids was then determined by HPLC (NZ-proline, NZ-pipecolic acid) or GC (proline, pipecolinic acid, N-acetyl-proiin). The conversion of the individual reactions, based on the Racemic starting material was estimated on the basis of the data from the enantiomer determination, whereby exact quantification is not possible with these methods. The ee values that could be achieved with some strains are shown in Tables 3 and 4
Tabelle 3:Table 3:
Enantioseiektivität gegenüber N-Acetyl-ProlinEnantiose activity towards N-acetyl-proline
- kein Produkt vorhanden In allen Fallen ist eine klare Selektivität der Hydrolyse gegenüber N-Acetyl-D-Prolin zu erkennen Unter aeroben Bedingungen lauft die Reaktion besser ab und führt in einigen Ansätzen zur Bildung von enantiomerenreinem N-Acetyl-L-Prolin Wahrscheinlich begünstigt die Verwertung des freigesetzten Prolins durch die Bakterienzellen die Umsetzung In Abwesenheit von Sauerstoff kommt es dann auch zur Anhäufung von D-Prolin In einem Fall (MIS231) konnte enantiomerenreines D-Prolin beobachtet werden, in den anderen Ansätzen erfolgte zumindest eine Anreicherung des gewünschten Enantiomers Effektiv handelte es sich dabei wahrscheinlich eher um eine Abreicherung von D-Prolin verursacht durch die Racemisierung von D-Prolin, da die Hydrolyse des Acetyl-Derivats sehr selektiv zu erfolgen scheint- no product available In all cases, a clear selectivity of the hydrolysis towards N-acetyl-D-proline can be seen. Under aerobic conditions, the reaction proceeds better and leads to the formation of enantiomerically pure N-acetyl-L-proline in some batches. The utilization of the released proline is likely to be favored Implementation by the bacterial cells In the absence of oxygen, D-proline also accumulates. In one case (MIS231) enantiomerically pure D-proline could be observed, in the other approaches there was at least an enrichment of the desired enantiomer rather a depletion of D-proline caused by the racemization of D-proline, since the hydrolysis of the acetyl derivative appears to be very selective
Tabelle 4:Table 4:
Enantioselektivität gegenüber N-Z-ProlinEnantioselectivity towards N-Z proline
Praktisch alle Ansätze zeigten sehr selektive Hydrolyse von N-Z-D-Prolin In Anwesenheit von Sauerstoff lauft die Reaktion absolut selektiv, so dass am Ende das gesamte, in die Reaktion eingesetzte N-Z-L-Prolin in enantiomerenreiner Form vorlag Practically all of the batches showed very selective hydrolysis of NZD-proline. In the presence of oxygen, the reaction proceeds absolutely selectively, so that in the end the entire NZL-proline used in the reaction was in enantiomerically pure form
Die Spezifitat der enzymatischen Reaktion ist auch mit Derivaten von anderen Aminosäuren als Prolin zu beobachten Wie Abbildung 1 zeigt, verlauft die Reaktion mit N- Z-(DL)-Pipecolinsaure relativ langsam, es wird aber auch hier selektiv das D- Enantiomere von den Stammen MIS132 und MIS222 hydrolysiertThe specificity of the enzymatic reaction can also be observed with derivatives of amino acids other than proline. As shown in Figure 1, the reaction with N-Z- (DL) -pipecolinic acid is relatively slow, but here too the D-enantiomer is selective from the strains MIS132 and MIS222 hydrolyzed
Abbildung 1 zeigt die Reaktion von MIS132 und MIS222 mit N-Z-(DL)-Pipecolin- saureFigure 1 shows the reaction of MIS132 and MIS222 with N-Z- (DL) -pipecolinic acid
Dies wird auch durch Versuche mit den Stammen MIS21 1 und MIS242 bestätigt, wo D-Pipecolinsaure mit hoher optischer Reinheit (ee > 95 %) gebildet wird Die Umsätze in diesen Versuchen waren allerdings relativ gering (< 10 %)This is also confirmed by tests with the strains MIS21 1 and MIS242, where D-pipecolinic acid with high optical purity (ee> 95%) is formed. However, the sales in these tests were relatively low (<10%)
(B) Test mit Mikroorganismen, die N-Z-D-Prolin als einzige N-Quelle verwerten(B) Test with microorganisms that use N-Z-D-proline as the only N source
Die mit der in Beispiel 1 (B) beschriebenen Methode erhaltenen Isolate wurden in dem dort beschriebenen Medium vermehrt Die so hergestellten Zellen wurden durch Zen- trifugation geerntet und anschliessend in Kochsalzlösung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlösung wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-geschutzten cychschen Aminosäuren getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit je 100 mM N-Z-DL-Prolin bzw. 50 mM N-Z-DL-Pipecolinsaure in Pufferlosung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) unterThe isolates obtained with the method described in Example 1 (B) were multiplied in the medium described there. The cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed. After resuspending in saline solution the ability to hydrolysis of N-protected cycho amino acids was tested with resting cells. A suitable amount of cells with 100 mM NZ-DL-proline or 50 mM NZ-DL-pipecolic acid in buffer solution (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) below
Schütteln inkubiert (30 °C). Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über Dunnschichtchromatographie auf die Freisetzung von Prolin bzw Pipecolinsaure hin überprüft Vier Isolate (die Bakterienstamme GS121 , GS131 , GS132 und GS134) wiesen hydrolytische Aktivität sowohl gegenüber N-Z-Prolin als auch gegenüber N-Z-Pipecolinsaure auf. Da GS131 die höchste Aktivität aufwies, wurde dieses Isolat genauer untersucht. Beispiel 3:Shake incubated (30 ° C). At different times, aliquots were taken and checked for the release of proline or pipecolinic acid by thin layer chromatography. Four isolates (the bacterial strains GS121, GS131, GS132 and GS134) showed hydrolytic activity against both NZ-proline and NZ-pipecolinic acid. Since GS131 showed the highest activity, this isolate was examined in more detail. Example 3:
Wachstum von Bakterienstamm GS131 (DSM 11637)Growth of bacterial strain GS131 (DSM 11637)
Um Bakterienstamm GS131 näher zu charakterisieren, wurde das Wachstum dieses Stammes mit verschiedenen C- und N-Quellen untersucht. Hierzu wurde das in Tabelle 1 beschriebene Grundmedium verwendet und die C-Quellen auf jeweils 10 g/1 sowie die N-Quellen auf eine Endkonzentration von 40 mM zugesetzt. Die Inkubation der Kulturen erfolgte dann bei 30 °C. GS131 konnte dabei eine breite Vielfalt von C- und N-Quellen verwerten und zeigte in den meisten untersuchten Medien sogar gutes Wachstum. In order to characterize bacterial strain GS131 in more detail, the growth of this strain was investigated with different C and N sources. For this purpose, the basic medium described in Table 1 was used and the C sources were added to 10 g / 1 each and the N sources to a final concentration of 40 mM. The cultures were then incubated at 30 ° C. GS131 was able to utilize a wide variety of C and N sources and even showed good growth in most of the media examined.
Tabelle 5:Table 5:
Wachstum von Bakterienstamm GS131 mit verschiedenen C- und N-Quellen.Growth of bacterial strain GS131 with different C and N sources.
Beispiel 4: Example 4:
Induktion der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS131 (DSM 11637)Induction of D-aminoacylase from bacterial strain GS131 (DSM 11637)
Bakterienstamm GS131 wurde unter Variation von verschiedenen Medienkomponemen bzw deren Konzentration bei 30 °C angezogen. Die so hergestellten Zellen wurden durch Zentrifü- gation geerntet und anschliessend in Kochsalzlosung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlösung wurde mit ruhenden Zellen unter aeroben Bedingungen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-Z-D-Prolin untersucht.Bacterial strain GS131 was grown under variation of different media components or their concentration at 30 ° C. The cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed. After resuspending in saline solution, the ability to hydrolyze N-Z-D-proline was examined with resting cells under aerobic conditions.
Tabelle 6:Table 6:
Induktion der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS131Induction of D-aminoacylase from bacterial strain GS131
Wachstum +++ gut, ++ massig, + schlecht Aktivität + vorhanden, - keine, ng nicht getestetGrowth +++ good, ++ massive, + poor activity + present, - none, ng not tested
Dabei zeigte sich, dass die Anwesenheit N-geschutzter cyclischer Aminosäuren das Wachstum nahezu durchgehend verlangsamt, wobei N-Z-D-Prolin in geringer Konzentration noch am besten toleriert wurden Ahnlich konnte die D-Aminoacylase nur durch Gabe von N-Z-D- Prolin in geringer Konzentration induziert werden, wobei sowohl Glucose als auch L-Prolin als C-Quelle akzeptiert wurden Beispiel 5:It was shown that the presence of N-protected cyclic amino acids slowed growth almost continuously, with NZD-proline still being best tolerated in low concentrations. Similarly, D-aminoacylase could only be induced by administration of NZD-proline in low concentrations, whereby both glucose and L-proline were accepted as the C source Example 5:
Enantioselektivität der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS131 (DSM 11637)Enantioselectivity of D-aminoacylase from bacterial strain GS131 (DSM 11637)
Bakterienstamm GS131 wurde in dem in Beispiel 1 (B) beschriebenen Medium vermehrt Die so hergestellten Zellen wurden durch Zentrif gation geerntet und anschließend in Kochsalzlosung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlosung wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-geschutzten cychschen Aminosäuren getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit dem jeweiligen Substrat ( 10 mM N-Z-L-Prolin oder N-Z-D-Prolin bzw 5 mM N-Z-L-Pipecolinsaure oder N- Z-D-Pipecolinsaure) in Pufferlosung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) inkubiert (30 °C) Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über HPLC wurde die Urnsetzung der Substrate verfolgtBacterial strain GS131 was propagated in the medium described in Example 1 (B). The cells produced in this way were harvested by centrifugation and then resuspended in saline solution (8.5 g / l) and washed. After resuspending in saline solution, the ability to Hydrolysis of N-protected cych amino acids was tested. A suitable amount of cells with the respective substrate (10 mM NZL-proline or NZD-proline or 5 mM NZL-pipecolic acid or N-ZD-pipecolic acid) in buffer solution (50 mM phosphate buffer , pH 7.0) (30 ° C.) Aliquots were removed at various times and the wetting of the substrates was monitored by HPLC
Abbildung 2 zeigt die Enantioselektivität der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS 131Figure 2 shows the enantioselectivity of D-aminoacylase from bacterial strain GS 131
Für beide getesteten N-geschutzten Aminosäuren wurde das D-Enantiomer hydrolysiert, wahrend das L-Enantiomer unangetastet blieb Das Enzym zeigt also sehr gute Enantioselektivität N-Z-D-Prolin wurde allerdings erheblich schneller hydrolysiert als N-Z-D-Pipecolin- saureFor both N-protected amino acids tested, the D-enantiomer was hydrolyzed, while the L-enantiomer remained untouched. The enzyme therefore shows very good enantioselectivity. However, N-Z-D-proline was hydrolyzed considerably faster than N-Z-D-pipecolinic acid
Beispiel 6:Example 6:
Herstellung von N-Z-L-Prolin durch Racemat-Spaltung mit Hilfe der D-Aminoacylase von Bakterienstamm GS131 Bakterienstamm GS131 wurde in dem in Beispiel 1 (B) beschriebenen Medium vermehrt Die so hergestellten Zellen wurden durch Zentrifügation geerntet und anschließend in Kochsalzlosung (8,5 g/1) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Kochsalzlosung wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-geschutzten cychschen Aminosäuren getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit 10 mM N-Z-(DL)- Prolin in Pufferlosung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) inkubiert (30 °C) Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über HPLC wurde die Umsetzung des Substrats verfolgt Abbildung 3 zeigt die Herstellung von N-Z-L-Prolin aus N-Z-(DL)-Prolin mit Hilfe der D- Aminoacylase von Bakterienstamm GS 131Production of NZL-Proline by Racemate Cleavage Using D-Aminoacylase from Bacterial Strain GS131 Bacterial Strain GS131 was propagated in the medium described in Example 1 (B). The cells thus produced were harvested by centrifugation and then in saline solution (8.5 g / 1) Resuspended and washed After resuspending in saline solution, the ability to hydrolize N-protected cych amino acids was tested with resting cells. For this purpose, a suitable amount of cells with 10 mM NZ- (DL) -proline in buffer solution (50 mM phosphate buffer , pH 7.0) incubated (30 ° C.) Aliquots were removed at various times and the conversion of the substrate was monitored by HPLC Figure 3 shows the production of NZL-proline from NZ- (DL) -proline using the D-aminoacylase from bacterial strain GS 131
Bereits nach drei Stunden war die gesamte Menge an N-Z-D-Prolin vollständig hydrolysiert, wahrend N-Z-L-Prolin über 26 Stunden unangetastet blieb Am Ende des Versuchs lag damit N-Z-L-Proiin in Losung in hoher Enantiomeren-Reinheit (ee >98 % nach HPLC) vorAfter only three hours, the entire amount of N-Z-D-proline was completely hydrolyzed, while N-Z-L-proline remained untouched for 26 hours
Beispiel 7: Synthese von N-Benzyloxycarbonyl-Derivaten cyclischer AminosäurenExample 7: Synthesis of N-benzyloxycarbonyl derivatives of cyclic amino acids
(A) Synthese von N-Z-(DL)-Prolin(A) Synthesis of N-Z- (DL) -proline
100,0 g (DL)-Prolin wurden in 217 ml 4 N NaOH gelost Zu dieser Losung wurde unter Thermostatisierung (5 - 10 °C) und pH-Stase (pH = 10,0 - 1 1,0) Chlorameisensaure- benzylester (Z-Cl) zugetropft Insgesamt wurden dabei 158, 1 g Z-Cl und 251 ,2 g 4 N100.0 g (DL) -proline were dissolved in 217 ml of 4 N NaOH. This solution was treated with thermostatic treatment (5 - 10 ° C) and pH-Stase (pH = 10.0 - 1 1.0) benzyl chloroformate ( Z-Cl) was added dropwise A total of 158.1 g Z-Cl and 251.2 g 4 N
NaOH zugesetzt Außerdem wurden 150 ml destilliertes Wasser beigefügt, um die Ruhr- barkeit der Reaktionsmischung aufrecht zu erhalten Mit konzentrierter Salzsaure (76 ml) wurde dann auf pH = 2,4 angesäuert und anschliessend wurde N-Z-(DL)-Prolin in mehreren Schritten mit insgesamt 584 ml Butylacetat extrahiert Die vereinigten organischen Phasen wurden unter Vakuum eingeengt und das erhaltene N-Z-(DL)-Prolin wurde inNaOH added In addition, 150 ml of distilled water were added in order to maintain the agitation of the reaction mixture. The mixture was then acidified to pH = 2.4 with concentrated hydrochloric acid (76 ml) and then NZ- (DL) -proline was added in several steps a total of 584 ml of butyl acetate extracted. The combined organic phases were concentrated in vacuo and the NZ- (DL) -proline obtained was dissolved in
Ethylacetat gelost und durch Zugabe von Hexan auskristallisiert Auf diese Weise wurden 187,4 g N-Z-(DL)-Prolin (86,5 % d Th ) erhaltenEthyl acetate dissolved and crystallized by adding hexane. In this way, 187.4 g of N-Z- (DL) -proline (86.5% of theory) were obtained
Zur Synthese von N-Z-D-Prolin bzw N-Z-L-Prolin wurde analog vorgegangenThe same procedure was followed for the synthesis of N-Z-D-proline or N-Z-L-proline
(B) Synthese von N-Z-L-Pipecolinsäure(B) Synthesis of N-Z-L-pipecolic acid
10,0 g L-Pipecolinsaure wurden in 13 ml 4 N NaOH gelost. Zu dieser Losung wurden unter Thermostatisierung (5 - 10 °C) 14,5 g Chlorameisensaurebenzylester (Z-Cl) zugetropft Über einen pH-Staten wurde durch entsprechende Zugabe von 4 N NaOH der pH- Wert bei 1 1 ,5 gehalten Nach Abschluss der Reaktion wurden 10 ml Wasser zugegeben, um die Ruhrbarkeit bei der Aufarbeitung zu erleichtern, und durch Zugabe von konzentrierter Salzsaure (ca 1 g) wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Durch zweimalige Extraktion mit je 40 ml Butylacetat wurden Verunreinigungen entfernt Anschliessend wurde der pH der wassrigen Phase durch Zugabe von weiteren 6,67 g konzentrierter Salzsaure auf pH 2,01 gebracht N-Z-L-Pipecolinsaure wurde dann durch dreimalige Extraktion (je 40 ml) mit Butylacetat gewonnen Die organischen Phasen wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und schliesslich bis zur Trockene eingeengt Nach Losen des Feststoffs in 10 ml Ethylacetat und Zugabe von 9 ml Hexan wurde N-Z-L-Pipecolinsaure durch Abkühlen auf eine Temperatur < 10 °C kristallisiert Nach Filtration und Trocknung wurden letztlich 13,22 g N-Z-L-Pipecolinsaure (64,9 % d Th ) erhalten10.0 g of L-pipecolic acid was dissolved in 13 ml of 4 N NaOH. 14.5 g of benzyl chloroformate (Z-Cl) were added dropwise to this solution while being thermostatted (5-10 ° C.). The pH was kept at 11.5 by means of a corresponding addition of 4 N NaOH via a pH stat 10 ml of water were added to the reaction to make it easier to work up, and the pH was adjusted to 7.0 by adding concentrated hydrochloric acid (about 1 g). Impurities were removed by extraction twice with 40 ml each of butyl acetate the pH of the aqueous phase was brought to pH 2.01 by adding a further 6.67 g of concentrated hydrochloric acid. NZL-pipecolic acid was then obtained by extraction three times (40 ml each) with butyl acetate. The organic phases were combined, dried over sodium sulfate and finally until evaporated to dryness After dissolving the solid in 10 ml of ethyl acetate and adding 9 ml of hexane, NZL-pipecolic acid was crystallized by cooling to a temperature <10 ° C. After filtration and drying, 13.22 g of NZL-pipecolinic acid (64.9% of theory Th) received
Zur Svnthese von N-Z-(DL)-Pipecolinsaure bzw N-Z-D-Pipecolinsaure wurde analog vorgegangen An analogous procedure was followed for the synthesis of N-Z- (DL) -pipecolinic acid or N-Z-D-pipecolinic acid

Claims

Patentansprüche:Claims:
Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass sie befähigt sind, ein oder mehrere N-geschutzte cyclische Aminosaurederivate, ausgewählt aus Verbindungen der allgemeinen Formel IMicroorganisms, characterized in that they are capable of one or more N-protected cyclic amino acid derivatives selected from compounds of general formula I.
worin A zusammen mit -N- und -CH einen gegebenenfalls substituierten 4-, 5-, 6- oder 7-gliedrigen gesattigten heterocyciischen Ring bedeutet und R1 jeweils gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy bedeutet, in Form des Racemats oder eines der optischen Isomeren als einzige C-Quelle, als einzige N-Quelle oder als einzige C- und N-Quelle zu verwerten und/oder zu hydrolysieren,wherein A together with -N- and -CH represent an optionally substituted 4-, 5-, 6- or 7-membered saturated heterocyclic ring and R 1 each represents optionally substituted alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy, in the form of the racemate or one utilize and / or hydrolyze the optical isomers as the only C source, as the only N source or as the only C and N source,
sowie Enzymextrakte darausand enzyme extracts from it
Mikroorganismen nach Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel I ein N-geschutztes cyclisches D-Aminosaurederivat istMicroorganisms according to claim 1, wherein the compound of formula I is an N-protected cyclic D-amino acid derivative
Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Verbindung der Formel I ein N-geschutztes D-Prolinderivat, vorzugsweise N-Acetyl- oder N-Benzyloxycar- bonyl-D-Prolin, oder ein N-geschutztes D-Pipecolinsaurederivat ist Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welche befähigt sind, ein N-geschutztes D-Prolinderivat, vorzugsweise N-Acetyl- oder N-Benzyloxycarbonyl-D- Pro n, als einzige C-Quelle, als einzige N-Quelle oder als einzige C- und N-Quelle zu verwerten, und/oder befähigt sind ein N-geschutztes D-Prolinderivat, vorzugsweise N- oder N-Benzyloxycarbonyl-D-Prolin und/oder ein N-geschutztes D-Pipe- colinsaurederivat zu hydrolysierenMicroorganisms according to one of claims 1 or 2, wherein the compound of formula I is an N-protected D-proline derivative, preferably N-acetyl or N-benzyloxycarbonyl-D-proline, or an N-protected D-pipecolinic acid derivative Microorganisms according to one of claims 1 to 3, which are capable of an N-protected D-proline derivative, preferably N-acetyl or N-benzyloxycarbonyl-D-Pro n, as the only C source, as the only N source or as the only one To utilize the C and N sources, and / or are capable of hydrolyzing an N-protected D-proline derivative, preferably N- or N-benzyloxycarbonyl-D-proline and / or an N-protected D-pipe colic acid derivative
Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 der Gattung ArthrobacterMicroorganisms according to one of claims 1 to 4 of the genus Arthrobacter
Mikroorganismen nach Anspruch 5 der Spezies Arthrobacter ramosus GS131 (DSM 11637), sowie dessen fünktionell äquivalente Varianten und MutantenMicroorganisms according to claim 5 of the species Arthrobacter ramosus GS131 (DSM 11637), as well as its functionally equivalent variants and mutants
Verfahren zur Herstellung von N-geschutzten cychschen L-Aminosaurederivaten der allgemeinen Formel II und/oder von cychschen D-Aminosauren der allgemeinen Formel IIIProcess for the preparation of N-protected cych L-amino acid derivatives of the general formula II and / or of cych D-amino acids of the general formula III
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, umfassend die Umsetzung eines racemischen N-geschutzten cychschen Aminosaurederivats der allgemeinen Formelwherein A together with -N- and -CH and R 1 have the meaning given in claim 1, comprising the reaction of a racemic N-protected cychino amino derivative of the general formula
worin A zusammen mit -N- und -CH und R1 die genannte Bedeutung haben, mittels Mikroorganismen und/oder Enzympraparaten nach Anspruch 1 zu den Verbindungen der Formel III und/oder den bei dieser Umsetzung anfallenden N-geschutzten cychschen L- Aminosaurederivaten der Formel II, sowie gegebenenfalls Isolierung dieser Verbindungen wherein A together with -N- and -CH and R 1 have the meaning given, by means of microorganisms and / or enzyme preparations according to claim 1 to give the compounds of the formula III and / or the N-protected cych L-amino acid derivatives of the formula which result from this reaction II, and optionally isolation of these compounds
. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotransformation mittels Mikroorganismen der Spezies Arthrobacter pascens oder ramosus GS131 (DSM 1 1637) oder mit deren fünktionell aequivalenten Varianten und Mutanten durchgeführt wird. A method according to claim 7, characterized in that the biotransformation is carried out by means of microorganisms of the species Arthrobacter pascens or ramosus GS131 (DSM 1 1637) or with their functionally equivalent variants and mutants
) Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotransformation unter Zugabe der N-geschutzten Aminosaurederivate so durchgeführt wird, dass die Konzentration 50 Gew % nicht übersteigt) Method according to one of claims 7 or 8, characterized in that the biotransformation is carried out with the addition of the N-protected amino acid derivatives so that the concentration does not exceed 50% by weight
0 Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotransformation bei einer Temperatur von 10 bis 70 °C und bei einem pH von 3 bis 12 durchgeführt wird 0 Method according to one of claims 7 to 9, characterized in that the biotransformation is carried out at a temperature of 10 to 70 ° C and at a pH of 3 to 12
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